CN112176041A - 一种表观遗传修饰的检测方法、试剂和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种表观遗传修饰的检测方法、试剂和应用。本申请的方法，包括染色体状态检测和甲基化检测，染色体状态检测包括，采用包埋已知核酸序列的转座酶对染色体开放区域进行攻击，以此区分染色体状态；甲基化检测包括，采用包埋条形码序列的TN5酶将染色体序列随机打断，然后进行甲基化处理，高通量测序获得染色体的甲基化信息；通过包埋的条形码序列区分不同细胞，实现多个细胞染色体状态和甲基化信息同时检测。本申请检测方法，采用包埋已知核酸序列的转座酶进行染色体状态检测，结合TN5转座技术，可一次性同时获得数千个甚至上万单细胞染色体状态和甲基化信息，具有通量高、操作简单、自动化程度高、灵敏性好、可重复强等优点。

Description

一种表观遗传修饰的检测方法、试剂和应用

技术领域

本申请涉及表观遗传修饰检测领域，特别是涉及一种表观遗传修饰的检测方法、试剂和应用。

背景技术

表观遗传修饰是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。表观遗传修饰往往不是孤立的，而是存在相互作用。现有的基于高通量测序来分析同一样本的全基因组表观多组学的研究方法，只能通过测序平行样本的方式间接获得相关信息。但测序平行样本的方案存在弊端，因为即使是处理条件完全相同的平行样本，在不计较人为处理时所产生的误差的前提下，其生理过程也不完全相同，因而无法在单细胞水平上对多种组学之间的互动关系进行研究。

目前能够在单细胞水平同时对多种组学进行分析的技术只有scCOOL-seq技术。该技术是采用甲基转移酶M.CviPI来处理单细胞染色体开放区域，然后用BS对全基因组进行甲基化处理。该技术可以精准地鉴定出染色质的开放状态和关闭状态，对同一个DNA单分子同时获得其染色质状态和DNA甲基化的信息。但是，但该技术对每一个单细胞进行上述操作，通量低；而且后续需要对单细胞基因组的两条链分别进行扩增，并采用M-280生物素的磁珠进行纯化；整个过程通量低、操作复杂、耗时长，且价格昂贵；并且，scCOOL-seq技术只适用于Illumina平台，大大限制了表观遗传修饰的研究。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的表观遗传修饰的检测方法，所使用的试剂，及表观遗传修饰检测方法和试剂的应用。

本申请具体采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种表观遗传修饰的检测方法，包括染色体状态检测和染色体甲基化检测；其中，染色体状态检测包括，采用包埋有已知核酸序列的转座酶对染色体的开放区域进行攻击，然后，去除核小体，将染色体序列随机打断，形成文库，通过检测文库中是否带有包埋的已知核酸序列信息来区分染色体的状态为开放区域或非开放区域；染色体甲基化检测包括，在将染色体序列随机打断时，采用包埋条形码序列的TN5酶将染色体序列随机打断，然后对随机打断的片段进行甲基化处理，并通过高通量测序获得染色体的甲基化信息；并通过TN5酶包埋的条形码序列区分不同的细胞，从而实现多个细胞的染色体状态和甲基化信息的同时检测。

需要说明的是，本申请的染色体状态检测，其原理是，在转座酶对染色体的开放区域进行攻击时，如果染色体状态为开放区域，则可以将该转座酶包埋的已知核酸序列插入染色体的开放区域序列中；而非开放区域因为包裹有组蛋白八聚体而不能被转座酶识别，因而非开放区域的序列中没有转座酶包埋的已知核酸序列；因此，可以通过检测后续文库中是否带有包埋的已知核酸序列，来判断染色体的状态为开放区域或非开放区域。也就是说，如果文库中含有包埋的已知核酸序列信息，则判断染色体状态为开放区域；否则为非开放区域。其中，去除核小体，将染色体序列随机打断，形成文库；这个过程中，将染色体非开放区域的核小体去除，使得非开放区域的核酸转变为裸露的DNA分子，即使染色体整体成为开放的DNA分子。

