CN109851711A - 可溶性水凝胶微球及其制备方法与在单细胞检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可溶性水凝胶微球及其制备方法与在单细胞检测中的应用。所述制备方法包括：使丙烯酰胺、N,N‑双(丙稀酰)酰胺、乙酸和2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮混匀，加入氢氧化钠得到预聚物溶液；采用单乳液装置，以预聚物溶液为内相、油相物质为外相，得到微液滴，在线聚合获得所述微球。所述单细胞检测方法包括：在可溶性水凝胶微球上标记条形码，将其与单细胞悬液、逆转录酶裂解液注入液滴微反应器中形成油包水的液滴，打碎液滴并溶解所述水凝胶微球，进行特异性的催化逆转录反应，以及进行cDNA扩增；通过识别条形码区分单细胞。本发明的单细胞检测方法既能有效提高逆转录酶的利用率又能解决通道堵塞。
Description
技术领域
本发明涉及一种单细胞检测方法，特别涉及一种可溶性条形码标记水凝胶微球及其制备方法，以及利用液滴微流控芯片技术进行单细胞检测，并检测单细胞相关生命信息的方法，属于核酸检测分析及检测技术领域。
背景技术
单细胞测序技术旨在单个细胞水平对基因组或转录组进行扩增并测序，反应单个细胞的遗传信息，这是因为即使来源相同的单个细胞，由于受到生物过程和环境扰动的原因，彼此在许多方面也存在差异，这就是我们所说的细胞异质性。常规的基因组测序技术无法避免细胞异质性带来的影响，这一现象在肿瘤组织中的表现尤为重要，肿瘤组织是一种高度异质性的组织，隐藏在人体循环系统里的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)进行全基因组或者转录组测序最有帮助，有关CTC细胞的信息对于疾病的诊断、监测和治疗都至关重要。
液滴微流控技术是在封闭的微通道网络中生成和操控纳升至皮升级液滴的科学与技术。液滴微流控系统可在短时间内生成大量的微反应器，每个液滴皆可作为独立的微反应器，体积可小至皮升或飞升，不仅大大降低了样品与试剂的消耗，而且缩短了反应时间。
目前用于单细胞检测的方法主要有Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和DROP-seq四种方法，其中以微滴为基础的微流体装置将带有条码的微珠和细胞一起装入微小的液滴，建立了快速、廉价、高通量的单细胞RNA-seq方法。这种技术将细胞隔离在微小的液滴中，装上用于扩增的条码引物，由此检测数以千计的细胞。Drop-seq能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞，绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，获得更多疾病的遗传学信息，因此Drop-seq技术受到越来越多的研究者的青睐，已成为单细胞测序的热点。
Drop-seq此项技术目前的实现方法一般是将单细胞悬液样品和带有条形码的微珠以及逆转录酶(RT)裂解液，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的条形码了。最后，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别条形码，区分单细胞。
目前实现Drop-seq的方法主要有两种。第一种方法是采用塑料珠作为承载条形码的微珠，利用微流控装置将单细胞悬液、带有条形码的塑料珠以及裂解液逆转录酶(RT)混合液包裹在一个液滴微反应器中。在裂解液的作用下，单细胞被裂解，RNA等遗传物质从裂解的细胞中释放出来，被条形码特异性捕获，形成了特异性单链。随后在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，进行cDNA扩增。这种方法主要存在的问题是塑料珠的可塑性差，在液滴的形成过程中导致通道的阻塞，从而降低单细胞的捕获率。
第二种方法采用水凝胶微球作为承载条形码的微珠，利用微流控装置将单细胞悬液、带有条形码的水凝胶以及裂解液逆转录酶(RT)混合液包裹在一个液滴微反应器中。在裂解液的作用下，单细胞被裂解，RNA等遗传物质从裂解的细胞中释放出来，被条形码特异性捕获，在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，整个反应过程均在单个液滴微反应器中进行。这种方法虽然利用了水凝胶微球的可塑性，避免了通道堵塞的现象，但是由于cDNA扩增反应过程是在单个液滴微反应器中进行的，液滴微反应器中未包裹单细胞悬液的逆转录酶未起到作用，一定程度降低了逆转录酶的利用率。
