CN111172257A - 一种带编码的凝胶微粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种带编码的凝胶微粒及其制备方法和应用。所述凝胶微粒上连接有至少两种接头，所述接头为核苷酸链，包括依次相连的配对区、条码区和引物区；所述配对区包括Acrydite修饰的测序引物；所述配对区修饰有光敏感基团。本发明提供的带编码的凝胶微粒利用微流控技术和两轮退火延伸制备得到，合成方法较为简单；且所述接头可以在紫外曝光的条件下脱落，而后作为引物对细胞核的开放染色质进行扩增，同时接头上的条码区可以作为识别序列，具有同样条码区的序列来自于同一细胞，在进行高通量测序时，可以通过条码区对测序结果进行分类，将所得结果归属为各个单细胞，实现单细胞ATAC‑seq。

Description

一种带编码的凝胶微粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于染色质开放性测序技术领域，具体涉及一种带编码的凝胶微粒及其制备方法和应用，尤其涉及一种单细胞ATAC测序中使用的带编码的凝胶微粒及其制备方法和应用。
背景技术
真核生物的细胞核DNA并不是裸露的，而是与组蛋白结合形成染色体的基本结构单位核小体，核小体再经逐步的压缩折叠最终形成染色体高级结构(如人的DNA链完整展开约2m长，经过这样的折叠就变成了纳米级至微米级的染色质结构而可以储存在小小的细胞核)。而DNA的复制和基因的转录是需要将DNA的高级结构打开，从而允许一些调控因子结合，这部分打开的染色质，称为开放染色质(Open chromatin)。
二代高通量测序技术的发展大大地推动了生命科学研究领域的巨大变革。科学家们不再局限于研究细胞的整体表征，更多地从基因组、转录组、表观组等多个方面进行单细胞组学研究来揭示单个细胞的基因结构、基因表达状态。通过分析细胞间的异质性来获取更多精准信息，在肿瘤、干细胞、神经、生殖等研究领域具有重要意义。目前，开放染色质的研究方法包括可接近性染色质高通量测序技术(Assay for Transposase-AccessibleChromatin with high throughput sequencing，ATAC-seq)以及传统的DNase-Seq(DNase测序)及FAIRE-seq(Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements，甲醛辅助分离调控元件测序技术)等。
ATAC-seq通过转座酶对开放染色质区域进行切割建库，结合高通量测序技术来分析染色体的可进入性(Chromatin Accessibility)，染色质的可进入性与转录调控密切相关，常用于表观遗传和基因调控的研究。ATAC-Seq由于所需细胞量少，可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态，目前已经成为研究染色质开放性的首选技术方法。ATAC-seq与其他染色质开放性检测技术相比，具有操作简单、省时省力、无需抗体富集和样本起始量低等显著优势。
单细胞ATAC-seq技术的发展将更有效地分析具有高度异质性的组织，获取更精准的亚细胞群信息。单细胞ATAC-seq技术从数千万个细胞的总体上紧密类似的图谱获得来自数百个单细胞的ATAC-seq图谱，提供了对细胞与细胞之间异质性的了解。单细胞ATAC-seq将调控与表型的细节连接起来，为洞察细胞异质性的分子基础提供了新的视角，该技术同样可以检测小的或者稀有生物样本的表观遗传学细节，从而在单细胞水平上检测细胞分化等问题。
然而，单细胞ATAC-seq方法步骤较为复杂，在具体的实验过程中容易受到实验室条件的限制，现有技术中单细胞测序时使用的凝胶微粒制备方法较为复杂，且制得表面连接有核苷酸的凝胶微粒在使用时，需要施加化学刺激如还原剂等使核苷酸从可降解的凝胶微粒表面脱落，然而这种化学刺激可能会破坏核苷酸链或扩增用的酶，使扩增无法正常进行。
因此，急需开发一种能够在不影响扩增的情况下实现表面核苷酸链的脱落，还能够对所得DNA文库进行合理有效地编码，同时合成方法较为简单的凝胶微粒，以满足单细胞ATAC技术的发展需求。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种带编码的凝胶微粒及其制备方法和应用。所述凝胶微粒能在紫外曝光的条件下较连接在表面的接头释放至液滴内作为引物实现DNA的扩增，并通过接头上的条码序列实现单细胞建库。本发明提供的凝胶微粒可实现多细胞同时扩增，方法简单，实验效率更高。为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种带编码的凝胶微粒(Gel beads)，所述凝胶微粒连接有至少两种接头，所述接头为核苷酸链，包括依次相连的配对区、条码区和引物区；所述配对区包括Acrydite修饰的测序引物；所述配对区修饰有光敏感基团。