可以理解，在单独的进行染色体状态检测时，在去除核小体后，将染色体序列随机打断成文库时，可以采用现有的常规方法进行随机打断，只要后续能够方便检测其中是否带有转座酶包埋的已知核酸序列即可；但是，在本申请的优选方案中，为了便于后续的高通量的染色体甲基化检测，同时也为了便于区分不同来源的细胞，在去除核小体后，采用TN5酶对染色体进行随机打断，并通过TN5酶在随机片段上引入条形码序列，对不同来源的细胞进行区分，从而可以实现对多个不同来源的细胞同时进行染色体状态和甲基化信息检测。

因此，本申请可以一次检测成千上万个细胞，其主要原因是采用TN5酶转座的方式引入多次index标记的方法，即Single cell Combinatorial Indexed Sequencing(SCI-seq)，也就是说，对不同来源的细胞可以分别引入不同的条形码序列，从而实现对不同来源的成千上万个细胞同时进行检测。而现有的scCOOL-seq是直接采用BS处理的方式将DNA打断，因此无法区分不同来源的细胞。本申请中采用的包埋有已知核酸序列的转座酶，其中已知核酸序列和scCOOL-seq中甲基化转移酶的作用是相同的，都是为了区分开放区域和非开放区域。在本申请的一种实现方式中，进一步对TN5酶的量进行优化，使得TN5酶随机打断后的片段适合后续建库和测序，大大简化了操作过程，降低了人工操作时间。

优选的，在TN5酶中还包埋有条形码序列之外的功能序列，该功能序列包括高通量测序平台的特异性接头序列。

需要说明的是，本申请的功能序列主要是指高通量测序平台的特异性接头序列，当然，不排除根据不同的使用或设计需求，在TN5酶中包埋其它特殊的功能序列，在此不做具体限定。

本申请的一种实现方式中，具体在TN5酶中还包埋有BGIseq-500平台的引物接头序列，通过优化方案，可以采用BGIseq-500平台进行高通量测序获得甲基化信息，极大的降低了测序成本。可以理解，scCOOL-seq技术是Illumina公司垄断的技术，因此其整套技术流程和试剂都只适用于Illumina测序平台，而无法采用其它测序平台。但是本申请TN5酶的包埋序列除了条形码序列之外还包括接头序列，本领域技术人员可以理解，接头序列可以根据不同的测序平台来选择与之相对应的特异性接头序列，例如本申请的实施例中包埋了BGIseq-500平台的引物接头序列。本申请可以使得获得的片段及构建的文库能够适用于多种高通量测序平台，为表观遗传修饰检测的推广应用和研究奠定了基础。

优选的，包埋有已知核酸序列的转座酶为MuA酶。

优选的，甲基化处理采用亚硫酸氢盐。

本申请的第二方面公开了一种用于表观遗传修饰检测的试剂，包括包埋有已知核酸序列的MuA酶，包埋有条形码序列和高通量测序平台的特异性接头序列的TN5酶，以及线性扩增引物和建库引物；MuA酶用于检测染色体状态；TN5酶用于随机打断染色体序列；线性扩增引物和建库引物用于高通量测序甲基化检测的测序文库构建，线性扩增引物用于对TN5酶打断后并经过甲基化处理的核酸片段进行预扩增，建库引物用于对预扩增产物进行PCR扩增，以用于后续高通量测序。其中，TN5酶包埋的条形码序列用于区分不同来源的细胞，TN5酶包埋的高通量测序平台的特异性接头序列用于将该序列插入随机打断的DNA片段中，使其可以适用于相应的高通量测序平台，从而打断Illumina平台的垄断，例如本申请的一种实现方式中，具体在TN5酶中包埋了BGIseq-500平台的特异性接头序列。

需要说明的是，本申请的表观遗传修饰检测试剂，实际上就是本申请表观遗传修饰检测方法中自行设计的适用于本申请表观遗传修饰检测方法的试剂；可以理解，为了使用方便，这些试剂完全可以组成特殊的用于表观遗传修饰检测的试剂盒，组合或单独作为售卖产品使用。