因此，现有技术采用塑料珠作为条形码载体、液滴内进行cDNA扩增，会导致捕获单细胞能力低和cDNA扩增效果不理想，在单细胞捕获、单细胞裂解和cDNA扩增方面还存在一定的问题。
另外，条形码标记的水凝胶微球在单细胞检测中占有重要的位置，它可以将不同的细胞进行分类，通过后期的生物信息学技术分析单一细胞信息并区分开。现有技术的水凝胶微球大多为不可溶的，cDNA扩增在凝胶微球上进行，cDNA扩增的量和效果都存在一定的局限性。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种可溶性核酸条形码标记的水凝胶微球及其制备方法，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供所述可溶性水凝胶微球在单细胞检测中的应用。
本发明的另一目的还在于提供一种基于液滴微流控技术的单细胞检测方法，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种可溶性水凝胶微球的制备方法，其包括：
使丙烯酰胺、N,N-双(丙稀酰)酰胺、乙酸和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮混合均匀，形成混合母液；
使所述混合母液与氢氧化钠混合均匀，得到预聚物溶液；
采用单乳液装置，以所述预聚物溶液为内相、油相物质为外相，制备得到微液滴，之后于30℃～65℃在线聚合10～14小时，获得可溶性水凝胶微球。
本发明实施例还提供了前述方法制备的可溶性水凝胶微球于单细胞检测中的应用。
本发明实施例提供了一种基于液滴微流控技术的单细胞检测方法，其包括：
提供由前述方法制备的可溶性水凝胶微球，并标记上条形码(简称barcode)，得到带有条形码标记的可溶性水凝胶微球；
采用液滴微流控装置，将单细胞悬液、带有条形码标记的可溶性水凝胶微球、逆转录酶裂解液和油相物质注入液滴微反应器中，并形成油包水的液滴，其中，所述液滴中包含至少一个单细胞和至少一个带有条形码标记的可溶性水凝胶微球，且所述水凝胶微球上的条形码能够特异性捕获单细胞裂解后释放出的遗传物质；
打碎所述液滴，并溶解所述可溶性水凝胶微球，在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，进行cDNA扩增；
通过特定程序识别条形码，区分单细胞。
进一步地，所述液滴中包含单个的单细胞和单个的带有条形码标记的可溶性水凝胶微球。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供的可溶性核酸条形码标记的水凝胶微球制备方法，应用于基于微流控芯片计数进行单细胞检测，该单细胞检测方法在逆转录之前将液滴打破，可提高逆转录酶的利用率，且通过采用带有条形码标记的可溶性水凝胶微球可防止通道堵塞，是一种既能有效提高逆转录酶的利用率又能解决通道堵塞的方法，解决了现有技术中采用塑料条形码载体、液滴内进行cDNA扩增，从而导致捕获单细胞能力低和cDNA扩增效果不理想等问题；
2)本发明将液滴微流控技术用于单细胞检测，解决了操作难度大、繁琐、成本高和通量低等问题，应用前景广泛。
附图说明
图1和图2是本发明实施例1中液滴生成过程及水凝胶微球被液滴包裹情况示意图。
图3是本发明实施例1中单个细胞荧光染色后包被情况示意图。
图4和图5是本发明实施例2中液滴生成过程及水凝胶微球被液滴包裹情况示意图。
图6是本发明实施例2中单个细胞荧光染色后包被情况示意图。
图7和图8是本发明实施例3中液滴生成过程及水凝胶微球被液滴包裹情况示意图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供了一种可溶性水凝胶微球的制备方法，其包括：
使丙烯酰胺、N,N-双(丙稀酰)酰胺、乙酸和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮混合均匀，形成混合母液；
使所述混合母液与氢氧化钠混合均匀，得到预聚物溶液；
采用单乳液装置，以所述预聚物溶液为内相、油相物质为外相，制备得到微液滴，之后于30℃～65℃在线聚合10～14小时，获得可溶性水凝胶微球。
在一些实施例中，所述预聚物溶液的流速为200～400μL/h，所述油相物质的流速为400～600μL/h，依据所需微球大小选择合适的流速。
进一步地，所述可溶性水凝胶微球的直径为20～120μm。通过调控内外相流速，可以控制生成的水凝胶微球的尺寸。
