CN107513568A - 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法 - Google Patents

一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107513568A
CN107513568A CN201710834304.1A CN201710834304A CN107513568A CN 107513568 A CN107513568 A CN 107513568A CN 201710834304 A CN201710834304 A CN 201710834304A CN 107513568 A CN107513568 A CN 107513568A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microrna
probe
detection
target
chemical sensor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710834304.1A
Other languages
English (en)
Inventor
张春阳
马飞
刘文静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Normal University
Original Assignee
Shandong Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Normal University filed Critical Shandong Normal University
Priority to CN201710834304.1A priority Critical patent/CN107513568A/zh
Publication of CN107513568A publication Critical patent/CN107513568A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于双链特异性核酸酶辅助的靶循环和芘准分子切换灵敏的用于检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法。本发明荧光化学传感器制备及检测方法简单，无需大型昂贵仪器设备，同时对本发明中的各反应条件也都进行了细致优化，因此在检测过程中，大大降低了非特异性反应，实验结果精准可靠，与基于环介导等温扩增(LAMP)的测定(1.0阿摩尔)相比，提高了2个数量级，与基于发夹探针的滚环扩增(RCA)的测定(10飞摩尔每升)和基于解旋酶依赖性扩增(HDA)测定相比，提高了一个数量级。因此，本发明技术方案极具推广应用之价值。

Description

一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及基于双链特异性核酸酶辅助的靶循环和芘准分子切换灵敏的用于检测let-7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法。
背景技术
小分子RNA(MicroRNA,miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小分子非编码RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。越来越多的证据表明，MicroRNAs的表达水平与人类疾病(包括癌症)密切相关。例如，在非小细胞肺癌患者的血液中let-7a microRNA的表达不足，在人乳腺癌中的MiR-21microRNA过表达以及胃癌中miR-141表达水平下调，因此，microRNA被认为是疾病诊断、预后治疗中潜在的生物标志物。亦因此，因此，开展对小分子RNA的超灵敏检测不仅对基础生物化学的深入研究有很大帮助，同时对发展人类疾病的新的治疗方法和策略具有重大意义。
迄今为止，针对小分子RNA的传统检测方法主要包括核酸印迹，微阵列和定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)等。其中，核酸印迹法是microRNA分析的标准方法，但该方法灵敏度较低、耗时多、样品消耗量较大。微阵列能够同时检测多种microRNAs，但由于其涉及到非特异性杂交，因此具有较差的特异性和重复性。此外，核酸印迹法和微阵列灵敏度较低，不具备检测低丰度microRNAs的能力。而定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)虽然可以灵敏的检测microRNAs，但需要精密仪器来精确控制反应温度。
有鉴于此，近年来，相关研究人员已经开发了一系列基于荧光，电化学，比色法，化学发光和表面等离子体共振的新方法以用于灵敏的检测microRNA。其中荧光方法由于其操作简易，复用能力强，灵敏度高，体内测定能力强等优点而引起极大的关注。荧光核酸染料(例如YOYO和SYBR Green I)和淬灭探针(例如分子信标和Taqman探针)通常用于信号输出。然而，他们都有局限性。由于荧光染料能够非特异性地结合几乎所有类型的核酸(即双链DNA，单链DNA和RNA)，导致高背景信号和差的特异性。尽管特异性得到提高，但淬灭探针强烈地依赖于荧光团和猝灭剂之间的距离和方向，具有不完全的淬灭和假阳性。为了提高检测灵敏度，已经引入了各种核酸扩增方法，如指数扩增反应(EXPAR)，环介导等温扩增(LAMP)，滚环扩增(RCA)和解旋酶依赖性扩增(HDA)。然而，这些方法涉及复杂的引物/模板设计和具有固有的非特异性背景扩增的耗时的实验程序。因此，迫切需要开发一种不涉及任何核酸扩增的用于灵敏检测microRNA的简单快速的方法。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，该传感器以芘分子标记作为报告探针，采用双链特异性核酸酶辅助的靶循环和芘准分子切换灵敏的检测策略，不需要任何核酸扩增技术即可实现对let-7a microRNA的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：let-7a microRNA结合探针和报告探针；