本发明提供的凝胶微粒表面连接至少两种接头，一般情况下凝胶微粒表面含有两种接头，所述接头含有光敏感基团，在紫外曝光的刺激下会从凝胶微粒表面脱落进入扩增反应液中，接头上的引物区可以与目标核苷酸链互补配对，因而接头能够实现对目标核苷酸链的扩增，同时接头上的条码区可以作为同一细胞的识别序列，具有同样条码区的序列来自于同一细胞，在进行高通量测序时，可以通过条码区对测序结果进行分类，将所得结果归属为各个单细胞文库，实现对单细胞的测序，进而分析细胞与细胞之间的差异。
作为本发明优选的技术方案，所述条码区为随机碱基序列，所述随机碱基的个数为8-16个，例如可以是8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个等。
优选地，所述引物区与转座酶携带的核苷酸链互补配对。
优选地，所述光敏感基团的曝光波长为320-400nm，例如可以是波长为320nm、325nm、330nm、340nm、350nm、365nm、370nm、380nm、390nm或400nm等的长波段紫外光，优选为365nm。
本发明中所述光敏感基团会导致接头在紫外曝光条件下从凝胶微粒上脱落，但是长波段的紫外曝光不会影响扩增反应液中的核酸和蛋白质，相比于化学刺激，例如添加还原剂使凝胶微粒降解，还原剂可能会影响扩增时使用的底物和酶，导致扩增异常从而影响建库的结果，因此紫外曝光的方法可以使扩增更加准确稳定。
优选地，所述凝胶微粒的直径为55-60μm，例如可以是55μm、56μm、57μm、58μm、59μm或60μm等。
本发明提供的凝胶微粒，其接头的长度为46-60bp；其中，所述配对区的长度为24-29bp；所述条码区的长度为8-16bp；所述引物区的长度为14-15bp。凝胶微粒上连接的接头要符合Illumina文库测序的接头要求，过长、过短或序列结构差异都将导致扩增及测序失败。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的带编码凝胶微粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备修饰有连接Oligo的凝胶微粒，所述连接Oligo作为所述凝胶微粒接头的配对区；
(2)将修饰有连接Oligo的凝胶微粒与第一轮编码Oligo混合，退火杂交、延伸、变性，混合后除去游离的编码Oligo；
(3)将步骤(2)所得的凝胶微粒与第二轮编码Oligo再次混合，退火杂交、延伸、变性，混合后除去游离的编码Oligo，得到所述带编码的凝胶微粒。
本发明中，所述带编码的凝胶微粒的制备方法主要包括两个部分；第一部分为利用微流控液滴技术，通过液滴微流控芯片油包水的原理，合成直径为55-60μm的凝胶微粒，并在凝胶微粒表面连接一段序列用于接头的合成；第二部分，采用恒温扩增方法，通过软件设计多种带条码的编码Oligo，利用排列组合思想对凝胶微粒进行两轮的延伸合成反应，假设条码区的序列有384种，编码Oligo的配对区与凝胶微粒表面的序列互补配对，一共有两种，两轮编码Oligo共有768种，分别用于两轮扩增即可产生147,456(384×384)种连接不同编码的凝胶微粒。
这些不同编码的凝胶微粒可以同时对十四万多个不同的细胞核进行扩增，扩增后的产物即使混合在一起进行测序，最终也能够通过条码区序列对其进行分类，具有相同条码的序列均来自于同一细胞核，实现对单一细胞的细胞核进行测序和建库。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述连接Oligo包括Acrydite修饰的测序引物，所述连接Oligo修饰有光敏感基团。
优选地，步骤(2)所述第一轮编码Oligo分为96-384种，例如可以是96种、192种、288种或384种等。
优选地，步骤(3)所述第二轮编码Oligo分为96-384种，例如可以是96种、192种、288种或384种等。
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述编码Oligo分为一区、二区和三区，所述一区与接头的配对区互补配对，所述二区与接头的条码区互补配对，所述三区与接头的引物区互补配对。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述修饰有连接Oligo的凝胶微粒的制备方法包括如下步骤：将含有两种连接Oligo的丙烯酰胺混合液和基底油-TEMED混合液分别导入凝胶微粒制备芯片中，得到修饰有连接Oligo的凝胶微粒。
优选地，通过蠕动泵控制所述丙烯酰胺混合液和基底油-TEMED混合液混合时的流速。