进一步地，所述油相物质包括硅油(粘度10cSt)、全氟三丁胺(FC-40)和其他全氟油等，但不限于此。
进一步地，所述丙烯酰胺与N,N-双(丙稀酰)酰胺的质量比为15：1～29：1。
进一步地，所述2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮与混合母液的体积比为10～50μL：1mL。其中，所述2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮的添加量与外界反应温度相关。
进一步地，所述制备方法还包括：对所获可溶性水凝胶微球进行收集，并进行清洗以除去多余的油相物质，之后用乙醇水溶液梯度置换，使所述可溶性水凝胶微球收集于水中。
在一些更为具体的实施案例之中，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)称取0.29g丙烯酰胺,0.01gN,N-双(丙稀酰)酰胺,溶于1ml 10％的乙酸中，并加入1-5μL的2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，得到总体积1mL的30％母液。
(2)取300μL的母液与600μL浓度为1M的氢氧化钠混匀，得到浓度为10％的预聚物溶液。
(3)以上述预聚物溶液为内相，硅油为外相，通过单乳液装置制备出微液滴，并在线聚合得到可溶性水凝胶微球。通过调控内外相流速，可以控制生成的水凝胶微球的尺寸。
(4)将所得到的可溶性水凝胶微球收集，并用正己烷清洗多遍以除去多余的硅油。之后用乙醇水溶液梯度置换，将洗净的可溶性水凝胶微球最终收集于水中。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的可溶性水凝胶微球于单细胞检测中的应用。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种基于液滴微流控技术的单细胞检测方法，其包括：
提供由前述方法制备的可溶性水凝胶微球，并标记上条形码(简称barcode)，得到带有条形码标记的可溶性水凝胶微球；
采用液滴微流控装置，将单细胞悬液、带有条形码标记的可溶性水凝胶微球、逆转录酶裂解液和油相物质注入液滴微反应器中，并形成油包水的液滴，其中，所述液滴中包含至少一个单细胞和至少一个带有条形码标记的可溶性水凝胶微球，且所述可溶性水凝胶微球上的条形码能够特异性捕获单细胞裂解后释放出的遗传物质；
打碎所述液滴，并溶解所述可溶性水凝胶微球，在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，进行cDNA扩增；
通过特定程序识别条形码，区分单细胞。
在一些实施例中，所述单细胞检测方法具体包括：在室温下，采用二巯基苏糖醇溶液、α－巯基乙醇和β－巯基乙醇的混合液对所述可溶性水凝胶微球进行溶解。
进一步地，所述方法包括：将二硫苏糖醇用乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，得到二硫苏糖醇溶液。
更进一步地，将二巯基苏糖醇用0.01Mol/L pH 5.2的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，得到1～10mmol的二巯基苏糖醇溶液，-20℃低温保存备用。
进一步地，取少量二巯基苏糖醇溶液，用氢氧化钠调节pH至碱性，将水凝胶微球浸入溶液中。一段时间(5-30min)后，可溶性水凝胶微球降解于溶液中。
更为具体的，溶解所述可溶性水凝胶微球的过程包括：二巯基苏糖醇(DTT)、α－巯基乙醇或β－巯基乙醇及其类似物可用于溶解所述可溶性水凝胶微球，其中DTT浓度在1～10mmol/L之间，依据不同实验要求，选择不同的浓度，α－巯基乙醇和β－巯基乙醇浓度范围在0.1～1wt％。之间，室温放置可将可溶性水凝胶微球充分溶解。
在一些实施例中，所述单细胞检测方法中，所述液滴为油包水结构，改变有表面性质可将液滴破碎，并释放出液滴内的反应物。因此，打碎所述液滴，可选择的方法包括物理方法和化学方法，例如物理方法中，可以是改变温度法、加热法或通电法等。不变改变液滴所处温度，可将液滴转移至-20℃低温放置20min，再转移至室温5min，如此反复3次，可将液滴破碎；加热法，温度高于100℃，10min以上，可将液滴破碎；电流作用，高压电220-380V，作用30S可破碎液滴。
在一些实施例中，所述单细胞检测方法具体包括：将单细胞悬液、带有条形码标记的可溶性水凝胶微球、逆转录酶裂解液和油相物质借助注射泵或真空泵注入液滴微反应器的微流控芯片通道内，并形成油包水的液滴。