其中，所述let-7a microRNA结合探针与let-7a microRNA碱基序列互补，能与靶microRNA即let-7a microRNA形成杂交形成探针-靶microRNA双链体；
所述报告探针为一个具茎环结构的发夹寡核苷酸，茎环的两端用芘分子标记；所述当缺乏靶microRNA即let-7a microRNA时，所述let-7a microRNA结合探针与所述报告探针进行杂交，使得所述报告探针的茎环结构打开，无法形成芘准分子；
所述荧光化学传感器还包括双链特异性核酸酶(DSN)，所述双链特异性核酸酶能够识别并消化形成探针-靶microRNA双链体中的let-7a microRNA结合探针，从而释放靶microRNA。释放的靶microRNA可以与新的探针杂交形成新的探针-靶microRNA双链体，引发多个探针链的循环消化。
所述荧光化学传感器还包括RNA酶抑制剂，防止靶microRNA即let-7amicroRNA被RNA酶降解，使得检测结果不准确；优选的，所述RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)；
优选的，所述let-7a microRNA结合探针长度为22nt，所述let-7a microRNA结合探针的碱基序列为：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A-3'。
优选的，所述报告探针长度为34nt，所述报告探针的碱基序列为：5'-Pyrene-CCTAGC TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT TGC TAG G-Pyrene-3'。
优选的，所述荧光化学传感还包括双链特异性核酸酶反应缓冲溶液，所述反应缓冲液包括：50毫摩尔每升的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),5毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(DTT)；
本发明还公开了所述荧光化学传感器用于检测let-7a microRNA的方法，具体包括：
1)将待测样品加入所述let-7a microRNA结合探针反应溶液中进行反应；
2)向步骤1)反应后溶液中加入报告探针进行加热反应，反应结束后降至室温冷却；
3)对步骤2)反应后的溶液的荧光光谱进行检测，实现对待测样品中的let-7amicroRNA的定量分析。
其中，步骤1)所述反应溶液中包括let-7a microRNA结合探针，双链特异性核酸酶和RNA酶抑制剂；
步骤1)中反应条件为：50-60℃(优选为55℃)，反应时间为20～60min(优选为30min)；
步骤2)中加热反应条件为：90-100℃(优选为95℃)，反应时间为3～5min(优选为4min)；
步骤3)中采用荧光分光光度计对荧光光谱进行检测，在激发波长为340nm，在485nm处的荧光强度进行数据分析，激发狭缝和发射狭缝分别设定为10.0nm和10.0nm。
本发明还公开了上述荧光化学传感器和/或检测方法在定量检测let-7amicroRNA和/或筛选let-7a microRNA抑制剂/激活剂中的应用。
本发明所述荧光化学传感器检测方法的原理为：本发明是基于双链特异性核酸酶辅助的靶循环和芘准分子切换灵敏的检测microRNA的一种简单的荧光法。我们设计了一个针对靶microRNA的特异性探针和一个茎环结构的发夹寡核苷酸，其茎的两端用芘分子标记作为报告探针。
芘是一种空间灵敏的荧光染料，当两个芘分子紧密接近时，可以形成在485纳米处强发射的准分子。与传统的分子信标相比，芘准分子具有较大的斯托克斯位移(约130纳米)，甚至可以在高浓度下避免自猝灭效应。此外，芘准分子的形成是一种无猝灭的信号输出，可以有效消除由不完全淬灭引起的假阳性。芘准分子具有比生物背景物种(小于5纳秒)更长的寿命(大于100纳秒)，适于复杂的样品分析(例如血液，唾液和尿液)。我们使用芘准分子作为信号报告分子，来表明靶microRNA的存在。同时，为了提高灵敏度，我们引入双链特异性核酸酶进行信号放大。双链特异性核酸酶可以切割DNA-RNA双链体中的DNA，但对RNA链无影响。当靶microRNA存在时，探针与靶microRNA杂交形成探针-靶microRNA双链体，使其探针链被双链特异性核酸酶识别并消化，从而释放靶microRNA。释放的靶microRNA可以与新的探针杂交形成新的探针-靶microRNA双链体，引发多个探针链的循环消化。由于缺乏探针链，报告探针形成发夹结构使两个芘分子相互靠近形成芘准分子。因此，通过测量485纳米处的芘准分子的荧光发射，可以简单地检测靶microRNA。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明首次提出一种基于双链特异性核酸酶辅助的靶循环和芘准分子切换灵敏的检测microRNA的荧光法。原理简单，成本低，用时少。在本发明中，通过设计了一个针对靶microRNA的特异性探针和一个茎环结构的发夹寡核苷酸，其茎的两端用芘分子标记。当靶microRNA存在时，探针与靶microRNA杂交形成探针-靶microRNA双链体，使其探针链被双链特异性核酸酶识别并消化，从而释放靶microRNA。释放的靶microRNA可以与新的探针杂交形成新的探针-靶microRNA双链体，引发多个探针链的循环消化。由于缺乏探针链，报告探针形成发夹结构使两个芘分子相互靠近形成芘准分子。因此，通过测量485纳米处的芘准分子的荧光发射，可以简单地检测靶microRNA。此方法操作简单，用时少且不需要任何核酸扩增技术。
