JP6977014B2 - 個別的エピゲノミクスのための天然クロマチンへの転移 - Google Patents

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Description

政府による支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた契約ＡＩ０５７２２９、ＨＧ００００４４およびＮＳ０７３０１５の下で、政府支援によりもたらされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
相互参照
本出願は、２０１３年５月２３日に出願された米国仮出願第６１／８２６，７２８号の利益を主張し、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
真核生物のゲノムはクロマチンに階層的にパッケージされ、このパッケージングの性質は遺伝子調節において中心的な役割をする。クロマチンの核タンパク質構造の中にコードされるエピジェネティック情報に関する主要な識見は、クロマチン到達性（「オープンクロマチン」）、ヌクレオソームの位置付けおよび転写因子（ＴＦ）占有率を別々に検査するためのハイスループットのゲノムワイドな方法からもたらされた。公開されたプロトコールが存在するが、それらの方法は出発材料として数百万の細胞、複雑で時間のかかる試料調製を必要とし、ヌクレオソームの位置付け、クロマチン到達性およびＴＦ結合の相互作用を同時に探ることができない。これらの制限は、３つの主要な点で問題を含む：第１に、現行の方法は細胞集団の不均一性を均し、「かき消す」ことがある。第２に、十分な生体材料を得るためにしばしば細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させなければならず、未知の方法でｉｎ ｖｉｖｏ状況を混乱させ、エピジェネティック状態をモジュレートする。第３に、インプット必要条件は、明確な臨床試料へのこれらのアッセイの適用をしばしば阻止し、診断タイムスケールでの「個別的エピゲノム」の生成を妨げる。本明細書で、それらの到達性およびそれらの構造を含めて、これらの制限（複数可）を克服することができるポリヌクレオチドの分析方法が提供される。バイオマーカーとしてのその使用を潜在的に可能にするために、より高い感度、および細胞間変動性を含むクロマチン到達性に関するさらなる情報を提供することができる単一細胞方法も提供される。
ゲノムＤＮＡなどのポリヌクレオチドを分析する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）細胞の集団から単離されたクロマチンをトランスポザーゼおよび分子タグで処理してポリヌクレオチドのタグ付き断片を生成するステップと；（ｂ）タグ付き断片の一部を配列決定して複数の配列リードを生成するステップと；（ｃ）配列リードから得られた情報を領域にマッピングすることによって細胞のゲノムの領域のエピジェネティックマップを作製するステップとを含む。
一部の場合には、配列リードの初め、および任意選択で終わりのヌクレオチド配列を使用して情報が得られる。一部の場合には、（ｃ）でマッピングされる情報は、（ｉ）トランスポザーゼの切断部位；（ｉｉ）ステップ（ａ）で生成される断片のサイズ；（ｉｉｉ）配列リードの長さ；（ｉｉｉ）規定の長さの範囲の配列リードの位置；および（ｉｖ）配列リード存在量の１つまたは複数から選択される。ある場合には、規定のサイズの範囲の断片は、ヌクレオソームを含まない断片である。
ある場合には、エピジェネティックマップは以下の１つまたは複数を示す：（ｉ）領域に沿ったクロマチン到達性のプロファイル；（ｉｉ）領域中の結合部位へのＤＮＡ結合タンパク質占有率；（ｉｉｉ）領域中のヌクレオソームを含まないＤＮＡ；（ｉｖ）領域に沿ったヌクレオソームの位置付け；および／または（ｖ）クロマチン状態。一部の場合には、本方法は、ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位の大域的占有率を測定することをさらに含むことができる。ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、転写因子であってもよい。
一部の場合には、細胞の集団は、約５００から１００，０００個の細胞で構成されてもよい。細胞は、個体、例えば個体の血液から単離されてもよい。一部の例では、細胞は同じ細胞型であってもよい。一部の例では、細胞はＦＡＣＳで選択された細胞であってもよい。
ある場合には、処理ステップ（ａ）は、細胞の集団から核を単離すること；ならびに単離した核を挿入酵素複合体と組み合わせることを含むことができ、組み合わせることで、核を溶解してクロマチンを放出することおよびゲノムＤＮＡのタグ付き断片の生成の両方をもたらす。一部の例では、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼに由来してもよい。他の例では、トランスポザーゼはＭｕＡトランスポザーゼに由来してもよい。さらなる例では、トランスポザーゼはＶｉｂｈａｒトランスポザーゼ（例えばＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）に由来してもよい。
本開示は、２つの試料を比較するための方法であって：（ａ）細胞の第１の集団を分析して第１のエピジェネティックマップを生成するステップ；および（ｂ）細胞の第２の集団を分析して第２のエピジェネティックマップを生成するステップ；および（ｃ）第１のエピジェネティックマップを第２のエピジェネティックマップと比較するステップを含む方法を提供する。例えば、細胞の第１の集団および細胞の第２の集団は、同じ個体から異なる時間に収集することができる。あるいは、細胞の第１の集団および細胞の第２の集団は、異なる個体から収集される異なる細胞の集団であってもよい。
本開示は、患者からのクロマチンを分析してエピジェネティックマップを生成するステップ；およびエピジェネティックマップに基づいて診断または予後診断を提供するステップを含む診断法をさらに提供する。
本開示は、ある部位での、細胞試料由来であるポリヌクレオチドの到達性を判定するための方法であって、（ａ）挿入酵素で複数の分子タグをポリヌクレオチドに挿入するステップ；および（ｂ）分子タグを使用して部位での到達性を判定するステップを含む方法を提供する。本方法は、判定された到達性を使用して、部位でポリヌクレオチドに結合している１つまたは複数のタンパク質を同定するステップをさらに含むことができる。一部の場合には、タンパク質の少なくとも１つは転写因子である。本方法は、分子タグを使用してポリヌクレオチドの到達性マップを生成するステップを含むこともできる。
本開示は、細胞試料からのポリヌクレオチドの三次元構造を分析するための方法であって、（ａ）挿入酵素で複数の分子タグをポリヌクレオチドに挿入するステップ；および（ｂ）分子タグを使用してポリヌクレオチドの三次元構造を分析するステップを含む方法も提供する。一部の場合には、挿入酵素は２つ以上の酵素部分を含むことができ、酵素部分の各々は共通の配列をポリヌクレオチドに挿入する。酵素部分は、互いに連結させることができる。共通の配列は、共通のバーコードを含むことができる。酵素部分は、トランスポザーゼを含むことができる。ポリヌクレオチドは、ステップ（ａ）の間、複数の断片に断片化することができ、ここで、共通のバーコードを含む断片は、ポリヌクレオチドの三次元構造で近接していると判定される。
ポリヌクレオチドは、挿入の間、複数の断片に断片化することができる。本方法は、断片を増幅するステップをさらに含むことができる。到達性は、断片を配列決定し、それによって複数の配列決定リードを生成することによって判定することができる。断片は、例えば、ハイスループット配列決定技術によって配列決定をすることができる。本方法は、挿入酵素の配列挿入優先度に基づいて配列決定リードを標準化することをさらに含むことができる。配列決定されたリードの長さは、クロマチン状態の注釈を決定するために使用することもできる。
挿入酵素の到達を可能にするために、細胞試料を透過処理することができる。一部の場合には、細胞試料中の核は、透過処理の間、最小限に不安定化されてもよい。細胞試料は、限定されずにＮＰ４０、ジギトニン、トゥイーン、ストレプトリシンおよび／またはカチオン性脂質を含む透過処理剤を用いて透過処理することができる。細胞試料は、低張性ショックおよび／または超音波処理を用いて透過処理することもできる。
本方法は、特定部位の到達性に基づいて対象中の疾患状態を分析するステップをさらに含むことができ、ここで、細胞試料は対象から得られる。細胞試料および／またはポリヌクレオチドは複数の部分に分割することもでき、それらは任意選択で分子タグに基づいて分割することができる。本方法は、細胞試料の表現型を分析するステップをさらに含むことができる。一部の場合には、表現型は、部位の到達性と相関し得る。
挿入は、１つまたは複数の二価カチオンの添加によって促進することができる。一部の場合には、１つまたは複数の二価カチオンは、マグネシウムを含むことができる。一部の場合には、１つまたは複数の二価カチオンは、マンガンを含むことができる。
細胞試料は、一次供給源から得ることができる。細胞試料は、約５００，０００個未満の細胞から、または単一細胞からさえなることができる。ポリヌクレオチドは、複数の会合分子に結合することができる。会合分子は、ヒストンなどのタンパク質を含むことができる。挿入酵素は、トランスポザーゼであってもよい。一部の場合には、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼに由来してもよい。他の場合には、トランスポザーゼは、ＭｕＡトランスポザーゼに由来してもよい。さらなる場合には、トランスポザーゼは、Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼ（例えばＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）に由来してもよい。一部の場合には、分子タグは配列決定アダプターを含むことができ、それはバーコード標識をさらに含むことができる。バーコード標識は、ユニーク配列を含むことができる。他の場合には、分子タグは、蛍光タグを含むことができる。挿入酵素は親和性タグをさらに含むことができ、それは任意選択で、転写因子、修飾ヌクレオソームおよび／または修飾核酸に結合する抗体であってもよい。修飾核酸は、例えば、メチル化またはヒドロキシメチル化されたＤＮＡであってもよい。親和性タグは一本鎖の核酸であってもよく、それは任意選択で標的核酸に結合してもよい。挿入酵素は、核局在シグナルをさらに含むことができる。
本開示は、組成物も提供する。組成物は、ポリヌクレオチド、挿入酵素および挿入物エレメントを含むことができ、ここで、挿入物エレメントは、所定の配列を含む核酸を含み；挿入酵素は、親和性タグをさらに含む。組成物は、ポリヌクレオチド、挿入酵素および挿入物エレメントを含むこともでき、ここで、挿入酵素は２つ以上の酵素部分を含み；酵素部分は互いに連結している。親和性タグは、転写因子、修飾ヌクレオソームおよび／または修飾核酸に任意選択で結合することができる抗体であってもよい。修飾核酸は、例えば、メチル化またはヒドロキシメチル化されたＤＮＡであってもよい。親和性タグは一本鎖の核酸であってもよく、それは任意選択で標的核酸に結合してもよい。挿入物エレメントは挿入酵素に結合してもよく、挿入酵素はポリヌクレオチドに結合する。ポリヌクレオチドは、複数の会合分子にさらに結合することができる。会合分子は、例えばヒストンなどのタンパク質を含むことができる。
本開示は、キットをさらに提供する。キットは、以下を含むことができる：（ａ）細胞の集団から核を単離するための試薬；（ｂ）挿入酵素複合体、および（ｃ）トランスポザーゼ反応バッファー。一部の場合には、キットの構成要素は、反応バッファー、トランスポゾンタグおよびアダプターを核とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせることで、核を溶解してクロマチンを放出することおよびゲノムＤＮＡのタグ付き断片の生成の両方をもたらすように構成することができる。キットは、以下を含むこともできる：細胞溶解バッファー；親和性タグを含む挿入酵素；および、所定の配列を含む核酸を含む挿入物エレメント。キットは、以下をさらに含むことができる：細胞溶解バッファー；２つ以上の酵素部分を含み、酵素部分が互いに連結している挿入酵素；および（ｃ）挿入物エレメント。親和性タグは、転写因子、修飾ヌクレオソームおよび／または修飾核酸に任意選択で結合することができる抗体であってもよい。修飾核酸は、例えば、メチル化またはヒドロキシメチル化されたＤＮＡであってもよい。親和性タグは一本鎖の核酸であってもよく、それは任意選択で標的核酸に結合してもよい。
本教示のこれらおよび他の特徴は、本明細書に示される。
参照による組込み
この明細書で指摘される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
当業者は、下記の図は例示だけが目的であることを理解する。これらの図は、本教示の範囲を決して限定するものではない。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、オープンクロマチン状態の高感度の精密なプローブであることを示す図である。（ａ）ＡＴＡＣ−ｓｅｑ反応概略図。配列決定アダプター（赤および青色）を積んだトランスポザーゼ（緑色）は、オープンクロマチン（灰色のヌクレオソーム）の領域だけで挿入し、ＰＣＲ増幅することができる配列決定ライブラリー断片を生成する。（ｂ）オープンクロマチン分析のゲノムワイドな方法のおよその報告されたインプット材料および試料調製時間の必要条件。（ｃ）ＡＴＡＣ−ｓｅｑと、高い一致を提示しているＧＭ１２８７８リンパ芽球腫細胞の遺伝子座での他のオープンクロマチンアッセイとの比較。５００個のＦＡＣＳ選別細胞から、より低いＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックが生成された。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、クロマチン圧縮に関するゲノムワイドな情報を提供することを示す図である。（ａ）ＧＭ１２８７８核（赤）から生成されたＡＴＡＣ−ｓｅｑ断片サイズは、ヌクレオソームと一貫した空間頻度のクロマチン依存性周期性、ならびに２００ｂｐ未満の断片のＤＮＡヘリックスのピッチと一貫した高頻度周期性を示す。（はめ込み）対数変換ヒストグラムは、明らかな周期性が６つのヌクレオソームまで持続することを示す。（ｂ）以前に規定された７つのクラスのクロマチン状態のための標準化されたリード濃縮度。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、調節領域でのヌクレオソームの位置付けに関するゲノムワイドな情報を提供することを示す図である。（ａ）ヌクレオソームを含まないリードトラック、計算されたヌクレオソームトラック（方法）、ならびに比較のためのＤＮアーゼ、ＭＮａｓｅおよびＨ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ２Ａ．Ｚトラックを示す２つの転写開始点（ＴＳＳ）を含有する遺伝子座の例。（ｂ）全ての活性ＴＳＳ（ｎ＝６４，８３６）のために示されるＡＴＡＣ−ｓｅｑ（１９８，０００，０００個の対になったリード）およびＭＮａｓｅ−ｓｅｑ（参照２３からの４，０００，０００，０００個の単一末端リード）ヌクレオソームシグナル、ＴＳＳはＣＡＧＥ発現によって選別される。（ｃ）ＴＳＳはヌクレオソームを含まない断片のために濃縮され、−２、−１、＋１、＋２、＋３および＋４位置でＭＮａｓｅ−ｓｅｑによって見られるものに類似する段階的なヌクレオソームを示す。（ｄ）ＴＳＳおよび遠位部位（方法を参照する）でのヌクレオソームと結合する塩基対ヌクレオソームを含まない（ＮＦＲ）塩基の相対的な割合。（ｅ）到達可能なクロマチン内の最も近いヌクレオソーム二分子に関するＤＮＡ結合因子位置の階層的クラスタリングは、ＤＮＡ結合因子の異なるクラスを明らかにする。ヌクレオソームに強く結合した因子は、クロマチンリモデラーのために濃縮される。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、ゲノムワイドな因子占有率を分析することを示す図である。（ａ）ｃｈｒｌ上の特定座位のＡＴＡＣ−ｓｅｑおよびＤＮアーゼ−ｓｅｑデータで観察されたＣＴＣＦフットプリント。（ｂ）ゲノム内の結合部位の上で生成されたＣＴＣＦ（モチーフを示す）のための凝集ＡＴＡＣ−ｓｅｑフットプリント。（ｃ）ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータ、ＣＴＣＦモチーフの位置重量マトリックス（ＰＷＭ）スコアおよび進化上の保存（ＰｈｙｌｏＰ）から推測されたＣＴＣＦ予測結合確率。右端カラムはこのＧＭ１２８７８細胞系のためのＣＴＣＦ ＣｈｌＰ−ｓｅｑデータ（ＥＮＣＯＤＥ）であり、予測された結合確率との高い一致を実証する。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、リアルタイムの個別的エピゲノミクスを可能にすることを示す図である。（ａ）標準の採血からの作業の流れ。（ｂ）３日にわたる発端者Ｔ細胞からの連続ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータ。（ｃ）候補ＴＦ薬物標的に優先順位をつけるためのＡＴＡＣ−ｓｅｑデータ（緑色のトラック）の適用の例。ＦＤＡ認可の薬物の標的にすることができるサイトカイン遺伝子ＩＬ２に近位の同定されたＴＦ結合部位の中で、ＮＦＡＴだけが発端者Ｔ細胞にたずさわる。ＡＴＡＣ−ｓｅｑフットプリント予測は、公開されたＮＦＡＴ ＣｈｌＰ−ｓｅｑデータ（青色のトラック、参照３５からのデータ）との整列によって確認される。（ｄ）ＧＭ１２８７８のＢ細胞系と比較した発端者Ｔ細胞からの細胞型特異的調節ネットワーク。各列またはカラムは、ＴＦ対同じ細胞型の全ての他のＴＦのそれとのフットプリントプロファイルである。色は、Ｔ対Ｂ細胞における相対的な類似性（黄色）または特殊性（青色）を示す。ＮＦＡＴは、最も高度に差次的に調節されるＴＦ（赤色のボックス）の１つであるが、正規のＣＴＣＦ結合はＴおよびＢ細胞で本質的に類似している。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑのピーク強度は、ＤＮアーゼ−ｓｅｑのピーク強度とかなり相関することを示す図である。