FI103809B - In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten - Google Patents
In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten Download PDFInfo
- Publication number
- FI103809B FI103809B FI972992A FI972992A FI103809B FI 103809 B FI103809 B FI 103809B FI 972992 A FI972992 A FI 972992A FI 972992 A FI972992 A FI 972992A FI 103809 B FI103809 B FI 103809B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- dna
- transposon
- primer
- reaction
- target dna
- Prior art date
Links
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 52
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000017105 transposition Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 133
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 37
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims 1
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010187 selection method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000013819 transposition, DNA-mediated Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 82
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 5
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004850 capillary HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 102000016470 mariner transposase Human genes 0.000 description 1
- 108060004631 mariner transposase Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Description
103809
IN VITRO -MENETELMÄ TEMPLAATTIEN TUOTTAMISEKSI DNA-SEKVENSOINTIA VARTEN
5 Tämä keksintö koskee DNA: n sekvensointia, ja erityisesti yksittäisten templaattien valikointia DNA: n sekvensointiin. Tämän keksinnön mukaiset valikointimenetelmät voidaan toteuttaa täysin in vitro. Keksintö koskee lisäksi pakkausta, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisen valikointimenetelmän toteutuksessa.
10 DNAn sekvensointi on laajalti käytetty menetelmä, joka on korvaamaton nykyaikaiselle molekyylibiologialle. Eräs sekvensointia rajoittava tekijä on yhtä aluketta käyttämällä luettavan sekvenssin lyhyys. Nykypäivän tekniikat antavat mahdollisuuden lukea noin 1000 emästä alukkeesta lähtien. Käytännössä luettavissa oleva alue kattaa noin 400 - 800 15 emästä. Kun sekvensoidaan pitkää DNA:ta, tutkittava DNA on jaettu pienempiin fragmentteihin, ja fragmentit on sekvensoitu yksittäin, tai on käytetty niin sanottua "DNA-kävelymenetelmää" ("DNA walk" method).
Lisäksi on olennaista, että yhdessä sekvensointireaktiossa käytetään ainoastaan yhtä 20 templaattia. Tunnetuissa menetelmissä ongelma on ratkaistu transformoimalla tutkittavan DNA n sisältävä sekvensointivektori bakteerisoluun, yleensä Escherichia colim, ja eristämällä yksittäisiä pesäkkeitä kasvatusmaljalta.
1. "DNA-kävelymenetelmässä" tutkittava DNA liitetään vektoriin ja liitetty DNA ' 25 sekvensoidaan niin pitkälle kuin mahdollista käyttäen tunnettua aluketta, joka on sijoitettu vektoriin. Käyttämällä saatua sekvenssiä suunnitellaan uusi aluke, josta sekvensointia jatketaan edelleen (Itakura et ai 1984 ja Sambrook et ai, 1989) Menettelyä toistetaan, kunnes koko tutkittava sekvenssi on selvitetty. Menetelmä on aikaavievä ja kallis. Aikaisemman kierroksen tulosta tarvitaan seuraavaa kierrosta varten, ja kutakin kierrosta 30 varten tarvitaan uusia, yksittäisiä alukkeita.
2 103809 2. DNA:n jakaminen pienempiin, osittain samoja alueita edustaviin fragmentteihin on tehty monella eri menetelmällä: - DNA:n kartoitus restriktioentsyymien avulla ja restriktiotuotteiden subkloonaus 5 sekvensointivektoreihin (Sambrook et ai, 1989), - niin sanottu "shot gun" -sekvensointimenetelmä, jossa DNA pilkotaan fragmentteihin sattumanvaraisesti ja kloonataan sekvensointivektoreihin (Suiston et ai, 1992), ja - niin sanottu eksodeleetiomenetelmä, jossa tutkittava DNA ligoidaan sekvensointivektoriin ja lyhennetään käyttämällä eksonukleaasia (Sambrook et ai, 1989 ja 10 Ausubel et ai 1989).
Kaikki edellä esitetyt menetelmät ovat työläitä, ja kaikissa täytyy transformoida DNA bakteeriin (yleensä E.colnn), jotta tuotetaan sekvensoitavaksi yksittäinen DNA-tempiaatti 15 DNA n sekvensoimiseksi on lisäksi esitetty erilaisia menetelmiä, jotka perustuvat DNA:n transpositioon. Suurin osa näistä menetelmistä perustuu transpositioon in vivo (US-patentti nro 4,716,105 ja Strathmann et ai 1991). Ainoa tunnettu sekvensointimenetelmä (kansainvälinen patenttihakemus WO 95/23875), jossa käytetään transpositiota in vitro, perustuu Tyl-integraasiaktiivisuuden käyttöön, ja jopa tässä menetelmässä ainoastaan ’· 20 transpositioreaktio toteutetaan in vitro, transpositiotuotteet transformoidaan Escherichia colhn, jotta saadaan yhdet sekvensointitemplaatit.
Olisi erittäin hyödyllistä, jos yksittäisten sekvensointitemplaattien valikointi käyttäen yksisoluviljelyä voitaisiin välttää täysin. Jopa tunnetuissa, osittain in vitro toteutettavissa 25 menetelmissä, monistustuotteet tulisi transformoida bakteeriin ja yksilöllisten templaattien saamiseksi DNA:n sekvensointia varten, olisi poimittava yksittäisiä pesäkkeitä.
Tämä keksintö tähtää aikaisempiin menetelmiin liittyvien ongelmien poistamiseen, ja sen vuoksi tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota käyttöön yksinkertainen menetelmä 30 suurempien DN A-segmenttien fragmentoimiseksi palasiin ja tehdä mahdolliseksi koko 3 103809 segmentin sekvensoimisen käyttäen yhtä tai muutamaa sekvensointialuketta.
Tämän keksinnön toinen tarkoitus on taijota käyttöön, täysin m vitro, yksittäinen sekvensointitemplaatti yhtä DNA: n sekvensointireaktiota varten.
5
Erään tämän keksinnön suoritusmuodon mukaisesti tutkittavalle DNA: lie tehdään DNA: n transpositioreaktio ja monistusreaktio. Monistusreaktio toteutetaan käyttäen ensimmäistä, kiinteätä aluketta, joka hybridisoituu tunnettuun asemaan tutkittavassa DNA ssa tai, jos tutkittava DNA on esimerkiksi osa vektorista, aluke hybridisoituu tutkittavan DNA: n 10 läheisyyteen, ja toista, valikoivaa aluketta, joka hybridisoituu transposonin insertiokoh-taan. Näillä reaktioilla saadaan aikaan monistustuotteet, jotka voidaan erotella koko-erojensa perusteella. Valikoimalla sopivat monistustuotteet, joiden kokoero on käytettävän sekvensointijäijestelmän lukukapasiteettialueella, yleensä väliMä 200 - 600 ep ia, voidaan saada osittain samoja alueita kohde-DNA:ta edustavat DNA-templaatit sekven-15 sointia varten. Kohde-DNAn pituus voi vaihdella muutamasta emäsparista aina 40 kiioemäspariin saakka. Ainoa rajoittava tekijä vielä pitempien DNA-segmenttien valitsemiselle kohde-DNA:ksi, on nykyisten monistusreaktioiden, kuten PCR n, kyvyttömyys tuottaa pitempiä DNA-segmenttejä.