优选地，所述丙烯酰胺混合液的流速为200-500μL/h，例如可以是200μL/h、220μL/h、240μL/h、300μL/h、350μL/h、400μL/h、450μL/h或500μL/h等。
优选地，所述基底油-TEMED混合液的流速为240-600μL/h，例如可以是240μL/h、260μL/h、300μL/h、350μL/h、400μL/h、450μL/h、500μL/h、550μL/h或600μL/h等。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)和步骤(3)所述编码Oligo的浓度为3-10μM，例如可以是3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM等。
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述退火杂交的温度为58-62℃，例如可以是58℃、58.5℃、59℃、60℃、60.5℃、61℃或62℃等，优选为60℃。
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述退火杂交的时间为15-25min，例如可以是15min、16min、18min、20min、22min、23min、24min或25min等。
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述退火杂交时使用的溶液中dNTP的浓度为1-3mM，例如可以是1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.5mM、2.8mM或3mM等，优选为2.5mM。
作为本发明优选的技术方案，所述延伸使用的酶为等温扩增酶。
优选地，所述等温扩增酶包括Bst 2.0DNA Polymerase。
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述延伸的温度为58-62℃，例如可以是58℃、58.5℃、59℃、60℃、60.5℃、61℃或62℃等，优选为60℃。
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述延伸的时间为1-2h，例如可以是1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h或2h等。
优选地，所述延伸完成后还包括加入终止缓冲液终止延伸的操作。
优选地，加入所述终止缓冲液后还包括加入变性缓冲液和中性缓冲液洗涤的操作。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将含有两种连接Oligo的丙烯酰胺混合液和基底油-TEMED混合液加入凝胶微粒制备芯片，利用蠕动泵控制所述丙烯酰胺混合液的流速为200-500μL/h，所述基底油-TEMED混合液的流速为240-600μL/h，得到修饰有两种连接Oligo的凝胶微粒；
(2)将步骤(1)制备的凝胶微粒与第一轮编码Oligo混合，所述第一轮编码Oligo的浓度为3-10μM，而后58-62℃退火杂交15-25min，再使用等温扩增酶在58-62℃延伸1-2h，所述第一轮编码Oligo的一区与凝胶微粒上其中一种连接Oligo的互补配对，变性后除去游离的编码Oligo，得到同时含有连接Oligo和接头的凝胶微粒；
(3)将步骤(2)制备的凝胶微粒与第二轮编码Oligo混合，所述第二轮编码Oligo的浓度为3-10μM，而后58-62℃退火杂交15-25min，再使用等温扩增酶在58-62℃延伸1-2h，所述第二轮编码Oligo的一区与凝胶微粒上另一种连接Oligo互补配对，变性后除去游离的编码Oligo，得到所述带编码的凝胶微粒。
第三方面，本发明还提供一种单细胞ATAC测序试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的带编码的凝胶微粒。本发明提供的单细胞ATAC测序试剂盒，其制备方法较为简单，同时还可以实现高通量高效率的测序。
优选地，所述试剂盒还包括转座酶。
优选地，所述转座酶包括Tn5。
第四方面，本发明还提供一种利用第一方面提供的凝胶微粒的进行单细胞ATAC测序方法，包括如下步骤：
利用液滴微流控芯片将如第一方面所述的凝胶微粒和转座酶处理后的细胞核包裹于由PCR缓冲液组成的液滴中，使用波长320-400nm的紫外光照射将所述凝胶微粒上的接头释放至液滴中，作为引物对所述细胞核上的片段进行PCR扩增；而后将所述液滴破裂，纯化出目标片段建立文库并测序。