优选的，线性扩增引物为Seq ID No.1所示序列，建库引物的正反向引物分别为Seq ID No.2和Seq ID No.3所示序列。

Seq ID No.1：5’-GTCTCGTGGGCTCGGNNNNNNNNN-3’

Seq ID No.2：

5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCGTCGGCAGCGTCGGTGTAG TGGGTTTGG-3’

Seq ID No.3：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCNNNNNNNNNNGTCTCGTGGG CTCGG-3’。

需要说明的是，Seq ID No.1所示序列的线性扩增引物，以及Seq ID No.2和SeqID No.3所示序列的建库引物，都是本申请的一种实现方式中具体设计的能够适用于BGIseq-500平台的文库构建引物。可以理解，在此基础上，还可以进行若干碱基的增减或替换，甚至可以采用其它与BGIseq-500平台特异性接头序列相应的引物，只要能够适用于BGIseq-500平台即可，在此不做具体限定。当然，如果使用其他高通量测序平台，相应的TN5酶中包埋的特异性接头序列也会改变；与此同时，线性扩增引物和建库引物也会根据所包埋的特异性接头序列重新设计，或者采用与特异性接头序列相匹配的文库构建引物组合。

优选的，本申请的表观遗传修饰检测试剂还包括甲基化处理试剂、测序文库构建试剂、高通量测序试剂和核酸纯化试剂中的至少一种。

需要说明的是，如前面提到的本申请的表观遗传修饰检测试剂实际上就是本申请表观遗传修饰检测方法所使用的试剂，因此，原则上，为了使用方便，本申请的试剂可以包含本申请表观遗传修饰检测方法中涉及的所有市购或自行设计的试剂，包括但不仅限于甲基化处理试剂、测序文库构建试剂、高通量测序试剂和核酸纯化试剂。

本申请的第三方面公开了本申请的表观遗传修饰检测方法或本申请的表观遗传修饰检测试剂在染色体开放性图谱绘制、作物表观修饰差异研究、胚胎发育表观遗传修饰研究、肿瘤发生表观机制研究、疾病潜在标志物预测或肿瘤异质性或分型研究中的应用。

可以理解，本申请的表观遗传修饰检测方法和试剂，具有检测通量高、操作简单、自动化程度高、灵敏性好、可重复等优点，因此，所有基于表观遗传修饰检测的研究都可以采用本申请的表观遗传修饰检测方法和试剂，包括但不仅限于染色体开放性图谱绘制、作物表观修饰差异研究、胚胎发育表观遗传修饰研究、肿瘤发生表观机制研究、疾病潜在标志物预测、肿瘤异质性或分型研究等。

本申请的第四方面公开了一种检测染色体状态的方法，包括采用包埋有已知核酸序列的转座酶对染色体的开放区域进行攻击，然后，去除核小体，将染色体序列随机打断，形成文库，通过检测文库中是否带有包埋的已知核酸序列信息来区分染色体的状态为开放区域或非开放区域。优选的，包埋有已知核酸序列的转座酶为MuA酶。

需要说明的是，本申请检测染色体状态的方法，实际上就是本申请表观遗传修饰检测方法中的染色体状态检测步骤，基于不同的使用需求，例如染色体开放性图谱绘制等，该步骤可以单独的作为染色体状态检测方法。

本申请的有益效果在于：

本申请的表观遗传修饰检测方法，采用包埋有已知核酸序列的转座酶进行染色体状态检测，并结合TN5转座barcode技术，可以一次性同时获得数千个甚至上万个细胞的染色体状态和甲基化信息，具有通量高、操作简单、自动化程度高、灵敏性好、可重复强等优点。本申请的一种实现方式中，在TN5酶包埋了条形码序列和BGIseq-500平台的特异性接头序列，使得TN5酶打断的片段及构建的文库能够适用于BGIseq-500平台，极大的降低了测序成本，为表观遗传修饰检测的进一步推广和应用奠定了基础。