V 20 Vielä erään tämän keksinnön suoritusmuodon mukaisesti transpositioreaktio toteutetaan tutkittavan DNA:n läsnäollessa, ja erilaiset päät omaavan transposonin tai transposonien läsnäollessa, mikä tekee mahdolliseksi valikoivien alukkeiden suunnittelemisen kumpaakin päätä varten. Transposonin päät voivat olla osa samasta molekyylistä tai eri molekyyleistä Monistusreaktio toteutetaan kumpaakin transposonin päätä varten suunniteltujen vali-I 25 koivien alukkeiden läsnäollessa. Monistustuotteet sijaitsevat satunnaisissa asemissa kohde-DNA:ssa. Jotta kyettäisiin kattamaan kohde-DNAn koko sekvenssi, on tarpeellista valikoida sekvensointia varten riittävä määrä monistustuotteita. Hyvin pitkät DNA-segmentit voidaan sekvensoida valikoimalla templaatit tämän suoritusmuodon mukaisesti Nykyisin käytössä olevat monistusreaktiot, kuten PCR, eivät ole rajoittava 30 tekijä. Eräs menetelmän eduista on, ettei tarvita lainkaan tietoa kohde-DNA n sekvens- 103809 sistä, eikä subkloonaus ole välttämätöntä.
Eräs tämän keksinnön tarkoituksista on taijota käyttöön pakkaus, joka käsittää trans-posonin, jonka transposaasientsyymi tunnistaa, transposaasientsyymin ja valikoivan 5 alukkeen, joka sisältää sekvenssin transposonin liittyvästä päästä sekä kiinteän alukkeen.
Vielä eräs tämän keksinnön tarkoituksista on taijota käyttöön pakkaus, joka käsittää kiinteän alukkeen, valikoivan alukkeen, transposonin, jonka transposaasientsyymi tunnistaa ja transposaasientsyymin, jolloin transposoni ja transposaasientsyymi taijotaan 10 transpositiokompleksina.
Edelleen eräs tämän keksinnön tarkoituksista on taijota käyttöön pakkaus, joka käsittää kaksi erilaista transposonipäätä, jotka transposaasientsyymi tai transposaasientsyymit 15 tunnistavat, transposaasientsyymin tai transposaasientsyymit, ja valikoivat alukkeet • molemmille transposonin päille.
Edellä esitetyt, ja muut keksinnön tarkoitukset, samoin kuin sen edut verrattuna 20 tunnettuihin sekvensointimenetelmiin ja pakkauksiin, tulevat ilmeisiksi seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauksesta, ja kuuluvat keksintöön, kuten seuraavassa selityksessä ja patenttivaatimuksissa esitetään.
Kuva 1 on kaavakuva keksinnön ensimmäisen (A) ja toisen (B) suoritusmuodon 25 periaatteesta.
Kuva 2 on kaavakuva keksinnön kolmannen (C) suoritusmuodon periaatteesta.
Kuvassa 3 esitetään valikoivan alukkeen rakenne, jossa X = valikoiva lisänukleotidi.
30 5 103809
Kuvassa 4 esitetään esimerkin 1 mukaisen valikoivan PCR-reaktion tulos agaroosigeelissä, M = Lambda/ff/ndlll + Phixl74/ifareIII DNA-markkeri (Finnzymes Oy, Espoo, Suomi). Kaistanumerot vastaavat reaktionumeroita taulukossa 2.
5 Kuvassa 5 esitetään sekvensointia varten eristetyt DNA-templaatit agaroosigeelissä. M = Lambda////n<ÄII + Phixl74///aeIII DNA-markkeri (Finnzymes Oy, Espoo, Suomi). Kaistanumerot vastaavat fragmenttinumeroita, jotka on merkitty nuolilla kuvaan 4. Reaktio A tehdään kummallakin alukkeella, reaktio B tehdään ainoastaan valikoivalla alukkeella.
10
Kuva 1 on kaavio tämän keksinnön ensimmäisen ja toisen suoritusmuodon mukaisen menetelmän eri vaiheista.
Kuten edellä on esitetty, tämä keksintö taijoaa käyttöön in vitro -menetelmän 15 templaattien valikoimiseksi DNA:n sekvensointia varten.
Määritelmä "DNA:n sekvensointi" tarkoittaa deoksiribonukleiinihapposegmentin muodostavien puriini-ja pyrimidiiniemästen sekvenssin määrittämistä. DNA:ssa yleisesti esiintyvät puriinit ovat adeniini (A) ja guaniini (G), yleisesti esiintyvät pyrimidiinit ovat 20 sytosiini (C) ja tyrniini (T). DNA-sekvenssin analyysi johtaa neljän emäksen variaatioon, jota merkitään ATCGTGC jne.
A. Tämän keksinnön ensimmäisen suoritusmuodon mukaisesti menetelmä käsittää 25 seuraavat vaiheet: a) Transpositioreaktio toteutetaan kohde-DNA:n ja transposonin läsnäollessa; kohde-DNA on renkaanmuotoinen DNA tai osa renkaanmuotoisesta DNA:sta.
30 "Kohde-DNA" on kiinnostuksen kohteena oleva DNA-segmentti, joka on tarkoitus 6 103809 sekvensoida täysin tai osittain. Kohde-DNA:n pituus voi vaihdella muutamasta emäs-parista aina 40 kiloemäspariin. Rajoittava tekijä vielä pitempien DNA-segmenttien valitsemiselle kohde-DNA:ksi on nykyisten monistusreaktioiden, kuten PCR:n, kyvyttömyys tuottaa pitempiä DNA-segmenttejä. Tämän keksinnön kolmannessa 5 suoritusmuodossa (C) PCR-reaktio ei kuitenkaan ole rajoittava tekijä, ja tämän suoritusmuodon mukaisesti voidaan sekvensoida erittäin pitkiä DNA-segmenttejä.
"Transposoni" on DNA-segmentti, joka voi liittää itsensä kohde-DNA:han sattumanvaraisiin tai melkein sattumanvaraisiin asemiin. Transpositioreaktioissa in vivo 10 käytettävät transposonit sisältävät normaalisti entsyymejä koodittavia geenejä, joita tarvitaan transpositioreaktiossa, mutta ne sisältävät myös DNA:ta, joka ei ole välttämätöntä transpositioreaktiolle. Reaktioissa in vitro on riittävää, että käytetty transposoni sisältää ainoastaan välttämättömän DNA:n, joka kykenee muodostamaan transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin transposaasi- tai integraa-15 sientsyymin kanssa, ja mahdollisesti jopa muiden entsyymien kanssa.
Savilahti et ai. (1995) ovat osoittaneet, että toimiva transpositiokompleksi voidaan muodostaa käyttäen ainoastaan faagin Mu transposonin genomin päitä ja MuA-transposaasientsyymiä.
20 Määritelmällä "transposoni" tarkoitetaan DNA-segmenttiä tai segmenttejä, jonka/jotka transposaasi- tai integraasientsyymi tunnistaa, ja joka kykenee/jotka kykenevät muodostamaan toimivan kompleksin transpositioreaktiota varten.
25 Määritelmällä "transposaasi" tarkoitetaan entsyymiä, joka kykenee muodostamaan transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin transposonin tai transposonien kanssa, mukaanluettuna integraasit retrotransposoneista ja retro viruksista.