本发明中，利用带编码的凝胶微粒实现单细胞测序的方法主要包括三个部分。其中，第一部分为：将细胞核悬液和编码后的凝胶微粒采用液滴微流控芯片进行包裹，将带编码的凝胶微粒和细胞核包裹于液滴中；第二部分为：将包裹后的液滴直接在液滴内进行PCR建库，之后将液滴破裂，对目标片段进行筛选建立文库并送样测序；第三部分为：采用生物信息学方法将测得数据进行ATAC染色体状态等信息进行分析。本发明中，所述测序方法具有高效率高通量的特点，减少了单细胞测序的步骤，大大节约了测序的时间，实现在单细胞水平上分析细胞分化等问题。
同时，本发明中尽可能地使每个所述液滴中仅包含一个所述凝胶微粒和一个细胞核，为了提高唯一包裹率，可以通过控制细胞核浓度、加入BSA蛋白减少细胞聚团等方法来提高液滴中单细胞的包裹几率，本发明中所用方法可以使一个液滴中包含一个所述凝胶微粒的几率提高为80-90％。
作为本发明优选的技术方案，所述液滴的直径为100-120μm，例如可以是100μm、102μm、105μm、108μm、110μm、115μm、116μm、118μm或120μm等。
优选地，制备所述液滴时通过蠕动泵控制凝胶微粒、细胞核悬液及PCR缓冲液的流速。
优选地，所述凝胶微粒的流速为40-50μL/h，例如可以是40μL/h、41μL/h、42μL/h、43μL/h、44μL/h、45μL/h、46μL/h、48μL/h或50μL/h等。
优选地，所述细胞核悬液的流速为180-220μL/h，例如可以是180μL/h、185μL/h、190μL/h、195μL/h、200μL/h、205μL/h、210μL/h、215μL/h或220μL/h等，优选为200μL/h。
优选地，所述PCR缓冲液的流速为180-220μL/h，例如可以是180μL/h、185μL/h、190μL/h、195μL/h、200μL/h、205μL/h、210μL/h、215μL/h或220μL/h等，优选为200μL/h。
优选地，使用荧光定量仪检测所述PCR扩增后的产物浓度和所述文库浓度。
优选地，所述单细胞ATAC测序方法中还包括对所得测序结果进行染色体状态分析的步骤。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的凝胶微粒合成方法较为简单，利用排列组合思想通过两轮的编码延伸，结合液滴微流控技术，即可得到大量不同编码的凝胶微粒，使凝胶微粒的制备更加高效，同时所得微粒的成本可控，为实现高通量的单细胞测序提供基础；
(2)本发明提供的凝胶微粒上的接头，可以在紫外曝光下从微粒表面脱落，不会影响扩增反应液中的核酸和蛋白质，保证扩增的正常进行，不会影响建库的结果；
(3)本发明提供的凝胶微粒能够同时对大量的细胞核进行扩增，且测序结果可以通过凝胶微粒上的编码进行分类，使用该方法能够高通量高效率地获取单细胞的ATAC-seq图谱，方便研究者分析细胞与细胞之间的差异，实现在单细胞水平分析生物体的表观性状等问题。
附图说明
图1为实施例1提供的带编码的凝胶微粒的第一轮合成步骤示意图。
图2为实施例1提供的带编码的凝胶微粒的第二轮合成步骤示意图。
图3为人胚肾细胞293T和小鼠结肠癌细胞CT26的细胞核DNA片段长度分布曲线图。
图4为人胚肾细胞293T和小鼠结肠癌细胞CT26的细胞核DNA分离图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种带编码的凝胶微粒。具体制备步骤包括：凝胶微粒的制备与凝胶微粒的编码。
1.凝胶微粒的制备
在2.5mL基底油(Carrier oil，来自伯乐液滴PCR中QX200试剂盒)中加入10μLTEMED(四甲基乙二胺)，混合均匀；采用2mL的注射器并倒置，用1mL移液枪将配置好的基底油-TEMED混合液转移至注射器，转移过程中一边将注射器中混合液推进一边倒抽注射器；
配制丙烯酰胺混合液，混合液配方如表1所示，由于Acrydite-modified DNAprimer1&2(Acrydite修饰的DNA引物1和2)中含有光敏感基团，所以配制溶液过程中，要注意避免波长小于400nm的光照射(例如可以保持操作室避光操作，或在显微镜操作台罩上避光罩，本实施例中保持操作室避光进行操作)；
表1
Figure BDA0002369794130000101
Figure BDA0002369794130000111
将丙烯酰胺混合液移入注射器，将基底油-TEMED注射器毛细管和丙烯酰胺注射器的毛细管均轻轻插入凝胶微粒制备芯片对应入口，15cm长的毛细管插入芯片出口，另一端插入15mL离心管中用来收集液滴，离心管中预先加入200μL基底油和1mL矿物油；在蠕动泵上，设置液相流速为300μL/h，油相流速为360μL/h；
在整个流速包裹过程进行5min后，将芯片出口的毛细管插入收集用离心管，并保持整个包裹过程静止勿受扰动，液滴在显微镜下具有良好的一致性，直径约为55-60μm；在包裹完成后，将收集了油包水液滴产物的离心管保持竖直，转移至65℃烘箱静置过夜，勿受扰动，液滴会固化形成凝胶微粒。