进一步地，所述液滴中包含单个的单细胞和单个的带有条形码标记的可溶性水凝胶微球。
进一步地，所述可溶性水凝胶微球的直径大小为20～120μm，直径越大越容易破碎。
更进一步地，所述可溶性水凝胶微球包括聚丙烯酰胺水凝胶微球。
在一些实施例中，所述单细胞检测方法具体包括：将条形码标记于所述可溶性水凝胶微球上，获得带有条形码标记的可溶性水凝胶微球。
标记的具体过程为：将一段引物固定于水凝胶微球上，采用等温扩增酶，将96种不同的Oligo引物分别连接于水凝胶微球上，获得96种Oligo文库，采用同样的方法，将另外96种Oligo连接上去，最终获得大约104容量大小的短核苷酸Oligo文库。
进一步地，所述单细胞悬液包括细菌悬液、真菌悬液和动物细胞悬液等中的任意一种或两种以上的组合，但不限于此。
进一步地，所述油相物质包括全氟三丁胺全氟油相组分和表面活性剂等。
更进一步地，所述表面活性剂包括司盘80、吐温20等，但不限于此。
进一步地，所述单细胞裂解后释放出的遗传物质包括DNA、RNA物质等，但不限于此。
综上所述，本发明采用可溶性水凝胶微球作为承载条形码的微珠，利用微流控装置将单细胞悬液、带有条形码的可溶性水凝胶微球以及裂解液逆转录酶(RT)混合液包裹在一个液滴微反应器中。在裂解液的作用下，单细胞裂解，RNA等遗传物质从裂解的细胞中释放出来，被水凝胶微球上的条形码特异性捕获，随后打碎液滴，并溶解可溶性水凝胶微球在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，进行cDNA扩增。
藉由上述技术方案，本发明提供的可溶性核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球制备方法，应用于基于微流控芯片计数进行单细胞检测，该单细胞检测方法在逆转录之前将液滴打破，可提高逆转录酶的利用率，且通过采用带有条形码标记的可溶性水凝胶微球可防止通道堵塞，是一种既能有效提高逆转录酶的利用率又能解决通道堵塞的方法，解决了现有技术中采用塑料条形码载体、液滴内进行cDNA扩增，从而导致捕获单细胞能力低和cDNA扩增效果不理想等问题。
本发明的基于微流控的单细胞检测方法和可溶性核酸条形码标记的水凝胶微球制备方法可用于单细胞检测各个领域，例如：用于肿瘤细胞单细胞转录组测序、用于免疫细胞单细胞转录组测序等。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1
(1)准备微流控芯片
(2)可溶性水凝胶微球制备：
1)称取0.29g丙烯酰胺,0.01g N,N-双(丙稀酰)酰胺,溶于1ml 10％的乙酸中，并加入3μL的2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，得到总体积1mL的30％母液。
2)取300μL的母液与600μL浓度为1mol/L的氢氧化钠混匀，得到浓度为10％的预聚物溶液。
3)以上述预聚物溶液为内相，硅油为外相，预聚物溶液的流速为250μL/h，所述油相物质的流速为450μL/h，通过单乳液装置制备出微液滴。
4)65℃，12h聚合。
5)正己烷清洗多遍以除去多余的硅油。之后用乙醇水溶液(100％，90％，
80％,75％,50％)梯度置换，将洗净的水凝胶微球最终收集于水中。
6)采用等温扩增方式将多种条形码连接至可容水凝胶微球上。
(3)准备可溶性核酸条形码标记的水凝胶微球：缓冲溶液(250Mm Tris-Hcl，375mMol/L KCl，15mMol/L MgCl2)清洗可溶性条形码标记的水凝胶微球，吸取30μl的可溶性水凝胶微球至1.5ml EP管中，加入1ml的缓冲溶液，室温，5000g，1min，尽量弃掉上层缓冲溶液，备用。
(4)准备RT-lysis裂解液：超净工作台内配置50μl 2x的裂解缓冲液(5x RT缓冲液20μl，酶5μl，核酸引物多聚腺苷酸尾2μl，dNTP 4μl，10％NP4010μl，dH2O 9μl)，冰上放置备用。
(5)准备肾癌组织的单细胞悬液：0.5％胰酶和0.04％EDTA消化液消化肾组织块20-30min，40μm筛网过滤细胞，室温，2000rpm，离心5min，细胞计数板计数细胞，取出1000-2000个细胞，调整终体积至30μl。
(6)连接芯片，其中包括，水凝胶微球通道，cell通道，RT-lysis通道，油相通道，收集口。调节真空负压职位-1.5kPa，液滴生成情况如图1所示，单个细胞和单个的条形码可溶性水凝胶微球包被情况如图2所示。