"Transpositioreaktio" on reaktio, jossa transposoni liittyy kohde-DNA:han sattumanva-30 raisiin tai melkein sattumanvaraisiin kohtiin. Olennaiset osat transpositioreaktiossa ovat 7 103809 transposoni ja transposaasi- tai integraasientsyymi, tai eräät muut osat, joita tarvitaan toimivan transpositiokompleksin muodostamiseen. Esimerkkinä tämän keksinnön mukaisesta menetelmästä käytetään transpositio-kompleksia, jonka muodostavat Mu-genomin päät ja MuA-transposaasientsyymi (Savilahti et ai., 1995). Transpositiomene-5 telmä ei kuitenkaan ole ratkaiseva tämän keksinnön kannalta. Kaikki transpositiojär- jestelmät, joissa kyetään liittämään monistusalukekohdat sattumanvaraisella tai melkein sattumanvaraisella tavalla, ovat käyttökelpoisia tässä keksinnössä (Craig N.L. 1995). Esimerkkejä tällaisista järjestelmistä ovat Tyl (Devine S.E. ja Boeke J.D., 1994) ja kansainvälinen patenttihakemus WO 95/23875, Transposoni Tn7 (Craig N. L. 1996), 10 TnlO ja IS10 (Kleckner N. et ai. 1996), Mariner-transposaasi (Lampe DJ. et ai, 1996), Tel (Vos J.C. et ai, Genes Dev., 1996,10(6), 755-61), Tn5 (Park B.T. et ai, 1992), P-elementti (Kaufman P. ja Rio D.C., 1992) ja Tn3 (Ichikawa H. ja Ohtsubo E., 1990), bakteerien insertiosekvenssit (Ohtsubo ja Sekine, 1996), retrovirukset (Varmus H. ja Brown. P. A. 1989) ja hiivan retrotransposoni (Boeke J. D. 1989).
15
Tunnettujen monistusmenetelmien, kuten PCR:n, suuren herkkyyden vuoksi (US-patentti nro 4,683,195, nro 4,683,202 ja nro 4,965,188), transpositioreaktion ei tarvitse olla kovin tehokas. Transposonit liitetään edullisesti kohde-DNA:han olosuhteissa, jotka sallivat insertion ainoastaan osaan kohdemolekyyleistä; näin minimoidaan mahdollisuus, että 20 kohde-DNA:ssa olisi kaksi tai useampia transposoni-inserttejä. Niissä tapauksissa, joissa monistustuotteiden kummassakin päässä on paikat valikoivalle alukkeelle, tuotteet eivät sovellu käytettäväksi sekvensointitemplaatteina.
Transpositioreaktio toteutetaan edullisesti käyttämällä transpositiokompleksia, joka 25 käsittää ainoastaan transposoni-DNA:n päät ja transposaasientsyymin, mikä johtaa kohde-DNA:n täydelliseen pilkkomiseen transposonin insertion jälkeen.
Yksi transposonin insertio linearisoi kohde-DNA:n, kun taas kaksi tai useampia inserti-oita lyhentää kohde-DNA:ta, mikä saa aikaan tasaisen leviämän linearisoidun kohde-30 DNA:n alapuolelle agaroosigeelissä. Leviämästä on mahdotonta eristää templaatteja DNA:n sekvensointia varten. Jos 5% tai vähemmän kohde-DNA-molekyyleistä 8 103809 linearisoituu, tulos on riittävä, mutta ei rajoita seuraavia valikoivia monistusreaktioita.
b) Kohde-DNA monistetaan käyttäen monistusalukkeina ensimmäistä, kiinteää aluketta, 5 tunnetussa asemassa, ja toista, valikoivaa aluketta, transposonin insertiokohdassa.
"Kiinteällä alukkeella" tarkoitetaan DNA-aluketta, jolla on vastinemäsjäijestys kohde-DNA:ssa olevalle tunnetulle sekvenssille tai, jos kohde-DNA on osana vektoria, vastinemäsjäijestys vektorissa olevalle tunnetulle sekvenssille kohde-DNA:n liittymä-10 kohdan läheisyydessä. Vektori voi olla mikä tahansa sekvensointivektori, kuten pUC-saijan vektorit tai niiden johdannaiset.
"Valikoivalla alukkeella" tarkoitetaan aluketta, jolla on vastinemäsjäijestys kohde-DNA:han liittyneen transposoni-DNA:n päälle. Valikoiva aluke on 5’- 3’ suunnassa 15 kohde-DNA.n suuntaan, ja sillä on 0 - 5 tunnettua lisänukleotidia 3’-päässään (kuva 3).
Määritelmä "transposonin liittyvä pää" tarkoittaa sitä transposonin päätä, joka liittyy kohde-DNA:han liitoskohdassa.
20 Valikoiva monistusreaktio, kuten PCR, toteutetaan käyttäen monistusalukkeina kiinteää aluketta ja valikoivaa aluketta. Tunnetut lisänukleotidit valikoivan alukkeen 3’-päässä saavat aikaan monistustuotteiden valikoinnin. Enenevä määrä lisänukleotideja parantaa valikointia. Jos lisänukleotidit puuttuvat valikoivan alukkeen 3’-päästä, monistustuote on eri kokoisten tuotteiden seos, mikä saa aikaan sen, että tietynkokoisten tuotteiden 25 eristäminen on mahdotonta. Tämä johtuu transpositio-reaktion sattumanvaraisesta luonteesta in vitro. Lisäämällä yhden ylimääräisen nukleotidin valikoivan alukkeen 3’-päähän, mahdollisten templaattien määrää voidaan vähentää neljännekseen verrattuna PCR-reaktioon, joka toteutetaan ilman valikointia. Kaksi lisänukleotidia vähentävät templaattien määrän kuudenteentoista osaan, kolme lisänukleotidia vastaavasti kuuden-30 teenkymmenenteenneljänteen osaan. Liang P. ja Pardee B. (1992) ovat käyttäneet 9 103809 samanlaista lähestymistapaa mRNA:n "differential display" -tekniikassa. Kukaan ei kuitenkaan ole esittänyt PCR-alukkeiden liittämistä kohde-DNAhan ja sekven-sointitemplaattien tuottamista PCR:llä käyttäen valikoivia alukkeita.
5 Valikoivien alukkeiden käyttö monistusreaktiossa johtaa spesifisiin monistustuotteisiin, joiden koko vaihtelee, kunkin koon edustaessa yhtä templaattia sekvensointireaktiota varten.
c) Monistustuotteet erotellaan koon perusteella alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten 10 geelielektroforeesilla, kapillaarielektroforeesilla, HPLCillä tai muilla hyvin tunnetuilla menetelmillä.
Spesifiset monistustuotteet, joiden koko vaihtelee, erotellaan kokoerojensa perusteella esimerkiksi ajamalla ne agaroosigeelissä, ja poimimalla, esim. neulalla tai tikulla, erilliset 15 "juovat" uuteen monistusreaktioon, kuten PCR-reaktioon, ja toteuttamalla PCR-reaktio käyttäen samoja alukkeita kuin valikoivassa monistuksessa. Saadaan eri kokoiset reaktiotuotteet, kunkin koon vastatessa erillistä transpositioreaktiota. Kunkin PCR-tuotteen tarkka asema tutkitussa DNAssa tunnetaan.
20 Valikoimalla sopivasti PCR-tuotteet, joiden kokoero on käytettävän sekvensointi-järjestelmän lukukapasiteettialueella, yleensä välillä 200 - 600 ep ia, saadaan osittain samoja alueita kohde-DNA.ta edustavat DNA-templaatit sekvensointia varten. Käyttämällä samaa kiinteää aluketta on jopa mahdollista sekvensoida suurempi DNA-segmentti yhdellä kertaa.