附图说明

图1是本申请实施例中表观遗传修饰检测方法的流程示意图；

图2是本申请实施例中细胞核分选流式图；

图3是本申请实施例中Ampure XP beads片段筛选产物的Agilent 2100生物分析仪检测核酸片段分布图；

图4是本申请实施例中采用包埋有已知核酸序列的转座酶MuA酶对染色体的开放区域进行攻击的作用原理示意图。

具体实施方式

目前能够在单细胞水平同时对多种组学进行分析的技术只有scCOOL-seq技术，该技术通量低、过程复杂、耗时长，并且只适用于Illumina平台，这大大限制了表观遗传修饰检测的深入研究和推广应用。scCOOL-seq技术主要是对染色体状态和DNA甲基化信息进行检测。本申请创造性的提出采用包埋有已知核酸序列的转座酶对染色体的开放区域进行攻击，实现染色体状态的检测，并结合包埋条形码序列的TN5酶，对不同来源的细胞采用不同的条形码序列区分，从而实现高通量染色体状态检测和染色体甲基化检测，本申请的一种实现方式中，可以实现数千甚至上万细胞染色体状态的检测；并且，将TN5转座技术引入开放区域序列的随机打断，简化并降低了后续测序文库构建的难度，本申请的一种实现方式中在TN5酶中还包埋有BGIseq-500平台的特异性接头序列，使得获得的片段及构建的测序文库能够适用于BGIseq-500平台，打断了Illumina平台的垄断检测，极大的降低了测序成本。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例采用新鲜培养的K562细胞系进行表观遗传修饰检测，本例的表观遗传修饰检测方法，如图1所示，包括游离细胞核获取、MuA酶处理、核小体去除、TN5转座酶打断、BS处理、线性扩增、PCR扩增等流程，在PCR扩增后，还包括对PCR扩增产物进行测序文库构建以及高通量测序等。

其中，线性扩增，是使用包含了随机引物的接头序列的单条扩增引物进行。因为最终针对的是单细胞甲基化建库，细胞中含有的目的模板总量较少，如果直接进行PCR指数扩增，会引入大量的PCR bais；因此，先用线性扩增，增加了单链模板的含量；同时线性扩增也很好的保证了模板的准确性，然后再进行指数扩增，就能得到足够多的目的产物，也降低了指数扩增的PCR bais。

详细如下：

一、试验材料准备

1.裂解液NIB buffer配制

本例的NIB buffer按表1的配方进行配制。

表1每1000μL裂解液NIB buffer组分及用量

试剂	体积(μL)	终浓度
			1M Tris HCl pH7.4	10	10mM
5M NaCl	2	10MM
			1M MgCl<sub>2</sub>	3	3mM
10％Igepal	10	0.1％
			100×protease inhibitors	10	1×
NF-H<sub>2</sub>O	965
			总计	1000

2.细胞核准备

制备单细胞细胞核悬液

悬浮细胞：轻轻吹打细胞团块，10mL新鲜培养的K562细胞系悬液中加入406μL37％甲醛，室温孵育10min并轻微摇晃；然后加800μL 2.5M甘氨酸冰上孵育5min，然后4℃550g离心8min，再用10mL冷的PBS清洗，去上清后用5mL冷的NIB buffer重悬，冰上孵育20min并轻微混匀。

贴壁细胞：吸去培养基，并在37℃用10mL的PBS清洗一次去上清，然后加入足量的0.25％Trypsin 37℃消化细胞5min，然后加入等体积的37℃培养基终止胰酶消化；将体积调整至10mL，10mL细胞悬液中加入406μL 37％甲醛，室温孵育10min并轻微摇晃；然后加800μL 2.5M甘氨酸冰上孵育5min，4℃ 550g离心8min，再用10mL冷的PBS清洗，去上清后用5mL冷的NIB buffer重悬，冰上孵育20min并轻微混匀。

二、MuA酶处理

a)对处理好的单细胞核悬液进行稀释，按总量投入50万个单细胞进行反应体系配制，具体的，20μL反应体系包括：50万个单细胞的单细胞核悬液、5×MuA转座酶ReactionBuffer 4μL、Entranceposon(M1-Cam R)OR(M1-Kan R),100ng 1μL、MuA转座酶1μL，补充水至20μL。