(7)将液滴打碎后，5mmol DTT溶液溶解水凝胶微球，随后进行逆转录反应，测得cDNA浓度12.34ng/μl，显著高于水凝胶微球未溶解组5.26ng/μl。
实施例2
(1)准备微流控芯片
(2)可溶性水凝胶微球制备：
1)称取0.22g丙烯酰胺,0.01g N,N-双(丙稀酰)酰胺,溶于1ml 10％的乙酸中，并加入3μL的2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，得到总体积1mL的30％母液。
2)取300μL的母液与600μL浓度为1mol/L的氢氧化钠混匀，得到浓度为10％的预聚物溶液。
3)以上述预聚物溶液为内相，硅油为外相，预聚物溶液的流速为300μL/h，所述油相物质的流速为500μL/h，通过单乳液装置制备出微液滴。
4)60℃，12h聚合。
5)正己烷清洗多遍以除去多余的硅油。之后用乙醇水溶液(100％，90％，80％,75％,50％)梯度置换，将洗净的水凝胶微球最终收集于水中。
6)采用等温扩增方式将多种条形码连接至可容水凝胶微球上。
(3)准备可溶性核酸条形码标记的水凝胶微球：缓冲溶液(250Mm Tris-Hcl，375mMol/L KCl，15mMol/L MgCl2)清洗可溶性条形码标记的水凝胶微球，吸取30μl的可溶性水凝胶微球至1.5ml EP管中，加入1ml的缓冲溶液，室温，5000g，1min，尽量弃掉上层缓冲溶液，备用。
(4)准备RT-lysis裂解液：超净工作台内配置50μl 2x的裂解缓冲液(5x RT缓冲液20μl，酶5μl，核酸引物多聚腺苷酸尾2μl，dNTP 4μl，10％NP4010μl，dH2O 9μl)，冰上放置备用。
(5)准备肾癌组织的单细胞悬液：0.5％胰酶和0.04％EDTA消化液消化肾组织块20-30min，40μm筛网过滤细胞，室温，2000rpm，离心5min，细胞计数板计数细胞，取出1000-2000个细胞，调整终体积至30μl。
(6)连接芯片，其中包括，水凝胶微球通道，cell通道，RT-lysis通道，油相通道，收集口。调节真空负压职位-1.5kPa，液滴生成情况如图1所示，单个细胞和单个的条形码可溶性水凝胶微球包被情况如图2所示。
(7)将液滴打碎后，5mmol DTT溶液溶解水凝胶微球，随后进行逆转录反应，测得cDNA浓度13.25ng/μl，显著高于水凝胶微球未溶解组5.82ng/μl。
实施例3
(1)准备微流控芯片
(2)可溶性水凝胶微球制备：
1)称取0.15g丙烯酰胺,0.01g N,N-双(丙稀酰)酰胺,溶于1ml 10％的乙酸中，并加入3μL的2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，得到总体积1mL的30％母液。
2)取300μL的母液与600μL浓度为1mol/L的氢氧化钠混匀，得到浓度为10％的预聚物溶液。
3)以上述预聚物溶液为内相，硅油为外相，预聚物溶液的流速为400μL/h，所述油相物质的流速为600μL/h，通过单乳液装置制备出微液滴。
4)65℃，10h聚合。
5)正己烷清洗多遍以除去多余的硅油。之后用乙醇水溶液(100％，90％，80％,75％,50％)梯度置换，将洗净的水凝胶微球最终收集于水中。
6)采用等温扩增方式将多种条形码连接至可容水凝胶微球上。
(3)准备可溶性核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球：缓冲溶液(250Mm Tris-Hcl，375mMol/L KCl，15mMol/L MgCl2)清洗可溶性条形码标记的水凝胶微球，吸取30μl的核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球至1.5ml EP管中，加入1ml的缓冲溶液，室温，5000g，1min，尽量弃掉上层缓冲溶液，备用。
(4)准备RT-lysis裂解液：超净工作台内配置50μl 2x的裂解缓冲液(5x RT缓冲液20μl，酶5μl，核酸引物多聚腺苷酸尾2μl，dNTP 4μl，10％NP4010μl，dH2O 9μl)，冰上放置备用。
(5)准备肾癌组织的单细胞悬液：0.5％胰酶和0.04％EDTA消化液消化肾组织块20-30min，40μm筛网过滤细胞，室温，2000rpm，离心5min，细胞计数板计数细胞，取出1000-2000个细胞，调整终体积至30μl。
(6)连接芯片，其中包括，水凝胶微球通道，cell通道，RT-lysis通道，油相通道，收集口。调节真空负压职位-1.5kPa，液滴生成情况如图1所示，单个细胞和单个的条形码可溶性水凝胶微球包被情况如图2所示。