' 25 d) Kohde-DNA sekvensoidaan käyttäen templaatteina monistustuotteita, jotka edustavat osittain samoja alueita kohde-DNA:sta, ja jotka ovat eri kokoisia toisiinsa verrattuina
Sekvensointimenetelmä voi olla mikä tahansa alalla tunnettu menetelmä, kuten Maxamin 30 ja Gilbertin (1977) nukleotidispesifinen kemiallinen reaktio ja pilkkomisreaktiot, ja 10 103809
Sangerin et ai. (1977) esittämät alukkeenpidennysreaktiot nukleotidispesifisten terminaattorien läsnäollessa, edullisesti käyttäen syklistä sekvensointimenetelmää.
B Tämän keksinnön toisen suoritusmuodon mukaisesti kohde-DNA on lineaarinen DNA 5 tai osa lineaarisesta DNA:sta. Kohde-DNAn tai kohde-DNA:ta lähellä olevan DNA n osasekvenssi tunnetaan, mikä tekee mahdolliseksi suunnitella kiinteä aluke, jolla on vastinemäsjäijestys tunnetulle osasekvenssille. Täten tunnetaan kiinteän alukkeen asema kohde-DNAssa tai lineaarisessa DNAssa, joka käsittää kohde-DNAn.
l o Suoritusmuoto B käsittää samat menetelmävaiheet kuin suoritusmuoto A, paitsi ettei siinä ole kohde-DNA:n linearisaatiovaihetta, toisin kuin suoritusmuodossa A.
Kuva 2 on kaavamainen esitys tämän keksinnön kolmannen suoritusmuodon mukaisen menetelmän eri vaiheista.
15 C. Tämän keksinnön kolmannen suoritusmuodon mukaisesti menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) Kohde-DNA han liitetään transpositiolla kaksi eri kohtaa monistusalukkeille.
20 Transpositioreaktio toteutetaan käyttämällä transposoneja, joilla on erilaiset päät, jotka mahdollistavat erilaisten valikoivien alukkeiden suunnittelun kumpaakin päätä varten. Transposonin päät voivat olla osia samasta molekyylistä tai osia kahdesta erillisestä transposonimolekyylistä (Savilahti et ai., 1995).
• 25 Jos tarpeen, toinen DNA-juoste voidaan täyttää DNA-polymeraasin ja DNA-ligaasin avulla. Suurin osa transpositiojäijestelmistä jättää toiseen juosteista katkoksen tai välin juosteiden liitoskohtaan kohde-DNA:n kanssa.
b) Valikoiva monistusreaktio, kuten PCR-reaktio, toteutetaan käyttämällä kahta 30 valikoivaa aluketta monistusalukkeina. Alukkeella yksi (ensimmäinen) on vastin- 11 103809 emäsjäijestys transposonin päälle yksi (ensimmäiselle päälle) ja alukkeella kaksi (toinen) on vastinemäsjäijestys transposonin päälle kaksi (toiselle päälle). Lisäksi kummallakin valikoivalla alukkeella on tunnettuja lisänukleotideja 3 -päässään.
5 Valikoivien alukkeiden käyttö monistusreaktiossa johtaa spesifisiin monistustuotteisiin, jotka ovat eri kokoisia, jolloin kukin koko edustaa yhtä templaattia sekvensointireaktiota varten. Enenevä määrä lisänukleotideja parantaa valikointia.
Valikoivuus voidaan saavuttaa lisäämällä valikoivia nukleotideja vain toisen alukkeista 10 päähän Valikoivuutta voidaan yhä vielä parantaa lisäämällä valikoivia nukleotideja kummankin alukkeen päähän.
c) Monistustuotteet erotellaan niiden koon perusteella alalla tunnetuilla menetelmillä, kuten geelielektroforeesilla, kapillaarielektroforeesilla, HPLC:llä tai muilla hyvin 15 tunnetuilla menetelmillä
Sopivat templaatit sekvensointia varten voidaan valikoida tekemällä monistus-tuotteille kolme rinnakkaista monistusreaktiota. Yhdessä reaktioista käytetään ainoastaan ensimmäistä valikoivista alukkeista, toisessa reaktiossa toista ja kolmannessa reaktiossa 20 kumpaakin valikoivaa aluketta. Ainoastaan ne templaatit, jotka saadaan tuloksena monistusreaktiosta kummallakin alukkeella, ovat sopivia templaatteja sekvensointia varten.
d) Monistustuotteet sijaitsevat satunnaisissa asemissa kohde-DNA.ssa. Jotta kyettäisiin . : 25 kattamaan kohde-DNA:n koko sekvenssi, valikoidaan riittävä määrä spesifisiä monistustuotteita templaateiksi sekvensointia varten.
Sekvensointimenetelmä voi olla mikä tahansa alalla tunnettu sekvensointimenetelmä, kuten Maxamin ja Gilbertin (1977) nukleotidispesifinen kemiallinen reaktio ja 30 pilkkomisreaktiot, ja Sangerin et ai. (1977) esittämät alukkeenpidennysreaktiot 12 103809 nukleotidispesifisten terminaattorien läsnäollessa, edullisesti käyttäen syklistä sekvensointia.
Yksi kolmannen suoritusmuodon (C) eduista on siinä, että voidaan sekvensoida erittäin 5 pitkiä DNA-segmenttejä valikoimalla templaatit tämän suoritusmuodon mukaisesti.
Tässä suoritusmuodossa nykyisin käytössä olevat monistusreaktiot, kuten PCR, eivät ole rajoittava tekijä, vaikka tarvitaankin enemmän sekvensointityötä verrattuna kahteen ensimmäiseen suoritusmuotoon (Aja B). Vielä yksi menetelmän eduista on, ettei siinä tarvita lainkaan tietoa kohde-DNA:n sekvenssistä, eikä subkloonausmenettely ole 10 välttämätön.
Vielä yksi tämän keksinnön tavoitteista on taijota käyttöön pakkaus templaattien valikoimiseksi DNA:n sekvensointia varteen.
15 Keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti pakkaus käsittää: - transposonin, joka käsittää DNA-sekvenssin, jonka transposaasientsyymi tunnistaa, ja mainittu transposoni-DNA ja mainittu transposaasientsyymi kykenevät muodostamaan transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin.
- transposaasientsyymin transpositioreaktion toteuttamiseksi ja 20 - valikoivan alukkeen, jolla on vastinemäsjäijestys kohde-DNA:han liittyvälle transposo nin päälle, ja jossa on 1 - 5 tunnettua lisänukleotidia, - kiinteän alukkeen, jolla on vastinemäsjäijestys kohde-DNA:ssa olevalle tunnetulle sekvenssille tai, jos kohde-DNA on osana vektoria, vastinemäsjäijestys vektorissa olevalle tunnetulle sekvenssille kohde-DNA:n liittymäkohdan läheisyydessä.
25
Keksinnön vielä erään suoritusmuodon mukaisesti pakkaus käsittää: - transpositiokompleksin, joka sisältää transposonin ja transposaasientsyymin, jolloin mainittu transposoni käsittää DNA-sekvenssin, jonka mainittu transposaasientsyymi tunnistaa 30 - valikoivan alukkeen, jolla on vastinemäsjäijestys kohde-DNA:han liittyvälle transposonin päälle, ja jossa on 1 - 5 tunnettua lisänukleotidia, 103809 - kiinteän alukkeen, jolla on vastinemäsjäijestys kohde-DNA:ssa olevalle tunnetulle sekvenssille tai, jos kohde-DNA on osana vektoria, vastinemäsjäijestys vektorissa olevalle tunnetulle sekvenssille kohde-DNA:n liittymäkohdan läheisyydessä.