Ｄｕｋｅ ＤＮアーゼ−ｓｅｑ（６０×１０６個のリードにダウンサンプリングされた）、ＵＷＤＮアーゼ−ｓｅｑ（４０×１０６個のリード）およびＡＴＡＣ−ｓｅｑデータ（６０×１０６個の対末端リード）のピークは、ＺＩＮＢＡを使用して呼び出した（Ｒａｓｈｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１１ １２：Ｒ６７）。各データセットは異なるリード長を有するので、マッピング可能な領域内のピークについてフィルタリングすることを選択した（Ｄｕｋｅ ＤＮアーゼ−ｓｅｑ＝２０ｂｐリード、ＵＷ ＤＮアーゼ−Ｓｅｑ＝３６ｂｐリード、およびＡＴＡＣ−Ｓｅｑ＝対末端５０ｂｐリード）。以下についてｌｏｇ１０（リード強度）を比較した：（Ａ）Ｄｕｋｅ ＤＮアーゼ−ｓｅｑおよびＡＴＡＣ−ｓｅｑ、（Ｂ）ＵＷ ＤＮアーゼ−ｓｅｑおよびＡＴＡＣ−ｓｅｑ、ならびに（Ｃ）ＵＷ ＤＮアーゼ−ｓｅｑおよびＤｕｋｅ ＤＮアーゼ−ｓｅｑ。ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータの技術的再現性を、Ｄに示す。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、ＤＮアーゼ同定ピークの大きな割合を捕捉することを示す図である。全てのデータセットのために、ＺＩＮＢＡを使用してピークを呼んだ。ｖｅｎｎ−図は、各方法の間でのピークコールの重複部分を示す。下：大多数のＡＴＡＣ−ｓｅｑリードは、ＤｕｋｅおよびＵＷ ＤＮアーゼ−ｓｅｑピークと交差する強いピークである。ＡＴＡＣ−ｓｅｑ、ＵＷ ＤＮアーゼ−ｓｅｑおよびＤｕｋｅ ＤＮアーゼ−ｓｅｑから呼んだピークの中のリードの全割合、ならびにこれらのデータの交差部を示す。全ての３つの方法からの６５％を超えるリードは、３つの方法のピークの交差部で見出され、かなりステレオタイプな強力なピークが全ての方法によって検出されることを示唆する。表のセルの色は、リードの割合に比例する。 バックグラウンド領域のセットと比較したＧＭ１２８７８細胞におけるＤｕｋｅ ＤＮアーゼ、ＵＷ ＤＮアーゼおよびＦＡＩＲＥによって同定されたオープンクロマチン領域のセットと重複するリードの数のグラフであり、オープンクロマチン部位を検出するために必要とされたリードの深さを判定するために、５０ｋ、１００ｋ、５００ｋ、１０，０００，０００および５０，０００，０００個のリードを含む様々なリードの深さで感度および特異性を評価した。最下部のグラフは、出発材料として５００、５，０００または５０，０００個の細胞を使用して、ＧＭ１２８７８細胞でのＡＴＡＣ−ｓｅｑの性能を評価したことを示す。 ゲノムＤＮＡおよびクロマチンにおけるＴｎ５挿入の優先度を示す図である。ヌクレオチド頻度スコアは各塩基の観察されたヌクレオチド頻度を表し、ヌクレオチド頻度は１に標準化される。ｘ＝０の位置はリード開始を表し、点線はＴｎ５ダイマーの対称軸を表す。精製されたゲノムＤＮＡとヒトクロマチンの間でＴｎ５挿入優先度の実質的な差は見られず、クロマチンへの局所挿入優先度が裸のゲノムＤＮＡで見出されるものと同一であることを示唆する。これらの報告された配列優先度は、以前に報告されたものに類似する（主文参照１１）。 あらゆるＡＴＡＣ−ｓｅｑピークでの各特徴の１塩基あたりの平均強度のグラフである。全てのＥＮＣＯＤＥ ＣｈＩＰデータは、インプットに標準化した。データは、２００個のピークのスライドウィンドウを使用して処理した。 様々な細胞数のＡＴＡＣ−ｓｅｑを示す図である。ＡＴＡＣ−ｓｅｑのための異なる出発数の細胞からのデータの代表的ＵＣＳＣゲノムブラウザートラック。この同じ遺伝子座は、主文の図１ｂでも示す。順に：ＦＡＣＳを用いて５００個の細胞を単離し、細胞培養物からの単純な希釈によって２反復の５００個の細胞および５，０００個の細胞を行った。比較のために、最下部のトラックは５０，０００個の細胞を表し、図１ｂにも示す。この図は、わずか５００個の細胞からオープンクロマチン部位を捕捉することができることを実証する。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑ断片サイズ分布にヌクレオソームピークをフィッティングして、ヌクレオソーム占有率測定を可能にすることを示す図である。観察された断片分布を、オープンＤＮＡを起源とすることが予想されるリード、および１つ、２つまたは３つの推定上のヌクレオソームにわたるリードの４つの集団に分割した。データのこの分割を可能にするために、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ断片分布を、１）１ヌクレオソーム未満の挿入物サイズでの断片分布パターンの指数関数、ならびに２）１つ、２つ、３つ、４つおよび５つのヌクレオソームからの保護から生じる分布への５つのガウス曲線の合計にフィッティングした。これらのフィットの合計が示され（黒色点線）、観察された断片分布（青色線）に類似している。縦の点線は、無ヌクレオソーム（＜１００ｂｐ）、１ヌクレオソーム、２ヌクレオソームおよび３ヌクレオソーム領域を起源とするものと断片を同定するための境界である。我々のフィットによって規定されるように、断片の＜１０％が近隣を起源とすることを確実とするために点線を設定した。 ＧＭ１２８７８細胞でＡＴＡＣ−ｓｅｑによって検出された転写因子フットプリントの選ばれたセットを示す図である。指示された転写因子について、対応するモチーフに一致する部位のゲノムワイドなセットでのＣＥＮＴＩＰＥＤＥを使用して、ＡＴＡＣ−ｓｅｑリードの集合シグナルを計算した。リードは、モチーフ境界から＋／−１００ｂｐ領域内で計算した。縦の破線は、モチーフの境界を示す。 ＣＥＮＴＩＰＥＤＥによるＡＴＡＣ−ｓｅｑおよびＤＮアーゼフットプリンティングを用いたＣＴＣＦ結合部位の予測を示す図である。ＣＴＣＦ結合部位の予測は、ＣＥＮＴＩＰＥＤＥによって報告される後部確率によって選別されたＣＴＣＦのモチーフのゲノムワイドなセットを用いて評価した。それらの重複するＣＴＣＦ ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークは正のセットとして使用し、他の全ては負のセットと考えた。これは０．９２の曲線下面積（ＡＵＣ）を与え、それは、ＣＴＣＦのための特異的で高感度の結合推量を示唆する。Ｄｕｋｅ ＤＮアーゼおよびＵＷ ＤＮアーゼデータはＣＥＮＴＩＰＥＤＥと同じ設定で使用し、ＲＯＣグラフを示す。ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータは１９８×１０６個の対のリードからなり、Ｄｕｋｅ ＤＮアーゼは２４５×１０６個のリードを含み、ＵＷ ＤＮアーゼは４８×１０６個のリードを含んだ。 Ｔ細胞特異的ＮＦＡＴ調節を示す図である。ＡＴＡＣ−ｓｅｑによって予測され、ＮＦＡＴ ＣｈＩＰ−ｓｅｑとの整列によって確認されたＴ細胞特異的ＮＦＡＴ標的遺伝子の例（主文参照３５からのデータ）。 ヒト血液からのＦＡＣＳ精製細胞集団のＡＴＡＣ−ｓｅｑを示す図である。（Ａ）標準の採血から、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ１４＋単球を精製するために、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用した。各集団は良好なＡＴＡＣ−ｓｅｑデータ（Ｂ）を生成し、公知の系統特異的遺伝子で細胞型特異的オープンクロマチン部位を明らかにした。 ＡＴＡＣ−ｓｅｑによるＧＭ１２８７８細胞での対立遺伝子特異的オープンクロマチンの検出を示す図である。公開されている変異体データを使用して、推定上のヘテロ接合遺伝子座のオープンクロマチン領域での対立遺伝子頻度を測定した。偽のヘテロ接合部位の潜在性のために、対立遺伝子のヘテロ接合を検証するために２つを超えるリードを必要とした。赤点（ｎ＝１６７）はｐ＜１０−５での候補対立遺伝子特異的オープンクロマチン部位であるが、灰色（ｎ＝９００）はｐ＜０．０１での候補を表す。ｐ値は、Ａｕｄｉｃら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９７ ７、９８６〜９９５頁）によって開発されたベイズモデルを用いて計算した。 トランスポザーゼは、オープンクロマチン染色の役割をすることができることを示す図である。蛍光標識ＤＮＡアダプターをＴｎ５トランスポザーゼに加えることによって、緑色で示す転移事象は主に核に局在化され、高次組織と一貫した点状パターンを示す。 単一の核（青色）からの単一細胞ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータは、５０，０００個の細胞と比較してオープンクロマチンのゲノムワイドの予想された位置に明らかなピークを示すことを示す図である。 単一細胞挿入物長分布は、ヌクレオソームの存在のために周期性を示す５０，０００個の細胞からのものに一致することを示す図である。
定義
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するかまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料が記載されている。
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、そのような特許および刊行物の中で開示される全ての配列を含めて、参照により明示的に組み込まれる。
数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。特に明記しない限り、核酸は左から右に５’から３’の向きで、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシの向きでそれぞれ記述される。
本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、これ以降に定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本明細書で使用される用語の多くの一般的意味を当業者に提供する。なお、明瞭性および参照の容易さのために、特定の用語が下で定義される。
本明細書で用いられる用語「試料」は、１つまたは複数の対象分析物を一般的に含有する材料または材料の混合物に関する。一実施形態では、その最も広い意味で用いられる本用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する任意の植物、動物またはウイルスの材料、例えば個体から（限定せずに血漿、血清、脳脊髄液、リンパ、涙、唾液および組織切片を含む）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養物構成成分から単離される組織または流体、ならびに環境からの試料を指す。
本明細書で用いる用語「核酸試料」は、核酸を含有する試料を表す。本明細書で使用される核酸試料は、それらが配列を含有する複数の異なる分子を含有するという点で複合体であってもよい。哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）からのゲノムＤＮＡ試料は、複合試料の種類である。複合試料は、約１０４、１０５、１０６または１０７、１０８、１０９または１０１０個を超える異なる核酸分子を有することができる。ＤＮＡ標的は、任意の供給源、例えばゲノムＤＮＡまたは人工ＤＮＡ構築物を起源とすることができる。核酸、例えば組織培養細胞からのゲノムＤＮＡを含有する任意の試料、または組織の試料を本明細書で用いることができる。
本明細書で用いる用語「混合物」は、散在しており、特定の順序ではない要素の組合せを指す。混合物は不均一であり、その異なる構成要素に空間的に分離できない。要素の混合物の例には、同じ水溶液中に溶解しているいくつかの異なる要素、およびランダムな位置で（すなわち、特に決まった順序でなく）固体支持体に結合しているいくつかの異なる要素が含まれる。混合物は、アドレス可能でない。例によって説明すると、当技術分野で公知であるように、空間的に分離された表面結合ポリヌクレオチドのアレイは、表面結合ポリヌクレオチドの種が空間的に別個であり、アレイがアドレス可能であるので、表面結合ポリヌクレオチドの混合物でない。
用語「ヌクレオチド」は、公知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含有する部分を含むものとする。そのような修飾には、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオチド」にはハプテンまたは蛍光標識を含有する部分が含まれ、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含む。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドには、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられるか、エーテル、アミンなどとして官能基化される、糖部分の修飾も含まれる。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される、任意の長さ、例えば約２塩基を超える、約１０塩基を超える、約１００塩基を超える、約５００塩基を超える、１０００塩基を超える、１０，０００塩基を超える、１００，０００塩基を超える、約１，０００，０００塩基を超える、最高約１０１０塩基またはそれ以上の長さのポリマーを記載するために互換的に使用され、酵素でまたは合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号およびその中の引用文献に記載されるＰＮＡ）、それは２つの天然に存在する核酸のそれに類似した配列特異的方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン−クリック型塩基対相互作用に関与することができる。天然に存在するヌクレオチドには、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシル（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、ＴおよびＵ）が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡはデオキシリボースおよびリボース糖骨格をそれぞれ有するが、ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結している反復するＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成される。ＰＮＡでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結している。しばしば到達不可能なＲＮＡと呼ばれるロック核酸（ＬＮＡ）は、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分の橋で修飾される。橋は３’−エンド（北）コンホメーションでリボースを「ロック」し、それはＡ形二重鎖でしばしば見出される。所望のときはいつでも、ＬＮＡヌクレオチドはオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合することができる。用語「非構造化核酸」または「ＵＮＡ」は、低い安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造化核酸はＧ’残基およびＣ’残基を含有することができ、ここで、これらの残基は、低い安定性で互いに塩基対を形成するが、天然に存在するＣおよびＧの残基とそれぞれ塩基対を形成する能力を保持する、ＧおよびＣの天然に存在しない形、すなわち類似体に対応する。非構造化核酸は、ＵＮＡの開示のために参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５０２３３３４０に記載されている。
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが約２から２００ヌクレオチド、最大で５００ヌクレオチドであるヌクレオチドの一本鎖の多量体を表す。オリゴヌクレオチドは合成であってもよく、または酵素で作製されてもよく、一部の実施形態では、長さが３０から１５０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよい）またはデオキシリボヌクレオチドモノマー、またはリボヌクレオチドモノマーおよびデオキシリボヌクレオチドモノマーの両方を含有することができる。オリゴヌクレオチドは、長さが例えば、１０から２０、２１から３０、３１から４０、４１から５０、５１から６０、６１から７０、７１から８０、８０から１００、１００から１５０または１５０から２００ヌクレオチドであってもよい。
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二重鎖を形成した結果として核酸合成の開始点として働くことができ、および伸長した二重鎖が形成されるように、鋳型に沿ってその３’末端から伸長させることが可能である、天然のまたは合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。伸張過程で加えられるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長する。プライマーは一般にプライマー伸長生成物の合成でのそれらの使用に適合する長さであり、通常長さが８から１００ヌクレオチドの範囲、例えば１０から７５、１５から６０、１５から４０、１８から３０、２０から４０、２１から５０、２２から４５、２５から４０などである。一般的なプライマーは、１０〜５０ヌクレオチドの範囲内の長さ、例えば１５〜４５、１８〜４０、２０〜３０、２１〜２５など、および明記された範囲の間の任意の長さであってもよい。一部の実施形態では、プライマーは、通常長さが約１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０ヌクレオチド以下である。
プライマーは増幅の最大効率のために通常一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖である場合は、伸張生成物を調製するために使用する前にその鎖を切り離すために、プライマーは通常先に処理される。この変性ステップは熱によって一般的に実行されるが、代わりにアルカリを使用して実行することができ、その後中和される。したがって、「プライマー」は鋳型に相補的であり、鋳型との水素結合またはハイブリダイゼーションによって複合体を形成して、ポリメラーゼによる合成の開始のためにプライマー／鋳型複合体を与え、それはＤＮＡ合成過程で鋳型に相補的なその３’末端に連結している共有結合した塩基の添加によって伸長する。