轻轻吹打混匀以上反应体系，30℃反应1h；然后75℃孵育10min使酶失活；

b)加入等体积的NotI消化酶37℃ 1h进行消化连接，此时染色体开放区域插入了15bp序列；

c)将细胞或细胞核500g离心5min，用900μL 1×NEB buffer2.1清洗一次，500g离心5min；再用800μL含有12μL的20％SDS的1×NEB buffer 2.1重悬，42℃孵育并剧烈摇晃30min，其中每5min用移液器对细胞或细胞核悬液进行吹打混匀；然后加200μL 10％Triton-X，42℃孵育并剧烈摇晃30min，其中每5min用移液器对细胞或细胞核悬液进行吹打混匀；35μm过滤筛过滤。

需要说明的是，本例采用包埋有已知核酸序列的转座酶MuA酶对染色体的开放区域进行攻击，使得染色体开放区域含有加入的已知核酸序列信息，而非开放区域因为包裹着组蛋白八聚体而不能被MuA转座酶识别，因而未带有已知核酸序列信息；然后去除核小体，此时染色体的非开放区域会释放核小体而形成裸露的DNA链，在后续的TN5转座酶的作用下将染色体的整个区域随机打断，最后形成文库；通过检测文库中是否带有已知核酸序列信息以此来区分染色体状态为开放区域或非开放区域。

本例的MuA酶中，实际上包埋了一段长链的DNA序列，在DNA序列的两端均设计了NotI消化酶的酶切位点，当MuA酶包埋的长链序列插入染色体开放区域之后，用NotI酶进行酶切消化，此时DNA序列两段的NotI酶切位点的末端缺口会同时进行补平，插入10bp的NotI酶切位点序列，同时由于MuA酶的转座会在染色体开放区域形成一个5bp的重复序列，因此最终MuA酶转座会形成15bp的插入序列。整个过程的原理示意图如图4所示，图4中，A表示染色体的形态，B表示MuA酶及其包埋的引物示意图，C表示MuA包埋情况，D表示包埋已知核酸序列的MuA酶准备在染色体开放区域转座，E表示MuA酶转座末端序列，F表示MuA酶转座，G表示MuA酶将已知核酸序列插入染色体开放区域的示意图，H表示NotI消化酶进行外切消化作用处理，I表示最终获得的染色体开放区域插入15bp已知序列的示意图。

三、TN5转座

a)配制1×TD buffer，包括500μL NIB buffer、200μL 5×TAG buffer和300μL的NF-H₂O；

b)将上一步处理的细胞核4℃ 500g离心5min收集，用配制好的1mL的1×TDbuffer重悬。40μm细胞筛过滤，血球计数板计数，根据计数结果用1×TD buffer稀释至100或250个核/μL，置于冰上；

c)提前准备96孔板转座体系，每孔中加入4μL不同barcode包埋好的500nM的TN5酶，置于冰上，待细胞核准备好后向每孔加入10μL稀释好的细胞悬液进行转座；即每个反应体系包括：4μL的TN5酶和10μL的细胞悬液，总计14μL；

d)混匀后，将96孔板500g离心5min，55℃孵育15min，然后将96孔板置于冰上；

e)将所有孔pool到一起，即将所有孔中的细胞全部放到一起，通过40μm过滤筛，然后在1ml细胞核悬液中加入5μL浓度5mg/mL的DAPI染色5min进行后续流式分选。其中，40μm过滤筛进行过滤是考虑到在经过TN5转座之后，可能有残留的细胞碎片等杂质，过滤后能够提高细胞核悬液中的纯度，便于后续的流式分选。

四、流式分选

a)按照需要分选的孔位数，每孔5μL的Zymo Digestion Reagent的量准备反应混合液；其中，5μL的Zymo Digestion Reagent由2.5μL M-Digestion Buffer、2.25μL NF-H₂O和0.25μL Proteinase K组成；

b)取部分细胞核悬液作为阴性对照，划定流式阴性门，剩余细胞核DAPI染色，确定完整细胞核所在区域。计算细胞核分选效率，分选细胞核至96孔板中，每孔分选22个单细胞核，分好后将96孔板4℃ 600g离心5min。