5
Keksinnön vielä erään suoritusmuodon mukaisesti pakkaus käsittää: - vähintään yhden transposonin, jolla on kaksi erilaista liittyvää päätä, jotka käsittävät DNA-sekvenssin tai sekvenssit, jonka/jotka transposaasientsyymi tunnistaa, jolloin mainittu transposoni ja mainittu transposaasientsyymi kykenevät muodostamaan 10 transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin; - transposaasientsyymin transpositioreaktion toteuttamiseksi ja - ensimmäisen valikoivan alukkeen, jolla on vastinemäsjäijestys ensimmäiselle liittyvälle päälle ja 0-5 tunnettua lisänukleotidia 3 '-päässään ja toisen valikoivan alukkeen, jolla on vastinemäsjäijestys toiselle liittyvälle päälle, ja 0-5 tunnettua lisänukleotidia 3'- 15 päässään, jolloin vähintään yhdellä valikoivalla alukkeella, mainitulla ensimmäisellä tai mainitulla toisella, on 1 - 5 lisänukleotidia 3'-päässään.
Tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti transposoni käsittää Mu-transposonin päät, jotka MuA-transposaasi tunnistaa.
20
Seuraava ei-rajoittava esimerkki kuvaa keksintöä yksityiskohtaisemmin.
Esimerkki 25 Transpositioreaktio
Kohde-DNA on pUC19-plasmidi.
Transpositioreaktio on toteutettu olennaisesti kuten julkaisussa Savilahti et ai. (1995) on kuvattu, käyttäen transposoni-DNA:ta, jolla on seuraava sekvenssi (sekvenssi nro 1):
30 5’TGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAAC
AAGCTTTTCCATCTCTCCTCCCCCCTG 3’ 14 103809
Edellä esitetyn sekvenssin komplementaarisen juosteen 3’-pää liitetään kohde-DNA:han transpositioreaktiossa.
Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 5 10 nM transposoni-DNA.ta (donori-DNA) 10 ng/μΐ pUC19 DNA:ta 15 % DMSO 120 mM NaCl 10 0,05 % Triton X-100
10 mM MgCl2 25 mM Tris, pH 8.0 100 ^g/ml BSA 15 % glyserolia 15 23 nM MuA
Reaktiotilavuus oli 25 μ\.
Reaktioseosta inkuboitiin 30 °C:ssa 1 tunti ja jäädytettiin reaktion jälkeen.
20
Valikoiva PCR-reaktio
Valikoiva PCR-reaktio toteutettiin käyttämällä alukkeita 1 ja 2 kiinteinä PCR-alukkeina ja alukkeita 3, 4 tai 5 valikoivina PCR-alukkeina taulukon 2 mukaan. Alukkeiden 25 sekvenssit on esitetty taulukossa 1.
Taulukko 1. Alukkeiden DNA-sekvenssit
Aluke Sekvenssi 30 1 AGCTGGCGAAAGGGGGATGTG (Sekvenssi nro 2) 15 103809 2 TTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT (Sekvenssi nro 3) 3 GTTTTTCGTGCGCCGCTTCA (Sekvenssi nro 4) 4 GTTTTTCGTGCGCCGCTTCAG (Sekvenssi nro 5) 5 GTTTTTCGTGCGCCGCTTCAGA (Sekvenssi nro 6) 5 jossa 1 on kiinteä aluke pUC19:ää myötäsuuntaan 2 on kiinteä aluke pUC19:ää vastasuunnassa 3 on valikoiva aluke ilman valikoivia nukleotideja 4 on valikoiva aluke, jossa on yksi valikoiva nukleotidi 10 5 on valikoiva aluke, jossa on kaksi valikoivaa nukleotidia
Taulukko 2
Reaktion numero Kiinteä aluke Valikoiva aluke taulukon 1 taulukon 1 mukaan mukaan 15 1 1 3 2 1 4 3 1 5 4 2 3 5 2 4 20 6 2 5 PCR-reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 25 1 μΐ kymmenenteen osaan laimennettua transpositioreaktioseosta 20 pmol aluketta 1 tai 2 ja aluketta 3,4 tai 5 taulukon 2 mukaan 200 μΜ dNTP (kutakin nukleotidia kohti) 1,5 mM MgCl2 5 μΐ Dynazyme 10x-puskuria 30 1 μΐ Dynazyme II DNA-polymeraasia (F-501, Finnzymes Oy, Suomi) 103809 j. o
Reaktiotilavuus oli 50 μ\. Ennen alukkeiden lisäämistä reaktioseosta inkuboitiin 10 min 72 °C:ssa, jotta täytettiin insertiokohdan aukko kohde-DNA:n 3-pään ja transposoni DNA n 5'-pään välissä.
5
Syklin olosuhteet:
Vaihe Aika T
1 1 min 30 s 96 °C
2 45 s 96 °C
10 3 2 min 72 °C
4 29 kertaa vaiheeseen 2
5 5 min 72 °C
6 pidetään kunnes poistetaan 4 °C
15 PCR-laite oli DNA Engine MJ-Researchilta, MA, USA.
PCR-reaktiot ladattiin ja ajettiin tavallisessa 1,8-prosenttisessa agaroosigeelissä. Tulos on esitetty kuvassa 4.
;* 20 Pienet näytteet reaktioista 3 ja 6 saaduista fragmenteista siirrettiin geelistä 18 G neulaa käyttäen uusiin PCR-reaktioihin ja PCR ajettiin käyttäen samoja alukkeita ja olosuhteita kuin aikaisemmassa PCR-reaktiossa. Lisäksi tehtiin kontrolli-PCR käyttäen ainoastaan valikoivaa aluketta (katso kuva 5, reaktio B) Uudet PCR-reaktiot ladattiin ja ajettiin 1,8-prosenttisessa agaroosigeelissä, jolloin saatiin erilliset, eri kokoiset DN A-fragmentit.
25 Alukkeet ja nukleotidit poistettiin kustakin reaktiosta käyttäen AGTC-puhdistusjärjes-telmää valmistajan ohjeiden mukaisesti (Advanced Genetic Technologies Corporation, MD, USA). Puhdistetut DNA-fragmentit toimivat sekvensointitemplaatteina (kuva 5)
Sekvensointi tehtiin käyttäen Thermo Sequenace syklisekvensointipakkausta valmistajan 30 ohjeiden mukaisesti käyttäen P33-leimattuja alukkeita (Amersham Life Science, Yhdistynyt 103809 17 kuningaskunta). Sekvensointireaktiot ajettiin 6-prosenttisessa Gene Page Plus -poly-akryyliamidigeelissä (Amresco, Ohio, USA) käyttäen yhtä latausta.
Taulukko 3 5
Fragmentti Reaktio nro Koko Sekvenssin sijainti Sekvenssin nro. pUC19:ssä pituuslukema 1 3 162 ep 318 -469 151 2 3 374 ep 457-681 224 10 3 3 646 ep 670-953 283 4 4 347 ep 188 -325 137 5 5 503 ep 32-202 170
Oli mahdollista sekvensoida 921 ep:n sekvenssi pUC19:stä yhdellä ajolla. pUC19 valittiin 15 kohde-DNA ksi, koska sen sekvenssi tunnettiin. Koe osoittaa, että menetelmä toimii, ja että sitä voitiin käyttää valikoimaan templaatteja pitempien DNA-segmenttien sekvensointiin. Ainoa rajoittava tekijä on PCR-reaktion kapasiteetti tuottaa pitempiä DNA-fragmentteja.
20 Kirjallisuusviitteet .·: Ausubel, F M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D D , Seidman, J.G., Smith, J A. ja
Struhl, K., 1989, Current Protocols in Molecular Biology 1 25 Boeke J. D. 1989 Transposable elements in Saccharomyces cerevisiae in Mobile DNA Berg D. E. ja Howe M. M toim. American Society for Microbiology, Washington D. C :] s. 335-374.