用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」は、正常なハイブリダイゼーション条件の下で核酸鎖の領域が第２の相補的な核酸鎖にアニールして、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖の安定した二重鎖を形成し、無関係な核酸分子とは同じ正常なハイブリダイゼーション条件の下で安定した二重鎖を形成しない過程を指す。ハイブリダイゼーション反応で２つの相補的な核酸鎖領域をアニールすることによって、二重鎖の形成は達成される。その２本の核酸鎖が実質的または完全に相補的である特定の配列の特定数のヌクレオチドを含有しない限り、２本の核酸鎖が安定した二重鎖、例えば正常なストリンジェンシー条件の下で二本鎖の領域を保持する二重鎖を形成しないように、ハイブリダイゼーション反応が起こるハイブリダイゼーション条件の調整によって、ハイブリダイゼーション反応を高度に特異的にすること（しばしばハイブリダイゼーションストリンジェンシーと呼ばれる）ができる。「正常なハイブリダイゼーションまたは正常なストリンジェンシー条件」は、任意の所与のハイブリダイゼーション反応のために容易に判定される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照。本明細書で用いるように、用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合する任意の過程を指す。
その２つの配列が中等度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の下で互いに特異的にハイブリダイズするならば、核酸は参照核酸配列と「選択的にハイブリダイゼーションが可能である」と考えられる。中等度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。高いストリンジェンシー条件の１つの例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性担体ＤＮＡ中で約４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、室温での２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳによる２回の洗浄と４２℃での０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳによる２回の追加の洗浄を含む。
本明細書で用いる用語「二重」または「二重になった」は、塩基対を形成した、すなわち互いにハイブリダイズした２つの相補的ポリヌクレオチド領域を記載する。
本明細書で用いる用語「増幅する」は、鋳型核酸の片方または両方の鎖に相補的である核酸分子を合成する過程を指す。核酸分子を増幅することは、鋳型核酸を変性させること、プライマーの融点より低い温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、および酵素によってプライマーから伸長させて増幅生成物を生成することを含むことができる。変性、アニーリングおよび伸長ステップの各々は、１回または複数回実施することができる。ある特定の場合には、増幅生成物の量が増加、しばしば指数関数的に増加するように、変性、アニーリングおよび伸長ステップは複数回実施されるが、指数関数的な増幅は本方法によって必要とされない。増幅は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素ならびにポリメラーゼ酵素の最適な活性のために適当なバッファーおよび／または補因子の存在を一般的に必要とする。用語「増幅生成物」は、本明細書に規定される増幅工程から生成される核酸を指す。
用語「判定する」、「測定する」、「評価する」、「調査する」、「試験する」および「分析する」は本明細書において互換的に使用されて任意の形の測定を指し、ある要素が存在するかどうかについて判定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的測定を含む。調査することは、相対的または絶対的であってもよい。「存在を調査すること」は、存在物の量を判定することに加えて、それが存在するかまたは不在であるか判定することを含む。
用語「使用する」はその従来の意味を有し、このように、目的を達成するための方法または組成物を用いること、例えば供用することを意味する。例えば、ファイルを作製するためにプログラムが使用される場合、プログラムはファイルを作製するために実行され、ファイルは通常プログラムのアウトプットである。別の例では、コンピュータファイルが使用される場合、それは通常アクセスされ、読み出され、ファイルに保存されている情報が用いられて目的が達成される。同様に、特異識別子、例えばバーコードが使用される場合は、通常、例えば特異識別子に関連したオブジェクトまたはファイルを識別するために特異識別子が読み出される。
本明細書で用いるように、用語「ライゲーションする」は、第１のＤＮＡ分子の５’末端の末端ヌクレオチドと第２のＤＮＡ分子の３’末端の末端ヌクレオチドとの、酵素によって触媒される連結を指す。
「複数」は、少なくとも２つのメンバーを含む。ある特定の場合には、複数は、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個または少なくとも１０９個またはそれ以上のメンバーを有することができる。
２つの核酸が「相補的である」ならば、それらは高ストリンジェンシー条件の下で互いにハイブリダイズする。用語「完全に相補的である」は、核酸の１つの各塩基が他の核酸の相補的ヌクレオチドと塩基対を形成する二重鎖を記載するために使用される。多くの場合には、相補的である２つの配列は、少なくとも１０個、例えば少なくとも１２個または１５個の相補性のヌクレオチドを有する。
「オリゴヌクレオチド結合部位」は、標的ポリヌクレオチドにおいてオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする部位を指す。オリゴヌクレオチドがプライマーのために結合部位を「提供する」ならば、プライマーはそのオリゴヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズすることができる。
本明細書で用いられる用語「鎖」は、共有結合、例えばホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドで構成される核酸を指す。細胞では、ＤＮＡは通常二本鎖の形で存在し、このように、本明細書において「トップ」および「ボトム」鎖と呼ばれる２つの相補的な核酸鎖を有する。ある特定の場合には、染色体領域の相補鎖は、「プラス」および「マイナス」鎖、「第１」および「第２」の鎖、「コード」および「非コード」鎖、「ワトソン」および「クリック」鎖または「センス」および「アンチセンス」鎖と呼ぶことができる。トップまたはボトム鎖への鎖の帰属は恣意的であり、いかなる特定の配向、機能または構造も意味しない。いくつかの例示的な哺乳動物の染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリー、染色体など）の第１の鎖のヌクレオチド配列が公知であり、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる。
本明細書で用いる用語「トップ鎖」は、核酸の両方の鎖でなく核酸のいずれかの鎖を指す。オリゴヌクレオチドまたはプライマーが「トップ鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１つの鎖だけに結合し、他には結合しない。本明細書で用いる用語「ボトム鎖」は、「トップ鎖」に相補的である鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「１つの鎖だけに」結合またはアニールするとき、それは１つの鎖だけ、例えば第１または第２の鎖だけに結合し、他の鎖には結合しない。
本明細書で用いる用語「配列決定」は、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続的なヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００個またはそれ以上の連続的なヌクレオチドの同一性）が得られる方法を指す。
用語「次世代配列決定」または「ハイスループット配列決定」は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＲｏｃｈｅなどによって現在用いられる、いわゆる並行化された合成による配列決定またはライゲーションによる配列決定プラットホームを指す。次世代配列決定方法は、ナノポア配列決定方法または電子検出に基づく方法、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術またはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商品化された単一分子蛍光に基づく方法を含むこともできる。
本明細書で用いる用語「バーコード配列」または「分子バーコード」は、ａ）反応でのポリヌクレオチドの供給源を同定および／もしくは追跡すること、ならびに／またはｂ）初期分子が何回配列決定されたかカウントすること（例えば、試料中の実質的にあらゆる分子が異なる配列で標識され、その後試料が増幅される場合）のために使用されるヌクレオチドのユニーク配列を指す。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端または中間にあってもよい。バーコード配列はサイズおよび組成が広く異なってもよい。以下の参考文献は、特定の実施形態に適当なバーコード配列のセットを選択するための指針を提供する：Ｂｒｅｎｎｅｒ、米国特許第５，６３５，４００号；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９７：１６６５〜１６７０頁（２０００）；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４：４５０〜４５６頁（１９９６）；Ｍｏｒｒｉｓら、欧州特許出願公開第０７９９８９７Ａ１号；Ｗａｌｌａｃｅ、米国特許第５，９８１，１７９号など。特定の実施形態では、バーコード配列は、４から３６ヌクレオチド、または６から３０ヌクレオチド、または８から２０ヌクレオチドの範囲の長さを有することができる。
用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、細胞ではなく容器内で単離された構成要素と起こる反応を指す。
標的核酸分子の長さに沿って分配される切断部位との関連で、用語「分配される」は、標的核酸分子の長さに沿って別のものから間隔を置いて配置される挿入を指す。全ての挿入が同じ量によって間隔をあけられる必要があるとは限らない。むしろ、挿入間の間隔は、ランダムであるか、セミランダムであるか、またはランダムでなくてもよい。
本明細書で用いる用語「クロマチン」は、真核細胞の核で見出されるような、タンパク質およびポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む分子の複合体を指す。クロマチンは、ヌクレオソームを形成するヒストンタンパク質、ゲノムＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに一般に結合している他のＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）で一部構成される。
本明細書で用いる用語「処理すること」は、反応、例えば切断をもたらす条件（例えば、適する温度、時間および条件）の下で組み合わせることを指す。
本明細書で用いる用語「細胞の集団から単離されたクロマチン」は、利用可能にさせられるクロマチン源を指す。単離された核（溶解してクロマチンを生成することができる）ならびに単離されたクロマチン（すなわち、溶解核の生成物）は、両方とも細胞の集団から単離された形のクロマチンであると考えられる。
本明細書で用いる用語「転写因子」は、遺伝子発現レベルを調節するために単独で、または少なくとも１つの他のポリペプチドと一緒に作用することができる任意のポリペプチドを指す。本用語には、限定されずに、ＤＮＡ配列に直接に結合するポリペプチドが含まれる。転写因子は、発現レベルを増加または抑制することができる。転写因子の例には、限定されずに、Ｍｙｃ／Ｍａｘ、ＡＰ−１（Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、ＡＴＦ）、ＣＲＥＢ、ＳＭＡＤ、ＨＩＦ、ＥＴＳ、ＥＲＧ、ＥＬＫ、ＳＴＡＴ、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、糖コルチコイド受容体（ＧＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ＮＦκＢ、ｐ５３、ＯＣＴ、ＳＯＸおよびＰＡＸが含まれる。転写因子は、配列分析によって同定される転写因子、または転写因子として以前に特徴付けられていない天然に存在する読み枠配列であってもよい。ポリペプチドは、人工的に生成された、または化学的にもしくは酵素で修飾されたポリペプチドであってもよい。
本明細書で用いる用語「挿入酵素複合体」は、ポリヌクレオチドと合わされて断片化してアダプターをポリヌクレオチドに加える、挿入酵素および２つのアダプター分子（「トランスポゾンタグ」）を含む複合体を指す。そのような系は、Ｃａｒｕｃｃｉｏ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１ ７３３：２４１〜５５頁）、およびＵＳ２０１００１２００９８を含む様々な刊行物に記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いる用語「タグ付きの断片」は、タグを付けられたポリヌクレオチド断片を指す。
本明細書で用いる用語「領域」は、生物のゲノム中のヌクレオチドの連続した長さを指す。染色体領域は、１ｂｐから染色体全長の範囲内であってもよい。ある場合には、領域は、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１０ｋｂまたは少なくとも１００ｋｂまたはそれ以上（例えば、最高１Ｍｂまたは１０Ｍｂまたはそれ以上）の長さを有することができる。ゲノムは、任意の真核生物に由来するもの、例えば動物または植物のゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類または昆虫のゲノムであってもよい。
本明細書で用いる用語「エピジェネティックマップ」は、エピジェネティックな特徴、例えば、ヌクレオソームの部位、無ヌクレオソーム領域、転写因子の結合部位などの任意の表示を指す。マップは、例えばコンピュータモニターに物理的に提示することができる。例示的なエピジェネティックマップは、図１Ｃ、３Ａ、４Ａ、４Ｂ、５Ｂおよび５Ｃに示す。
本明細書で用いる用語「マッピング情報」は、ある領域に関して実験的に得られた情報をその領域の物理的マップに組み立てることを指す。
本明細書で用いる用語「配列リード存在量」は、特定の配列またはヌクレオチドが配列リードの集合で観察される回数を指す。
本明細書で用いる用語「無ヌクレオソーム断片」は、ヌクレオソームが比較的枯渇しているかまたは欠けている、すなわちヌクレオソーム間のゲノムＤＮＡの断片を指す。
本明細書で用いる用語「クロマチン到達性」は、ポリヌクレオチド内で、例えばゲノムＤＮＡ内で核酸部位がどの程度到達可能であるか、すなわちクロマチンがどの程度「オープン」であるかを指す。ポリペプチド、例えばヌクレオソーム中のゲノムＤＮＡに関連した核酸部位は、通常到達不可能である。ポリペプチド、例えばヌクレオソーム間のゲノムＤＮＡと複合体を形成していない核酸部位は、一般に到達可能である（転写因子および他のＤＮＡ結合タンパク質と複合体を形成した核酸部位を除く）。
本明細書で用いる用語「ＤＮＡ結合タンパク質占有率」は、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質のための結合部位（例えば、転写因子のための結合部位）がＤＮＡ結合タンパク質によって占められているかどうかを指す。ＤＮＡ結合タンパク質占有率は、定量的または定性的に測定することができる。
本明細書で用いる用語「全体的占有率」は、ゲノム全体に分配されているＤＮＡ結合タンパク質のための複数の異なる結合部位（例えば、転写因子のための結合部位）がＤＮＡ結合タンパク質に結合しているかどうかを指す。ＤＮＡ結合タンパク質占有率は、定量的または定性的に測定することができる。
本明細書で用いる用語「診断」は、対象が特定の疾患または状態を有するかどうかの判定を指す。
本明細書で用いる用語「予後診断」は、臨床転帰、例えば疾患再発、疾患からの回復、死亡の予測、ならびに特定の疾患または状態を有する対象が特定の処置に対してどのように応答するかについての予測を指す。
他の用語の定義は、明細書全体で出現する。
一態様では、クロマチンを分析するための方法が提供される。ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）細胞の集団から単離されたクロマチンを挿入酵素複合体で処理してゲノムＤＮＡのタグ付き断片を生成するステップを含む。このステップでは、クロマチンのオープン領域でゲノムＤＮＡを切断して断片の両末端にアダプターを加える、Ｔｎ５またはＭｕＡなどの挿入酵素を使用して、クロマチンはタグメント（tagment）される（すなわち、同じ反応で切断され、タグを付けられる）。単離されたゲノムＤＮＡをタグメントする方法は当技術分野で公知であり（例えば、Ｃａｒｕｃｃｉｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１ ７３３：２４１〜５５頁；Ｋａｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１３ １１０：５５５２〜７頁；Ｍａｒｉｎｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ ７７：８０７１〜９およびＵＳ２０１００１２００９８を参照）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および他の販売会社から市販されている。そのような系は、本明細書での使用のために容易に応用することができる。一部の場合には、クロマチンへの挿入の望ましいレベルを得るように条件を調整することができる（例えば、オープン領域で平均して５０から２００塩基対ごとに起こる挿入）。本方法で使用するクロマチンは、任意の適する方法によって作製することができる。一部の実施形態には、核を単離、溶解すること、およびクロマチンを例えば核膜からさらに精製することができる。他の実施形態では、単離された核を反応バッファーと接触させることによってクロマチンを単離することができる。これらの実施形態では、単離された核は、それが挿入酵素複合体によるクロマチンへの到達を可能にする反応バッファー（挿入酵素複合体および他の必要な試薬を含む）と接触するときに溶解することができる。これらの実施形態では、本方法は、細胞の集団から核を単離すること；ならびに単離した核をトランスポザーゼおよびアダプターと組み合わせることを含むことができ、組み合わせることで、核を溶解して前記クロマチンを放出することおよびゲノムＤＮＡのアダプタータグ付き断片の生成の両方をもたらす。クロマチンは、他の方法（例えば、ＣｈＩＰ−ＳＥＱ方法）におけるように、架橋を必要としない。