本例K562细胞系的DAPI分选流式图如图2。图2中，左上方的Ⅰ图中横坐标FSC-A表示前向角散射，与细胞直径成正比，纵坐标SSC-A是侧向角散射，与细胞内部颗粒复杂程度成正相关，因此最下角可能是杂质，颗粒集中的区域代表颗粒均一性好，是单细胞的可能性越大；右上方的Ⅱ图，横坐标FSC-A中A是信号脉冲的面积，纵坐标FSC-H中H是信号脉冲的高度，同一参数的两个值之间是正相关关系，因此图中颗粒越接近对角线代表是单细胞可能性越大；左下方的Ⅲ图为单参数直方图，横坐标是DAPI荧光通道，纵坐标是颗粒数目，颗粒分为两群，最后边的群代表颗粒染上DAPI荧光，是目的细胞的可能性越大；右下方的Ⅳ图，与左下的Ⅲ图是一个意思，都是染上DAPI荧光的颗粒分群，只是用二位散点图表示更加直观，图中最右边的群是目的细胞群的可能性更大。

图2的结果显示，采用没有进行DAPI染色的细胞核悬液作为阴性样本，根据阴性样本流式结果对照，Ⅰ图中颗粒明显分为两群，初步确认Ⅰ图中右下集中的细胞群为目的细胞，然后通过Ⅱ图去除细胞黏连，靠近对角线确定是本试验需要的目的细胞群，最后再通过Ⅲ图和Ⅳ图与阴性样本流式图对照发现，选中的P3符合DAPI阳性的分群，即为目的细胞核群。

五、细胞核消化和BS处理

a)将96孔板50℃孵育20min，消化细胞核；

b)加入32.5μL新鲜配制的Zymo CT Conversion Reagent，充分混匀，将96孔板4℃600g离心2min，按如下程序孵育：98℃ 8min、65℃ 210min、然后4℃ hold，其中4℃保存需少于20h。

c)每孔加5μL Zymo MagBinding Beads和150μL M-Binding Buffer，充分混匀，室温孵育5min，然后置于磁力架上至溶液澄清，去上清；

d)每孔加100μL 80％乙醇，将板子从磁力架上移开，等磁珠散开后，将板子置于磁力架上至溶液澄清，去上清；

e)脱磺化Desulphonation：每孔加50μL M-Desulphonation Buffer，充分混匀，室温孵育15min，将板子置于磁力架上至溶液澄清，去上清；

f)每孔加100μL 80％乙醇，将板子从磁力架上移开，等磁珠散开后，将板子置于磁力架上至溶液澄清，去上清；

g)从磁力架上取下样本，干燥约10min至磁珠有明显裂纹；

h)洗脱：每孔加25μL Zymo M-Elution Buffer，充分混匀以重悬磁珠，然后将板子在PCR仪上55℃加热4min，使DNA脱离磁珠。

六、线性扩增

a)将PCR板置于磁力架上3min至溶液澄清，将25μL上清转移至新的PCR板中，新PCR板提前配好以下反应混合液：10×Blue buffer 5μL、10mM的dNTP mix 2μL、10μM的Sci-N92μL、NF水16μL，总计25μL反应混合液；

其中，Sci-N9即线性扩增引物，是本例特异设计的适用于后续的BGI500-seq平台的引物序列，Sci-N9为Seq ID No.1所示序列，

Seq ID No.1：5’-GTCTCGTGGGCTCGGNNNNNNNNN-3’。

b)预扩增

将样品在PCR仪中95℃孵育45s后立即置于冰上。完全冷却后，每孔加入10Uklenow(3’->5’exo-)后，轻轻涡旋混匀后离心，转移进入PCR仪中进行孵育，孵育条件为：4℃ 5min，然后以4℃/min的升温速度，从4℃升温至37℃，整个升温的时间为8.25，然后在37℃恒温孵育90min，最后4℃ hold；

c)配制mix，样本中每孔添加3.25μL的mix，将样品在PCR仪中95℃孵育45s后立即置于冰上。完全冷却后，每孔加入10U klenow(3’->5’exo-)后，轻轻涡旋混匀后离心，转移进入PCR仪中进行孵育；