(7)将液滴打碎后，5mmol DTT溶液溶解可溶性水凝胶微球，随后进行逆转录反应，测得cDNA浓度7.17ng/μl，显著高于水凝胶微球未溶解组4.87ng/μl。
实施例4
本实施例中，一种基于液滴微流控技术的单细胞检测方法主要包括以下步骤：
1RT裂解液：NaCl、NP-40、Tween-20、SDS、EDTA、PMSF、Tris-HCl、Aprotinin、Leupeptin、Sodium dexycholate。
2承载条形码的可溶性水凝胶微球的制备：
1)称取0.29g丙烯酰胺,0.01g N,N-双(丙稀酰)酰胺,溶于1ml 10％的乙酸中，并加入3μL的2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，得到总体积1mL的30％母液。
2)取300μL的母液与600μL浓度为1mol/L的氢氧化钠混匀，得到浓度为10％的预聚物溶液。
3)以上述预聚物溶液为内相，硅油为外相，预聚物溶液的流速为200μL/h，所述油相物质的流速为400μL/h，通过单乳液装置制备出微液滴。
4)30℃，14h聚合。
5)正己烷清洗多遍以除去多余的硅油。之后用乙醇水溶液(100％，90％，80％,75％,50％)梯度置换，将洗净的水凝胶微球最终收集于水中。
6)采用等温扩增方式将多种条形码连接至可溶性水凝胶微球上。
3单细胞悬液的制备：
3.1细菌悬液：挑取单一细菌落在液体培养基中培养过夜，测细菌生长的OD值，按照实验要求稀释并得到相应体积的细菌悬液；
3.2真菌悬液：真菌菌种用相应的培养基培养，收菌，重悬，镜下(400倍)计数，得到适合实验用的真菌悬液；
3.3动物细胞悬液：取动物组织，采用机械、化学或酶消化的方式获得动物组织的单细胞悬液；
4油相准备：全氟三丁胺(FC-40)全氟油相，加入相应的表面活性剂Span 80,Tween-20。
5.单细胞检测的操作流程
5.1搭建液滴微流控装置；
5.2将RT裂解液、条形码标记的可溶性水凝胶微球，单细胞悬液和油相物质借助注射泵或真空泵注入微流控芯片通道内，形成油包水的液滴，单个细胞和单个的条形码标记的可溶性水凝胶微球被包裹在一个液滴内；
5.3条形码标记的可溶性水凝胶微球捕捉单细胞裂解后释放出的DNA或RNA物质；
5.4以二巯基苏糖醇(DTT)、α－巯基乙醇和β－巯基乙醇溶解所述水凝胶微球，其中DTT浓度在5～40mmol/L之间，α－巯基乙醇和β－巯基乙醇浓度范围在0.1～1wt％。之间，室温放置将可溶性水凝胶微球充分溶解。
以及，不变改变液滴所处温度，将液滴转移至-20℃低温放置20min，再转移至室温5min，如此反复3次，将液滴破碎。
5.5逆转录反应，进行cDNA扩增；
实施例5
1.准备微流控芯片。
2.准备核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球：buffer(250Mm Tris-Hcl，375mMKCl，15mM MgCl2)清洗水凝胶微球，吸取25-30μl的核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球至1.5ml EP管中，加入1ml的buffer，室温，5000g，1min，尽量弃掉上层buffer，备用。
3.准备RT-lysis裂解液：超净工作台内配置50μl 2x的Lysis buffer(5xRTbuffer 20μl，enzyme 5μl，Oligo dT 2μl，dNTP 4μl，10％NP4010μl，dH2O 9μl)，冰上放置备用。
4.准备培养的K562细胞：细胞计数板计数细胞，取出1000-2000个细胞，室温，2000rpm，离心5min，调整终体积至30μl。
5.连接芯片，其中，①为水凝胶微球通道，②为cell通道，③为RT-lysis通道，④为油通道，⑤为收集口。调节真空负压值为-1.5kPa。
6.将drop打碎后，进行逆转录反应，测得c DNA浓度8.74ng/μl，显著高于未破碎组5.26ng/μl。
综上所述，藉由本发明的技术方案，本发明提供的核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球制备方法，应用于基于微流控芯片计数进行单细胞检测，该单细胞检测方法在逆转录之前将液滴打破，可提高逆转录酶的利用率，且通过采用带有条形码标记的可溶性水凝胶微球可防止通道堵塞，是一种既能有效提高逆转录酶的利用率又能解决通道堵塞的方法，解决了现有技术中采用塑料条形码载体、液滴内进行cDNA扩增，从而导致捕获单细胞能力低和cDNA扩增效果不理想等问题。