クロマチンが断片化され、タグ付けされてゲノムＤＮＡのタグ付き断片を生成した後、アダプタータグ付き断片の少なくともいくつかが配列決定をされて複数の配列リードを生成する。断片は、任意の都合のよい方法を用いて配列決定をすることができる。例えば、断片は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター方法、Ｒｏｃｈｅのピロシークエンシング方法（４５４）、ライゲーションによるＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの配列決定（ＳＯＬｉＤプラットホーム）またはＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットホームを使用して配列決定をすることができる。そのような方法の例は、以下の参考文献に記載される：Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３７：３７６〜８０頁）；Ｒｏｎａｇｈｉら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ ２４２：８４〜９頁）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５ ３０９：１７２８〜３２頁）；Ｉｍｅｌｆｏｒｔら（Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９ １０：６０９〜１８頁）；Ｆｏｘら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９〜１０８頁）；Ａｐｐｌｅｂｙら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９〜３９頁）およびＭｏｒｏｚｏｖａら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８ ９２：２５５〜６４頁）、これらはステップの各々のための全ての出発製品、ライブラリー調製の方法、試薬および最終生成物を含む方法および方法の特定のステップの一般記載のために参照により組み込まれる。明らかになるように、選択された次世代配列決定プラットホームに適合するフォワードおよびリバース配列決定プライマー部位は、増幅ステップ中に断片の末端に加えることができる。ある特定の実施形態では、断片は断片に加えられたタグとハイブリダイズするＰＣＲプライマーを用いて増幅することができ、ここで、ＰＣＲのために使用するプライマーは特定の配列決定プラットホームに適合する５’テールを有する。ある特定の場合には、配列決定の前に異なるプールを一緒にプールすることができ、バーコード配列を使用して配列リードを特定の試料までたどることができるように、使用するプライマーは分子バーコード（「指標」）を含有することができる。
別の態様では、本開示は、そのポリヌクレオチドが細胞試料に由来するある部位のポリヌクレオチドの到達性を判定するための方法を提供し、前記方法は、挿入酵素で複数の分子タグをポリヌクレオチドに挿入するステップ、および分子タグを使用してその部位での到達性を判定するステップを含む。細胞試料は、一次供給源からであってもよい。細胞試料は、単一細胞からなることができる。細胞試料は、有限数の細胞（例えば約５００，０００細胞未満）からなることができる。
本方法は、判定された到達性を使用して、その部位でポリヌクレオチドに結合している１つまたは複数のタンパク質を同定するステップをさらに含むことができる。一部の場合には、タンパク質の少なくとも１つは転写因子である。さらに、本方法は、分子タグを使用してポリヌクレオチドの到達性マップを生成するステップを含むことができる。
ポリヌクレオチドは、分子タグの挿入中に複数の断片に断片化することができる。一部の場合には、断片は増幅することができる。一部の場合には、断片は、複数の配列決定リードを生成するために配列決定をすることができる。任意の所与の部位でのポリヌクレオチドの到達性を判定するために、これを使用することができる。断片は、ハイスループット配列決定技術を用いて配列決定をすることができる。一部の場合には、配列決定リードは、挿入酵素の配列挿入優先度に基づいて標準化することができる。配列決定されたリードの長さは、クロマチン状態の注釈(annotation)を決定するために使用することができる。
ポリヌクレオチドは、複数の会合分子に結合することができる。会合分子は、例えば、タンパク質、核酸またはサッカライドであってもよい。一部の場合には、会合分子は、ヒストンを含むことができる。他の場合には、会合分子は、アプタマーを含むことができる。
挿入酵素は、核酸配列をポリヌクレオチドに挿入することが可能な任意の酵素であってもよい。一部の場合には、挿入酵素は、実質的に配列非依存性の方法で、核酸配列をポリヌクレオチドに挿入することができる。挿入酵素は、原核生物または真核生物のものであってもよい。挿入酵素の例には、限定されずに、トランスポザーゼ、ＨＥＲＭＥＳおよびＨＩＶインテグラーゼが含まれる。トランスポザーゼは、Ｔｎトランスポザーゼ（例えばＴｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ１０、Ｔｎ５５２、Ｔｎ９０３）、ＭｕＡトランスポザーゼ、Ｖｉｂｈａｒトランスポザーゼ（例えばＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉから）、Ａｃ−Ｄｓ、Ａｓｃｏｔ−１、Ｂｓ１、Ｃｉｎ４、Ｃｏｐｉａ、Ｅｎ／Ｓｐｍ、Ｆ因子、ｈｏｂｏ、Ｈｓｍａｒ１、Ｈｓｍａｒ２、ＩＮ（ＨＩＶ）、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５、ＩＳ６、ＩＳ１０、ＩＳ２１、ＩＳ３０、ＩＳ５０、ＩＳ５１、ＩＳ１５０、ＩＳ２５６、ＩＳ４０７、ＩＳ４２７、ＩＳ６３０、ＩＳ９０３、ＩＳ９１１、ＩＳ９８２、ＩＳ１０３１、ＩＳＬ２、Ｌ１、Ｍａｒｉｎｅｒ、Ｐ因子、Ｔａｍ３、Ｔｃ１、Ｔｃ３、Ｔｅｌ、ＴＨＥ−１、Ｔｎ／Ｏ、ＴｎＡ、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ１０、Ｔｎ５５２、Ｔｎ９０３、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、ＴｎｌＯ、Ｔｙｌ、任意の原核生物のトランスポザーゼ、または上に掲載のものに関連および／または由来する任意のトランスポザーゼであってもよい。ある特定の場合には、親のトランスポザーゼに関連および／または由来するトランスポザーゼは、親トランスポザーゼの対応するペプチド断片と少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％のアミノ酸配列相同性を有するペプチド断片を含むことができる。ペプチド断片は、長さが少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約４００または約５００アミノ酸であってもよい。例えば、Ｔｎ５に由来するトランスポザーゼは、長さが５０アミノ酸であり、親Ｔｎ５トランスポザーゼの対応する断片に約８０％相同的であるペプチド断片を含むことができる。一部の場合には、挿入は、１つまたは複数のカチオンの添加によって促進および／または誘発することができる。カチオンは、二価のカチオン、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋であってもよい。
分子タグは、配列決定アダプター、ロック核酸（ＬＮＡ）、ジップ（zip）核酸（ＺＮＡ）、ＲＮＡ、親和性反応性分子（例えばビオチン、ディグ（dig））、自己相補的分子、ホスホロチオエート修飾、アジドまたはアルキン基を含むことができる。一部の場合には、配列決定アダプターは、バーコード標識をさらに含むことができる。さらに、バーコード標識は、ユニーク配列を含むことができる。ユニーク配列は、個々の挿入事象を同定するために使用することができる。タグのいずれも、蛍光タグ（例えばフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、チアゾールオレンジなど）をさらに含むことができる。
さらに、挿入酵素は、親和性タグをさらに含むことができる。一部の場合には、親和性タグは抗体であってもよい。抗体は、例えば、転写因子、修飾ヌクレオソームまたは修飾核酸に結合することができる。修飾核酸の例には、限定されずに、メチル化またはヒドロキシメチル化されたＤＮＡが含まれる。他の場合には、親和性タグは一本鎖の核酸（例えばｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ）であってもよい。一部の例では、一本鎖の核酸は、標的核酸に結合することができる。さらなる場合には、挿入酵素は、核局在化シグナルをさらに含むことができる。
一部の場合には、細胞試料は、挿入酵素の到達を可能にするために透過処理されてもよい。透過処理は、細胞試料中の核を最小限に不安定化する方法で実施することができる。ある場合には、細胞試料は、透過処理剤を用いて透過処理することができる。透過処理剤の例には、限定されずにＮＰ４０、ジギトニン、トゥイーン、ストレプトリシンおよびカチオン性脂質が含まれる。他の例では、細胞試料は低張性ショックおよび／または超音波処理を用いて透過処理することができる。他の場合には、挿入酵素は高度に荷電させることができ、そのことはそれが細胞膜を透過することを可能にする。
さらに別の態様では、本開示は、細胞試料からのポリヌクレオチドの三次元構造を分析するための方法であって、挿入酵素で複数の分子タグをポリヌクレオチドに挿入するステップ；および分子タグを使用してポリヌクレオチドの三次元構造を分析するステップを含む方法を提供する。挿入酵素は２つ以上の酵素部分を含むことができ、それらは任意選択で互いに連結することができる。酵素部分は、任意の適する化学合成またはバイオコンジュゲーション方法を用いて連結することができる。例えば、酵素部分は、エステル／アミド結合、マレイミドへのチオール付加、Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＮＣＬ）技術、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（すなわちアルキン−アジド対）またはビオチン−ストレプトアビジン対を通して連結することができる。一部の場合には、酵素部分の各々は、共通配列をポリヌクレオチドに挿入することができる。共通配列は、共通バーコードを含むことができる。酵素部分は、トランスポザーゼまたはその誘導体を含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、挿入中に複数の断片に断片化することができる。共通バーコードを含む断片は、ポリヌクレオチドの三次元構造で近接していると判定することができる。
ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、ヒストンなどのタンパク質にさらに結合することができ、任意選択でクロマチンの形にパッケージされてもよい。特定の場合には、ゲノムの１つまたは複数の領域（例えば、２つ以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、最高１，０００個またはそれ以上の領域）に対応するＤＮＡ断片は、配列決定の前にハイブリダイゼーションによって濃縮する、すなわち選択することができる。これらの実施形態では、ライブラリー全体を配列決定する必要はない。選択される領域（選択ステップが実施された場合）の所望の結果および長さに従い、方法のこのステップは、少なくとも１，０００個の配列決定（例えば、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも１０６、少なくとも５×１０６、最高１０７個またはそれ以上の配列決定リード）をもたらすことができる。配列リードは、コンピュータメモリに一般に保存される。
本方法の一部の実施形態は、細胞のゲノムの領域のエピジェネティックマップを作製することを含む。配列リードから得られた情報を領域にマッピングすることによって、このステップを実行することができる。これらの実施形態では、対象領域の表示（例えば、グラフ表示）にマッピングされるいくつかの数値アウトプットを生成するために、配列リードはコンピュータで分析される。後にさらに詳しく説明されるように、限定されずに以下を含む多くの種類の情報をマッピングすることができる：（ｉ）トランスポザーゼの切断部位；（ｉｉ）ステップ（ａ）で生成される断片のサイズ；（ｉｉｉ）断片の長さ；（ｉｉｉ）長さが規定の範囲の配列リードの位置；および（ｉｖ）配列リード存在量。
例えば、断片の末端（それからトランスポゾン切断部位を推測することができる）を同定するために、配列リードをコンピュータで分析することができる。これらの実施形態では、断片の１つの末端は、配列決定リードの初めにある配列によって規定することができ、断片の他の末端は、第２の配列決定リードの初めにある配列によって規定することができ、ここで、第１および第２の配列決定リードは対末端配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの配列決定プラットホームを使用する）によって得られた。同じ情報は、より長い配列リードの始めと終わりを検査することから得ることができる（それは、理論的には両アダプターの配列を有するはずである；１つは片方の末端に、他は他方の末端に）。これらの実施形態では、単一の配列リードは両方のアダプター配列を含有することができ、その場合には、断片の両末端（それらは、２つの別々のトランスポザーゼの２つの切断部位に対応する）は単一の配列リードから推測することができる。断片の長さは、例えば、断片末端を対象領域のヌクレオチド配列の上にマッピングして、それらの位置の間の塩基対の数を計数することによって計算することができる。使用する情報は、配列リードの初めおよび／または終わりのヌクレオチド配列を用いて得ることができる。
ある特定の場合には、配列リードは、長さによって群に入れることができる。一部の実施形態では、一部の配列は、そのサイズに基づいて無ヌクレオソーム配列（すなわち、ヌクレオソーム間にあると予測される断片からの配列）であると注釈付けることができる。モノヌクレオソーム、ジヌクレオソームおよびトリヌクレオソームと結合するリードを同定することもできる。これらのカットオフは、図１２に示すデータを使用して判定することができる。断片の長さ（配列リードの長さと同じ情報を提供する）を同様に処理することもできる。ある特定の場合には、配列リード存在量、すなわち、ゲノム領域中の特定の配列が配列リードで表される回数を計算することができる。
結果として生じたエピジェネティックマップは、対象領域のクロマチンの分析を提供することができる。例えば、どの情報がマッピングされるかに従い、マップは以下の１つまたは複数を示すことができる：領域に沿ったクロマチン到達性のプロファイル；領域中の部位へのＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）占有率；領域中の無ヌクレオソームＤＮＡ；領域に沿ったヌクレオソームの位置付け；および領域に沿ったクロマチン状態のプロファイル。一部の実施形態では、本方法は、例えば、そのタンパク質が結合する複数の部位で１つのＤＮＡ結合タンパク質についてデータを集めることによって、ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位の全体占有率を測定するステップをさらに含むことができる。ある特定の場合には、エピジェネティック情報を注釈との関連で見ることができるように、マップは、配列情報および配列に関する情報（例えば、プロモーター、イントロン、エクソン、公知のエンハンサー、転写開始部位、非翻訳領域、ターミネーターなどの位置）と一緒に注釈付けることもできる。
ある特定の実施形態では、エピジェネティックマップは、活性調節領域および／または調節領域に結合している転写因子に関する情報を提供することができる。例えば、ヌクレオソーム位置は、生成される配列決定リードの長さから推測することができる。あるいは、転写因子結合部位は、生成される配列決定リードのサイズ、分布および／または位置から推測することができる。一部の場合には、新規転写因子結合部位は、生成される配列決定リードから推測することができる。他の場合には、新規転写因子は、生成される配列決定リードから推測することができる。
アッセイで使用する細胞の集団は、任意の数の細胞、例えば、約５００から約１０６以上の数の細胞、約５００から約１００，０００の数の細胞、約５００から約５０，０００の数の細胞、約５００から約１０，０００の数の細胞、約５０から１０００の数の細胞、約１から５００の数の細胞、約１から１００の数の細胞、約１から５０の数の細胞または単一細胞で構成されてもよい。一部の場合には、細胞試料は、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、約３０，０００、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約１２０，０００、約１４０，０００、約１６０，０００、約１８０，０００、約２００，０００、約２５０，０００、約３００，０００、約３５０，０００、約４００，０００、約４５０，０００、約５００，０００、約６００，０００、約７００，０００、約８００，０００、約９００，０００または約１，０００，０００未満の数の細胞からなることができる。他の場合、細胞試料は、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、約３０，０００、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約１２０，０００、約１４０，０００、約１６０，０００、約１８０，０００、約２００，０００、約２５０，０００、約３００，０００、約３５０，０００、約４００，０００、約４５０，０００、約５００，０００、約６００，０００、約７００，０００、約８００，０００、約９００，０００または約１，０００，０００を超える数の細胞からなることができる。