其中3.25μL的mix包括1.25μL的4×NEB buffer 2.1、10mM dNTP mix 1μL、1μL的10μM Sci-N9；

在PCR仪中进行孵育的条件为：4℃ 5min，然后以4℃/min的升温速度，从4℃升温至37℃，整个升温的时间为8.25，然后在37℃恒温孵育90min，最后4℃ hold；

d)重复步骤c)两次，即包括步骤b)和步骤c)，总共进行四轮的线性扩增。

七、线性扩增的扩增产物纯化

本例采用Ampure XP beads进行1.1×纯化；PCR板室温孵育5min后置于磁力架至液体澄清去上清；用50μL 80％乙醇清洗磁珠，移除上清，室温放置3min使磁珠干燥，最后用34μL 10mM NF-H₂O回溶。

八、文库扩增

取33.5μL NF-H₂O回溶的产物转移至新的PCR板中，新PCR板提前配好以下反应混合液：5×KAPA HiFi buffer 10μL、10mM dNTPs 1.5μL、10μM F-tag primer 2μL、10μM R-tag(index)prime 2μL、1U/μL的KAPA HiFiDNA Polymerase 1μL，加上33.5μL NF-H₂O回溶的产物，总计反应体系为50μL。

其中，F-tag primer和R-tag(index)prime即建库引物的正反向引物，F-tagprimer即sci-Ad153-F-tag，为Seq ID No.2所示序列，R-tag(index)prime即sci-Ad153-R-tag(index)，为SeqIDNo.3所示序列；

Seq ID No.2：

5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCGTCGGCAGCGTCGGTGTAGTGGGTTTGG-3’

Seq ID No.3：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCNNNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG-3’

Seq ID No.2所示序列的5’端具有磷酸化修饰，Seq ID No.3所示序列的引物中，10个N是10bp的BGI500-seq平台index序列。

PCR反应条件为：95℃预变性3min，然后进入23个循环：98℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸30s，循环结束后，72℃延伸5min，最后4℃ hold。

九、文库片段选择和质控

a)每孔取10μL的PCR扩增产物进行pooling，将从每孔中取10μL的PCR扩增产物混合在一起，然后采用0.6×和0.2×Ampure XP beads进行片段筛选；

b)实验前将Ampure XP beads室温平衡30min；加入0.6×磁珠后的pooling样本室温孵育5min后置于磁力架至液体澄清；吸取上清并向其中加入0.2×磁珠室温孵育5min后置于磁力架至液体澄清去上清；用200μL80％乙醇清洗磁珠，移除上清，室温放置3min使磁珠干燥，用50μL NF-H₂O回溶。

c)从50μL NF-H₂O回溶产物中取1μL，采用Qubit荧光定量仪，测回溶产物的浓度，本例具体为30ng/μL，并按照测定的浓度将回溶产物稀释至4ng/μL，然后采用Agilent 2100生物分析仪检测回溶产物的片段分布，结果如图3所示；

图3的结果显示，文库即回溶产物的片段长度主要分布在200bp-400bp。

十、单链DNA环化

在0.2mL的PCR管中准备反应模板混合液，并按总量投入330ng DNA进行环化，反应模板混合液包括：总量330ng的DNA、20μM的Splint oligo 5μL、补充NF H₂O至70μL。将该反应模板混合液95℃反应3min，然后立即置于冰上保存备用。

然后，向反应模板混合液中加入单链DNA环化反应体系，包括：12μL的10×TAbuffer、100mM ATP 1.2μL、600U/μL的T4 DNA ligase 0.42μL、NF H₂O 36.38μL，加上70μL的反应模板混合液，总计反应体系为120μL。

反应体系配制好后，vortex轻甩5s；然后置于37℃孵育1h，4℃ hold；完成单链DNA环化连接。

单链DNA环化连接后，对其产物进行EXO酶消化，具体的，将上述反应产物置于冰浴中，添加8μL的消化反应体系，8μL消化反应体系包括：10×TA buffer 0.8μL、20U/μL的EXOI 3.9μL、100U/μL的EXO III 1.3μL、NF H₂O 2μL，加上120μL的单链DNA环化连接产物，消化反应体系总体积为128μL。