(2)灵敏度高。本发明中，芘准分子具有较大的斯托克斯位移(约130纳米)，甚至可以在高浓度下避免自猝灭效应。芘准分子的形成是一种无猝灭的信号输出，可以有效消除由不完全淬灭引起的假阳性。我们引入双链特异性核酸酶介导的信号扩增，可以通过简单的反应过程有效地消除非特异性扩增的风险，从而达到很高的灵敏度。
(3)特异性好。本技术方案优异的特异性是由于双链特异性核酸酶对于完全匹配的双链体具有比非完全匹配的双链体更高的切割活性。因此大幅降低了非特异性扩增可能产生的干扰信号，具有很高的特异性。
综上，本发明荧光化学传感器制备及检测方法简单，无需大型昂贵仪器设备，同时由于我们对本发明中的各反应条件也都进行了细致优化，因此在检测过程中，大大降低了非特异性反应，实验结果精准可靠，与基于环介导等温扩增(LAMP)的测定(1.0阿摩尔)相比，提高了2个数量级，与基于发夹探针的滚环扩增(RCA)的测定(10飞摩尔每升)和基于解旋酶依赖性扩增(HDA)测定相比，提高了一个数量级。因此，本发明技术方案极具推广应用之价值。
附图说明
图1为本发明MicroRNA检测的原理说明图，其中图1(A)通过与探针的杂交，报告探针的开关状态转换；图1(B)为基于靶分子引发的双链特异性核酸酶辅助的芘准分子的形成检测靶microRNA。
图2(A)为当let-7a microRNA存在和不存在时的荧光发射光谱，其中当let-7amicroRNA存在时，其浓度为200纳摩尔每升；图2(B)为反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，其中，泳道1：报告探针+探针+双链特异性核酸酶+let-7a microRNA,泳道2：报告探针+探针+双链特异性核酸酶,泳道3：报告探针+探针,泳道4：报告探针:报告探针的浓度是800纳摩尔每升,探针浓度是800纳摩尔每升,let-7a microRNA浓度是10纳摩尔每升，双链特异性核酸酶的用量是0.1个单位。
图3为灵敏度检测示意图。其中图3(A)为不同浓度的靶let-7a microRNA对应的荧光光谱；图3(B)为荧光强度与靶let-7a microRNA浓度的对数形式在1飞摩尔每升到10纳摩尔每升的线性关系；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
图4为无双链特异性核酸酶时的灵敏度检测，其中图4(A)为无双链特异性核酸酶时microRNA检测的原理说明；图4(B)为不同浓度的靶let-7a microRNA对应的荧光光谱；图4(C)荧光强度与靶let-7a microRNA浓度在100纳摩尔每升到1微摩尔每升之间的线性关系；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
图5(A)为let-7a microRNA，let-7b microRNA和let-7c microRNA的序列；图5(B)为不同microRNA对应的荧光强度的测量；其中，let-7a,let-7b和let-7c的浓度为100纳摩尔每升；探针和报告探针的浓度均为800纳摩尔每升；误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
图6(A)为1微克的总RNA，1微克的总RNA+0.5飞摩尔合成的let-7a,以及没有任何样品的对照组所对应的荧光发射光谱；图6(B)没有任何样品的对照组，1微克的总RNA，1微克的总RNA+0.5飞摩尔合成的let-7a的荧光强度的比较。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术对小分子RNA测定存在灵敏度偏低、检测方法繁琐、所需仪器昂贵等各种问题；
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：let-7a microRNA结合探针和报告探针；
其中，所述let-7a microRNA结合探针与let-7a microRNA碱基序列互补，能与靶microRNA即let-7a microRNA形成杂交形成探针-靶microRNA双链体；
所述报告探针为一个具茎环结构的发夹寡核苷酸，茎环的两端用芘分子标记；所述当缺乏靶microRNA即let-7a microRNA时，所述let-7a microRNA结合探针与所述报告探针进行杂交，使得所述报告探针的茎环结构打开，无法形成芘准分子；
所述荧光化学传感器还包括双链特异性核酸酶(DSN)，所述双链特异性核酸酶能够识别并消化形成探针-靶microRNA双链体中的let-7a microRNA结合探针，从而释放靶microRNA。释放的靶microRNA可以与新的探针杂交形成新的探针-靶microRNA双链体，引发多个探针链的循环消化。
所述荧光化学传感器还包括RNA酶抑制剂，防止靶microRNA即let-7a microRNA被RNA酶降解，使得检测结果不准确；优选的，所述RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)；