細胞は、任意の供給源からであってよい。ある特定の場合には、細胞は細胞の培養物、例えば細胞系から得ることができる。他の場合には、細胞は個体（例えば、患者など）から単離することができる。細胞は、軟組織または体液から、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる細胞培養物から単離することができる。特定の実施形態では、クロマチンは、脳、副腎、皮膚、肺、脾臓、腎臓、肝臓、脾臓、リンパ節、骨髄、膀胱胃、小腸、大腸または筋肉などの軟組織から単離することができる。体液には、血液、血漿、唾液、粘液、痰、脳脊髄液、胸膜液、涙、乳管液（lactal duct fluid）、リンパ液、喀痰、脳脊髄液、滑液、尿、羊水および精液などが含まれる。
一部の実施形態では、本方法で使用するポリヌクレオチド（例えばゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ）は血液細胞からであってもよく、ここで、血液細胞は全血の試料または全血中の細胞の亜集団を指す。全血中の細胞の亜集団には、血小板、赤血球（赤血球）、血小板および白血球（すなわち、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球および単球で構成される末梢血白血球）が含まれる。これらの５種類の白血球は、２つの群、顆粒球（多核白血球としても知られ、好中球、好酸球および好塩基球を含む）および単核白血球（単球およびリンパ球を含む）にさらに分類することができる。リンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞にさらに分類することができる。末梢血細胞は血液の循環プールに見出され、リンパ系、脾臓、肝臓または骨髄の中で隔離されない。他の細胞は、単離することができる血液中に存在する。血液を先ず薬剤と接触させ、次に血液試料をアッセイで使用するならば、接触させた血液の一部または全てをアッセイで使用することができる。
ある特定の実施形態では、細胞試料は、一次供給源から直接に単離することができる。例えば、細胞試料は、新鮮な組織から直接に単離することができる。他の場合には、細胞試料は、凍結組織から直接に単離することができる。さらに他の場合には、細胞試料は、固定組織から直接に単離することができる。細胞試料の一次供給源のさらなる例には、限定されずに、組織から解離された細胞、血球、ＦＦＰＥ組織、細菌、ウイルス、ミトコンドリア、葉緑体、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てられたタンパク質ＤＮＡ複合体、好中球細胞外トラップが含まれる。
本開示で提供される方法を使用して、対象から得られる細胞試料中のポリヌクレオチド部位の到達性に基づいて、対象の疾患状態を分析することができる。例えば、任意の所与の部位の転写因子占有率は、その部位で到達性の欠如をもたらすことができる。転写因子占有率に基づいて、対象を適する薬剤（例えば転写因子阻害剤）で次に処置することができる。
ある特定の場合には、細胞試料は表現型でさらに分析することができる。例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）および／またはレーザー捕捉顕微手術（ＬＣＭ）を使用して細胞試料を分析することができる。一部の場合には、細胞試料および／またはポリヌクレオチドは、複数の部分に分割することができる。これらの部分は、分子タグ（例えば蛍光タグ）に基づいて分割することができる。一部の場合には、細胞試料および／またはポリヌクレオチドは選別することができる。選別は、分子タグをポリヌクレオチドに挿入した後に実施することができる。選別は、断片を配列決定する前に実施することができる。細胞試料の遺伝子転写は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの技術を用いて分析することもできる。クロマチン到達性は、表現型、転写または翻訳の分析と相関させることができる。
一部の実施形態では、細胞は同じ細胞型である。これらの実施形態では、細胞の集団は、細胞表面マーカーに対する標識抗体を用いる公知の方法により、細胞の不均一な集団、例えば血液からＭＡＣＳまたはＦＡＣＳによって選択することができる。幹細胞、がん幹細胞および血球のサブセットを含む多種多様の細胞を、これらの方法を用いて単離することができる。特定の実施形態では、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって以下の細胞を血液から単離することができる；Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２０＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）、幹細胞／前駆細胞（ＣＤ３４＋；造血幹細胞だけ）、マクロファージ／単球（ＣＤ１４＋ＣＤ３３＋）、顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）、血小板（ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＣＤ６２＋）、赤血球（ＣＤ２３５ａ＋）、内皮細胞（ＣＤ１４６＋）および上皮細胞（ＣＤ３２６＋）。これらの細胞のサブセットは、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体を用いて単離することができる。
一部の実施形態では、本方法は、２つの試料を比較するために使用することができる。これらの実施形態では、本方法は、上記の方法を使用して細胞の第１の集団を分析して第１のエピジェネティックマップを生成するステップ；および上記の方法を使用して細胞の第２の集団を分析して第２のエピジェネティックマップを生成するステップ；および例えばクロマチン開放性または転写因子占有率に変化があるかどうか例えば確かめるために、第１のエピジェネティックマップを第２のエピジェネティックマップと比較するステップを含むことができる。
一部の実施形態では、細胞の第１の集団および細胞の第２の集団は、同じ個体から異なる時間に収集される。他の実施形態では、細胞の第１の集団および細胞の第２の集団は、組織または異なる個体から収集される異なる細胞の集団である。
本方法で使用することができる例示的な細胞型には、例えば、組織生検から（例えば、結腸、乳房、前立腺、肺、皮膚のがんなどの疾患を有するか、または病原体などに感染した組織から）単離された細胞および同じ組織、例えば同じ患者からの正常な細胞；不死である組織培養で増殖させた細胞（例えば、増殖性突然変異または不死化導入遺伝子を有する細胞）、病原体に感染した細胞、または処理した細胞（例えば、環境または化学薬剤、例えばペプチド、ホルモン、変化させた温度、増殖条件、物理的ストレス、細胞形質転換などで）、ならびに正常な細胞（例えば、それらが不死化されていないか、感染していないかまたは処理されていないことなど以外は、さもなければ実験的な細胞と同一である細胞）；がん、疾患を有する哺乳動物、老齢哺乳動物または状態に曝露した哺乳動物から単離される細胞、ならびに健康または若齢である同じ種の哺乳動物、例えば同じファミリーからの細胞；ならびに同じ哺乳動物からの分化細胞および非分化細胞（例、例えば哺乳動物で１つの細胞は他の祖先である）が含まれる。一実施形態では、異なる型の細胞、例えば神経細胞および非神経細胞、または異なる状態（例えば、細胞への刺激の前後）の細胞を比較することができる。別の実施形態では、実験材料は、ウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの病原体による感染症に感受性の細胞であり、対照材料は病原体による感染症に抵抗性の細胞である。本発明の別の実施形態では、試料の組は、未分化細胞、例えば幹細胞、および分化細胞によって代表される。酵母、植物および動物、例えば魚類、鳥類、爬虫類、両生類および哺乳動物からの細胞を、本方法で使用することができる。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞、すなわちマウス、ウサギ、霊長類もしくはヒトからの細胞、またはその培養派生物を使用することができる。
一部の例示的な実施形態では、本方法は、２つ以上の異なる試験薬剤の効果に差があるかどうか判定するために、試験薬剤、例えば薬物の効果を同定するために使用することができる。これらの実施形態では、２つ以上の同一の細胞の集団を調製し、実験の実施方法に従い、細胞の集団の１つまたは複数を規定時間の間、試験薬剤とインキュベートすることができる。試験薬剤とのインキュベーションの後、上に示す方法を用いて細胞の集団のクロマチンを分析することができ、結果を比較することができる。特定の実施形態では、細胞は血球であってもよく、細胞はｅｘ ｖｉｖｏで試験薬剤とインキュベートすることができる。これらの方法は、例えば薬物に応答したクロマチン構造または転写因子占有率の変化を同定するために、試験薬剤の作用機作を判定するために使用することができる。
上記の方法は、診断薬（この用語は、診断を提供する方法ならびに予後診断を提供する方法を含むものとする）として使用することもできる。これらの方法は、例えば、上記の方法を使用して患者からのクロマチンを分析してエピジェネティックマップを生成するステップ；およびエピジェネティックマップに基づいて診断または予後診断を提供するステップを含むことができる。
本明細書に示す方法は、変化したクロマチンまたはＤＮＡ結合タンパク質占有率に関連した任意の状態に対して信頼できる診断薬を提供するために使用することができる。本方法は、エピジェネティックパターン（例えば、クロマチン到達性またはＤＮＡ結合タンパク質占有率のパターン）によって特徴付けられる状態の特徴付け、分類、区別、グレーディング、病期分類、診断または予後診断に適用することができる。例えば、本方法は、疾患または状態に罹患していることが疑われる個体からの試料のエピジェネティックマップが、その疾患または状態に関して「正常である」と考えられる試料と比較して同じであるかまたは異なるかについて判定するために使用することができる。特定の実施形態では、本方法は、試験試料中の特定の遺伝子座のエピジェネティックパターンによって特徴付けられる状態を有する個体を診断することに向けることができ、その場合、そのパターンはその状態と相関している。本方法は、状態への個体の感受性を予測するために使用することもできる。
本明細書に示す方法を用いる分析に適する例示的な状態は、例えば、細胞増殖性障害もしくは細胞増殖性障害の素因；代謝系の機能不全もしくは障害；免疫系の機能不全、傷害もしくは障害；ＣＮＳ系の機能不全、傷害もしくは疾患；攻撃性もしくは行動障害の症状；脳傷害の臨床的、精神的および社会的結果；精神障害および人格異常；認知症もしくは関連する症候群；心血管系の疾患、機能不全および傷害；胃腸管の機能不全、傷害もしくは疾患；呼吸器系の機能不全、傷害もしくは疾患；病変、炎症、感染症、免疫および／または回復；発達過程での異常としての身体の機能不全、傷害もしくは疾患；皮膚、筋肉、結合組織もしくは骨の機能不全、傷害もしくは疾患；内分泌系および代謝系の機能不全、傷害もしくは疾患；頭痛または性的機能不全、ならびにそれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、本方法は、例えば患者が再発する危険があるかどうか判定するために、予後診断を提供することができる。がん再発は、様々な型のがんに関係する懸念である。予後診断方法は、患者に対して、化学療法、放射線、生物学的変更因子および他の適する療法などの術前または術後補助的手段を含む追加の治療選択肢を提供することができるように、がん再発を起こす可能性がある外科処置患者を同定するために使用することができる。本方法は、検査または手術の時に測定可能な転移を示さない患者において転移の危険を判定するために特に有効である。
本方法は、疾患または状態を有する患者、例えばがん患者のために、適切な処置クールを決定するために使用することもできる。処置クールは、診断後または処置後の患者のためにとられる治療手段を指す。例えば、再発、広がりまたは患者生存の可能性の判定は、療法に対してより保存的もしくはより根治的なアプローチをとるべきかについて、または処置療法を組み合わせるべきかどうかについて判定するときに助けることができる。例えば、がん再発の可能性があるとき、外科処置の前または後に化学療法、放射線、免疫療法、生物学的変更因子療法、遺伝子療法、ワクチンなどをもってくること、または患者の処置時間を調整することが有利である。
特定の実施形態では、ラボは離れた場所（例えば、医師の診療室または病院）から試料（例えば、血液）を受け取り、ラボは上記の通りに試料中の細胞を分析してデータを生成し、分析のためにデータを離れた場所に転送することができる。
組成物
一態様では、本開示は、本明細書で提供される方法に関係がある組成物を提供する。組成物は、ポリヌクレオチド、挿入酵素および挿入物エレメントを含むことができ、ここで、挿入物エレメントは所定の配列を含む核酸を含むことができ、挿入酵素は親和性タグをさらに含むことができる。ポリヌクレオチドは、複数の会合分子にさらに結合してもよい。会合分子は、タンパク質（例えばヒストン）または核酸（例えばアプタマー）であってもよい。親和性タグは、抗体であってもよい。一部の場合には、抗体は転写因子に結合してもよい。他の場合には、抗体は修飾ヌクレオソームに結合してもよい。さらなる場合には、抗体は修飾核酸に結合してもよい。修飾核酸の例には、限定されずに、メチル化またはヒドロキシメチル化されたＤＮＡが含まれる。親和性タグは、一本鎖の核酸（例えばｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ）であってもよい。一部の場合には、一本鎖の核酸は、標的核酸に結合してもよい。ある場合には、挿入酵素は、核局在化シグナルをさらに含むことができる。
組成物は、ポリヌクレオチド、挿入酵素および挿入物エレメントを含むことができ、ここで、挿入酵素は２つ以上の酵素部分を含み、酵素部分は互いに連結している。挿入物エレメントは、挿入酵素に結合してもよい。挿入酵素は、ポリヌクレオチドに結合してもよい。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、複数の会合分子にさらに結合してもよい。会合分子は、タンパク質（例えばヒストン）または核酸（例えばアプタマー）であってもよい。
キット
さらに別の態様では、本開示は、上記のような、本方法を実施するための試薬を含有するキットを提供する。本キットは、（ａ）細胞の集団から核を単離するための試薬；（ｂ）トランスポザーゼおよびトランスポゾンタグ、ならびに（ｃ）トランスポザーゼ反応バッファーを含むことができ、ここで、キットの構成要素は、反応バッファー、トランスポザーゼおよびアダプターを核とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせることで、核を溶解してクロマチンを放出することおよびゲノムＤＮＡのアダプタータグ付き断片の生成の両方をもたらすように構成される。
一部の場合には、キットは以下を含むことができる：（ａ）細胞溶解バッファー；（ｂ）親和性タグを含む挿入酵素；および（ｃ）所定の配列を含む核酸を含む挿入物エレメント。挿入酵素は、例えば、トランスポザーゼであってもよい。挿入酵素は、互いに連結している２つ以上の酵素部分を含むこともできる。一部の場合には、親和性タグは抗体であってもよい。抗体は、転写因子、修飾ヌクレオソームまたは修飾核酸に結合することができる。修飾核酸の例には、限定されずに、メチル化またはヒドロキシメチル化されたＤＮＡが含まれる。他の場合には、親和性タグは一本鎖の核酸（例えばｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ）であってもよい。
キットは、上記の通り、他の構成要素、例えば、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲ試薬、例えばポリメラーゼ、バッファー、ヌクレオチドなどを任意選択で含有することができる。キットの様々な構成要素は別々の容器に存在することができるか、または所望により、特定の適合する構成要素を単一の容器中に予め合わせることができる。
前述の構成要素に加えて、本キットは、本方法を実施するためのキットの構成要素を用いるための指示書、すなわち試料分析のための指示書をさらに含むことができる。本方法を実施するための指示書は、適する記録媒体に一般に記録される。例えば、指示書は被印刷物、例えば紙またはプラスチックなどに印刷することができる。このように、指示書は添付文書としてキット中に、キットまたはその構成要素の容器（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに付随している）のラベルなどに存在することができる。他の実施形態では、指示書は、適するコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示書はキット中に存在しないが、離れた供給源から、例えばインターネットを通して指示書を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、指示書を見ることができ、および／または指示書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るこの手段は、適する被印刷物に記録されている。
実施形態
クロマチンをマッピングする方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、配列決定アダプターをクロマチン内のポリヌクレオチドに挿入するトランスポザーゼで稀であるかまたは豊富な細胞のクロマチンを断片化するステップと、断片を増幅および配列決定して細胞特異的マップを生成するステップを含む。
ある特定の実施形態では、細胞特異的マップは、活性調節領域および前記調節領域に結合している転写因子に関する情報を提供する。