收集管中的凝胶微粒处于中层，下层为基底油，上层为矿物油，用注射器针头移除上层矿物油和下层基底油，加入500μL的凝胶微粒清洗缓冲液于收集管中；加入1mL体积浓度为20％(v/v)的PFO(1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol，全氟辛醇)来分离油相和水相，离心5,000g，30s。下层油水相接处将出现牛奶状半透明层，移除下层PFO，重复加入PFO清洗，直到半透明层消失；
移除PFO层，加入1mL体积浓度为1％(v/v)的Span 80-Hexane(山梨醇甘油酸酯-正己烷)，充分混匀后离心3,000g，30s，重复清洗两次；在收集管中加入2mL TBSET溶液，以3,000g的速度离心3min，凝胶微粒沉淀成透明层，移除上清溶液，重复清洗2次，去除残留的Span 80-Hexane；加入2mL TBSET至收集管中，并用直径为100μm的细胞滤网过滤去除直径大的凝胶微粒；离心去除凝胶微粒上清液，并避光保存于4℃中，以用于编码。
此步骤通过液滴微流控芯片油包水的原理，合成了直径在55-60μm左右的凝胶微粒，且凝胶微粒表面连接两种连接Oligo，分别为Acrydite-modified DNA primer1&2，作为凝胶微粒接头的配对区，用来与编码Oligo的一区配对。
2.凝胶微粒的编码
凝胶微粒的编码分为两轮，每轮使用96种编码Oligo。每轮将其中一条连接Oligo接上条码区和引物区，根据排列组合原理，总共可以得到9,216(96×96)种带编码的凝胶微粒。
SEQ ID NO.1为第一轮编码Oligo之一，其序列为：3'-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTA(TCATACCT)CAGAGCACCCGAGCC-5'，其中TCATACCT为条码区互补核苷酸序列；
SEQ ID NO.2为第二轮编码Oligo之一，其序列为：3'-TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTG(CTGAGTAT)AGCAGCCGTCGC AG-5'，其中CTGAGTAT为条码区互补核苷酸序列。
第一轮的合成步骤示意图如图1所示，具体操作如下：
凝胶微粒水溶液的制备：在凝胶微粒中加入清洗溶液HBW(HBW溶液的配方如表2所示)，混匀后以1,000g的速度离心3min，移除上清液，该过程操作3次；在凝胶微粒中加水至总体积为4,610μL，备于后续96分管的恒温延伸实验。
表2
成分 体积
1M Tris-HCl(pH 8.0) 10mL
0.5M EDTA 200μL
10％(v/v)吐温20 200μL
ddH<sub>2</sub>O 980mL
编码Oligo的预处理：将96种编码Oligo分别稀释至浓度100μM，并取2.4μL至96孔PCR板中，用于凝胶微粒编码。
退火延伸所需溶液的配制：配制溶液A和溶液B，配制时按96孔板的量来准备，其中溶液A用于编码Oligo与凝胶微粒上的接头退火，溶液B用于延伸反应形成接头上的条码区和引物区，溶液A与溶液B的配方分别如表3和表4所示，其中Bst.Polymerase(购自NEB.Inc，8000U/mL)。
表3
Figure BDA0002369794130000131
表4
Figure BDA0002369794130000132
Figure BDA0002369794130000141
退火：将溶液A分到4个含有编码Oligo的96孔板中，每孔52.6μL，编码Oligo和凝胶微粒上的连接Oligo退火：将PCR板盖上硅胶盖，放置于PCR仪中，加热85℃2min，接着加热至60℃保持20min，盖顶温度设置为105℃。
延伸：之后将PCR板在冰盒上冷却并离心，除去盖子，将配置好的溶液B加入，每个PCR分管加入5μL的溶液B混匀，再盖上新的硅胶盖子，将PCR板继续放入PCR仪中60℃加热2h，盖顶温度为105℃；凝胶微粒上的连接Oligo完成了第一轮的延伸，形成了完整的接头。
收集：将反应后的PCR板置于冰上冷却，所有的凝胶微粒沉淀在底部，移除PCR硅胶盖，在每一PCR分管中加入40μL含2.5mM EDTA(乙二胺四乙酸)的缓冲液A终止延伸反应，并将PCR管中所有的溶液混合移入装有200μL该缓冲液A的15mL离心管；将收集了凝胶微粒的离心管以50rpm的转速旋转混合10min，再以300g的速度离心5min，移除上清液，加入含1mMEDTA的缓冲液B，以25rpm的转速旋转混合10min，再以300g的速度离心5min。