优选的，所述let-7a microRNA结合探针长度为22nt，所述let-7a microRNA结合探针的碱基序列为：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A-3'；
优选的，所述报告探针长度为34nt，所述报告探针的碱基序列为：5'-Pyrene-CCTAGC TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT TGC TAG G-Pyrene-3'；
所述荧光化学传感还包括双链特异性核酸酶反应缓冲溶液，所述反应缓冲液包括：50毫摩尔每升的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),5毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(DTT)；
本发明的又一具体实施方式中，公开了所述荧光化学传感器用于检测let-7amicroRNA的方法，具体包括：
1)将待测样品加入所述let-7a microRNA结合探针反应溶液中进行反应；
2)向步骤1)反应后溶液中加入报告探针进行加热反应，反应结束后降至室温冷却；
3)对步骤2)反应后的溶液的荧光光谱进行检测，实现对待测样品中的let-7amicroRNA的定量分析。
其中，步骤1)所述反应溶液中包括let-7a microRNA结合探针，双链特异性核酸酶和RNA酶抑制剂；
步骤1)中反应条件为：50-60℃(优选为55℃)，反应时间为20～60min(优选为30min)；
步骤2)中加热反应条件为：90-100℃(优选为95℃)，反应时间为3～5min(优选为4min)；
步骤3)中采用荧光分光光度计对荧光光谱进行检测，在激发波长为340nm，在485nm处的荧光强度进行数据分析，激发和发射狭缝分别设定为10.0nm和10.0nm。
本发明的又一具体实施方式中，公开了上述荧光化学传感器和/或检测方法在定量检测let-7a microRNA和/或筛选let-7a microRNA抑制剂/激活剂中的应用。
本发明检测原理如图1所示：本发明设计了一个针对靶microRNA的特异性探针即let-7a microRNA结合探针和一个茎环结构的发夹寡核苷酸，其茎的两端用芘分子标记作为报告探针。报告探针的5'和3'末端用芘分子标记，可以自发地折叠成具有22个核苷酸的环区和6个核苷酸茎区的发夹结构。形成的发夹结构使两个芘分子相互靠近形成在485nm处有强发射的芘准分子。let-7a microRNA结合探针设计为与报告探针的环区完全互补。let-7a microRNA结合探针与报告探针的杂交使其茎区打开(let-7a microRNA结合探针与报告探针环区碱基序列完全互补)，从而使两个芘分子分离。因此观察不到芘准分子的发射。当靶microRNA不存在时，let-7a microRNA结合探针保持完整，随后与报告探针杂交，使其茎区打开，两个芘分子分离(图1B)。当靶microRNA即let-7a microRNA(图1B)存在时，let-7amicroRNA结合探针与靶microRNA杂交形成探针-靶microRNA双链体，使其探针链被双链特异性核酸酶识别并消化，从而释放靶let-7a microRNA。释放的靶let-7a microRNA可以与新的let-7a microRNA结合探针杂交形成新的探针-靶microRNA双链体，引发多个探针链的循环消化。因此，由于缺少let-7a microRNA结合探针，报告探针形成芘准分子。通过荧光测量，可以很容易地检测到芘准分子在485纳米处的发射。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。
实施例
实验方法步骤
1.MicroRNA的检测：20微升的反应体系包括焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水,1×双链特异性核酸酶反应缓冲溶液(50毫摩尔每升的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),5毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(DTT)),50毫摩尔每升的氯化钠,0.1个单位的双链特异性核酸酶,20个单位的RNA酶抑制剂，2微摩尔每升的探针以及不同浓度的靶microRNA,在55℃反应30分钟。然后，以上20微升的反应产物和800纳摩尔每升的芘准分子报告探针在含有3.6微升的2.5摩尔每升的氯化钠的反应溶液中，于95℃反应4分钟,后缓慢冷却至室温。荧光光谱用以氙灯作为激发光源的F-7000荧光分光光度计(日立公司)来测定。在340纳米的激发波长下记录440-600纳米的荧光光谱。激发和发射狭缝分别设定为10.0和10.0纳米。485纳米处的荧光强度用于数据分析。
2.凝胶电泳分析：在1×三羟甲基氨基甲烷-硼酸(TBE)缓冲液(9毫摩尔每升的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，9毫摩尔每升的硼酸，0.2毫摩尔每升的乙二胺四乙酸)中以110V恒定电压在室温下进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。凝胶用银染色试剂盒(Tiandz Inc.，北京，中国)染色，并通过柯达图像站4000MM(Rochester，NY，U.S.A)显现。