ある特定の実施形態では、前記稀な細胞の数は、１から１００，０００である。
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼに由来する。
ある特定の実施形態では、トランスポザーゼはＭｕＡトランスポザーゼに由来する。
ある特定の実施形態では、ヌクレオソーム位置は、生成される配列決定リードの長さから推測される。
ある特定の実施形態では、転写因子結合部位は、生成される配列決定リードから推測される。
ある特定の実施形態では、クロマチンは新鮮な組織から直接に単離される。
ある特定の実施形態では、クロマチンは凍結組織から直接に単離される。
ある特定の実施形態では、クロマチンは固定組織から直接に単離される。
ある特定の実施形態では、多重化（バーコード化）のための断片を特異的に同定するために、配列が配列決定アダプターに加えられる。
ある特定の実施形態では、対象の特定の巨大分子にトランスポザーゼを標的化するために、親和性タグが使用される。
ある特定の実施形態では、多重化（バーコード化）のための断片を特異的に同定するために、配列が配列決定アダプターに加えられ、対象の特定の巨大分子にトランスポザーゼを標的化するために親和性タグが使用される。
ある特定の実施形態では、親和性タグは、転写因子に標的化される抗体である。
ある特定の実施形態では、親和性タグは、修飾ヌクレオソームに標的化される抗体である。
ある特定の実施形態では、クロマチン開放性を推測するために、特定のゲノム遺伝子座での挿入物サイズ分布が使用される。
ある特定の実施形態では、転写因子結合性を推測するために、挿入物サイズ分布および挿入位置が使用される。
ある特定の実施形態では、得られる配列決定リードの数は、トランスポザーゼの測定された配列挿入優先度によって標準化される。
ある特定の実施形態では、新規転写因子結合部位は、生成される配列決定リードから推測される。
ある特定の実施形態では、新規転写因子は、生成される配列決定リードから推測される。
ある特定の実施形態では、原因の変異体は、配列決定リードの対立遺伝子特異的生成を見ることによって推測することができる。
ある特定の実施形態では、クロマチン状態の注釈は、配列決定リードの長さの分布から推測される。
本教示の態様は、以下の実施例を考慮してさらに理解することができるが、それらの実施例は本教示の範囲を限定するものと決して解釈されるべきでない。
配列決定（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）を使用するトランスポザーゼ到達可能クロマチンのアッセイ
本明細書において、統合エピゲノム分析のための迅速高感度方法としての、配列決定（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）を使用するトランスポザーゼ到達可能クロマチンのアッセイ−天然のクロマチンへの配列決定アダプターの直接的ｉｎ ｖｉｔｒｏ転移に基づく−が記載される。ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、細胞数５００から５０，０００の単純な２ステッププロトコールを用いたオープンクロマチン部位を捕捉し、オープンクロマチン、ＤＮＡ結合タンパク質、個々のヌクレオソームのゲノム位置、およびヌクレオチド溶解による調節領域での高次圧縮の間の相互作用を明らかにする。ヌクレオソームと重複することを厳密に避けるか、許容することができるか、またはその傾向があるＤＮＡ結合因子のクラスが発見された。ＡＴＡＣ−ｓｅｑを用いて、標準採血により発端者から、静止ヒトＴ細胞の連続する毎日のエピゲノムを測定および評価し、健康および疾患の監視のために臨床タイムスケールで個別的エピゲノムを読み取ることの実現可能性を実証した。
材料および方法
ＡＴＡＣ−ｓｅｑプロトコールの例示的な実行例は、以下の３つの主要なステップを有する：
１）核を調製する：核を調製するために、５０，０００個の細胞を５分の間５００×ｇで遠心し、続いて５０μＬの冷たい１×ＰＢＳを使用して洗浄し、５分の間５００×ｇで遠心分離した。細胞は、冷たい溶解バッファー（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）を用いて溶解した。溶解の直後に、冷却遠心機を用いて核を１０分の間５００×ｇで遠心した。核プレップの間に細胞を失うことを避けるために、固定角度の遠心機を使用し、遠心分離後にピペットでそれらをペレットから注意深く分離した。
２）転移および精製する：核プレップの直後に、ペレットをトランスポザーゼ反応混合物（２５μＬの２×ＴＤバッファー、２．５μＬのトランスポザーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）および２２．５μＬの無ヌクレアーゼ水）に再懸濁させた。転移反応は、３７℃で３０分の間実行した。転移の直後に、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｅｌｕｔｅキットを用いて試料を精製した。
３）ＰＣＲ：精製に続いて、以下のＰＣＲ条件を用いて、１×ＮＥＢｎｅｘｔ ＰＣＲマスターミックスならびに１．２５μＭの特製Ｎｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマー１および２（下の表を参照する）を用いてライブラリー断片を増幅した：７２℃で５分間、９８℃で３０秒間、続いて９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間および７２℃で１分間のサーモサイクリング。ＰＣＲでのＧＣおよびサイズバイアスを低減するために、飽和の前に増幅を停止するためにｑＰＣＲを用いてＰＣＲ反応を監視した。これを行うために、完全ライブラリーを５サイクル増幅させ、５サイクル後にＰＣＲ反応の一定分量をとり、０．６×の最終濃度のＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎとの１０μｌのＰＣＲカクテルに加えた。残りの４５μＬの反応のために必要とされる追加のサイクル数を判定するために、この反応を２０サイクル実行した。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを用いてライブラリーを精製し、２０μＬに約３０ｎＭの最終ライブラリー濃度を与えた。ライブラリーは、合計１０〜１２サイクル増幅させた。
Figure 0006977014
低細胞数プロトコール：５００および５，０００個の細胞反応を調製するために、一部の注目すべき例外で同じプロトコールを使用した：転移反応は、５０μＬ反応の代わりに５μＬで実行した。さらに、ＰＣＲの前のＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｅｌｕｔｅ精製を削除し、代わりに転移の直後に５μＬ反応を５０μＬのＰＣＲに直接にとった。
ライブラリーＱＣおよび定量化：ＡＴＡＣ−ｓｅｑプロトコールの間、ライブラリー複雑性を最大にするためにサイズ選択ステップを避けた。配列決定された挿入物サイズは４０ｂｐから１ｋｂの間に分布し、平均約１２０ｂｐである。バイオアナライザーおよびゲルから＞２ｋｂの断片が観察されたが、それはＱｕｂｉｔおよび他の質量ベースの定量方法の解釈を困難にする。この理由で、我々はｑＰＣＲをベースとした方法を用いてライブラリーを数量化した。
末梢血からのＣＤ４＋濃縮：Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＩＲＢ承認のプロトコールの下で、７２時間の間に３回、１人の正常なボランティアから１グリーントップ管の全血を得た。インフォームドコンセントを得た。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮カクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、各時点の５ｍＬの血液をＣＤ４＋細胞に関してネガティブ選択した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐカクテルを血液と一緒に５０μＬ／ｍＬで２０分間インキュベートし、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳの等量で希釈し、１５ｍＬのＦｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ）の上に置いた。中断なしで血液を１２００×ｇで２０分の間遠心分離し、ネガティブ選択された細胞を密度媒体から取り出した：血漿インターフェイスおよび細胞を、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２×洗浄した。
末梢血白血球およびＧＭ細胞のＦＡＣＳ選別：ＧＭ１２８７８細胞をＤＡＰＩ ＮｕｃＢｌｕｅ固定細胞染色液（分子プローブ）で染色し、１００μｍノズルを用いるＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生細胞を選別した。ＲＴの暗所で２０分の間、１つの末梢血試料（バフィーコート）を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ抗体ＣＤ１４−Ａ−４８８（Ｍ５Ｅ２、１：２０）、ＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＳＫ７、１：２０）、ＣＤ４−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＲＰＡ−Ｔ４、１：２０）およびＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８、１：２０）で染色した。ｄｉＨ２Ｏ（ＢＤ）中の１：１０希釈ＢＤｐｈａｒｍＬｙｓｅを用いて細胞を１５分間溶解し、５分の間遠心分離し、ＰＢＳ２％ＦＢＳで２×洗浄し、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁させた。５０，０００個のＣＤ３＋ＣＤ８＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ１４＋細胞集団を、１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中に選別した。
データ分析
一次データ処理：ＭｉＳｅｑからの３４×８×３４リードまたはＨｉＳｅｑでの５０×８×５０リードを用いてデータを収集した。パラメータ−Ｘ２０００および−ｍｌを用いたＢＯＷＴＩＥ（Ｌａｎｇｍｅａｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００９ １０、Ｒ２５）を使用して、リードをｈｇ１９に整列させた。これらのパラメータは、最高２ｋｂまでの断片が整列し（−Ｘ２０００）、特異な整列リードだけが収集される（−ｍｌ）ことを確実とした。全てのデータファイルについて、Ｐｉｃａｒｄを使用して２反復を取り出した。
ピークの呼出しおよびフットプリンティングについては、リード開始部位は、トランスポゾン結合事象の中心を表すように調整した。Ｔｎ５トランスポザーゼの以前の記載は、トランスポゾンがダイマーとして結合し、９ｂｐ離れた２つのアダプターを挿入することを示す（Ａｄｅｙ、Ａ．らＧｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１０ １１：Ｒ１１９）。したがって、＋鎖に整列した全てのリードは＋４ｂｐオフセットされ、−鎖に整列した全てのリードは−５ｂｐオフセットされた。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク呼出し：この原稿では、全ての報告されたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを呼び出すために、ＺＩＮＢＡを使用した。３００ｂｐのウィンドウサイズおよびオフセット７５ｂｐを用いてＺＩＮＢＡを実行した。ゼロ−インフレート構成要素をモデル化するために整列度を使用し、バックグラウンドおよび濃縮構成要素のためにＡＴＡＣ−ｓｅｑリードカウント数を使用した。濃縮領域は、事後確率＞０．８を有するものと同定された。
クロマチン注釈の範囲内のＡＴＡＣ−ｓｅｑ挿入サイズ濃縮分析：
第１に、各クロマチン状態（ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇウェブサイトを参照する）に重なっている対末端配列決定断片サイズの分布を計算した。次に、各状態の中の最大パーセントに分布を標準化し、濃縮を断片サイズのゲノムワイドセットと比較して計算した。
ヌクレオソームの位置付け：ヌクレオソーム位置データトラックを生成するために、様々なビンにリードを分割することを選択した。１００ｂｐ未満のリードは無ヌクレオソームとみなし、１８０から２４７ｂｐの間のリードはモノヌクレオソームとみなし、３１５から４７３ｂｐの間のリードはジヌクレオソームとみなし、５５８から６１５の間のリードはトリヌクレオソームとみなした（カットオフの判定については、図１２を参照する）。ジヌクレオソームリードは２つのリードに分け、トリヌクレオソームリードは３つのリードに分けた。リードは、パラメータ−ｐ １、−ａ １、−ｄ ２０、−ｃｌｏｎａｌｃｕｔ ０を用いたＤａｎｐｏｓおよびＤａｎｔｏｏｌｓを使用して分析した。使用したバックグラウンドは無ヌクレオソームリード（１００ｂｐ未満のリード）であって、これらのリードの有効な負の重み付けを可能にした。この分析法は、複数の重複するヌクレオソームの呼出しを可能にする。単純な挿入物サイズカットオフを使用してヌクレオソームトラックを生成することは、他のヌクレオソームサイズの特徴、すなわちエンハナセオソーム（enhanaceosome）のために偽陽性を与えることができるが、ゲノムワイドのヌクレオソーム位置の全体的特徴を忠実に再現することを我々は観察した（図２ｃ、ｄ主文）。
ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークの呼出しおよびクラスタリング：ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、ＵＣＳＣ ＥＮＣＯＤＥリポジトリからダウンロードした。ピークはＧＥＭ（Ｇｕｏら、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２０１２ ８：ｅ１００２６３８）を用いて呼び出し、使用したパラメータは−ｋ最小６−ｋ最大２０であった。インプットは、ピーク呼出しの対照として使用した。結合事象は、１０ｂｐのビンで最も近い二分子までの距離によって注釈付けた。次にユークリッドの距離を使用して因子を階層的にクラスタリングし、遺伝子によって標準化し、平均によってセンタリングした。（Ｅｉｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９８ ９５：１４８６３〜１４８６８頁）。
ＣＥＮＴＩＰＥＤＥを用いたフットプリンティング：モチーフのゲノムワイドセットを、ＥＮＣＯＤＥモチーフリポジトリ（ウェブサイトｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ）から得た。ＣＥＮＴＩＰＥＤＥのインプットは、モチーフにマッチした各ゲノム領域から＋／−１００ｂｐ以内の、ＰＷＭスコア、保存（ＰｈｙｌｏＰ）およびＡＴＡＣ−ｓｅｑカウント数を含んだ。ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、ＵＣＳＣ ＥＮＣＯＤＥリポジトリから得た。
転写因子調節ネットワークの比較：それぞれの細胞型についてＣＥＮＴＩＰＥＤＥによって推定される事後確率のゲノムワイドセットとＧＥＮＣＯＤＥ ｖ１４遺伝子を比較することによって、転写因子調節ネットワークを構築した。同じ染色体への所与の転写因子マッピングの重み付け事後確率の合計をとることによって、各遺伝子を調節する転写因子の程度を判定した。各マッピングされたモチーフについて、各遺伝子の転写開始点までの距離に基づいて事後確率を重み付けした。転写因子調節ネットワークの比較は、所与の細胞型での各転写因子と他の細胞型での全ての転写因子との相関として計算された。生じた相関マトリックスは、ピアソン相関係数および完全連関を用いて階層的にクラスタリングした。
候補ＩＬ２エンハンサー分析：ＦＤＡ承認非調節薬に応答性である可能性がある１つまたは複数の細胞型で推定上のＩＬ２エンハンサーを同定するために、ＵＣＳＣゲノムブラウザー上のＥＮＣＯＤＥデータを検査した。我々は、（ｉ）エンハンサー会合ヒストンのマーク（Ｈ３Ｋ４ｍｅｌおよびＨ３Ｋ２７ａｃ）、（ｉｉ）ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって確認される１つまたは複数のＴＦによる結合のために、ｈｇ１９のＩＬ２上流の遺伝子間領域を調べたが、（ｉｉｉ）ＴＦ経路は、ヒト治療薬の標的にすることができる。この分析は、公知のＮＦＡＴ応答エレメントに加えて、ＩＲＦ４およびＳＴＡＴ３結合部位を同定した。
結果
ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、トランスポゾンによるクロマチン到達性を調べる
ハイスループットＤＮＡ配列決定のためのアダプターをｉｎ ｖｉｔｒｏで加えた、機能亢進性のＴｎ５トランスポザーゼ（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８ ２７３：７３６７〜７３７４頁；Ａｄｅｙ、Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１０ １１：Ｒ１１９）は、ゲノムを断片化し、同時に配列決定アダプターでタグ付けすることができる（前に「タグメンテーション（tagmentation）」と記載される）。精製されたＴｎ５、原核生物のトランスポザーゼによる少数の固定されてない真核生物の核への転移は、到達可能なクロマチンの領域を識別すると仮定された。トランスポザーゼ到達可能クロマチンアッセイと、続くハイスループット配列決定（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）が記載される。ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、到達可能クロマチンの領域にそのアダプターペイロードを組み込むためにＴｎ５トランスポザーゼを使用するが、立体障害のない到達可能クロマチンは転移の確率を低くする。したがって、ハイスループット配列決定に適する増幅可能なＤＮＡ断片は、オープンクロマチンの位置で優先的に生成される（図１ａ）。全アッセイおよびライブラリー構築は、Ｔｎ５挿入およびＰＣＲを含む単純な２ステップ法で実行することができる。対照的に、クロマチン到達性を試験するための公開されているＤＮアーゼおよびＦＡＩＲＥ−ｓｅｑプロトコールは、多段階式のプロトコール、ならびに多くの潜在的に損失を起こしやすいステップ、例えばアダプターライゲーション、ゲル精製および架橋反転を含む。例えば、公開されたＤＮアーゼ−ｓｅｑプロトコールはおよそ４４ステップおよび２晩のインキュベーションを要求し、公開されたＦＡＩＲＥ−ｓｅｑプロトコールは少なくとも３日にわたって実行される２晩のインキュベーションを必要とする。さらに、おそらくこれらの複雑なワークフローのために、これらのプロトコールは、１，０００，０００〜５０，０００，０００個の細胞（ＦＡＩＲＥ）または５０，０００，０００個の細胞（ＤＮアーゼ−ｓｅｑ）を必要とする（図１ｂ）。確立された方法と比較して、アッセイおよびライブラリー調製が単一の酵素ステップで実行されるので、ＡＴＡＣ−ｓｅｑは迅速で効率的なライブラリー生成を可能にする。