Craig N. L. 1995, Unity in transposition reactions. Science 270: 253-254
Craig N. L. 1996. Transposon Tn7. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 27-48.
30 18 103809
Devine, S.E jaBoeke, J.D., Nucleic Acids Research, 1994, Vol 22, 18, 3765-3772 Ichikawa H. ja Ohtsubo E., J. Biol. Chem., 1990, 265(31), 18829-32.
5 Itakura, K., Rossi, J.J. ja Wallace, R.B., 1984, Ann. Rev. Biochem., 53, 323-356. Kaufman P ja Rio D C., Cell, 1992, 69(1), 27-39
Kiyoshi Mizuuchi, Michiyo Mizuuchi ja Toshiro Adachi, US-patentti 4,716,105, 1987 10
Kleckner N., Chalmers R M , Kwon D , Sakai J ja Bolland S 1996 TnlO and IS 10 Transposition and chromosome rearrangements: mechanism and regulation in vivo and in vitro. Curr. Top. Microbiol Immunol 204: 49-82.
15 Lampe D.J , Churchill M E.A. ja Robertson H.M., EMBO J. (1996), 15(19), 5470-5479
Liang P. ja Pardee B , Science. 1992, 257, 967-971.
Maxam ja Gilbert, PNAS, 74:560, 1977.
.·: 20
Ohtsubo E. & Sekine Y. 1996 Bacterial insertion sequences Curr Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26.
Park B.T., Jeong M H. ja Kim B.H., Taehan Misaengmul Hakhoechi, 1992, 27(4), 381-9 :* 25
Sambrook, J., Fritch, E.F. ja Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, toinen painos, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
Sanger, F., Nicklen, S., ja Coulson, A.R., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-30 5467.
;9 103809
Savilahti, H., Rice, P.A. ja Mizuuchi, K., The EMBO Journal, voi. 14, 19, 4893-4903, 1995.
Strathmann M., Hamilton B. A., Mayeda C. A., Simon M. I., Meyerovvitz E. M. ja 5 Palazzolo M. J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. 88, s. 1247-1250, 1991.
Suiston, J., Du, Z., Thomas, K., Wilson, R., Hillier, L., Staden, R, 1992, Nature 356, 37-41.
ίο Varmus H ja Brown. P. A. 1989. Retroviruses, kiijassa Mobile DNA. Berg D E ja Howe M. M toim. American Society for Microbiology, Washington D C s. 53-108
Vos J.C., Baere I. ja Plasterk R.H.A., Genes Dev., 1996, 10(6), 755-61 15 20 1 0 3 8 0 9
SEKVENSSILUETTELO
(1) YLEISET TIEDOT: 5 (l) HAKIJA: (A) NIMI: Finnzymes Oy
(B) KATU: Riihitontuntie 14 B
(C) KAUPUNKI: ESPOO
10 (E) MAA: SUOMI
(F) POSTINUMERO: 02200 (G) PUHELIN: +358 9 584121 (li) KEKSINNÖN NIMITYS:
15 IN VITRO -MENETELMÄ TEMPLAATTIEN
TUOTTAMISEKSI DNA-SEKVENSOINTIA VARTEN
(m) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 6 20 (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (l) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 77 emäspana 25 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksi]uostemen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(il) MOLEKYYLITYYPPI: GENOMINEN
30 (lii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1 5' TGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAACAAGCTTTTCCATCTCTCCT CCCCCCTG3' 35 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (l) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 21 emäspana (B) TYYPPI: nukleiinihappo 40 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 21 103809
(II) MOLEKYYLITYYPPI: synteettinen DNA
(III) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2 AGCTGGCGAAAGGGGGATGTG
5 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emäsparia 10 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (11) MOLEKYYLITYYPPI: synteettinen DNA 15 (lii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3 TTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT 20 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (l) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 25 (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(li) MOLEKYYLITYYPPI: synteettinen DNA
30 (lii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4
GTTTTTCGTGOGOOGOTTCA
2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: 35 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen 40 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 22 1 0 3 8 0 9
(11) MOLEKYYLITYYPPI: synteettinen DNA
;ill) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5 5 GTTTTTCGTGCGCCGCTTCAG
(2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (l) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 10 (A) PITUUS: 22 emäspana (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
15 (il) MOLEKYYLITYYPPI: synteettinen DNA
(m) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6 GTTTTTOGTGOGOOGCTTCAGA
Claims (21)
1. In v/fro-menetelmätemplaattientuottamiseksiDNA-sekvensointiavarten, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: S - tehdään transpositioreaktio kohde-DNA:n ja transposonin läsnäollessa siten, että tuloksena on vähintään yksi transposonin insertio kohde-DNA: ssa; - tehdään monistusreaktio käyttäen alukkeina ensimmäistä, kiinteätä aluketta, joka hybridisoituu tunnettuun kohtaan kohde-DNA.ssa tai jos kohde-DNA on osa vektoria, aluke hybridisoituu vektoriin kohde-DNA:n läheisyydessä ja toista aluketta, valikoivaa 10 aluketta, joka hybridisoituu transposonin insertiokohdassa; - erotetaan monistustuotteet kokonsa perusteella, ja - valikoidaan monistustuotteiden joukosta ne tuotteet, jotka soveltuvat käytettäväksi templaattina sekvensoitaessa kohde-DNA:ta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monistustuotteet, jotka soveltuvat käytettäväksi templaatteina sekvensoinnissa edustavat osittain samoja alueita kohde-DNA:sta ja ovat eri kokoisia toisiinsa verrattuina.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että : 20 monistusreaktio on PCR-reaktio.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohde-DNA on renkaanmuotoinen tai osa renkaanmuotoista DNA: ta
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohde- DNA on lineaarinen tai osa lineaarista DNA:ta.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisellä, kiinteällä alukkeella on vastinemäsjäijestys tunnetulle kohdalle kohde-• 30 DNA:ssa tai jos kohde-DNA on liitetty osaksi vektoria, alukkeella on vastinemäsjäijestys 24 103809 vektorisekvenssille, joka sijaitsee lähellä kohde-DNA:n liittymiskohtaa.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valikoivalla alukkeella on vastinemäsjäijestys transposonin liittyvän pään sekvenssille ja 5 että alukkeella on 3-päässään 1-5 tunnettua lisänukleotidia.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transposoni käsittää DNA-sekvenssin, jonka transposaasientsyymi tunnistaa, ja että transposoni-DNA ja transposaasi-entsyymi kykenevät muodostamaan 10 transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transposoni käsittää Mu-transposonin päät, jotka MuA-transposaasi tunnistaa.
10 DNA:n liittymäkohtaa, ja että valikoivalla alukkeella on vastinemäsjärjestys transposonin liittyvälle päälle ja että sen 3 päässä on 1-5 tunnettua lisänukleotidia.