3.细胞内总RNA的提取：人类子宫颈癌细胞(HeLa)在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中，于37℃在含有5％二氧化碳的培养箱中进行培养。当细胞生长到对数生长期时，使用德国凯杰生物公司的总RNA提取试剂盒对细胞中的总RNA进行抽提与纯化，提取与纯化操作严格按照试剂盒所附的说明书进行。所得的总RNA的浓度用紫外可见分光光度计进行测定。
4.回收率的测定：总体积为20微升的反应体系包括含有不同浓度靶microRNA的1％的血清，1×双链特异性核酸酶反应缓冲溶液(50毫摩尔每升的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),5毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升的二硫苏糖醇(DTT)),50毫摩尔每升的氯化钠,0.1个单位的双链特异性核酸酶,20个单位的RNA酶抑制剂，2微摩尔每升的探针,在55℃反应30分钟。然后，20微升反应产物和800纳摩尔每升的芘准分子报告探针在26微升的反应溶液(22.4微升的水,3.6微升的2.5摩尔每升的氯化钠)中于95℃反应4分钟,后缓慢冷却至室温。用上述相同的方法进行荧光测量。
结果分析与讨论
1.本发明原理的实验验证
为了验证本技术方案的可行性，我们在340纳米的激发波长下，测量在不存在和存在靶let-7a时的芘准分子的荧光发射光谱。当靶let-7a存在(图2A)时，观察到在最大波长485纳米处的强荧光发射，表明由靶let-7a引发了芘准分子的形成。相比之下，当靶let-7a不存在(图2A)时，在485纳米处观察不到明显的荧光发射，表明在不存在靶let-7a的情况下没有形成芘准分子。这些结果通过12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析进一步证实(图2B)。当存在靶let-7a时，产生一条明显的34个核苷酸的芘准分子探针的带宽(图2B，泳道1),由芘准分子探针证明(图2B，泳道4)。相反，当靶let-7a不存在时，探针-报告探针双链体保持不变，并且没有观察到芘准分子探针链的条带(图2B，泳道2)，通过探针-报告探针双链体证明(图2B，泳道3)。结果清楚地表明，靶let-7a可以引发芘准分子的形成用于microRNA的检测。
2.灵敏度检测
为了评估本技术方案检测microRNA的灵敏度，我们探究不同浓度靶let-7a对应的荧光强度。如图3A所示，在485纳米处的芘准分子的荧光发射随着靶let-7a浓度的增加而升高。荧光强度与靶let-7a浓度的对数形式在1飞摩尔每升到10纳摩尔每升范围内呈现线性相关(图3B)。该方法显示从1飞摩尔每升到10纳摩尔每升7个数量级大的动态范围，并且其检测限计算为0.58飞摩尔每升(11.6仄摩尔)。与常规的基于分子信标的测定(4纳摩尔每升)相比，本技术的灵敏度提高了6个数量级。即使没有涉及核酸扩增，本技术的灵敏度也远高于基于核酸扩增法的灵敏度，与基于环介导等温扩增(LAMP)的测定(1.0阿摩尔)相比，提高了2个数量级，与基于发夹探针的滚环扩增(RCA)的测定(10飞摩尔每升)和基于解旋酶依赖性扩增(HDA)测定相比，提高了一个数量级。另外，无双链特异性核酸酶参与的反应(图4)中，荧光强度与靶let-7a浓度在100纳摩尔每升到1微摩尔每升的动态范围内呈现线性相关，且检测限计算为15.2纳摩尔每升。因此，双链特异性核酸酶辅助的反应的灵敏度比无双链特异性核酸酶辅助的反应的灵敏度高7个数量级，表明双链特异性核酸酶的引入可以大大地放大信号并提高检测灵敏度。这足以说明本技术方案的检测灵敏度之高。
3.特异性检测
为了评估本技术方案检测某种特定microRNA的特异性，我们使用let-7 microRNA家族(即let-7a，let-7b和let-7c)作为模型靶标，其中彼此之间只有一个或两个碱基差异(图5A)。如图5B所示，let-7a的荧光信号远高于let-7b和let-7c的荧光信号，比let-7b高出7.31倍，比let-7c高出5.79倍。本技术优异的特异性主要归因于：双链特异性核酸酶对于完全匹配的双链体具有比非完全匹配的双链体更高的切割活性。由此可以看出，本技术方案具有很高的特异性，能够区分即使是单个碱基差异的microRNA家族。
4.实际样品检测
为了探究本技术方案对实际样品的检测，我们测量了从人子宫颈癌(HeLa)细胞提取的总RNA样品中的内源性let-7a。如图6所示，1微克总RNA对应的荧光信号与没有总RNA的对照组的荧光信号显示出很好的区别。总RNA中的let-7a的绝对量定量为13.6阿摩尔每微克(或8.18×106拷贝每微克)，与通过无标记的电化学测定(7.4×106拷贝每微克)和基于等温指数扩增的测定(8.85×106拷贝每微克)得到的let-7a的绝对量一致。将0.5飞摩尔合成的let-7a加入到1微克总RNA中，样品中let-7a的绝对量定量为0.522飞摩尔，计算的回收率为101.6％。另外为了探究本技术方案在复杂生物流体中的性能，将不同量的let-7a加入10倍稀释的血清样品中，其中不存在可检测的内源性let-7a，并测量相应的回收率。如表1所示，得到从98.76％到102.35％的定量回收率，与双链置换法得到的回收率一致。证明本技术方案能够用于实际样品的检测，并在临床诊断和预后治疗中具有巨大的潜在应用。
表1
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aactatacaa cctactacct ca 22
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cctagctgag gtagtaggtt gtatagttgc tagg 34
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7a microRNA