広範な分析は、ＡＴＡＣ−ｓｅｑがゲノムワイドなクロマチン到達性の正確で高感度の尺度を提供することを示す。ＤＮアーゼ−ｓｅｑおよびＦＡＩＲＥ−ｓｅｑを含むクロマチン到達性データセットによる比較および検証のために、ＡＴＡＣ−ｓｅｑをＧＭ１２８７８リンパ芽球腫細胞系（ＥＮＣＯＤＥ Ｔｉｅｒ １）から単離された５０，０００個および５００個の固定されてない核の上で実行した。前に他によって強調された遺伝子座で（図１ｃ）、ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、およそ３から５桁より多くの細胞で生成された、ＤＮアーゼ−ｓｅｑに類似のＳＮ比を有する。ピーク強度は、テクニカル反復の間で再現性が高く（Ｒ＝０．９８）、ＡＴＡＣ−ｓｅｑとＤＮアーゼ−ｓｅｑの間で非常に相関しており（Ｒ＝０．７９およびＲ＝０．８３、図６）、ピークの中の大多数のリードは、ＤＮアーゼおよびＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの交差部から来ることに注意する（図７）。我々のデータをＥＮＣＯＤＥ ＤＮアーゼ−ｓｅｑデータで同定されたＤＨＳと比較すると、レシーバー動作特性（ＲＯＣ）曲線は、ＤＮアーゼ−ｓｅｑと類似の感度および特異性を実証する（図８）。ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク強度は活性クロマチンのマーカーとよく相関するが、トランスポザーゼ配列優先度と相関しない点にも注意する（図９および１０）。高感度オープンクロマチン検出は、出発材料として５，０００個または５００個のヒト核を使用するときでも維持される（図８および１１）が、図１ｃから分かるように、使用する条件下で、より少数のインプット材料で感度は低減する。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑ挿入物サイズは、ヌクレオソーム位置を開示する
ＡＴＡＣ−ｓｅｑ対末端リードがヌクレオソームのパッキングおよび位置付けに関する詳細な情報を生成することが判明した。ヒトクロマチンからの配列決定断片の挿入物サイズ分布は、およそ２００塩基対の明らかな周期性を有し、多くの断片が整数倍数のヌクレオソームによって保護されていることを示唆する（図２ａ）。この断片サイズ分布は、ＤＮＡの螺旋ピッチと等しい明らかな周期性も示す。以前のモデル（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ ４１：８２７〜８４１頁）で規定されたクロマチンの機能的クラスに従って挿入物サイズ分布を分割し、全体的挿入物分布に標準化することによって、この挿入物サイズ分布全体で明らかなクラス特異的濃縮が観察され（図２ｂ）、クロマチンのこれらの機能的状態が、ＡＴＡＣ−ｓｅｑで読み出すことができる到達性「フィンガープリント」を有することが実証される。ＣＴＣＦ結合領域はＤＮＡの短い断片が濃縮され、転写開始点はモノヌクレオソーム、ジヌクレオソームおよびトリヌクレオソーム結合断片が差次的に枯渇しているので、これらの差次的断片化パターンはこれらのクラスの推定上の機能的状態と一貫している。転写された、プロモーターに隣接する領域はより長い多ヌクレオソーム断片が濃縮され、それらがクロマチンのより詰まった形を表すことを示唆する。最後に、先行研究は、ある特定のＤＮＡ配列がヌクレアーゼ分解に不応性であり、大きな多ヌクレオソームサイズの断片として放出されることを示している。以降の研究は、そのような断片が濃縮されたヘテロクロマチンであることを示した。実際、抑圧された領域は短い断片が枯渇し、段階的な多ヌクレオソーム挿入物が濃縮されることが見出され、それらの予想された到達不可能な状態と一貫していた。これらのデータはＡＴＡＣ−ｓｅｑがクロマチンの差次的に到達可能な形を明らかにすることを示唆し、そのことはｉｎ ｖｉｖｏで存在することが長く仮定されていた。
ＧＭ１２８７８細胞系の到達可能なクロマチン内でのヌクレオソームの位置付けを探るために、ＤＮＡの推定上の無ヌクレオソーム領域から生成されるリード、およびヌクレオソーム結合ＤＮＡにおそらく由来するリードにデータを分割した（図１２を参照する）。ヌクレオソーム結合断片を正に重み付けし、無ヌクレオソーム断片を負に重み付けする単純な発見的手法を使用して（方法の欄を参照する）、到達可能なクロマチンの領域内のヌクレオソーム位置を呼び出すために使用するデータトラックを計算した（Ｃｈｅｎ、Ｋ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３ ２３、３４１〜３５１頁）。遺伝子座の例（図３ａ）は、約７００ｂｐ離れた２つの転写開始点（ＴＳＳ）を示すＣＡＧＥデータを有する、推定上の両方向プロモーターを含有する。実際、ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、単一のよく位置決めされたモノヌクレオソームによって隔てられた２つの異なる無ヌクレオソーム領域を明らかにする（図３ａ）。大多数のリードがクロマチンの到達可能な領域内に集中しているので、ＭＮａｓｅ−ｓｅｑと比較して、ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータは、推定上の調節領域内のヌクレオソームを検出するのにより適合する（図３ｂ）。全ての活性ＴＳＳにわたってシグナルを平均することによって、無ヌクレオソーム断片はＴＳＳに重なる正規の無ヌクレオソームプロモーター領域で濃縮され、ヌクレオソームシグナルは活性ＴＳＳの上流と下流の両方で濃縮され、上流および下流ヌクレオソームの特徴的位相調整を提示することに注意する（図３ｃ）。ＡＴＡＣ−ｓｅｑリードはオープンクロマチンの領域に集中しているので、強力なヌクレオソームシグナルが＋１ヌクレオソームで見られ、それは＋２、＋３および＋４ヌクレオソームで減少し、対照的に、ＭＮａｓｅ−ｓｅｑヌクレオソームシグナルは、おそらくより到達可能なヌクレオソームの過消化のために、ＴＳＳからより離れた距離で増加する。さらに、ＭＮａｓｅ−ｓｅｑ（４，０００，０００，０００個のリード）は全てのヌクレオソームを試験するが、ＡＴＡＣ−ｓｅｑから生成されるリード（１９８，０００，０００個の対のリード）は調節ヌクレオソームに集中する（図３ｂ、ｃ）。ヌクレオソーム呼び出しを使用して、推定上の遠位調節領域およびＴＳＳを、無ヌクレオソームであった領域およびヌクレオソームが結合していると予測された領域にさらに分割した。ヌクレオソームに富んだままである傾向の遠位エレメントと比較したとき、ＴＳＳは無ヌクレオソーム領域に関して濃縮されていたことに注意する（図３ｄ）。これらのデータは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑが、ゲノムワイドな調節エレメントでヌクレオソーム結合および無ヌクレオソーム領域の高分解能リードを提供することができることを示唆する。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、ヌクレオソーム−ＴＦ間隔のパターンを明らかにする
ヌクレオソームとＤＮＡ結合因子の間の関係を理解するために、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ高分解能調節ヌクレオソームマップを使用することができる。ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータを使用して、最も近いヌクレオソームの二分子に関して、様々なＤＮＡ結合因子の位置をプロットした。管理されない階層的クラスタリング（図３ｅ）は、以下を含む近位ヌクレオソームに関して主要なクラスの結合を明らかにした。１）最も近いヌクレオソーム二分子（Ｃ−ＦＯＳ、ＮＦＹＡおよびＩＲＦ３を含む）から約１８０塩基でステレオタイプ化された結合事象を有する因子の強ヌクレオソーム回避群、２）クロマチンルーピング因子ＣＴＣＦおよび粘着複合サブユニットＲＡＤ２１およびＳＭＣ３を特に含む、ヌクレオソームＤＮＡ接点の予想される末端に正確に「寄り添う」因子のクラス；３）ヌクレオソーム回避またはヌクレオソーム重複結合行動のグラデーションを有するＴＦを主とする大きなクラス、ならびに４）その結合部位がヌクレオソーム結合ＤＮＡに重なる傾向があるクラス。興味深いことに、この最終クラスは、ＣＨＤ１およびＳＩＮ３Ａなどのクロマチンリモデリング因子、ならびにヌクレオソーム境界で濃縮されるようであるＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む。正確なヌクレオソームの位置付けとＤＮＡ結合因子の位置の間の相互作用は、メカニズムの研究のための特定の仮説、ＡＴＡＣ−ｓｅｑの潜在的利点を直ちに示唆する。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑフットプリントはゲノムワイドな因子占有率を推測する
ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、ゲノムワイドなＤＮＡ結合因子占有率の正確な推測を可能にする。ＤＮＡ結合タンパク質によって直接に占有されるＤＮＡ配列は、転移から保護されるはずである。生じる配列「フットプリント」は、ＤＮアーゼ消化フットプリントに類似して、各部位でのＤＮＡ結合タンパク質の存在を明らかにする。第１染色体上の特定のＣＴＣＦ結合部位で、ＧＭ１２８７８細胞のＣＴＣＦ ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルの頂点と一致するＣＴＣＦモチーフの正確な位置で、ＤＮアーゼ−ｓｅｑによって見られるフットプリントに類似した明らかなフットプリント（ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルの深いノッチ）が観察された（図４ａ）。ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルをゲノム内のＣＴＣＦの全ての予想位置にわたって平均し、よくステレオタイプ化された「フットプリント」を観察した（図４ｂ）。様々な共通ＴＦで、類似の結果が得られた（例については、図１３を参照する）。我々は、全ての遺伝子座でＣＴＣＦ結合の事後確率を生成するために、モチーフコンセンサススコア、進化的保存およびＡＴＡＣ−ｓｅｑ挿入データからＣＴＣＦ結合確率を推測した（図４ｃ）（Ｐｉｑｕｅ−Ｒｅｇｉら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１ ２１ ４４７〜４５５頁）。ＡＴＡＣ−ｓｅｑを使用した結果は、この細胞系でのＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合データを精密に再現し、ＤＮアーゼベースの因子占有率の推測によく匹敵し（図１４を参照する）、調節ネットワークの再構築を可能にするこれらのＡＴＡＣ−ｓｅｑデータから因子占有率データを引き出すことができることを示唆する。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、臨床タイムスケールでエピゲノム分析を可能にする
ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、迅速、情報豊富、および少数の細胞に適合し、クリニックで個別化されたエピゲノミクスのための強力なツールの役割をすることができる。具体的には、「個別的エピゲノミクス」は、臨床タイムスケールで標準の臨床試料から個体から生成されるクロマチンに関するゲノムスケールの情報と想定することができる。臨床タイムスケールでＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリーを生成することが可能なワークフローを実証するために、健康なボランティアの個別的Ｔ細胞エピゲノムを標準の連続採血を通して試験するのにＡＴＡＣ−ｓｅｑを適用した。迅速Ｔ細胞濃縮および試料処理プロトコールを用いると、採血から配列決定までに必要な合計時間は、およそ２７５分であった（図５ａ）。配列決定および分析のターンアラウンド時間の進行中の改善と一緒にするとき、ＡＴＡＣ−ｓｅｑは個別的エピゲノムマップのための毎日のターンアラウンド時間の可能性を提供することができる。この可能性を探るために、単一の個体からの標準の採血を通してＡＴＡＣ−ｓｅｑを３日連続で実施した（図５ｂ）。個別的エピゲノムマップがどのようにして個別化された調節情報を含有することができるか考える練習として、我々はＩＬ２遺伝子座でＡＴＡＣ−ｓｅｑプロファイルを調査した。ＩＬ−２は、炎症性および自己免疫性疾患でＴ細胞の増殖および機能を推進する鍵となるサイトカインである。さらに、異なる薬物が、状況依存的に推定上のＩＬ２エンハンサーに結合する異なる転写因子の活性を阻害する。原則的に、ＩＬ−２遮断の治療目標に役立つ可能性が低い薬物に患者を曝露させることなく、阻害を合理的に標的にするために、原因の転写因子経路を同定したいと願うであろう。ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、発端者のＴ細胞では、他の２つの薬物標的ではなくＮＦＡＴだけがＩＬ２を関与させることを示し（図５ｃ）、この個体の調節状態に関する臨床的に妥当な情報を提供する。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑフットプリントを用いて、発端者Ｔ細胞中の８９個の転写因子の占有率プロファイルを生成して、調節ネットワークの体系的再構築を可能にした。この個別化された調節マップで、ＧＭ１２８７８と発端者ＣＤ４＋Ｔ細胞の間で同じ８９個の転写因子のゲノム分布を比較した。Ｔ細胞とＢ細胞の間で分布の大きな変動を示す転写因子は、Ｔ細胞特異的因子に関して濃縮されている（図５ｄ）。この分析は、ＮＦＡＴが差次的に調整し、正規のＣＴＣＦ占有率がこれらの２つの細胞型の中で高度に相関することを示す（図５ｄ）。この解釈を支持するように、ＮＦＡＴが近くに局在する特定の遺伝子座は、公知のＴ細胞特異的遺伝子、例えばＣＤ２８および新規ｌｉｎｃＲＮＡ ＲＰ１１−２２９Ｃ３．２に局在することに注目される（図１５）。さらに、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに単一の採血からの蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって単離された単球のＡＴＡＣ−ｓｅｑは、個別的エピゲノムのための解説的なフレームワークを形成し、ＡＴＡＣ−ｓｅｑが表面マーカーを用いた細胞濃縮に適合することを実証した（図１６）。それとは別に、対立遺伝子特異的クロマチン到達性は、ヒト疾患の我々の理解に特に関連することが示された。原理の証明として、ＧＭ１２８７８細胞系の中で候補の対立遺伝子特異的オープンクロマチン領域を同定するためにＡＴＡＣ−ｓｅｑも使用した（図１７）。これらの結果は、臨床試料から詳細な個別化された遺伝子調節ネットワークを生成することの実現可能性を実証し、将来の診断適用への道を開く。
クロマチン到達性のエピゲノム研究は膨大な生物学的識見を与えたが、それらの複雑なワークフローおよび多数の細胞の必要条件によって現在は適用が限定されている。既存の方法の改良はそれらが類似の性能に到達することを可能にする一方で、特定の場合にはＡＴＡＣ−ｓｅｑはその速度、単純さおよび少数のインプット細胞の必要条件のために、既存の技術を超える実質的な利点を提供することができる。ＡＴＡＣ−ｓｅｑは情報の豊富なアッセイであり、因子占有率、調節部位中のヌクレオソーム位置およびゲノムワイドなクロマチン到達性の同時調査を可能にする。これらの識見は、挿入の位置および転移反応の間に捕捉される挿入物の長さの分布から導かれる。ＤＮアーゼ−ｓｅｑおよびＭＮａｓｅ−ｓｅｑなどの現行の方法はＡＴＡＣ−ｓｅｑでの情報の一部のサブセットを提供することができるが、それらは多数の細胞による別々のアッセイを各々必要とし、それは時間、費用を増大させ、多くの系への適用性を制限する。ＡＴＡＣ−ｓｅｑは生物学的に関連するゲノム領域の挿入物サイズ「フィンガープリント」も提供し、それがクロマチン圧縮に関する情報を捕捉することを示唆する。ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、特に他の強力な稀な細胞技術、例えばＦＡＣＳ、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）およびＲＮＡ−ｓｅｑでの近年の進歩と統合したときに、広い適用性を有することができ、ゲノム研究ツールキットをかなり追加し、遺伝子調節の我々の理解を向上させることができる。
ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、臨床意思決定に適合するタイムスケールで「個別的エピゲノム」プロファイルを生成するために使用することができる。最適化された手順は、２７５分で臨床血液試料を完全な配列決定ライブラリーに変換することができる。迅速ターンアラウンドハイスループット配列決定機器、例えばＭｉＳｅｑおよびＨｉＳｅｑ２５００の近年の導入と一緒にしたときの、低減されたインプット必要条件および迅速ワークフローは、ラボおよびクリニックの両方において選択された組織の個別化されたエピジェネティックな風景の調査を可能にするはずである。ＡＴＡＣ−ｓｅｑはＦＡＣＳに適合し、一次組織からの注意深く選別された稀な亜集団での研究を可能にする。発達および加齢、ならびにがん、自己免疫および神経精神医学的障害を含むヒト疾患の異なる時点で選択される細胞亜集団は、実行可能な適用である。
単一細胞ＡＴＡＣ−ｓｅｑ