此外，本案发明人还参照实施例1-实施例5的方式，以本说明书中列出的其他原料和条件进行了实验，并同样制得了核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球，且该些核酸条形码标记的可溶性水凝胶微球的性能与实施例1-5基本一致。
应当理解，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种可溶性水凝胶微球的制备方法，其特征在于包括：
使丙烯酰胺、N,N-双(丙稀酰)酰胺、乙酸和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮混合均匀，形成混合母液；
使所述混合母液与氢氧化钠混合均匀，得到预聚物溶液；
采用单乳液装置，以所述预聚物溶液为内相、油相物质为外相，制备得到微液滴，之后于30℃～65℃在线聚合10～14小时，获得可溶性水凝胶微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述预聚物溶液的流速为200～400μL/h，所述油相物质的流速为400～600μL/h；优选的，所述可溶性水凝胶微球的直径为20～120μm；优选的，所述油相物质包括硅油和/或全氟三丁胺。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述丙烯酰胺与N,N-双(丙稀酰)酰胺的质量比为15：1～29：1；优选的，所述2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮与混合母液的体积比为10～50μL：1mL；
和/或，所述制备方法还包括：对所获可溶性水凝胶微球进行收集，并进行清洗以除去多余的油相物质，之后用乙醇水溶液梯度置换，使所述可溶性水凝胶微球收集于水中。
4.由权利要求1-3中任一项所述方法制备的可溶性水凝胶微球于单细胞检测中的应用。
5.一种基于液滴微流控技术的单细胞检测方法，其特征在于包括：
提供由权利要求1-3中任一项所述方法制备的可溶性水凝胶微球，并标记上条形码，得到带有条形码标记的可溶性水凝胶微球；
采用液滴微流控装置，将单细胞悬液、带有条形码标记的可溶性水凝胶微球、逆转录酶裂解液和油相物质注入液滴微反应器中，并形成油包水的液滴，其中，所述液滴中包含至少一个单细胞和至少一个带有条形码标记的可溶性水凝胶微球，且所述可溶性水凝胶微球上的条形码能够特异性捕获单细胞裂解后释放出的遗传物质；
打碎所述液滴，并溶解所述可溶性水凝胶微球，在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，进行cDNA扩增；
通过特定程序识别条形码，区分单细胞。
6.根据权利要求5所述的单细胞检测方法，其特征在于具体包括：在室温下，采用采用二巯基苏糖醇溶液、α－巯基乙醇和β－巯基乙醇的混合液对所述可溶性水凝胶微球进行溶解；优选的，所述方法包括：将二硫苏糖醇用乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，得到二硫苏糖醇溶液；优选的，所述二巯基苏糖醇溶液的浓度为1～10mmol；
和/或，打碎所述液滴的方法包括物理方法或化学方法；优选的，所述物理方法包括改变温度法、加热法或通电法。
7.根据权利要求5所述的单细胞检测方法，其特征在于具体包括：将单细胞悬液、带有条形码标记的可溶性水凝胶微球、逆转录酶裂解液和油相物质借助注射泵或真空泵注入液滴微反应器的微流控芯片通道内，并形成油包水的液滴；优选的，所述液滴中包含单个的单细胞和单个的带有条形码标记的可溶性水凝胶微球。
8.根据权利要求5所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述可溶性水凝胶微球的直径大小为20～120μm；优选的，所述可溶性水凝胶微球包括聚丙烯酰胺水凝胶微球。
9.根据权利要求5所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述单细胞悬液包括细菌悬液、真菌悬液和动物细胞悬液中的任意一种或两种以上的组合；和/或，所述油相物质包括全氟三丁胺全氟油相组分和表面活性剂；优选的，所述表面活性剂包括司盘80和/或吐温20。
10.根据权利要求5所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述单细胞裂解后释放出的遗传物质包括DNA和/或RNA物质。
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