<400> 3
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7b microRNA
<400> 4
ugagguagua gguugugugg uu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> let-7c microRNA
<400> 5
ugagguagua gguuguauag uu 22

Claims (10)

1.一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括：let-7a microRNA结合探针和报告探针；
其中，所述let-7a microRNA结合探针与let-7a microRNA碱基序列互补，能与靶microRNA即let-7a microRNA形成杂交形成探针-靶microRNA双链体；
所述报告探针为一个具茎环结构的发夹寡核苷酸，茎环的两端用芘分子标记；当缺乏靶microRNA即let-7a microRNA时，所述let-7a microRNA结合探针与所述报告探针进行杂交，使得所述报告探针的茎环结构打开，无法形成芘准分子；
所述荧光化学传感器还包括双链特异性核酸酶(DSN)，所述双链特异性核酸酶能够识别并消化形成探针-靶microRNA双链体中的let-7a microRNA结合探针，从而释放靶microRNA。释放的靶microRNA可以与新的探针杂交形成新的探针-靶microRNA双链体，引发多个探针链的循环消化。
2.如权利要求1所述的一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器还包括RNA酶抑制剂；优选的，所述RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙酯。
3.如权利要求1所述的一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，其特征在于，所述let-7a microRNA结合探针长度为22nt，所述let-7a microRNA结合探针的碱基序列为：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC A-3'。
4.如权利要求1所述的一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，其特征在于，所述报告探针长度为34nt，所述报告探针的碱基序列为：5'-Pyrene-CCT AGC TGA GGT AGTAGG TTG TAT AGT TGC TAG G-Pyrene-3'。
5.如权利要求1所述的一种检测let-7a microRNA的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感还包括双链特异性核酸酶反应缓冲溶液，所述反应缓冲液包括：50毫摩尔每升的pH8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，5毫摩尔每升的氯化镁，1毫摩尔每升的二硫苏糖醇。
6.权利要求1-5任一项所述荧光化学传感器用于检测let-7a microRNA的方法，其特征在于，步骤包括：
1)将待测样品加入所述let-7a microRNA结合探针反应溶液中进行反应；
2)向步骤1)反应后溶液中加入报告探针进行加热反应，反应结束后降至室温冷却；
3)对步骤2)反应后的溶液的荧光光谱进行检测，实现对待测样品中的let-7amicroRNA的定量分析。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述反应溶液中包括let-7amicroRNA结合探针，双链特异性核酸酶和RNA酶抑制剂；
步骤1)中反应条件为：50-60℃(优选为55℃)，反应时间为20～60min(优选为30min)。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中加热反应条件为：90-100℃(优选为95℃)，反应时间为3～5min(优选为4min)。
9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中采用荧光分光光度计对荧光光谱进行检测，在激发波长为340nm，在485nm处的荧光强度进行数据分析。
10.权利要求1-5任一项所述荧光化学传感器和/或权利要求6-9任一项所述检测方法在定量检测let-7a microRNA和/或筛选let-7a microRNA抑制剂/激活剂中的应用。
CN201710834304.1A 2017-09-15 2017-09-15 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法 Pending CN107513568A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710834304.1A CN107513568A (zh) 2017-09-15 2017-09-15 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710834304.1A CN107513568A (zh) 2017-09-15 2017-09-15 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107513568A true CN107513568A (zh) 2017-12-26