単一細胞クロマチン到達性データセットは、ＡＴＡＣ−ｓｅｑプロトコールを使用して得られた。オープンクロマチン部位に対するトランスポザーゼ分子の比がほとんど一定に保たれることを確実とするために、初期転移反応の後に個々の細胞を操作することによって単一細胞ＡＴＡＣ−ｓｅｑアッセイを実行した。
トランスポザーゼは、オープンクロマチン染色の役割をすることができる
配列決定アダプターのｉｎ ｖｉｔｒｏ挿入の後、Ｔｎ５トランスポザーゼはＤＮＡにタイトに結合したままであり、生成されたＡＴＡＣ−ｓｅｑＤＮＡ断片の解離を阻止した高親和性巨大分子複合体を形成したことが観察された。この観察を裏づけるために、Ｔｎ５トランスポザーゼに蛍光標識ＤＮＡアダプターを付加し、個々の細胞の核内のオープンクロマチン領域の可視化を可能にした（図１８）。追加の電気泳動移動度偏移検定も、トランスポザーゼが転移の後にＤＮＡに結合したままであることを示した。
単一細胞ＡＴＡＣ−ｓｅｑは、染色体ＤＮＡに特徴的である特異なリードを提供する
この蛍光シグナルは核に局在化し、転移の後でさえ検出が可能であったので、以降の選別および細胞選択ステップの間は転移された断片を核内に保つことによって単一細胞ＡＴＡＣ−ｓｅｑ実験を実施した。一群の細胞を透過処理し、Ｔｎ５トランスポザーゼで染色体ＤＮＡを転移させた。細胞は、生じたＡＴＡＣ−ｓｅｑ断片が細胞核を離れる（すなわち二価のカチオンはキレート化されなかった）のを阻止する条件下に置き、上記の通り、個々の細胞をライブラリー調製のための独立したＰＣＲ反応に分けた。このワークフローは単一細胞分析のためのワークフローをかなり単純化し、２つの追加の利点を提供した。第１に、転移が選別に先行したので、これは、クロマチン状態に及ぼす選別過程のいかなる影響も排除した。第２に、細胞がＰＣＲマスターミックスに直接に選別され、増幅されたので、それはより頑強なＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルを提供した。このワークフローを使用して、１細胞につき約２，０００〜５，０００個の特異なＡＴＡＣ−ｓｅｑリードが生成された。これらのリードは、ＧＭ１２８７８細胞で公知のオープンクロマチン部位に関して濃縮され（図１９）、ヌクレオソームの指標となる特徴的な周期的濃縮を提示した（図２０）。
品質管理
トランスポザーゼ到達可能クロマチンのためのアッセイ（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）は、細胞収集のための多くの方法に適合することが示され、多くの細胞型および種にわたって効果的に働いた。しかし、ヒトリンパ芽球腫細胞のために、以下のプロトコールを最適化した。特定の適用のために軽微な変更（すなわち、細胞数、遠心分離速度および溶解条件）を最適化することができる。
Ｉ．細胞調製
１．細胞（固定しない）収集、プロトコールはユーザーが規定する。
２．４℃で５分間、５００×ｇで５０，０００個の細胞を遠沈させる。
３．５０μＬの１×冷ＰＢＳバッファーで一度洗浄する。４℃で５分間、５００×ｇで遠沈させる。
４．細胞ペレットをピペットで５０μＬの冷たい溶解バッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０）に静かに再懸濁させる。４℃で１０分間、５００×ｇで直ちに遠沈させる。
５．上清を捨て、直ちに転移反応を続ける。
ＩＩ．転移反応および精製
１．細胞ペレットが氷上にあることを確認する。
２．転移反応混合液を作製するために、以下を合わせる：
２５μＬの２×ＴＤバッファー（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ＃ＦＣ−１２１−１０３０）
２．５μＬのＴｎ５トランスポザーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ＃ＦＣ−１２１−１０３０）
２２．５μＬの無ヌクレアーゼＨ２Ｏ
合計５０μＬ
３．核をピペットで転移反応混合液に静かに再懸濁させる。
４．３７℃で３０分間、転移反応をインキュベートする。
５．転移の直後に、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅキットを用いて精製する。
６．１０μＬの溶出バッファー（１０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ８）で、転移されたＤＮＡを溶出する。
７．精製されたＤＮＡは、−２０℃に保存することができる。
ＩＩＩ．ＰＣＲ増幅
１．転移されたＤＮＡ断片を増幅するために、ＰＣＲ管で以下を合わせる：
１０μＬの転移されたＤＮＡ
９．７μＬの無ヌクレアーゼＨ２Ｏ
２．５μＬの２５μＭ特製Ｎｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマー１＊
２．５μＬの２５μＭ特製Ｎｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマー２＊［バーコード］
０．３μＬの１００×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ＊＊（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃Ｓ−７５６３）
２５μＬのＮＥＢＮｅｘｔＨｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｌａｂｓカタログ＃Ｍ０５４１）
合計５０μＬ
＊プライマーの完全リストは上に示す。
＊＊１０，０００×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを１０ｍＭトリスバッファーｐＨ８に希釈して、１００×使用液を作製する。
２．以下の通り循環させる：
（１）７２℃、５分間
（２）９８℃、３０秒間
（３）９８℃、１０秒間
（４）６３℃、３０秒間
（５）７２℃、１分間
（６）ステップ３〜５を繰り返す、４×
（７）４℃に保持する
３．ＰＣＲでのＧＣおよびサイズバイアスを低減するために、飽和の前に増幅を停止するためにｑＰＣＲを用いてＰＣＲ反応を監視する。ｑＰＣＲ副反応を実行するために、以下を合わせる：
５μＬの５サイクルＰＣＲ増幅ＤＮＡ
４．４４μＬの無ヌクレアーゼＨ２Ｏ
０．２５μＬの２５μＭ 特製Ｎｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマー１＊
０．２５μＬの２５μＭ 特製Ｎｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマー２＊
０．０６μＬの１００×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
５μＬのＮＥＢＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２×ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
合計１５μＬ
＊このプロトコールのセクションＶＩで入手できるプライマーの完全なリスト
４．以下の通りのｑＰＣＲサイクル：
（１）９８℃、３０秒間
（２）９８℃、１０秒間
（３）６３℃、３０秒間
（４）７２℃、１分間
（５）ステップ２〜４を繰り返す、１９×
（６）４℃に保持
５．残りの４５μＬのＰＣＲ反応のために必要とされる追加のサイクル数を、以下の通りに判定する：
（１）線形Ｒｎ対サイクルをプロットする
（２）５０００ＲＦ閾値を設定する
（３）最大蛍光強度の１／４に相当するサイクル数を計算する
加えられるサイクル数が２サイクルの間にあるならば、小さい方の整数を加えられるサイクル数（すなわち、青色およびピンク色の試料）としてとることによって数が判定される
２つの試料が類似したＣｔ値を有するが蛍光強度が異なる場合は、より低い蛍光強度の試料（すなわち、赤色および青色の試料）を使用してサイクル数を計算する
６．正しいサイクル数まで残りの４５μＬのＰＣＲ反応を実行する。以下の通りに循環させる：
（１）９８℃、３０秒間
（２）９８℃、１０秒間
（３）６３℃、３０秒間
（４）７２℃、１分間
（５）ステップ２〜４を繰り返す、×回
（６）４℃に保持
７．Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐキットを用いて、増幅されたライブラリーを精製する。２０μＬの溶出バッファー（１０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ８）で、精製されたライブラリーを溶出する。溶出バッファーを加える前に、カラムを必ず乾燥させる。
ＩＶ．ゲル電気泳動を用いたライブラリーＱＣ
１．１０ｍＭトリスバッファーｐＨ８で、１００ｂｐのＮＥＢＤＮＡラダーを１：２０に希釈する。
２．希釈したラダーの５μＬごとに０．６μＬの１０×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを加える。
３．希釈したラダーと２×ＤＮＡ負荷色素の１：１の混合。
４．増幅したライブラリーと２×ＤＮＡ負荷色素の１：１の混合。
５．５％Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ ＴＢＥ Ｐｒｅｃａｓｔゲル（４℃に保存された）に、増幅したライブラリーを流す。５μＬの希釈ラダー／ＤＮＡ負荷色素混合物を入れる。１０μＬの増幅ライブラリー／ＤＮＡ負荷色素混合物を入れる。
６．約１００ｍＶで４５分間実行する。
７．ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素は、約４８８ｎｍに励起最大値を有し、約５２０ｎｍに放射最大値を有する。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素で染色されたＤＮＡは、青色光源または４８８ｎｍで放射するレーザーを備えている画像化系を使用して可視化することができる。我々は、可視化のためにＡｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴｙｐｈｏｏｎ ＴＲＩＯ可変モード撮影装置を一般的に使用する。画像は、反射および散乱した励起光およびバックグラウンド蛍光をふるい落とすために、５２０ｎｍ帯域通過放射フィルターにより１００ミクロンピクセルサイズの分解能でデジタル化することによって最もよく得られる。
Ｖ．ライブラリー定量化
我々のＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリーを数量化するために、ｑＰＣＲをベースとした方法を使用する。他の方法、例えばバイオアナライザーおよびＱｕｂｉｔは、挿入物サイズの大きな分布のために、まぎらわしくて不正確な結果を与える可能性があることを見出した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットホームのためにＫＡＰＡライブラリーＱｕａｎｔキット（ＫＡＰＡＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してライブラリーを数量化することを推奨する。
前述の実施形態は理解の明瞭性のために例示および例により多少詳細に記載されているが、上の教示に照らして、添付の請求項の精神または範囲から逸脱せずに、特定の変更および改変をそれに加えることができることは当業者に容易に明らかである。

Claims (31)

  1. 核酸処理または分析するための方法であって、
    a）複数の細胞を溶解して、クロマチンを含む複数の細胞核を提供するステップと;
    b）前記複数の細胞核のうちの１つの細胞核をトランスポザーゼ複合体と接触させ、前記細胞核のポリヌクレオチドがオープンクロマチン領域でタグ付けされることにより、複数のタグ付き断片を生成するステップと
    を含む方法。
  2. 配列決定ライブラリーを生成するために、前記タグ付き断片に対して１つまたは複数の核酸反応を行うことを更に含む、請求項１記載の方法。
  3. 複数の配列リードを生成するために、前記配列決定ライブラリーの配列を決定することを更に含む、請求項２記載の方法。
  4. 前記１つまたは複数の核酸反応が核酸増幅反応を含む、請求項２記載の方法。
  5. 前記核酸増幅反応は、タグ付き核酸分子またはそれらの誘導体に１つまたは複数の機能性配列を付加するように構成され、前記１つまたは複数の機能性配列は選択された次世代配列決定プラットホームに適合する、請求項４記載の方法。
  6. 前記複数のタグ付き断片のうちの１つのタグ付き断片が、そのタグ付き断片に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
  7. 前記タグ付き断片がプライマー配列を更に含む、請求項６記載の方法。
  8. 前記トランスポザーゼ複合体が、Ｔｎ５トランスポザーゼまたはＴｎ５由来のトランスポザーゼを含む、請求項１記載の方法。
  9. 前記Ｔｎ５トランスポザーゼが機能亢進性のＴｎ５トランスポザーゼである、請求項８記載の方法。
  10. 前記トランスポザーゼ複合体が、第１のアダプター配列を含む第１の核酸挿入エレメントを含み、ここで、１つまたは複数の前記タグ付き断片が前記第１のアダプター配列を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記第１のアダプター配列が第１の配列決定アダプター配列を含む、請求項１０記載の方法。
  12. 前記第１のアダプター配列がバーコード配列を含む、請求項１０記載の方法。
  13. 前記第１のアダプター配列が第１のプライマー配列を含む、請求項１０記載の方法。
  14. 前記トランスポザーゼ複合体が、第２のアダプター配列を含む第２の核酸挿入エレメントを含み、ここで、１つまたは複数の前記タグ付き断片が第２のアダプター配列を含む、請求項１記載の方法。
  15. 前記第２のアダプター配列が第２の配列決定アダプター配列を含む、請求項１４記載の方法。
  16. 前記第２のアダプター配列がバーコード配列を含む、請求項１４記載の方法。
  17. 前記第２のアダプター配列が第２のプライマー配列を含む、請求項１４記載の方法。
  18. 前記細胞核のポリヌクレオチドに沿ったクロマチン到達性のプロファイルを生成するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項３記載の方法。
  19. 前記細胞核のポリヌクレオチドにおける１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質結合部位のためのＤＮＡ結合タンパク質占有率を決定するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項３記載の方法。
  20. 前記細胞核のポリヌクレオチドの１つまたは複数のエピジェネティックな特徴を示すエピジェネティックマップを作製するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項３記載の方法。
  21. 前記細胞核のポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の転写開始点（ＴＳＳｓ）の位置を決定するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項３記載の方法。
  22. 前記細胞核のポリヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオソームの位置を決定するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項３記載の方法。
  23. 前記トランスポザーゼ複合体はクロマチンの一部であるタンパク質に特異的な抗体を含まない、請求項１記載の方法。
  24. 核酸処理または分析するための方法であって、
    a）複数の細胞を溶解して、クロマチンを含む複数の細胞核を単離するステップと;
    b）前記複数の細胞核のうちの１つの細胞核をＴｎ５トランスポザーゼ複合体と接触させ、前記細胞核のポリヌクレオチドがオープンクロマチン領域でタグ付けされることにより、複数のタグ付き断片を生成するステップと
    を含み、
    前記Ｔｎ５トランスポザーゼ複合体は第１の配列決定アダプター配列および第２の配列決定アダプター配列を含み、
    前記Ｔｎ５トランスポザーゼ複合体はクロマチンの一部であるタンパク質に特異的な抗体を含まず、そして、
    前記複数のタグ付き断片のうちの１つのタグ付き断片は、
    ｉ．オープンクロマチン領域に相当する核酸配列、
    ｉｉ．第１の配列決定アダプター配列、および、
    ｉｉｉ．第２の配列決定アダプター配列、を含む方法。
  25. 配列決定ライブラリーを生成するために、前記タグ付き断片に対して１つまたは複数の核酸反応を行うことを更に含む、請求項２４記載の方法。
  26. 複数の配列リードを生成するために、前記配列決定ライブラリーの配列を決定することを更に含む、請求項２５記載の方法。
  27. 前記細胞核のポリヌクレオチドに沿ったクロマチン到達性のプロファイルを生成するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項２６記載の方法。
  28. 前記細胞核のポリヌクレオチドにおける１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質結合部位のためのＤＮＡ結合タンパク質占有率を決定するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項２６記載の方法。
  29. 前記細胞核のポリヌクレオチドの１つまたは複数のエピジェネティックな特徴を示すエピジェネティックマップを作製するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項２６記載の方法。
  30. 前記細胞核のポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の転写開始点（ＴＳＳｓ）の位置を決定するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項２６記載の方法。
  31. 前記細胞核のポリヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオソームの位置を決定するために前記配列リードを分析することを更に含む、請求項２６記載の方法。
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