10. In vitro- menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekvensointia varten, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: - tehdään transpositioreaktio vähintään yhden transposonin läsnäollessa, jolloin transposonilla tai transposoneilla on kaksi erilaista liittyvää päätä, liittyvien päiden erotessa toisistaan vähintään yhdellä nukleotidilla; 20. tehdään monistusreaktio käyttäen alukkeina ensimmäistä, valikoivaa aluketta, joka hybridisoituu transposonin ensimmäisen pään liittymiskohdassa ja toista, valikoivaa aluketta, joka hybridisoituu transposonin toisen pään liittymiskohdassa; - erotetaan monistustuotteet kokonsa perusteella, ja - valikoidaan monistustuotteiden joukosta templaatit DNA-sekvensointia varten siten, 25 että valituilla templaateilla on erilaiset päät ja että ne on saatu käyttäen molempia alukkeita.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monistustuotteet, jotka soveltuvat käytettäväksi templaatteina sekvensoinnissa edustavat 30 osittain samoja alueita kohde-DNA:sta ja ovat erikokoisia toisiinsa verrattuina. 25 103809
12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monistusreaktio on PCR-reaktio.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 ensimmäisellä, valikoivalla alukkeella on vastinemäsjärjestys transposonin ensimmäiselle liittyvälle päälle ja 0- 5 tunnettua lisänukleotidia 3' päässään ja toisella, valikoivalla alukkeella on vastinemäsjäijestys transposonin toiselle liittyvälle päälle ja 0- 5 tunnettua lisänukleotidia 3 'päässään ja että vähintään toisella valikoivista alukkeista on 1-5 lisänukleotidia. 10
14 Jonkin patenttivaatimuksen 10-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transposoni tai transposonit käsittää/käsittävät DNA-sekvenssin, jonka transposaasientsyymi tunnistaa, ja että transposoni-DNA ja transposaasi-entsyymi kykenevät muodostamaan transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin. 15
15. Jonkin patenttivaatimuksen 10-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transposoni tai transposonit käsittää/käsittävät Mu-transposonin pään tai päät, jotka MuA-transposaasi tunnistaa.
16. Pakkaus templaattien tuottamiseksi DNA-sekvensointia varten patenttivaatimuksessa 1 esitetyn menetelmän mukaisesti, tunnettu siitä, että se käsittää: - transposaasientsyymin transpositioreaktion suorittamiseksi; - transposonin, joka käsittää DNA-sekvenssin, jonka transposaasientsyymi tunnistaa ja että transposoni-DNA ja transposaasientsyymi kykenevät muodostamaan 25 transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin; - kiinteän alukkeen, ja - valikoivan alukkeen.
17. Pakkaus templaattien tuottamiseksi DNA-sekvensointia varten patenttivaatimuksessa 30 1 esitetyn menetelmän mukaisesti, tunnettu siitä, että se käsittää: 26 103809 - transpositiokompleksin, joka sisältää transposaasientsyymin transpositioreaktion suorittamiseksi ja transposonin, joka käsittää DNA-sekvenssin, jonka transposaasientsyymi tunnistaa; - kiinteän alukkeen, ja 5. valikoivan alukkeen.
18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että kiinteällä alukkeella on vastinemäsjärjestys tunnetulle sekvenssille kohde-DNA:ssa tai jos kohde-DNA on osa vektoria, alukkeella on vastinemäsjärjestys vektorisekvenssille lähellä kohde-
19. Pakkaus templaattien tuottamiseksi DNA-sekvensointia varten patenttivaatimuksessa 10 esitetyn menetelmän mukaisesti, tunnettu siitä, että se käsittää: 15. transposaasientsyymin transpositioreaktion suorittamiseksi; - vähintään yhden transposonin, jolla on kaksi erilaista liittyvää päätä, joka tai jotka sisältävät DNA-sekvenssin tai sekvenssejä, joka tai jotka transposaasientsyymi tunnistaa, jolloin transposoni-DNA ja transposaasi-entsyymi kykenevät muodostamaan transpositioreaktiossa tarvittavan toimivan kompleksin; 20. ensimmäisen, valikoivan alukkeen, ja - toisen, valikoivan alukkeen.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että ensimmäisellä, valikoivalla alukkeella on vastinemäsjärjestys transposonin ensimmäiselle liittyvälle päälle, 25 ja 0 - 5 tunnettua lisänukleotidia 3' päässään, ja toisella valikoivalla alukkeella on vastinemäsjärjestys transposonin toiselle liittyvälle päälle ja 0-5 tunnettua lisänukleotidia 3' päässään, jolloin vähintään toisella valikoivista alukkeista on 1-5 lisänukleotidia.
21. Jonkin patenttivaatimuksen 16-20 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että ' 30 transposon käsittää Mu-transposonin pään tai päät, jotka MuA-transposaasi tunnistaa. 27 103809
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI972992A FI103809B1 (fi) | 1997-07-14 | 1997-07-14 | In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten |
| PCT/FI1998/000586 WO1999004035A1 (en) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | In vitro method for providing templates for dna sequencing |
| CA002295968A CA2295968C (en) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | In vitro method for providing templates for dna sequencing |
| EP98935045A EP1005571B1 (en) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | In-vitro method for providing templates for DNA sequencing |
| JP2000503240A JP2001510055A (ja) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | ＤＮＡ配列決定のための鋳型の提供のためのｉｎｖｉｔｒｏ方法 |
| DE69838911T DE69838911D1 (de) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | In-vitro Verfahren zur Bereitstellung von Fragmenten für die DNS Sequenzierung |
| US09/462,013 US6593113B1 (en) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | In vitro method for providing templates for DNA sequencing |
| AU84429/98A AU738345B2 (en) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | In vitro method for providing templates for DNA sequencing |
| AT98935045T ATE382095T1 (de) | 1997-07-14 | 1998-07-10 | In-vitro verfahren zur bereitstellung von fragmenten für die dns sequenzierung |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI972992A FI103809B1 (fi) | 1997-07-14 | 1997-07-14 | In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten |
| FI972992 | 1997-07-14 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI972992A0 FI972992A0 (fi) | 1997-07-14 |
| FI972992A FI972992A (fi) | 1999-01-15 |
| FI103809B true FI103809B (fi) | 1999-09-30 |
| FI103809B1 FI103809B1 (fi) | 1999-09-30 |
Family
ID=8549258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI972992A FI103809B1 (fi) | 1997-07-14 | 1997-07-14 | In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6593113B1 (fi) |
| EP (1) | EP1005571B1 (fi) |
| JP (1) | JP2001510055A (fi) |
| AT (1) | ATE382095T1 (fi) |
| AU (1) | AU738345B2 (fi) |
| CA (1) | CA2295968C (fi) |
| DE (1) | DE69838911D1 (fi) |
| FI (1) | FI103809B1 (fi) |
| WO (1) | WO1999004035A1 (fi) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7727744B2 (en) * | 2004-03-30 | 2010-06-01 | Epicentre Technologies Corporation | Methods for obtaining directionally truncated polypeptides |
| JP2010534474A (ja) * | 2007-07-26 | 2010-11-11 | パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド | 分子冗長配列決定 |
| US8383345B2 (en) | 2008-09-12 | 2013-02-26 | University Of Washington | Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads |
| DK2376517T3 (da) * | 2008-10-24 | 2013-02-11 | Epict Technologies Corp | Transposon-ende-sammensætninger og fremgangsmåder til at modificere nukleinsyrer |
| US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
| US9074251B2 (en) | 2011-02-10 | 2015-07-07 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| EP2635679B1 (en) * | 2010-11-05 | 2017-04-19 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| US8829171B2 (en) | 2011-02-10 | 2014-09-09 | Illumina, Inc. | Linking sequence reads using paired code tags |
| DK3037536T3 (da) | 2011-01-28 | 2020-01-13 | Illumina Inc | Oligonukleotiderstatning for di-taggede og retnings biblioteker |
| AU2012212148B8 (en) | 2011-02-02 | 2017-07-06 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Massively parallel contiguity mapping |