Family

ID=60725425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710834304.1A Pending CN107513568A (zh) 2017-09-15 2017-09-15 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107513568A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136353A (zh) * 2018-08-21 2019-01-04 中山大学 一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法
CN109234413A (zh) * 2018-11-27 2019-01-18 中国农业大学 一种用于猪源性成分定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器
CN109540856A (zh) * 2018-11-08 2019-03-29 南京师范大学 一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂
CN109706226A (zh) * 2019-03-11 2019-05-03 中国科学院化学研究所 一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法
CN110747257A (zh) * 2019-10-31 2020-02-04 天津大学 非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒
CN112626178A (zh) * 2019-09-24 2021-04-09 首琳生物科学株式会社 利用双标记探针的检测信号增强的核糖核酸检测方法及试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101675165A (zh) * 2006-12-08 2010-03-17 奥斯瑞根公司 Let-7微小rna的功能和靶标
CN103320519A (zh) * 2013-07-12 2013-09-25 华东理工大学 定量检测microRNA的PCR分析方法
CN106119368A (zh) * 2016-07-05 2016-11-16 中国人民解放军第四五五医院 一种microRNA‑1的快速检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101675165A (zh) * 2006-12-08 2010-03-17 奥斯瑞根公司 Let-7微小rna的功能和靶标
CN103320519A (zh) * 2013-07-12 2013-09-25 华东理工大学 定量检测microRNA的PCR分析方法
CN106119368A (zh) * 2016-07-05 2016-11-16 中国人民解放军第四五五医院 一种microRNA‑1的快速检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIN-CHENG YIN等: "One-Step, Multiplexed Fluorescence Detection of microRNAs Based on Duplex-Specific Nuclease Signal Amplification", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 *
FEI MA等: "Sensitive detection of microRNAs by duplex specific nuclease-assisted target recycling and pyrene excimer switching", 《CHEMICAL COMMUNICATION》 *
郭云良等: "《神经生物学技术》", 31 January 2005, 中国海洋大学出版社 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136353A (zh) * 2018-08-21 2019-01-04 中山大学 一种低序列依赖高阶恒温指数扩增检测microRNA的方法
CN109540856A (zh) * 2018-11-08 2019-03-29 南京师范大学 一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂
CN109540856B (zh) * 2018-11-08 2022-01-28 南京师范大学 一种基于荧光共振能量转移检测不同亚型乳腺癌细胞的试剂
CN109234413A (zh) * 2018-11-27 2019-01-18 中国农业大学 一种用于猪源性成分定量检测的可视化级联放大功能核酸传感器
CN109706226A (zh) * 2019-03-11 2019-05-03 中国科学院化学研究所 一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法
CN109706226B (zh) * 2019-03-11 2021-06-15 中国科学院化学研究所 一种基于不对称PCR和LAMP循环扩增反应进行miRNA快速检测的方法
CN112626178A (zh) * 2019-09-24 2021-04-09 首琳生物科学株式会社 利用双标记探针的检测信号增强的核糖核酸检测方法及试剂盒