变性：移除上清液，再用缓冲液B清洗两次，按照表5配制DNA变性缓冲液，其中NaOH需要新鲜配置。将配制的变性缓冲液加入6mL至收集离心管中，在常温旋转混合10min，并以300g速度离心3min，并移除上清液，将凝胶微粒用变性缓冲液清洗两次，上下混匀1min后，以300g速度离心3min，并移除上清液；再加入中性缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M HCl，0.01MEDTA，pH为8.0)上下混匀1min后，以300g速度离心3min，并移除上清液，清洗两次。
表5
成分 体积
NaOH 0.375mL
Brij-35(30％) 0.42mL
ddH<sub>2</sub>O 补足25mL
根据图2所示的合成步骤，重复以上操作，进行第二轮编码。
本实施例中采用恒温扩增方法，利用排列组合思想对凝胶微粒进行两轮的引物延伸合成反应，产生9,216(96×96)种连接不同接头的凝胶微粒。
实施例2
本实施例利用实施例1合成的带编码的凝胶微粒进行单细胞ATAC-seq。具体方法如下：
1.将细胞核悬液和编码后的凝胶微粒采用液滴微流控芯片进行包裹，将带编码的凝胶微粒和细胞核包裹于液滴中。
凝胶编码微粒的预处理：凝胶编码微粒用HBW缓冲液清洗，在常温下以1,000g速度离心3min，移除上清液；清洗两次，按表6比例配制实施例1制备的凝胶微粒悬液；在HBW溶液中，移除上清液后实施例1制备的凝胶微粒126μL的样品足够30μL 6,000个细胞核悬液进行包裹编码建库。
表6
Figure BDA0002369794130000151
Figure BDA0002369794130000161
配置好的悬液室温静置5min，混匀后用70μm直径的细胞筛网过滤，将大颗粒的凝胶微粒去除，防止堵塞流体通路，5,000g，1min，将过滤后的凝胶微粒悬液离心，移除上清，这时留下的微粒体积大概为50μL，保证凝胶微粒紧密地聚集，取以1mL注射器，将凝胶微粒移入毛细管，准备插入芯片，保持注射器和毛细管避光。
取长度为～60cm毛细管插入1mL注射器，用移液枪将400μL HFE 7500氟化油移入注射器，竖直倒置注射器固定在蠕动泵(竖直放置)上，移除气泡，将氟化油推至毛细管出口端，并将PCR缓冲液移入毛细管，PCR缓冲液用于细微调节PCR溶液体系，其配方如表7所示：
表7
Figure BDA0002369794130000162
细胞核(Nuclei)悬液配制：使用Tn5转座酶(诺唯赞，Vazyme)处理小鼠结肠癌细胞CT26和人胚肾细胞293T，按照转座酶试剂盒说明进行操作；而后配制单细胞ATAC-seq的悬液，配方如表8如下：
表8
Figure BDA0002369794130000171
将毛细管出口端插入细胞核悬液，并在蠕动泵上设置倒抽速度为1,000μL/h，将所有细胞核悬液倒抽入毛细管内；将所有的毛细管进样口和出样口准备完毕，设置进样的凝胶微粒的流速为45μL/h，细胞核悬液的流速为200μL/h，PCR缓冲液的流速为200μL/h，基底油的流速为250μL/h，流体稳定后收集包裹后的液滴。
通过以上步骤，在微流控芯片上采用油包水原理，获得直径约为100-120μm的液滴，其中凝胶微粒和细胞核包裹于液滴中，80-90％的液滴中含有一个凝胶编码微粒。
2.将包裹后的液滴直接在液滴内进行PCR建库，之后将液滴破裂，对目标片段进行筛选建立文库并送样测序。
收集到液滴需要保持稳定，PCR管要保持稳定的竖直放置状态，避免摇晃对液滴的破坏。将PCR管插入装有冰的盒子，用两个8W的UV灯管(波长为365nm)曝光15min，曝光引物将从凝胶微粒上释放到液滴缓冲液中，作为引物对细胞核内的DNA目标片段进行扩增。在UV365nm波长曝光后，凝胶微粒上被标记的引物被释放，凝胶微粒的荧光消失，同时UV 365nm波长对DNA和蛋白没有破坏作用，不会对PCR产生影响。UV曝光后，将进行PCR扩增，温度控制如表9所示：
表9
Figure BDA0002369794130000181
PCR产物的片段分选分成三个阶段：
(a)由于PCR产物产量较低，二聚体较高，因此在第一步采用切胶回收目标片段；
PCR结束后，液滴仍旧保持原状，此时每个PCR管加入10μL浓度为20％的PFO-HFE7500，静置1min，油滴破裂水相和油相分离；将4管PCR液相混合加入到1.5mL离心管(Eppendorf管，EP管)中，去除油相；以2,000g速度离心1min，转移上清液至另一EP管中用于产物收集；
在剩余凝胶微粒中加入30μL PBS，混匀后再以2,000g速度离心1min，转移上清液至产物收集离心管中，弃除留下的凝胶微粒；制备浓度为2％的琼脂凝胶，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压为130V，时间为30min；