消化反应体系配制好后，vortex轻甩5s；然后置于37℃孵育30min，4℃ hold；完成消化反应。

消化反应完成后，取1μL消化反应产物测量环化ssDNA的浓度，结果显示ssDNA浓度为1.2ng/μL，符合后续测序使用。

十一、PEG32磁珠纯化

a)取170μL PEG32 beads，加入到上述消化反应产物中，涡旋震荡混匀，室温孵育10分钟；

b)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心移除上清；

c)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后小心移除上清；

d)重复上步，总计漂洗两次；

e)移除上清后，保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3分钟；

f)将EP管从磁力架中取出，加入40μL灭菌超纯水洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清，小心吸取上清至灭菌EP管中，于-20℃保存。即获得环化ssDNA的纯化产物。

取1μL纯化产物测量其浓度，结果显示，ssDNA浓度为2ng/μL，满足后续测序要求。

采用BGIseq-500平台对纯化产物进行PE150+11上机测序。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 一种表观遗传修饰的检测方法、试剂和应用

<130> 18I26989

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gtctcgtggg ctcggnnnnn nnnn 24

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaacgacatg gctacgatcc gactttcgtc ggcagcgtcg gtgtagtggg tttgg 55

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(35)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

tgtgagccaa ggagttgttg tcttcnnnnn nnnnngtctc gtgggctcgg 50

Claims (10)

1.一种表观遗传修饰的检测方法，包括染色体状态检测和染色体甲基化检测，其特征在于：所述染色体状态检测包括，采用包埋有已知核酸序列的转座酶对染色体的开放区域进行攻击，然后，去除核小体，将染色体序列随机打断，形成文库，通过检测文库中是否带有包埋的已知核酸序列信息来区分染色体的状态为开放区域或非开放区域；

所述染色体甲基化检测包括，在将染色体序列随机打断时，采用包埋条形码序列的TN5酶将染色体序列随机打断，然后对随机打断的片段进行甲基化处理，通过高通量测序获得染色体的甲基化信息；并通过TN5酶包埋的条形码序列区分不同的细胞，实现多个细胞的染色体状态和甲基化信息的同时检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述包埋有已知核酸序列的转座酶为MuA酶。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述TN5酶中还包埋有条形码序列之外的功能序列，所述功能序列包括高通量测序平台的特异性接头序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：所述甲基化处理采用亚硫酸氢盐。

5.一种用于表观遗传修饰检测的试剂，其特征在于：包括包埋有已知核酸序列的MuA酶，包埋有条形码序列和高通量测序平台的特异性接头序列的TN5酶，以及线性扩增引物和建库引物；

所述MuA酶用于检测染色体状态；

所述TN5酶用于随机打断染色体序列；

所述线性扩增引物和建库引物用于高通量测序甲基化检测的测序文库构建，线性扩增引物用于对TN5酶打断后并经过甲基化处理的核酸片段进行预扩增，建库引物用于对预扩增产物进行PCR扩增，以用于后续高通量测序。

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：所述线性扩增引物为Seq ID No.1所示序列，所述建库引物的正反向引物分别为Seq ID No.2和Seq ID No.3所示序列。

7.根据权利要求5或6所述的试剂，其特征在于：还包括甲基化处理试剂、测序文库构建试剂、高通量测序试剂和核酸纯化试剂中的至少一种。

8.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法或权利要求5-7任一项所述的试剂在染色体开放性图谱绘制、作物表观修饰差异研究、胚胎发育表观遗传修饰研究、肿瘤发生表观机制研究、疾病潜在标志物预测或肿瘤异质性或分型研究中的应用。

9.一种检测染色体状态的方法，其特征在于：包括采用包埋有已知核酸序列的转座酶对染色体的开放区域进行攻击，然后，去除核小体，将染色体序列随机打断，形成文库，通过检测文库中是否带有包埋的已知核酸序列信息来区分染色体的状态为开放区域或非开放区域。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述包埋有已知核酸序列的转座酶为MuA酶。

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