CN110747257A (zh) * 2019-10-31 2020-02-04 天津大学 非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7327826B2 (ja) 核酸の検知
CN107513568A (zh) 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法
Ma et al. Sensitive detection of microRNAs by duplex specific nuclease-assisted target recycling and pyrene excimer switching
US9297047B2 (en) Molecular beacon based assay for the detection of biomarkers for breast cancer metastasis
US11214841B2 (en) Rapid low-cost detection of valley fever using isothermal amplification and sensing methods
Wang et al. Ratiometric fluorescence sensor based on carbon dots as internal reference signal and T7 exonuclease-assisted signal amplification strategy for microRNA-21 detection
Guo et al. Amplified fluorescence sensing of miRNA by combination of graphene oxide with duplex-specific nuclease
EP1972693A1 (en) Method and kit for detecting a target protein using a DNA aptamer
CN104120184B (zh) 一种利用扩增dna片段长度多态性测定短链rna的方法
US20140342933A1 (en) Methods and compositions for multiplexed and ultrasensitive microrna detection
US9845495B2 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
CN107760764A (zh) 一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒
CN107287291A (zh) 一种基于g‑C3N4与CdTe/CdS量子点相互作用的双标记核酸检测方法
Wang et al. Target-mediated hyperbranched amplification for sensitive detection of human alkyladenine DNA glycosylase from HeLa cells
KR102080823B1 (ko) 형광염기유사체를 포함하는 분할 g-쿼드로플렉스를 이용한 표적 dna 검출방법
JP4317854B2 (ja) 微量胃癌細胞の検出法
Wang et al. Absolute quantification of circRNA using digital reverse transcription-hyperbranched rolling circle amplification
CN106754902B (zh) 一种荧光共振探针及其应用和试剂盒
CN114196733B (zh) 端粒G四链体DNA与硫黄素T介导的荧光生物传感器及其在lncRNA检测中的应用
CN104561249A (zh) 在样品中检测靶核酸的方法
CN104561248A (zh) 用于检测靶核酸的引物和其应用
Liu et al. A programmable quantum dot nanosensor guided by three-way junction skeleton-mediated cascade signal amplification for sensitive detection of circRNAs in breast cancer
CN102937613B (zh) 一种基于亚甲基蓝指示剂定量检测pcr的电化学安培检测法
Ma et al. Delayed full opening of bumped switchable molecular probe enables repeated generation of target analogues for mix-to-signaling determination of microRNAs
Liu et al. A simple “turn-on” fluorescent biosensor for sensitive detection of exonuclease III activity through photoinduced electron transfer and self-hybridization of a DNA probe

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171226

RJ01 Rejection of invention patent application after publication