电泳完成后，在低功率UV曝光下，将目标条带200-800bp切块，转移至EP管中；按照胶回收试剂盒步骤要求回收纯化DNA；采用Qubit荧光定量仪测产物的浓度；
(b)用公共引物片段扩增，增加文库量，不影响片段上的编码；根据测得的浓度来计算公共引物扩增圈数，扩增时按表10所示体系，在体系中加入20μL纯化回收的PCR产物：
表10
Figure BDA0002369794130000191
(c)用DNA片段分选纯化磁珠对目标片段回收：扩增产物(即文库)用0.8×VAHTSDNA Clean Beads进行片段分选纯化；
Qubit和Bioanalyzer 2100测文库浓度及片段分布，并上机测序，测序模式为PE150，测序仪器为Illumina Hiseq X Ten。
3.采用生物信息学方法将测得数据进行ATAC染色体状态等信息进行分析。
使用Fastp进行数据质控，过滤测序结果差的序列以及接头序列；使用bowtie2将测序数据比对到参考基因组上，设置参数-X，最大插入片段为2,000；保留双端完全比对上基因组的片段；排除ENCODE数据黑名单区域，这些区域在测序中显示异常或非结构化的reads数，而与细胞系和实验类型无关。
数据黑名单区域参照：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hg19/encodeDCC/wgEncodeMapability/；使用Picard去除重复序列；去除线粒体数据；使用MACS2进行peak calling。
文库分析后的数据如下图，图3为人胚肾细胞293T和小鼠结肠癌细胞CT26的细胞核DNA片段长度分布曲线图，人胚肾细胞293T在片段长度120左右出现峰值，小鼠结肠癌细胞CT26在片段长度100以及200处出现峰值，显示出所得曲线为典型的ATAC-seq的染色体中核小体分布峰值曲线；图4为人胚肾细胞293T和小鼠结肠癌细胞CT26的细胞核DNA分离图，由图可知显示了本发明中制备的凝胶微粒以及使用的试剂和测试平台能够很好地将混合的人鼠细胞分离，实现单细胞水平的ATAC测序。
综上所述，使用本发明提供的方法制备带编码的凝胶微粒，方法简单，成功率高，且成本可控，且所述带编码的凝胶微粒可以同时实现高通量的单细胞测序，为实验室进行单细胞ATAC-seq实验提供了可能。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方科技大学
<120> 一种带编码的凝胶微粒及其制备方法和应用
<130> 20200114
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gttcgtcttc tgccgtatgc tctatcatac ctcagagcac ccgagcc 47
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttactatgcc gctggtggct ctagatgtgc tgagtatagc agccgtcgca g 51

Claims (10)

1.一种带编码的凝胶微粒，其特征在于，所述凝胶微粒连接有至少两种接头，所述接头为核苷酸链，包括依次相连的配对区、条码区和引物区；
所述配对区包括Acrydite修饰的测序引物；
所述配对区修饰有光敏感基团。
2.根据权利要求1所述的凝胶微粒，其特征在于，所述条码区为预先编码的碱基序列，所述条码区的碱基个数为8-16个；
优选地，所述引物区与转座酶携带的核苷酸链互补配对；
优选地，所述光敏感基团的曝光波长为320-400nm，优选为365nm；
优选地，所述凝胶微粒的直径为55-60μm。
3.一种如权利要求1或2所述的带编码的凝胶微粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备修饰有连接Oligo的凝胶微粒，所述连接Oligo作为所述凝胶微粒接头的配对区；
(2)将修饰有连接Oligo的凝胶微粒与第一轮编码Oligo混合，退火杂交、延伸、变性，混合后除去游离的编码Oligo；
(3)将步骤(2)所得的凝胶微粒与第二轮编码Oligo再次混合，退火杂交、延伸、变性，混合后除去游离的编码Oligo，得到所述带编码的凝胶微粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述连接Oligo包括Acrydite修饰的测序引物，所述连接Oligo修饰有光敏感基团；
优选地，步骤(2)所述第一轮编码Oligo包括96-384种；
优选地，步骤(3)所述第二轮编码Oligo包括96-384种；
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述编码Oligo包括一区、二区和三区，所述一区与接头的配对区互补配对，所述二区与接头的条码区互补配对，所述三区与接头的引物区互补配对。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述修饰有连接Oligo的凝胶微粒的制备方法包括如下步骤：
将含有两种连接Oligo的丙烯酰胺混合液和基底油-TEMED混合液分别加入凝胶微粒制备芯片中，得到修饰有连接Oligo的凝胶微粒；
优选地，通过蠕动泵控制所述丙烯酰胺混合液和基底油-TEMED混合液在芯片流道中混合的流速；
优选地，所述丙烯酰胺混合液的流速为200-500μL/h；
优选地，所述基底油-TEMED混合液的流速为240-600μL/h。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)所述编码Oligo的浓度为3-10μM；
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述退火杂交的温度为58-62℃，优选为60℃；
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述退火杂交的时间为15-25min；
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述退火杂交时使用的溶液中dNTP的浓度为1-3mM，优选为2.5mM；
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述延伸使用的酶包括等温扩增酶；
优选地，所述等温扩增酶包括Bst 2.0 DNA Polymerase；
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述延伸的温度为58-62℃，优选为60℃；
优选地，步骤(2)和步骤(3)所述延伸的时间为1-2h；
优选地，所述延伸完成后还包括加入终止缓冲液终止延伸的操作；
优选地，加入所述终止缓冲液后还包括加入变性缓冲液和中性缓冲液洗涤的操作。
7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将含有两种连接Oligo的丙烯酰胺混合液和基底油-TEMED混合液加入凝胶微粒制备芯片，利用蠕动泵控制所述丙烯酰胺混合液的流速为200-500μL/h，所述基底油-TEMED混合液的流速为240-600μL/h，得到修饰有两种连接Oligo的凝胶微粒；
(2)将步骤(1)制备的凝胶微粒与第一轮编码Oligo混合，所述第一轮编码Oligo的浓度为3-10μM，而后58-62℃退火杂交15-25min，再使用等温扩增酶在58-62℃延伸1-2h，所述第一轮编码Oligo的一区与凝胶微粒上其中一种连接Oligo互补配对，变性后除去游离的编码Oligo，得到同时含有连接Oligo和接头的凝胶微粒；
(3)将步骤(2)制备的凝胶微粒与第二轮编码Oligo混合，所述第二轮编码Oligo的浓度为3-10μM，而后58-62℃退火杂交15-25min，再使用等温扩增酶在58-62℃延伸1-2h，所述第二轮编码Oligo的一区与凝胶微粒上另一种连接Oligo互补配对，变性后除去游离的编码Oligo，得到所述带编码的凝胶微粒。
8.一种单细胞ATAC测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的带编码的凝胶微粒；
优选地，所述试剂盒还包括转座酶；
优选地，所述转座酶包括Tn5。
9.一种单细胞ATAC测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用液滴微流控芯片将如权利要求1或2所述的凝胶微粒和转座酶处理后的细胞核包裹于由PCR缓冲液组成的液滴中；
使用波长320-400nm的紫外光照射将所述凝胶微粒上的接头释放至液滴中，作为引物对所述细胞核上的片段进行PCR扩增；而后使所述液滴破裂，筛选出目标片段建立文库并测序。
10.根据权利要求9所述的单细胞ATAC测序方法，其特征在于，所述液滴的直径为100-120μm；
优选地，制备所述液滴时通过蠕动泵控制凝胶微粒、细胞核悬液及PCR缓冲液的流速；
优选地，所述凝胶微粒的流速为40-60μL/h；
优选地，所述细胞核悬液的流速为180-220μL/h，优选为200μL/h；
优选地，所述PCR缓冲液的流速为180-220μL/h，优选为200μL/h；
优选地，使用荧光定量仪检测所述PCR扩增后的产物浓度和所述文库浓度；
优选地，所述单细胞ATAC测序方法中还包括对所得测序结果进行染色体状态分析的步骤。
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