| US20130017978A1 (en) | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Finnzymes Oy | Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library |
| US9145623B2 (en) | 2011-07-20 | 2015-09-29 | Thermo Fisher Scientific Oy | Transposon nucleic acids comprising a calibration sequence for DNA sequencing |
| US9388465B2 (en) | 2013-02-08 | 2016-07-12 | 10X Genomics, Inc. | Polynucleotide barcode generation |
| US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| CN114891871A (zh) | 2012-08-14 | 2022-08-12 | 10X基因组学有限公司 | 微胶囊组合物及方法 |
| US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
| US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| EP3567116A1 (en) | 2012-12-14 | 2019-11-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
| DK3553175T3 (da) | 2013-03-13 | 2021-08-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af et nukleinsyresekvenseringsbibliotek |
| EP4321628A2 (en) | 2013-05-23 | 2024-02-14 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Transposition into native chromatin for personal epigenomics |
| EP3083994B1 (en) | 2013-12-20 | 2021-08-18 | Illumina, Inc. | Preserving genomic connectivity information in fragmented genomic dna samples |
| US11136576B2 (en) | 2014-02-03 | 2021-10-05 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Method for controlled DNA fragmentation |
| EP3102691B1 (en) | 2014-02-03 | 2019-09-11 | Thermo Fisher Scientific Baltics UAB | Method for controlled dna fragmentation |
| US9694361B2 (en) | 2014-04-10 | 2017-07-04 | 10X Genomics, Inc. | Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same |
| CN113249435A (zh) | 2014-06-26 | 2021-08-13 | 10X基因组学有限公司 | 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法 |
| WO2016061517A2 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Illumina Cambridge Limited | Contiguity preserving transposition |
| BR112017008877A2 (pt) | 2014-10-29 | 2018-07-03 | 10X Genomics Inc | métodos e composições para sequenciamento de ácido nucleico-alvo |
| US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
| EP3628732B1 (en) * | 2014-11-05 | 2023-05-03 | Illumina, Inc. | Transposase compositions for reduction of insertion bias |
| AU2016207023B2 (en) | 2015-01-12 | 2019-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Processes and systems for preparing nucleic acid sequencing libraries and libraries prepared using same |
| CN115651972A (zh) | 2015-02-24 | 2023-01-31 | 10X 基因组学有限公司 | 用于靶向核酸序列覆盖的方法 |
| WO2016137973A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-09-01 | 10X Genomics Inc | Partition processing methods and systems |
| JP6698708B2 (ja) | 2015-06-09 | 2020-05-27 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体 |
| EP3384048B1 (en) | 2015-12-04 | 2021-03-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
| WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
| US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
| WO2018129368A2 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Editas Medicine, Inc. | Methods of assessing nuclease cleavage |
| CN117512066A (zh) | 2017-01-30 | 2024-02-06 | 10X基因组学有限公司 | 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统 |
| CN109526228B (zh) | 2017-05-26 | 2022-11-25 | 10X基因组学有限公司 | 转座酶可接近性染色质的单细胞分析 |
| US10400235B2 (en) | 2017-05-26 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
| EP3652312A1 (en) | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
| SG11201913654QA (en) | 2017-11-15 | 2020-01-30 | 10X Genomics Inc | Functionalized gel beads |
| US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
| US20210115475A1 (en) | 2018-01-30 | 2021-04-22 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for modulating chromosomal rearrangements |
| EP3775271A1 (en) | 2018-04-06 | 2021-02-17 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for quality control in single cell processing |
| WO2023225095A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Illumina Cambridge Limited | Preparation of size-controlled nucleic acid fragments |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5677170A (en) * | 1994-03-02 | 1997-10-14 | The Johns Hopkins University | In vitro transposition of artificial transposons |
-
1997
- 1997-07-14 FI FI972992A patent/FI103809B1/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-07-10 WO PCT/FI1998/000586 patent/WO1999004035A1/en active IP Right Grant
- 1998-07-10 EP EP98935045A patent/EP1005571B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-10 AU AU84429/98A patent/AU738345B2/en not_active Expired
- 1998-07-10 JP JP2000503240A patent/JP2001510055A/ja active Pending
- 1998-07-10 US US09/462,013 patent/US6593113B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-10 AT AT98935045T patent/ATE382095T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-07-10 DE DE69838911T patent/DE69838911D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-10 CA CA002295968A patent/CA2295968C/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999004035A1 (en) | 1999-01-28 |
| EP1005571B1 (en) | 2007-12-26 |
| AU8442998A (en) | 1999-02-10 |
| DE69838911D1 (de) | 2008-02-07 |
| US6593113B1 (en) | 2003-07-15 |
| EP1005571A1 (en) | 2000-06-07 |
| FI972992A0 (fi) | 1997-07-14 |
| FI103809B1 (fi) | 1999-09-30 |
| CA2295968A1 (en) | 1999-01-28 |
| AU738345B2 (en) | 2001-09-13 |
| ATE382095T1 (de) | 2008-01-15 |
| CA2295968C (en) | 2008-11-25 |
| JP2001510055A (ja) | 2001-07-31 |
| FI972992A (fi) | 1999-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI103809B (fi) | In vitro -menetelmä templaattien tuottamiseksi DNA-sekventointia varten | |
| US10450608B2 (en) | Nucleic acid adaptors and uses thereof | |
| Knapp et al. | Transcription and processing of intervening sequences in yeast tRNA genes | |
| Hanai et al. | Human TOP3: a single-copy gene encoding DNA topoisomerase III. | |
| Simpson et al. | Comparison of the maxicircle (mitochondrial) genomes of Leishmania tarentolae and Trypanosoma brucei at the level of nucleotide sequence. | |
| Efstratiadis et al. | The primary structure of rabbit β-globin mRNA as determined from cloned DNA | |
| Goldman et al. | NanoRNAs prime transcription initiation in vivo | |
| Broglie et al. | Cloned DNA sequences complementary to mRNAs encoding precursors to the small subunit of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase and a chlorophyll a/b binding polypeptide | |
| EP0902035A2 (en) | Altered thermostable DNA polymerases for sequencing | |
| CN105705656A (zh) | 方法 | |
| CN107250447A (zh) | 一种长片段dna文库构建方法 | |
| Bayev et al. | The structure of the yeast ribosomal RNA genes. 2. The nucleotide sequence of the initiation site for ribosomal RNA transription | |
| KR100559098B1 (ko) | Ｄｎａ 의 합성방법 | |
| CN114540473B (zh) | 一种新型核酸测序系统 | |
| Ono et al. | Cloning and characterization of the CYS3 (CYI1) gene of Saccharomyces cerevisiae | |
| US20090215034A1 (en) | Method for selectively detecting subsets of nucleic acid molecules | |
| Young et al. | Nucleotide sequence and analysis of NMR, a negative-acting regulatory gene in the nitrogen circuit of Neurospora crassa | |
| White et al. | RNA end-labeling and RNA ligase activities can produce a circular rRNA in whole cell extracts from trypanosomes | |
| Osinga et al. | A putative precursor for the small ribosomal RNA from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae | |
| EP0810288A2 (en) | A new DNA polymerase with proof-reading 3'-5' exonuclease activity | |
| Lin et al. | Characterization of the rRNA-encoding genes and transcripts, and a group-I self-splicing intron in Pneumocystis carinii | |
| CN114480578B (zh) | 一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法 | |
| Castagnoli et al. | Analysis of dominant copy number mutants of the plasmid pMB1 | |
| Reich et al. | Evolutionary origin of the U6 small nuclear RNA intron | |
| US7060455B1 (en) | Broad specificity DNA damage endonuclease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |