CN110100010A - 单细胞中细胞内或表面分子靶标的多重检测 - Google Patents

单细胞中细胞内或表面分子靶标的多重检测 Download PDF

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Abstract

本公开展示了一种方法，该方法将合成的DNA遗传密码翻译成在纳升微腔中记录的空间代码，用于在单细胞中多重测定几乎任何类型的分子靶标(例如，miRNA、mRNA、细胞内和表面蛋白质)。

Description

单细胞中细胞内或表面分子靶标的多重检测
相关申请
本申请要求2016年7月18日提交的美国临时申请号62/363,696的优先权，该文献的全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院授予的批准号5U01CA164252和国立癌症研究所授予的批准号R21CA17739301的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景
在单细胞水平上进行分子靶标的多重检测一直是具有挑战性的。尽管最近取得了进展，但大量细胞计数需要复杂且昂贵的分析。特别地，如果样品大小有限(例如，几千个细胞)，则难以进行大量细胞计数。大量细胞计数也限于蛋白质靶标的检测。迄今为止，还没有技术能够以高度多重的方式在单个细胞中检测多种类型的分子靶标。
概述
本公开提供了可用于蛋白质和/或核酸(例如RNA或DNA)靶标(例如，细胞内靶标)的多重检测的方法、系统、试剂盒、装置和组合物。该技术可用于将合成核酸(例如，DNA)密码子翻译成纳升微腔中记录的空间和光谱代码，例如，用于在单个细胞中多种类型的分子靶标(例如，miRNA、mRNA、细胞内和表面蛋白质)的多重测定。本公开的可检测报告构建体的空间位置和光谱性质都与特定的目标分子靶标和特定的单个细胞相关。因此，该技术为系统生物学、细胞信号传导和基因组学领域中的单细胞、高通量、蛋白质和/或核酸的多重检测，以及例如用于抑制或激活信号传导途径或基因表达的治疗剂的开发提供了有效且划算的手段。
作为非限制性实例，本文提供的技术可用于单细胞中microRNA(miRNA)生物标志物的高通量、多重检测。miRNA是一类小的非编码RNA，通常作为负基因调节因子起作用。许多miRNA位于染色体的脆弱区域内，这些区域是与人类癌症更紧密相关的基因组区域，表明miRNA在肿瘤发展中的可能作用。miRNA表达谱与各种癌症相关，并且miRNA特征是潜在的独特癌症生物标志物，用于准确诊断和分类人类癌症。然而，人类癌症是高度异质的，部分原因在于单细胞水平的高度瘤内异质性。因此，表征这些人类癌症可能需要评估大量单个肿瘤细胞，每个肿瘤细胞具有其自身的miRNA表达谱。本文提供的方法、系统、试剂盒、装置和组合物能够在单细胞中进行高通量和多重miRNA检测，而无需进行长度扩增过程。更具体地，在一些实施方案中，该技术将条形码核酸阵列和分子缀合物与纳升微流体平台(例如，芯片)整合在一起，能够从大量单个癌细胞中多重检测许多(例如，至少5,10,12,15,20,30,40或50个)miRNA生物标志物(或其他细胞内生物标志物)。该技术不仅是用于检测涉及多种人类癌症的miRNA生物标志物的通用平台，而且还可用于检测来自单细胞的其他非编码RNA和信使RNA生物标志物。
因此，本公开内容提供的方法包括(a)使包含核酸靶标的细胞与至少两种(例如，至少3种，至少4种，至少5种，至少10种，至少20种，或至少50种)缀合物接触，每个缀合物包含与(ii)核酸报告链通过(iii)可切割接头连接的(i)核酸诱饵链，其中核酸诱饵链含有与目标核酸靶标互补的核苷酸序列，以产生包含靶共轭复合物的修饰细胞，(b)将步骤(a)的修饰细胞加载到含有微孔的基板(例如微芯片)上(或在溶液中含有少量细胞的其它方法)，以产生负载的基板。
本文还提供了包括(a)使包含蛋白质靶标的细胞与至少两种(例如，至少3种，至少4种，至少5种，至少10种，至少20种，或至少50种)缀合物接触的方法，每个缀合物包含与(ii)核酸报告链通过(iii)可切割接头连接的(i)抗体，其中所述抗体与目的蛋白质靶标特异性结合，以产生包含靶缀合物复合物的修饰细胞，(b)将步骤(a)的修饰细胞加载到含有微孔的基板(例如微芯片)上(或在溶液中含有少量细胞的其它方法)，以产生负载的基板基板。
在一些实施方式中，该方法还包括(c)使装载的基板基板与包含至少两套(例如，至少3套，至少4套，至少5套，或至少10套)的至少两个(例如，至少3个，至少4个，至少5个，或至少10个)固定化核酸捕获探针的覆盖基板(例如，玻璃覆盖物)接触，每个捕获探针包含与步骤(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以产生至少两个封闭的(例如，密封的)微孔，所述至少两个封闭的微孔中的每一个包含覆盖基板的(例如，单套)的至少两个(例如，至少3个，至少4个，至少5个，或至少10个)不同的捕获探针组(例如，相对于每套的唯一的捕获探针)。
在一些实施方案中，所述方法还包括(d)切割缀合物的可切割接头以释放核酸报告链。该切割步骤可以在覆盖基板与基板接触(施加到基板基板)之前或之后进行。
在一些实施方案中，所述方法还包括在核酸杂交条件下维持封闭的(例如，密封的)微孔，以产生固定在覆盖基板上的报告捕获复合物。例如，可以基于旨在一起杂交(彼此结合)的核酸的长度和序列来确定核酸杂交条件。
在一些实施方案中，所述方法还包括从基板解离(分离，除去)含有固定的报告物捕获复合物的覆盖基板，并可视化固定在覆盖基板上的至少一种报告-捕获复合物。在一些实施方案中，报告分子与荧光分子如荧光团连接，荧光分子可在荧光显微镜下检测。
在一些实施方案中，该方法还包括鉴定(a)的至少一种目标核酸靶标。固定的报告分子的位置和光谱性质与特定的目标靶标以及获得靶细胞相关。
在一些实施方案中，步骤(a)包括使包含核酸靶标的细胞与至少3种，至少4种，至少5种，至少10种，至少15种，至少20种，至少25种，至少30种，至少35种，至少40种，至少45种或至少50种缀合物接触。
在一些实施方案中，细胞被透化(例如，机械，化学或酶促)和/或固定(例如，在多聚甲醛，甲醇或丙酮中)。
在一些实施方案中，核酸诱饵链含有与核糖核酸(RNA)靶标互补的核苷酸序列。例如，RNA靶标可以选自mRNA靶标(信使RNA)，tRNA(转运RNA)靶标，rRNA(核糖体RNA)靶标和miRNA(微小RNA)靶标。
在一些实施方案中，核酸诱饵链含有与脱氧核糖核酸(DNA)靶标互补的核苷酸序列(例如，基因或基因片段)。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。
在一些实施方案中，可切割接头选自光可切割接头和酶可切割接头。
在一些实施方案中，核酸报告链与可检测标记连接。可检测标记可以是例如荧光标记(例如荧光团)。
在一些实施方案中，基板是微芯片、微孔板(microplate)、微孔板(microwellplate)、多层板或板。微孔是能够包含微升体积的溶液或微粒(例如细胞)的结构。前述术语和基板在本领域中是公知的。
在一些实施方案中，基板基板含有2-20,000个微孔。例如，基板可含有5,000-20,000个微孔。
在一些实施方案中，每个微孔具有1-999纳升的体积。例如，每个微孔可具有1-10纳升的体积。
在一些实施方案中，步骤(b)包括加载配制在体积为1-10纳升的悬浮液(例如液体缓冲液)中的经修饰的细胞。
在一些实施方案中，基板由聚二甲基硅氧烷(PDMS)或玻璃组成。
在一些实施方案中，覆盖基板由PDMS或玻璃组成。
在一些实施方案中，覆盖基板与基板形成密封，以防止封闭的微孔之间的流体连通。
在一些实施方案中，本公开还提供了装置，包含(a)包含微孔的基板，每个微孔含有至少一个含有至少两个(例如2-50个)靶-缀合物复合物的细胞(例如，至少2,3,4或5个细胞；或少于5个细胞)，每个复合物包含与通过可切割接头与核酸报告链相连的核酸诱饵链结合的核酸靶标，(b)包括至少两组(例如，至少3组，至少4组，至少5组，或至少10组)的至少两组(例如，至少3组，至少4组，至少5组，或至少10组)固定化核酸捕获探针的覆盖基板，每个捕获探针包含与(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中覆盖基板与基板接触以形成至少两个(例如2-20,000个)封闭的微孔，所述至少两个封闭的微孔中的每一个包含覆盖基板的一组(例如，单个)的至少两个捕获探针。
在一些实施方案中，本公开还提供了装置，包含：(a)包含微孔的基板，每个微孔含有至少一个(例如，至少2,3,4或5个细胞；或少于5个细胞)含有至少两个(例如2-50个)靶-缀合物复合物的细胞，每个复合物包含与通过可切割接头与核酸报告链相连的抗体结合的蛋白质靶标，(b)包括至少两组(例如，至少3组，至少4组，至少5组，或至少10组)的至少两组(例如，至少3组，至少4组，至少5组，或至少10组)固定化核酸捕获探针的覆盖基板，每个捕获探针包含与(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中覆盖基板与基板接触以形成至少两个封闭的微孔，所述至少两个(例如，2-20,000个)封闭的微孔中的每一个包含一组至少两个覆盖基板的捕获探针。
附图简要说明
图1是用于从单个细胞中多重检测细胞内靶标的方法的一些实施方案的示意图。
图2是用于从单个细胞中多重检测细胞内靶标的方法的一些实施方案的示意图。
图3是用于从单个细胞中多重检测低丰度靶标的方法的一些实施方案的示意图，其使得芯片上单细胞多重PCR与高密度DNA微阵列相结合，检测一组分子靶标。
图4是显示用于在单细胞水平检测多种miRNA的整个DNA微阵列载玻片的微阵列扫描仪图像。放大视图显示出优异的信号背景比。
图5显示使用图1中描述的方案检测的多种miRNA的定量。测量两种细胞系(U937和U87)中的靶miRNA水平。
图6是描绘每个微孔的细胞加载实例的直方图。在一些实施方案中，每个微孔含有5,000-20,000个微孔。根据本公开的方法，如该实施例中所示，可以将细胞直接分配到微芯片的表面并使其沉降在其中的至少一个(一个或多个)微孔中。通过将覆盖基板(例如，载玻片)放置在微芯片的顶部以包围微孔(其也可以密封微孔)，可以将细胞捕获在微孔内。该图显示了每个微孔的细胞负载的直方图。细胞负载表示为在单个微芯片内含有0、至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个细胞的微孔的百分比。在一些实施方案中，单个微芯片内25-33％(例如，25％，30％或33％)的微孔仅含有单个细胞。在一些实施方案中，单个微芯片内超过30％或超过50％的微孔仅含有单个细胞。
图7是扫描仪荧光图像，其描绘了使用一组13种miRNA生物标记物分析单细胞的结果。
图8是显示单细胞miRNA谱的实例的热图。每列表示检测到的特定miRNA，热图上的每行代表单个细胞。
图9A是描绘从单细胞捕获和检测miR-16-5p的图。对数尺度散点图显示零细胞和单细胞微孔中的荧光强度分布。条形显示平均值和标准偏差。
图9B是描绘从单细胞捕获和检测miR-16-5p的图。分别与单个、2个、3个和4个微孔相比，这是所有零细胞微孔的对数尺度原始强度平均值。零细胞微孔平均值可用作背景以计算单个和多个细胞微孔中的净信号。
图10A是描绘单细胞中miR-223-3p的捕获和检测的图。这是对数尺度散点图，显示零细胞和单细胞微孔中的荧光强度分布。条形显示平均值和标准偏差。
图10B是描绘单细胞中miR-223-3p的捕获和检测的图。分别与单个、2个、3个和4个微孔相比，这是所有零细胞微孔的对数尺度原始强度平均值。零细胞微孔平均值可用作背景以计算单个和多个细胞微孔中的净信号。
图11是一系列图像，其描绘了使用大量miRNA检测的标准方法(针点阵微阵列)验证图6-10中所示的结果。左图是显示大量miRNA检测结果的图像。中间图像是通过将去离子水添加到以与左图相同的格式点样的捕获DNA微阵列获得的。右图是显示使用该方法检测到的相应miRNA的布局的示意图，每次实验重复三次。针状斑点微阵列的结果与图6-10中所示的单细胞平均值一致。
图12是描绘每种miRNA在三个斑点上平均的荧光强度(如图11中左、右图所示)和标准偏差的图。针点微阵列的结果与图6-10中所示的单细胞平均值一致。
图13是描绘通过标准定量PCR(qPCR)实验验证本公开内容的单细胞测定的图。
图14A-14C显示了一对照片，其描绘了使用荧光原位杂交(FISH)和图14A和图14B中的每一个中荧光强度的定量来验证用于检测miR16的本公开的单细胞测定。
发明详述
在一些实施方案中，本公开提供的方法包括(a)使包含核酸和/或蛋白质(或肽)靶标的细胞与报告分子-探针缀合物(“RPC”或“缀合物”)接触，每个缀合物包含(i)核酸诱饵链或通过(iii)可切割接头与(ii)核酸报告链连接的抗体，其中核酸诱饵链含有与细胞核酸靶标互补的核苷酸序列，或者其中抗体与目标蛋白(或肽)靶标特异性结合，产生包含靶-缀合物复合物的修饰细胞，(b)将步骤(a)的修饰细胞加载到含有微孔的基板上，以产生负载的基板基板(参见例如图1和2)。
本文还提供了装置，包含：(a)包含微孔的基板，每个微孔含有至少一个含有至少两个靶-缀合物复合物的细胞，每个复合物包含通过可切割接头与核酸报告链连接的与核酸诱饵链结合的核酸或蛋白质靶标；(b)包含至少两组的至少两组固定化捕获探针的覆盖基板，每个捕获探针包含与(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中覆盖基板与基板接触以形成至少两个封闭的微孔，所述至少两个封闭的微孔中的每一个包含覆盖基板的一组至少两个捕获探针。
如本文提供的细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞，如大肠杆菌细胞)或真核细胞(例如哺乳动物或酵母细胞)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。例如，细胞可以是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肿瘤细胞。肿瘤细胞可以是非癌性的或癌性的。因此，在一些实施方案中，细胞是癌细胞。修饰细胞是含有外源(非天然)蛋白质或核酸的细胞。
在一些实施方案中，在使细胞与缀合物接触之前，将细胞固定和/或透化。固定和透化的方法是已知的，其中任何一种都可以如本文所提供的那样使用。在一些实施方案中，细胞不是固定的。在一些实施方案中，细胞不透化。
核酸靶标通常是细胞内靶标。在一些实施方案中，核酸靶标是RNA靶标(例如，mRNA，tRNA，rRNA和/或miRNA)。在一些实施方案中，核酸靶标是DNA靶标。靶标可以是RNA靶标和DNA靶标的组合。
蛋白质(或肽)靶标可以是细胞内蛋白质或细胞表面蛋白质(例如，受体)。蛋白质靶标不受类型限制。例如，蛋白质可以是酶、激素、受体、配体或其他类型的蛋白质。
在一些实施方案中，核酸靶标和/或蛋白质靶标是指示疾病或病症，例如癌症的生物标志物。
部分地取决于目标靶标的数量，可以使细胞与至少两种缀合物接触。在一些实施方案中，使细胞与至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个缀合物接触。在一些实施方案中，使细胞与2-5、2-10、2-15、5-10、5-15、3-5、3-10或3-15缀合物接触。可以使用超过10种缀合物。例如，可以使用至少10、15、20、25、30、35、40、45或50(例如，2-10或2-50)的缀合物。
本文提供的缀合物(或RPC)包括通过可切割接头与核酸(例如DNA)报告链连接的核酸(例如DNA)诱饵链。在一些实施方案中，核酸诱饵链和/或核酸报告链具有4-50个核苷酸的长度。例如，核酸诱饵链和/或核酸报告链可具有4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，核酸诱饵链和/或核酸报告链具有长于50个核苷酸的长度。
可切割接头可以是，例如，光可切割接头(例如，硝基苄基接头)、二硫键和/或磷酸键。已知许多不同的可切割接头，其中任何一种都可以如本文所提供的那样使用。
核酸诱饵链包括与靶核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。因此，在允许核酸杂交的条件下，核酸诱饵链能够与靶核酸结合(杂交)和/或核酸报告链能够与核酸捕获探针结合(杂交)。用于杂交的核酸链之间的互补性不必是，但在一些实施方案中，完全(100％)互补。在一些实施方案中，核酸诱饵链仅与核酸靶链部分互补(例如，至少50、60、70、70至90％互补)。在一些实施方案中，核酸报告链仅与核酸捕获探针部分互补(例如，至少50、60、70、70至90％互补)。
核酸报告链包括可检测的标记，例如荧光团。例如，核酸报告链可以用羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布蓝、太平洋蓝、太平洋橙、路西法黄、NBD、R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5缀合物、PE-Cy7缀合物、红613、PerCP、TruRed、FluorX、荧光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、德克萨斯红、别藻蓝蛋白(APC)和/或APC-Cy7缀合物标记。本文包括其他染料和荧光标记。
核酸诱饵链与靶标的结合产生靶-缀合物复合物，然后在切割条件下进行(切割)，使得缀合物的核酸报告链从核酸诱饵链中释放出来，从而从靶共轭复合物中释放出来。然后，游离核酸报告链可以与固定的捕获探针结合。
将含有靶-缀合物复合物的修饰细胞加载到(递送至)含有微孔的基板上以产生负载的基板。例如，基板可以由玻璃或塑料(或其他材料)构成。在一些实施方案中，基板是微芯片(例如，类似于微阵列)或微孔板。
在一些实施方案中，单个微孔含有单个细胞，尽管单个微孔内可以包含更多细胞。在一些实施方案中，单个微孔包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个细胞。在一些实施方案中，单个微孔包含1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9或1-10个细胞。在一些实施方案中，单个微孔包含5个或更少，或少于5个细胞。在一些实施方案中，基板的25-33％的微孔仅含有单个细胞。在一些实施方案中，基板的至少30％的微孔仅含有单个细胞。例如，基板的至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的微孔仅含有单个细胞。在一些实施方案中，基板的所有(100％)微孔仅含有单个细胞。
基板可包括任何数量的微孔。例如，基板(例如，微芯片或微孔板)可以包括2-10、2-20、2-50、2-100、2-500、2-1000、2-5000、2-10000或2-20000微孔。
例如，每个微孔可具有1纳升至999纳升的体积。在一些实施方案中，微孔的体积为1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900纳升。在一些实施方案中，微孔具有1-10、1-15或1-20纳升的体积。
在一些实施方案中，将细胞作为体积为1-10纳升的悬浮液(例如，在缓冲液，如盐水缓冲液中)加载到微孔中。
将细胞加载到微孔中后，使负载的微孔(负载的基板基板)与包含至少2组的至少2个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少2组的至少3个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少3组的至少2个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少3组的至少3个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少4组的至少2个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少4组的至少3个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少4组的至少4个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少5组的至少2个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少5组的至少3个固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少5组的至少4种固定的捕获探针的覆盖基板接触。在一些实施方案中，使负载的微孔(负载的基板)与包含至少5组的至少5个固定的捕获探针的覆盖基板接触。
例如，覆盖基板可以是玻璃或塑料。它可以是平坦的基板，使得它包围并密封基板的微孔，从而防止封闭的微孔之间的流体连通。
捕获探针包含与核酸报告链(缀合物的)核苷酸序列互补的核苷酸序列。释放的报告链(切割后)与核酸捕获探针结合。捕获探针通常作为在覆盖基板上固定和图案化(例如，平行排列)的多组探针提供。例如，单组捕获探针可包括3、4、5或更多种不同的捕获探针，每种探针编码(能够结合)不同的报告链(对应于不同的细胞靶标)。覆盖基板包括多组捕获探针，其被图案化，使得当覆盖基板基板与基板基板接触时，任何单个微孔包含(至少一个)完整的捕获探针组。例如，单组捕获探针可包括捕获探针A'、捕获探针B'和捕获探针C'。覆盖基板包含多组固定的捕获探针A'、捕获探针B'和捕获探针C'(例如，以线性、平行的形式-参见例如图7)，其定位成反映基板的微孔的位置，使得当被覆盖基板包围时，每个微孔暴露于(包含)含有捕获探针A'、捕获探针B'和捕获探针C'的完全固定的捕获组。因此，微孔的每个细胞(或多个细胞)暴露于一组完整的捕获探针。
单组捕获探针可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的捕获探针。在一些实施方案中，单组捕获探针包含2-5、2-10、2-15、5-10、5-15、3-5、3-10或3-15个捕获探针。可以使用超过10个捕获探针。例如，可以使用至少10、15、20、25、30、35、40、45或50个捕获探针。
覆盖基板可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50组捕获探针(例如，每组2-50个捕获探针)。在一些实施方案中，覆盖基板包含2-10、2-20、2-50、2-100、2-500、2-1000、2-5000、2-10000或2-20000组捕获探针。
在一些实施方案中，所述方法还包括切割缀合物的可切割接头以释放核酸报告链。切割条件通常取决于所用可切割接头的类型。可切割接头的实例是已知的并且在本文其他地方提供。
在一些实施方案中，所述方法还包括在核酸杂交条件下维持封闭的微孔，以产生固定在覆盖基板上的报告捕获复合物。允许互补核酸彼此结合(杂交)的条件是已知的和/或部分基于核酸的长度和组成来确定的(例如，低严格性或高严格性、低盐、特定缓冲液、时间和温度)。
在一些实施方案中，所述方法还包括从基板解离(去除)含有固定的报告－捕获复合物的覆盖基板，并观察固定在覆盖基板上的至少一种报告-捕获复合物。
在一些实施方案中，该方法还包括鉴定(a)的至少一种目标核酸靶标。基于靶标同一性与相应的固定的报告链的空间位置和光谱性质之间的相关性来鉴定靶标。
在一些实施方案中，本公开内容涉及在单个细胞上或单个细胞池中的细胞表面和/或细胞内靶标的多重检测方法。本方法还涉及在单个细胞上或单个细胞池中检测一个以上的细胞表面靶标和/或细胞内靶标。在一些实施方案中，在单个细胞上多重检测一个以上细胞表面靶标的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种缀合物按以下顺序包含：(1)结合细胞表面靶标的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，其中在该条件下，RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)将(b)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含含有单个细胞的纳升微孔的微芯片；(d)用带有微阵列的基板覆盖(c)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(a)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列；(e)鉴定含有单个细胞的(d)微孔；(f)维持含有单个细胞的微孔，在该条件下，切割在微孔中表面靶标结合的RPC，并且报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞中释放，所释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，并产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(g)从微芯片中除去带有(f)中产生的复合物的基板；(h)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果复合物结合，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。例如，表面抗原CD3和CD8的组合可以定义细胞毒性T淋巴细胞。可以一起测定表面抗原如CD3、CD4、CD8、CD11a、CD11b、CD12和CD24以区分不同的免疫细胞表型。
在一些实施方案中，在单个细胞池的每个成员上多重检测一个以上细胞表面靶标的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种缀合物按以下顺序包含：(1)结合细胞表面靶标的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)将(b)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含一个单独的细胞池；(d)用带有微阵列的基板覆盖(c)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(a)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列；(e)鉴定含有单个细胞池的(d)微孔；(f)维持含有单个细胞的各微孔，在该条件下，在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割并且报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的各细胞池的各成员中释放，所释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，并产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(g)从微芯片中除去带有(f)中产生的复合物的基板；(h)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果复合物结合，则确定细胞表面靶标存在于单个细胞池的成员上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。在一些实施方案中，细胞池包含单细胞类型。在一些实施方案中，细胞池包含多种细胞类型。
在一些实施方案中，多重检测单个细胞中一个以上细胞内靶标的方法包括：(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)将(a)的细胞与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；(d)将(c)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含含有单个细胞的纳升微孔的微芯片；(e)用带有微阵列的基板覆盖(d)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(b)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列；(f)鉴定含有单个细胞的(e)微孔；(g)维持含有单个细胞的微孔，在该条件下，在微孔中细胞内靶标结合的RPC的可切割接头被切割，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(h)从微芯片中除去带有(g)中产生的复合物的基板；(i)确定核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果复合物结合，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。例如，检测细胞内蛋白质如p-Akt可以确定给予类型的癌细胞的增殖潜力。检测一组细胞内蛋白质如pEGFR、pERK和pS6可以区分Ras和Pi3K-Akt途径在确定包括异质癌细胞群的单个细胞的命运中的不同作用。
在一些实施方案中，多重检测单个细胞池的每个成员的一个以上细胞内靶标的方法包括：(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)将(a)的细胞与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；(d)将(c)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含一个单独的细胞池；(e)用带有微阵列的基板覆盖(d)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(b)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列；(f)鉴定(e)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；(g)维持含有单个细胞的微孔，在该条件下，在微孔中细胞内靶标结合的RPC的可切割接头被切割，报告分子从单个细胞池的每个成员中释放，RPC与细胞内靶标结合，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(h)从微芯片中除去带有(g)中产生的复合物的基板；(i)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果复合物结合，则确定细胞内靶标存在于单个细胞池的成员内。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。在一些实施方案中，细胞池包含单细胞类型。在一些实施方案中，细胞池包含多种细胞类型。例如，检测细胞内蛋白质如p-Akt可以确定给予类型的癌细胞的增殖潜力。检测一组细胞内蛋白质，如pEGFR、pERK和pS6，可以区分Ras和Pi3K-Akt途径在确定包括异质癌细胞群在内的单个细胞命运中的不同作用。
在一些实施方案中，多重检测单个细胞的一个以上低丰度细胞表面靶标的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)与低丰度细胞表面靶标结合的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)装载(1)(b)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳升微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；(d)在疏水表面与(c)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(c)中产生的微芯片；(e)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞释放；(f)通过PCR扩增(e)的切割的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(g)降低(f)微孔内的温度，并提供(f)的扩增产物不与(d)的基板相互作用的条件；(h)保持(g)的条件并从微芯片上除去(d)的基板；(i)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(f)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列；(j)在扩增产物和核酸探针在基板微阵列上杂交的条件下，将(f)的扩增产物与与扩增产物互补的核酸探针组合，并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物；(k)鉴定含有单个细胞的(f)的微孔；(l)从微芯片上除去带有(j)中产生的复合物的基板；(m)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果结合复合物，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。例如，作为免疫检查点蛋白的表面抗原PD-1具有非常广泛的表达水平。检测PD-1的低丰度表达的能力对于确定个体免疫细胞的活化状态具有重要意义。
在一些实施方案中，在细胞池的每个成员上多重检测一个以上低丰度细胞表面靶标的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)与低丰度细胞表面靶标结合的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)装载(1)(b)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含单个细胞库和PCR酶和寡核苷酸引物；(d)在疏水表面与(c)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(c)中产生的微芯片；(e)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞释放；(f)通过PCR扩增(e)的切割的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(g)降低(f)微孔内的温度，并提供(f)的扩增产物不与(d)的基板相互作用的条件；(h)保持(g)的条件并从微芯片上除去(d)的基板；(i)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(f)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列；(j)在扩增产物和核酸探针在基质微阵列上杂交的条件下，将(f)的扩增产物与与扩增产物互补的核酸探针组合，并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物；(k)鉴定(f)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；(l)从微芯片上除去带有(j)中产生的复合物的基板；(m)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果结合复合物，则确定细胞表面靶标存在于单个细胞池的成员上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。
在一些实施方案中，多重检测来自单个细胞的一种以上低丰度细胞内靶标的方法包括：(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与低丰度细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；(d)装载(1)(c)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳米微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；(e)在疏水表面与(d)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(d)中产生的微芯片；(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来；(g)通过PCR扩增(f)的释放的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(h)降低(g)微孔内的温度，并提供(g)的扩增产物不与(e)的基板相互作用的条件；(i)保持(h)的条件并从微芯片中除去(d)的基板；(j)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(g)的扩增产物互补的核酸探针并以已知的空间排列进行排列；(k)提供条件，其中(g)的扩增产物与(j)的核酸探针杂交并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物；(l)鉴定含有单个细胞的(f)微孔；(m)从微芯片中除去带有(k)中产生的复合物的基板；(n)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果结合复合物，则确定存在细胞内靶标。在报告分子核酸与微阵列上的互补核酸杂交后，参照微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定目标同一性。例如，细胞内磷蛋白如p-mTOR是重要的信号转导蛋白，并且与总mTOR相比以低丰度存在。检测这些磷蛋白而不是总蛋白直接与相应信号级联的激活相关。
在一些实施方案中，从细胞池的每个成员多重检测一个以上低丰度细胞内靶标的方法包括：(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与低丰度细胞内靶杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；(d)装载(1)(c)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳米微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；(e)在疏水表面与(d)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(d)中产生的微芯片；(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来；(g)通过PCR扩增(f)的释放的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(h)降低(g)微孔内的温度，并提供(g)的扩增产物不与(e)的基板相互作用的条件；(i)保持(h)的条件并从微芯片中除去(d)的基板；(j)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(g)的扩增产物互补的核酸探针并以已知的空间排列进行排列；(k)提供条件，其中(g)的扩增产物与(j)的核酸探针杂交并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物；(l)鉴定(f)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；(m)从微芯片中除去带有(k)中产生的复合物的基板；(n)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果结合复合物则则确定细胞内靶标存在于单个细胞库的成员上。在报告分子核酸与微阵列上的互补核酸杂交后，参照微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定目标同一性。
在一些实施方案中，细胞库包含约2至约100个细胞。在一些实施方案中，细胞库包含2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个细胞。
在一些实施方案中，(a)的细胞与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45种RPC一起温育。
在一些实施方案中，每种RPC的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体选自下组：CD3、CD4、CD8、CD11、CD24、EPCAM和PSMA。
在一些实施方案中，每个RPC的核酸诱饵的长度为约10至约500个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的核酸诱饵的长度为约10至约30个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的核苷酸诱饵的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
在一些实施方案中，每个RPC的可切割接头是光可切割的。在一些实施方案中，每个RPC的可切割接头是酶可切割的。
在一些实施方案中，每个RPC的报告分子的长度为约10至约500个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的报告分子的长度为约10至约30个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的报告分子的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
在一些实施方案中，包含纳升微孔的微芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。在一些实施方案中，包含纳升微孔的微芯片的纳升孔的体积为约1nL至999nL。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板是玻璃。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板带有微阵列，所述微阵列包含与RPC报告探针的已知核酸序列互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板带有微阵列，所述微阵列包含与RPC报告探针的已知核酸序列的PCR扩增子互补的核酸探针，并以已知的空间排列进行排列。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板具有疏水表面。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板的疏水表面是在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板的疏水表面是烷烃长链官能化的氧化硅表面或金属表面。
在一些实施方案中，微孔的温度降低至0℃以下。在一些实施方案中，微孔的温度降低至-10℃以下。在一些实施方案中，微孔的温度降低约20℃至100℃。在一些实施方案中，微孔的温度在1ms至5分钟的时间范围内降低。在一些实施方案中，微孔的温度在0.5ms至2分钟的时间范围内降低。在一些实施方案中，微孔的温度在1s至1分钟的时间范围内降低。
在一些实施方案中，通过微阵列扫描进行报告探针-核酸探针复合物的检测。在一些实施方案中，通过微阵列扫描进行PCR扩增子-核酸探针复合物的检测。
在一些实施方案中，本公开内容涉及在单个细胞上或细胞内或单个细胞池中的细胞表面和/或细胞内靶标的多重检测方法。本方法还涉及在单个细胞上或细胞内或单个细胞池中检测一个以上细胞表面靶标和/或细胞内靶标。在一些实施方案中，在单个细胞上多重检测一个以上细胞表面靶标的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种缀合物按以下顺序包含：(1)结合细胞表面靶标的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)将(b)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含含有单个细胞的纳升微孔的微芯片；(d)用带有微阵列的基板覆盖(c)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(a)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；(e)鉴定含有单个细胞的(d)微孔；(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞中释放出来，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(g)从微芯片中除去带有(f)中产生的复合物的基板；(h)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果复合物结合，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。例如，表面抗原CD3和CD8的组合可以定义细胞毒性T淋巴细胞。可以一起测定表面抗原如CD3、CD4、CD8、CD11a、CD11b、CD12和CD24以区分不同的免疫细胞表型。
在一些实施方案中，在单个细胞池的每个成员上多重检测一个以上细胞表面靶标的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种缀合物按以下顺序包含：(1)结合细胞表面靶的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)将(b)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含一个单独的细胞池；(d)用带有微阵列的基板覆盖(c)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(a)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；(e)鉴定含有单个细胞的(d)微孔；(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞中释放出来，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(g)从微芯片中除去带有(f)中产生的复合物的基板；(h)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果复合物结合，则确定细胞表面靶标存在于单个细胞池的成员上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。在一些实施方案中，细胞池包含单细胞类型。在一些实施方案中，细胞池包含多种细胞类型。
在一些实施方案中，在单个细胞中多重检测一个以上细胞内靶标的方法包括：(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)将(a)的细胞与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；(d)将(c)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含含有单个细胞的纳升微孔的微芯片；(e)用带有微阵列的基板覆盖(d)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(b)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；(f)鉴定含有单个细胞的(e)微孔；(g)在微孔中细胞内靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(h)从微芯片中除去带有(g)中产生的复合物的基板；(i)确定核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果复合物结合，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。例如，检测细胞内蛋白质如p-Akt可以确定给予类型的癌细胞的增殖潜力。检测一组细胞内蛋白质如pEGFR、pERK和pS6可以区分Ras和Pi3K-Akt途径在确定包括异质癌细胞群在内的单个细胞的命运方面的差异作用。
在一些实施方案中，在单个细胞池的每个成员上多重检测一个以上细胞内靶标的方法包括：(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)将(a)的细胞与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；(d)将(c)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含一个单独的细胞池；(e)用带有微阵列的基板覆盖(d)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(b)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；(f)鉴别(e)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；(g)在微孔中细胞内靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；(h)从微芯片中除去带有(g)中产生的复合物的基板；(i)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果复合物结合，则确定细胞内靶标存在于单个细胞库的成员内。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。在一些实施方案中，细胞池包含单细胞类型。在一些实施方案中，细胞池包含多种细胞类型。例如，检测细胞内蛋白质如p-Akt可以确定给予类型的癌细胞的增殖潜力。检测一组细胞内蛋白质如pEGFR、pERK和pS6可以区分Ras和Pi3K-Akt途径在确定包括异质癌细胞群在内的单个细胞的命运方面的差异作用。
在一些实施方案中，多重检测单个细胞的一个以上低丰度细胞表面靶标的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)与低丰度细胞表面靶标结合的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)装载(1)(b)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳米微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；(d)在疏水表面与(c)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(c)中产生的微芯片；(e)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞释放；(f)通过PCR扩增(e)的切割的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(g)降低(f)微孔内的温度，并提供(f)的扩增产物不与(d)的基板相互作用的条件；(h)保持(g)的条件并从微芯片上除去(d)的基板；(i)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(f)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；(j)在扩增产物和核酸探针在基板微阵列上杂交的条件下，将(f)的扩增产物与与扩增产物互补的核酸探针组合，并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物；(k)鉴定含有单个细胞的(f)的微孔；(l)从微芯片上除去带有(j)中产生的复合物的基板；(m)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，并且如果结合复合物，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。例如，作为免疫检查点蛋白的表面抗原PD-1具有非常广泛的表达水平。检测PD-1的低丰度表达的能力对于确定个体免疫细胞的活化状态具有重要意义。
在一些实施方案中，在细胞池的每个成员上多重检测一个以上低丰度细胞表面靶的方法包括：(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)与低丰度细胞表面靶标结合的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；(c)装载(1)(b)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含单个细胞库和PCR酶和寡核苷酸引物；(d)在疏水表面与(c)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(c)中产生的微芯片；(e)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞释放；(f)通过PCR扩增(e)的切割的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(g)降低(f)微孔内的温度，并提供(f)的扩增产物不与(d)的基板相互作用的条件；(h)保持(g)的条件并从微芯片上除去(d)的基板；(i)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(f)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；(j)在扩增产物和核酸探针在基板微阵列上杂交的条件下，将(f)的扩增产物与与扩增产物互补的核酸探针组合，并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物；(k)鉴定(f)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；(l)从微芯片上除去带有(j)中产生的复合物的基板；(m)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，并且如果结合复合物，则确定细胞表面靶标存在于单个细胞库的成员上。在一些实施方案中，参考微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定靶标同一性。
在一些实施方案中，多重检测来自单个细胞的一种以上低丰度细胞内靶标的方法包括(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与低丰度细胞内靶杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已与细胞内靶标结合)RPC的细胞悬浮液；(d)装载(1)(c)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳米微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；(e)在疏水表面与(d)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基质覆盖(d)中产生的微芯片；(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔和PCR酶和PCR寡核苷酸，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来；(g)通过PCR扩增(f)释放的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(h)降低(g)微孔内的温度，并提供(g)的扩增产物不与(e)的基板相互作用的条件；(i)保持(h)的条件并从微芯片中除去(d)的基板；(j)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(g)的扩增产物互补的核酸探针并以已知的空间排列排列；(k)提供(g)的扩增产物与(j)的核酸探针杂交并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物的条件；(l)鉴定含有单个细胞的(f)微孔；(m)从微芯片中除去带有(k)中产生的复合物的基板；(n)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果结合复合物，则确定存在细胞内靶标。在报告分子核酸与微阵列上的互补核酸杂交后，参照微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定目标同一性。例如，细胞内磷蛋白如p-mTOR是重要的信号转导蛋白，并且与总mTOR相比以低丰度存在。检测这些磷蛋白而不是总蛋白直接与相应信号级联的激活相关。
在一些实施方案中，从细胞库的每个成员多重检测多个低丰度细胞内靶标的方法包括(a)生产固定的透化细胞悬浮液；(b)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与低丰度细胞内靶杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已与细胞内靶标结合)RPC的细胞悬浮液；(d)装载(1)(c)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳米微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；(e)在疏水表面与(d)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(d)中产生的微芯片；(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔和PCR酶和PCR寡核苷酸，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来；(g)通过PCR扩增(f)释放的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(h)降低(g)微孔内的温度，并提供(g)的扩增产物不与(e)的基板相互作用的条件；(i)保持(h)的条件并从微芯片中除去(d)的基板；(j)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(g)的扩增产物互补的核酸探针并以已知的空间排列排列；(k)提供(g)的扩增产物与(j)的核酸探针杂交并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物的条件；(l)鉴别(f)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；(m)从微芯片中除去带有(k)中产生的复合物的基板；(n)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，如果结合复合物，则确定细胞内靶标存在于单个细胞库的成员上。在报告分子核酸与微阵列上的互补核酸杂交后，参照微阵列上互补核酸的位置确定细胞内靶标的特性，其指定目标同一性。
在一些实施方案中，细胞池包含约2至约100个细胞。在一些实施方案中，细胞池包含2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个细胞。
在一些实施方案中，(a)的细胞与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45种RPC一起温育。
在一些实施方案中，每种RPC的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，每种RPC的抗体选自CD3、CD4、CD8、CD11、CD24、EPCAM和PSMA。
在一些实施方案中，每个RPC的核酸诱饵的长度为约10至约500个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的核酸诱饵的长度为约10至约30个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的核苷酸诱饵的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
在一些实施方案中，每个RPC的可切割接头是光可切割的。在一些实施方案中，每个RPC的可切割接头是酶可切割的。
在一些实施方案中，每个RPC的报告分子的长度为约10至约500个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的报告分子的长度为约10至约30个核苷酸。在一些实施方案中，每个RPC的报告分子的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
在一些实施方案中，包含纳升微孔的微芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。在一些实施方案中，包含纳升微孔的微芯片的纳升孔的体积为约1nL至999nL。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板是玻璃。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板带有微阵列，所述微阵列包含与RPC报告探针的已知核酸序列互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板带有微阵列，所述微阵列包含与RPC报告探针的已知核酸序列的PCR扩增子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板具有疏水表面。在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板的疏水表面是在一些实施方案中，用于覆盖微芯片的基板的疏水表面是烷烃长链官能化的氧化硅表面或金属表面。
在一些实施方案中，微孔的温度降低至0℃以下。在一些实施方案中，微孔的温度降低至-10℃以下。在一些实施方案中，微孔的温度降低约20℃至100℃。在一些实施方案中，微孔的温度在1ms至5分钟的时间范围内降低。在一些实施方案中，微孔的温度在0.5ms至2分钟的时间范围内降低。在一些实施方案中，微孔的温度在1s至1分钟的时间范围内降低。
在一些实施方案中，通过微阵列扫描进行报告探针-核酸探针复合物的检测。在一些实施方案中，通过微阵列扫描进行PCR扩增子-核酸探针复合物的检测。
附加实施方式
1.一种多重检测单个细胞的一种以上细胞表面靶标的方法，包括：
(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)结合细胞表面靶标的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面结合的细胞；
(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；
(c)将(b)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含含有单个细胞的纳升微孔的微芯片；
(d)用带有微阵列的基板覆盖(c)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(a)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(e)鉴定含有单个细胞的(d)微孔；
(f)维持(e)微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件，在RPC的核酸报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交的条件下，从靶结合的抗体释放报告分子，并产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；
(g)从微芯片中除去带有(f)中产生的复合物的基板；和
(h)检测与基板结合的核酸-核酸探针复合物的位置，并确定是否存在细胞表面靶标。
2.一种多重检测细胞池的细胞表面靶标的方法，包括：
(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)结合细胞表面靶标的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；
(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；
(c)将(b)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含一个单独的细胞池；
(d)用带有微阵列的基板覆盖(c)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(a)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(e)鉴定含有单个细胞池的(d)微孔；
(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持每个含有单个细胞池的微孔，报告分子从单个(individual)细胞池的每个成员释放，其中RPC与其表面上的靶标结合，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；
(g)从微芯片中除去带有(f)中产生的复合物的基板；和
(h)检测核酸-核酸探针复合物是否与底物结合，并且如果结合复合物，则确定细胞表面靶标存在于单个细胞池的成员上。
3.如实施方式2所述的方法，其中所述细胞池包含约2至约100个细胞。
4.如实施方式3所述的方法，其中所述细胞库包含2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个或10个细胞。
5.如实施方式1至4中任一项所述的方法，其中(a)的细胞与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45种RPC一起温育。
6.如实施方式1至5中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体是多克隆抗体。
7.如实施方式1至5中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体是单克隆抗体。
8.如实施方式1至7中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体是嵌合抗体。
9.如实施方式8所述的方法，其中(a)(1)的抗体是人源化抗体。
10.如实施方式1至9中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体选自针对CD3、CD4、CD8、CD11、CD24、EPCAM和PSMA的抗体。
11.如实施方式1至10中任一项所述的方法，其中(a)(2)的可切割接头是可光切割的。
12.如实施方式1至10中任一项所述的方法，其中(a)(2)的可切割接头是酶可切割的。
13.如实施方式1至13中任一项所述的方法，其中(a)(3)的报告分子的长度为约10至约500个核苷酸。
14.如实施方式1至13中任一项所述的方法，其中(a)(3)的报告分子的长度为约10至约30个核苷酸。
15.如实施方式1至14中任一项所述的方法，其中(a)(3)的报告分子的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
16.如实施方案1至15中任一项所述的方法，其中(c)的微芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
17.如实施方案1至16中任一项所述的方法，其中(c)的微芯片的纳升孔的体积为约1nL至999nL。
18.如实施方案1至17中任一项所述的方法，其中(h)的检测通过微阵列扫描进行。
19.一种多重检测单个细胞的低丰度细胞表面靶标的方法，包括：
(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)与低丰度细胞表面靶标结合的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；
(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；
(c)装载(1)(b)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳米微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；
(d)在疏水表面与(c)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(c)中产生的微芯片；
(e)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞释放；
(f)通过PCR扩增(e)切割的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；
(g)降低(f)微孔内的温度，并提供(f)的扩增产物不与(d)的基板相互作用的条件；
(h)保持(g)的条件并从微芯片上除去(d)的基板；
(i)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(f)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(j)在扩增产物和核酸探针在基板微阵列上杂交的条件下，将(f)的扩增产物与扩增产物互补的核酸探针组合，并产生与底物结合的扩增产物-核酸探针复合物；
(k)鉴定含有单个细胞的(f)的微孔；
(l)从微芯片上除去带有(j)中产生的复合物的基板；和
(m)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果结合复合物，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。
20.一种多重检测细胞库的低丰度细胞表面靶标的方法，包括：
(a)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)与低丰度细胞表面靶标结合的抗体；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的抗体组分与其细胞表面靶标结合，从而产生RPC与其表面上的靶标结合的细胞；
(b)洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合其表面)RPC的细胞悬浮液；
(c)装载(1)(b)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含单个细胞池和PCR酶和寡核苷酸引物；
(d)在疏水表面与(c)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(c)中产生的微芯片；
(e)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与其表面上的靶标结合的细胞释放；
(f)通过PCR扩增(e)切割的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；(f)通过PCR扩增(e)切割的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；
(g)降低(f)微孔内的温度，并提供(f)的扩增产物不与(d)的底物相互作用的条件；
(h)保持(g)的条件并从微芯片上除去(d)的基板；
(i)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(f)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(j)在扩增产物和核酸探针在基板微阵列上杂交的条件下，将(f)的扩增产物与与扩增产物互补的核酸探针组合，并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物；
(k)鉴定(f)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；
(l)从微芯片上除去带有(j)中产生的复合物的基板；和
(m)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果结合复合物，则确定细胞表面靶标存在于单个细胞池的成员上。
21.如实施方式20所述的方法，其中所述细胞池包含约2至约100个细胞。
22.如实施方案21所述的方法，其中所述细胞库包含2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个细胞。
23.如实施方式19至22中任一项所述的方法，其中(a)的细胞与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45种RPC一起温育。
24.如实施方式19至23中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体是多克隆抗体。
25.如实施方式19至23中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体是单克隆抗体。
26.如实施方式19至25中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体是嵌合抗体。
27.如实施方式26所述的方法，其中(a)(1)的抗体是人源化抗体。
28.如实施方式19至27中任一项所述的方法，其中(a)(1)的抗体选自针对CD3、CD4、CD8、CD11、CD24、EPCAM和PSMA的抗体。
29.如实施方式19至28中任一项所述的方法，其中(a)(2)的可切割接头是可光切割的。
30.如实施方式19至28中任一项所述的方法，其中(a)(2)的可切割接头是酶可切割的。
31.如实施方式19至30中任一项所述的方法，其中(a)(3)的报告分子的长度为约10至约500个核苷酸。
32.如实施方式19至30中任一项所述的方法，其中(a)(3)的报告分子的长度为约10至约30个核苷酸。
33.如实施方式19至32中任一项所述的方法，其中(a)(3)的报告分子的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
34.如实施方式19至33中任一项所述的方法，其中(c)的微芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
35.如实施方式19至34中任一项所述的方法，其中(c)的微芯片的纳升孔的体积为约1nL至999nL。
36.如实施方式19至35中任一项所述的方法，其中(l)的检测通过微阵列扫描进行。
37.如实施方式19至36中任一项所述的方法，其中(d)的基材是玻璃。
38.如实施方式19至37中任一项所述的方法，其中(d)的基材的疏水表面是
39.如实施方式19至37中任一项所述的方法，其中(d)的基材的疏水表面是烷烃链官能化的氧化硅表面和金属表面。
40.如实施方式19至39中任一项所述的方法，其中将温度降低至0℃以下。
41.如实施方案40的方法，其中温度降低至-10℃以下。
42.如实施方案19至41中任一项所述的方法，其中将温度降低约20℃至100℃。
43.如实施方案19至42中任一项所述的方法，其中温度在1ms至5分钟的时间跨度内降低。
44.如实施方案43所述的方法，其中温度在0.5ms至2分钟的时间跨度内降低。
45.如实施方案44所述的方法，其中温度在1s至1分钟的时间跨度内降低。
46.一种多重检测单个细胞中细胞内靶标的方法，包括：
(a)生产固定的透化细胞悬浮液；
(b)将(a)的细胞与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；
(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；
(d)将(c)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含含有单个细胞的纳升微孔的微芯片；
(e)用带有微阵列的基板覆盖(d)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(b)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(f)鉴定含有单个细胞的(e)微孔；
(g)在微孔中细胞内靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；
(h)从微芯片中除去带有(g)中产生的复合物的基板；和
(i)确定核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果复合物结合，则确定细胞表面靶标存在于细胞上。
47.一种多重检测细胞库中细胞内靶标的方法，包括：
(a)生产固定的透化细胞悬浮液；
(b)将(a)的细胞与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；
(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；
(d)将(c)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含一个单独的细胞池；
(e)用带有微阵列的基板覆盖(d)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(b)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(f)鉴定(e)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；
(g)在微孔中细胞内靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞的微孔，报告分子从单个细胞库的每个成员释放，RPC与细胞内靶标结合，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物；
(h)从微芯片中除去带有(g)中产生的复合物的基板；和
(i)确定核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，如果复合物结合，则确定细胞内靶标存在于单个细胞池的成员内。
48.如实施方式47所述的方法，其中所述细胞池包含约2至约100个细胞。
49.如实施方案48所述的方法，其中所述细胞池包含2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个细胞。
50.如实施方式46至49中任一项所述的方法，其中(b)的细胞与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45种RPC一起温育。
51.如实施方案46至50中任一项所述的方法，其中(b)(1)的核酸诱饵的长度为约10至约500个核苷酸。
52.如实施方案46至51中任一项所述的方法，其中(b)(1)的核酸诱饵的长度为约10至约30个核苷酸。
53.如实施方式46至52中任一项所述的方法，其中(b)(1)的核酸诱饵的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
54.如实施方式46至53中任一项所述的方法，其中(b)(2)的可切割接头是可光切割的。
55.如实施方式46至53中任一项所述的方法，其中(b)(2)的可切割接头是酶可切割的。
56.如实施方式46至55中任一项所述的方法，其中(b)(3)的报告分子的长度为约10至约500个核苷酸。
57.如实施方式46至56中任一项所述的方法，其中(b)(3)的报告分子的长度为约10至约30个核苷酸。
58.如实施方式46至57中任一项所述的方法，其中(b)(3)的报告分子的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
59.如实施方式46至58中任一项所述的方法，其中(d)的微芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
60.如实施方式46至59中任一项所述的方法，其中(d)的微芯片的纳升孔的体积为约1nL至999nL。
61.如实施方式46至60中任一项所述的方法，其中(i)的检测通过微阵列扫描进行。
62.一种从单个细胞中多重检测低丰度细胞内靶标的方法，包括：
(a)生产固定的透化细胞悬浮液；
(b)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与低丰度细胞内靶杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；
(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；
(d)装载(1)(c)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，所述纳米微孔含有单个细胞和PCR酶和寡核苷酸引物；
(e)在疏水表面与(d)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(d)中产生的微芯片；
(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来；
(g)通过PCR扩增(f)的释放的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；
(h)降低(g)微孔内的温度，并提供(g)的扩增产物不与(e)的基板相互作用的条件；
(i)保持(h)的条件并从微芯片中除去(d)的基板；
(j)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(g)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(k)提供(g)的扩增产物与(j)的核酸探针杂交并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物的条件；
(l)鉴定含有单个细胞的(f)微孔；
(m)从微芯片中除去带有(k)中产生的复合物的基板；和，
(n)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，并且如果结合复合物则确定存在细胞内靶标。
63.一种从细胞池中多重检测低丰度细胞内靶标的方法，包括：
(a)生产固定的透化细胞悬浮液；
(b)用至少两种报告-探针缀合物(RPC)孵育细胞，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与低丰度细胞内靶杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；
(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生具有(已结合细胞内靶标)RPC的细胞悬浮液；
(d)装载(1)(c)中产生的悬浮液；(2)与(b)(3)的核酸报告分子互补的PCR酶和PCR寡核苷酸引物到包含纳升微孔的微芯片上，从而产生包含纳升微孔的微芯片，每个微孔包含单个细胞库和PCR酶和寡核苷酸引物；
(e)在疏水表面与(d)的微孔接触的条件下，用包含疏水表面的基板覆盖(d)中产生的微芯片；
(f)在微孔中表面靶标结合的RPC的可切割接头被切割的条件下维持含有单个细胞和PCR酶和PCR寡核苷酸的微孔，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来；
(g)通过PCR扩增(f)的释放的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；
(h)降低(g)微孔内的温度，并提供(g)的扩增产物不与(e)的基板相互作用的条件；
(i)保持(h)的条件并从微芯片中除去(d)的基板；
(j)用带有微阵列的基板覆盖(h)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(g)的扩增产物互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列；
(k)提供(g)的扩增产物与(j)的核酸探针杂交并产生与基板结合的扩增产物-核酸探针复合物的条件；
(l)鉴定(f)的微孔，每个微孔包含一个单独的细胞池；
(m)从微芯片中除去带有(k)中产生的复合物的基板；和，
(n)检测核酸-核酸探针复合物是否与基板结合，并且如果结合复合物则确定细胞内靶标存在于单个细胞池的成员上。
64.如实施方式63所述的方法，其中所述细胞池包含约2至约100个细胞。
65.如实施方案64所述的方法，其中所述细胞池包含2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10个细胞。
66.如实施方式62至65中任一项所述的方法，其中(b)的细胞与2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45种RPC一起温育。
67.如实施方式62至66中任一项所述的方法，其中(b)(1)的核酸诱饵的长度为约10至约500个核苷酸。
68.如实施方式62至67中任一项所述的方法，其中(b)(1)的核酸诱饵的长度为约10至约30个核苷酸。
69.如实施方式62至68中任一项所述的方法，其中(a)(3)的核酸诱饵的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
70.如实施方式62至69中任一项所述的方法，其中(b)(2)的可切割接头是可光切割的。
71.如实施方式62至69中任一项所述的方法，其中(b)(2)的可切割接头是酶可切割的。
72.如实施方式62至71中任一项所述的方法，其中(b)(3)的报告分子的长度为约10至约500个核苷酸。
73.如实施方式62至72中任一项所述的方法，其中(b)(3)的报告分子的长度为约10至约30个核苷酸。
74.如实施方式62至73中任一项所述的方法，其中(b)(3)的报告分子的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。
75.如实施方式62至74中任一项所述的方法，其中(d)的微芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
76.如实施方式62至75中任一项所述的方法，其中(d)的微芯片的纳升孔的体积为约1nL至999nL。
77.如实施方式62至76中任一项所述的方法，其中(n)的检测通过微阵列扫描进行。
78.如实施方式62至77中任一项所述的方法，其中(e)的基材是玻璃。
79.如实施方式62至78中任一项所述的方法，其中(e)的基材的疏水表面是
80.如实施方式62至78中任一项所述的方法，其中(e)的基材的疏水表面是烷烃链官能化的氧化硅表面和金属表面。
81.如实施方式62至80中任一项所述的方法，其中将温度降低至0℃以下。
82.如实施方案81的方法，其中温度降低至-10℃以下。
83.如实施方案62至82中任一项所述的方法，其中将温度降低约20℃至100℃。
84.如实施方案62至83中任一项所述的方法，其中温度在1ms至5分钟的时间跨度内降低。
85.如实施方案84所述的方法，其中温度在0.5ms至2分钟的时间跨度内降低。
86.如实施方案85所述的方法，其中温度在1s至1分钟的时间跨度内降低。
87.一种多重检测细胞内靶标的方法，包括：
(a)将固定的透化细胞悬浮液与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包括：(1)与细胞内靶标杂交的核酸诱饵；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子，在该条件下，其中RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合，从而产生包含细胞内靶标结合的RPC的细胞；
(b)将(a)中产生的悬浮液加载到包含多个纳升微孔的微芯片上，以产生负载的微芯片；
(c)接触(b)中产生的负载微芯片和带有包含多个捕获探针的微阵列的基质，其中每个捕获探针包含与(b)的至少一个核酸报告分子互补的核酸序列(3)，其中多个捕获探针以已知的空间排列排列在基板上，其中微芯片和基板的接触包围微芯片的每个微孔，并且其中每个封闭的微孔包含微阵列的每个捕获探针；
(d)将负载的微芯片保持在微孔中细胞内靶结合的RPC的可切割接头被切割并且报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放的条件下，释放的报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交，产生报告分子-与基板结合的捕获探针复合物；
(e)从微芯片中除去带有(d)中产生的复合物的基板；和
(f)观察一个或多个报告分子-捕获与基板结合的探针复合物
(g)鉴定对应于与基板结合的一种或多种报告分子的一种或多种细胞内靶标，用于至少一个含有少于5个细胞的封闭微孔。
88.如实施方式87所述的方法，其中所述方法包括鉴定存在于所述基板上的一个或多个相应的细胞内靶标，用于至少一个含有单个细胞的封闭微孔。
89.如实施方式87或88所述的方法，其中所述方法包括将固定的透化细胞的悬浮液与至少5个RPC、至少10个RPC、至少15个RPC、至少20个RPC、至少25个RPC、至少30个RPC、至少35个RPC、至少40个RPC、至少45个RPC或至少50个RPC一起温育。
90.如实施方式87-89中任一项所述的方法，其中所述微芯片包含2至20,000个微孔，包括端点。
91.如实施方式87-89中任一项所述的方法，其中所述微芯片包含5,000至20,000个微孔，包括端点。
92.如实施方式87-91中任一项所述的方法，其中每个微孔的体积为1纳升至999纳升。
93.如实施方式87-91中任一项所述的方法，其中每个微孔的体积为1纳升至10纳升。
94.如实施方式87-93中任一项所述的方法，其中每个微孔包含一定体积的(a)的悬浮液，其在1纳升至10纳升之间。
95.如实施方式87-94中任一项所述的方法，其中(a)(1)的核酸诱饵包含DNA序列、RNA序列、肽或其组合。
96.如实施方式87-95中任一项所述的方法，其中(a)(3)的核酸报告分子包含DNA序列、RNA序列、肽或其组合。
97.如实施方式87-95中任一项所述的方法，其中(a)(3)的核酸报告分子包含DNA序列、RNA序列、肽或其组合。
98.如实施方式87-95中任一项所述的方法，其中(a)(3)的核酸报告分子包含DNA序列。
99.如实施方式87-98中任一项所述的方法，其中所述基板包含玻璃组合物。
100.如实施方式87-99中任一项所述的方法，其中与每个捕获探针的(b)(3)的至少一个核酸报告分子互补的核酸序列包含DNA序列、RNA序列、肽或其组合。
101.如实施方式87-99中任一项所述的方法，其中与每个捕获探针的(b)(3)的至少一个核酸报告分子互补的核酸序列包含DNA序列。
102.如实施方式87-101中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针包含与(a)的RPC的数量相等的许多不同的捕获探针。
103.如实施方式87-101中任一项所述的方法，其中所述多种捕获探针包含至少2种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、或至少50种捕获探针。
104.如实施方式87-103中任一项所述的方法，其中所述微阵列的捕获探针的已知空间排列包括重复型式。
105.如实施方式104所述的方法，其中重复型式包括平行线。
106.如实施方式87-105中任一项所述的方法，其中防止封闭的微孔与微芯片上的任何其他封闭的微孔流体连通。
107.如实施方式106所述的方法，其中所述基板接触所述微芯片的整个表面，包围所述微芯片的每个微孔。
108.如实施方式87-107中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针中的每个捕获探针包含可检测标记。
109.如实施方式108所述的方法，其中可检测标记是荧光标记。
110.如实施方式108-109中任一项所述的方法，其中鉴定步骤包括组合来自可检测标记的信号和微阵列内已知空间排列内的位置，以确定结合到基板的报告分子-捕获探针复合物的特性。
111.如实施方式87-110中任一项所述的方法，还包括洗涤(a)的产物以除去未结合的RPC并产生包含RPC的细胞悬浮液的步骤。
112.如实施方式87-111中任一项所述的方法，其中(a)(2)的可切割接头是可光切割的。
113.如实施方式87-111中任一项所述的方法，其中(a)(2)的可切割接头是酶可切割的。
114.如实施方式87-113中任一项所述的方法，其中微芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
115.如实施方式87-115中任一项所述的方法，其中通过微阵列扫描进行观察的步骤。
116.如实施方式87-116中任一项所述的方法，其中一种或多种细胞内靶标是低丰度的，其中该方法还包括
将(a)的悬浮液与PCR酶和与(a)(3)的核酸报告分子互补的PCR寡核苷酸引物一起温育以产生PCR悬浮液，
将PCR悬浮液加载到微芯片上以产生PCR负载的微芯片；
在微孔中细胞内RPC的可切割接头被切割的条件下维持PCR负载的微芯片，报告分子从RPC与细胞内靶标结合的细胞中释放出来；
通过PCR扩增释放的核酸报告分子，从而在每个微孔中产生多个扩增产物；
使负载PCR的微芯片与带有微阵列的基板接触，所述微阵列包含与扩增产物互补的核酸探针。
117.如实施方式116所述的方法，其中该方法还包括使负载PCT的微芯片与包含疏水表面的基板接触，并且提供了在使负载PCR的微芯片与带有包含与扩增产物互补的核酸探针的微阵列的基板接触之前，扩增产物不与疏水表面相互作用的条件。
118.如实施方式117所述的方法，其还包括在使PCT负载的微芯片与包含疏水表面的基板接触之前降低每个微孔内的温度。
119.如实施方式117或118所述的方法，其中所述基板的疏水表面是
120.如实施方式117或118所述的方法，其中(e)的基板的疏水表面是烷烃链官能化的氧化硅或金属表面。
121.如实施方式118所述的方法，其中温度降低至0℃以下。
122.如实施方式118所述的方法，其中温度降低至-10℃以下。
123.如实施方式118所述的方法，其中温度降低约20℃至100℃。
124.如实施方式118或121-123中任一项所述的方法，其中温度在1ms至5分钟的时间跨度内降低。
125.如实施方式118或121-123中任一项所述的方法，其中温度在0.5ms至2分钟的时间跨度内降低。
126.如实施方式118或121-123中任一项所述的方法，其中温度在1s至1分钟的时间跨度内降低。
以下实施例旨在说明但不以任何方式限制要求保护的发明。
实施例
实施例1：材料和方法
I.实验步骤(以miRNA检测为例)
1.旋转收获的细胞并用DPBS洗涤两次。
2.用管内的多聚甲醛溶液(PBS中4％)固定细胞。在37℃孵育细胞10分钟。
3. 10分钟后，将细胞置于冰上1分钟，然后将其旋转以除去多聚甲醛溶液。
4.向细胞中加入90％甲醇，置于冰上30分钟。
5.半小时后，旋转细胞并除去甲醇溶液。
6.在管内加入封闭缓冲液(TET中3％BSA+2％NaCl)，37℃孵育细胞1小时。
7.一小时后，将细胞旋转并除去封闭缓冲液。
8.应将溶液A(NEB2A和TET内的T4DNA连接酶)加入细胞中。
9.将1uL PC接头缀合的微小RNA探针溶液(1ul*100uM＝100nM)加入1mL细胞悬浮液中，并在37℃下孵育2小时。
同时，带有DNA探针的载玻片应该用封闭缓冲液封闭2小时。
1. 2小时后，应旋转细胞并除去上清液。用TET彻底洗涤细胞六次(每个洗涤步骤需要孵育步骤)。
10.将细胞重悬于另一个1mL溶液A。然后将200μL细胞悬浮液移液到PDMS微孔上，并将带有流动图案化DNA探针的载玻片放在其顶部，含有DNA的面朝下。将载玻片和PDMS微孔板夹在一起。
11.分别使用暗视野和倾斜通道扫描被细胞捕获的PDMS微孔。
12.用紫外灯照射设备900秒(15分钟)。
13.将设备放入培养箱(37℃)中过夜。
14.从培养箱中取出设备，然后从PDMS微孔板上释放载玻片。
15.用5％BSA溶液洗几次玻璃载玻片。
16.在5％BSA中稀释SA-PE 1：100，并使用移液管将200uL添加到载玻片上并孵育30分钟。
17.将载玻片洗几次，然后依次浸入DPBS，50/50DPBS/水，去离子水中。吹干载玻片并用Genepix荧光扫描仪检测信号。
实施例2：来自单个细胞的细胞内靶标的多重鉴定的示意图
图1描绘了来自单个细胞的细胞内靶标的多重检测的一些实施方案的示意图。在该非限制性实施方案中，miRNA捕获链充当报告分子-探针缀合物(RPC)的核酸诱饵。
在该实施方案中，在单个细胞中多重检测细胞内靶标的方法包括(a)产生固定的透化细胞悬浮液，(b)将(a)的细胞与至少两种报告-探针缀合物(RPC)一起孵育，每种报告-探针缀合物按以下顺序包含：(1)与细胞内靶标或细胞表面靶标杂交的核酸诱饵(图1，任何miRNA 1-3)；(2)可切割的接头；(3)已知序列的核酸报告分子(图1A，B或C)，在RPC的核酸诱饵组分与其细胞内靶标结合的条件下，从而产生包含靶标结合的RPC的细胞，(c)洗涤(b)的产物以除去未结合的RPC并产生含有靶标结合的RPC的细胞悬浮液，(d)将(c)中产生的悬浮液加载到包含纳升微孔的微芯片上，并产生包含含有单个细胞的纳升微孔的微芯片，(e)用带有微阵列的基板覆盖(d)中产生的微芯片，所述微阵列包含与(b)(3)的核酸报告分子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列(图1，A'，B'或C')，(f)鉴定含有单个细胞的(e)微孔，(g)提供条件，其中(f)的微孔中靶标结合的RPC的可切割接头被切割，从靶标结合的诱饵中释放报告分子，在RPC的核酸报告分子与微阵列上的互补核酸探针杂交的条件下，产生与基板结合的报告分子核酸-核酸探针复合物，(h)从微芯片上除去带有(g)中产生的复合物的基板，(i)检测与基板结合的核酸-核酸探针复合物的位置，并确定是否存在细胞内靶标。
参照微阵列上的互补核酸(A-A'，B-B'或C-C')的位置确定细胞内靶标(miRNA 1,2或3)的特性，其指定靶标同一性。例如，微阵列上A-A'的检测表明细胞内存在miRNA-1。
实施例3：来自单个细胞的细胞内靶标的多重鉴定的备选实施方案的示意图
图2描绘了本公开的另一个非限制性实施方案。该实施方案遵循与实施例2中描述的实施方案相同的通用方法，然而RPC的捕获部分包含结合细胞内靶标而不是核酸诱饵序列的抗体。
实施例4：来自单个细胞的低丰度靶标的多重鉴定的示意图描述
图3描绘了来自单个细胞的低丰度靶标的多重鉴定的一些实施方案的几个步骤。在用PCR酶和引物将包含靶结合的RPC的细胞加载到微孔中之后，在扩增RPC的切割的核酸报告分子的条件下进行PCR，从而在每个微孔中产生多个PCR扩增子。然后微孔内的温度迅速降低，从而提供PCR扩增子从覆盖微孔的基板的表面排斥的条件。然后除去基板，用带有微阵列的基板覆盖微芯片，所述微阵列包含与PCR扩增子互补的核酸探针，并以已知的空间排列排列。然后该过程如实施例2步骤(f)进行。
实施例5
图4显示代表性扫描仪图像，其显示用于在单细胞水平检测多种miRNA的整个DNA微阵列载玻片。放大视图显示出优异的信号背景比。
图5显示使用图1中描绘的方案检测多种miRNA的定量。测定两种细胞系(U937和U87)。
实施例6
将包含DNA链的捕获探针(图7，A'-M')固定在基板上，作为一组平行线，其定向使得每个微孔与全套DNA寡聚体(A'-M')相交(即，每个微孔与组中的13种miRNA生物标记物中的每一种相交)。包含荧光的、Cy3标记的DNA链(A-M)的报告链从捕获的细胞释放，通过捕获探针固定在基板上，并使用荧光微阵列扫描仪检测/成像/观察。来自与固定的捕获链杂交的报告链(图7，A-M)的信号强度(图7，A'-M')可用于确定捕获在微芯片的每个微孔内的单个细胞中的每个相应miRNA的丰度。表1和2提供了用于检测相应miRNA的捕获和报告DNA链的序列(图7，A-M，A'-M')。图7中所示的细胞来自人THP-1细胞系。
实施例7
在该实施例中，在微芯片上测定了大约1000个单细胞。进行无监督聚类以对细胞进行分组。图8是显示单细胞miRNA谱的热图。每列表明检测到的特定miRNA，并且热图上的每一行是单个细胞。该图8中所示的细胞来自人THP-1细胞系。
实施例8
该实施例证明了从单细胞捕获和检测miR-16-5p。对数尺度散点图显示零细胞和单细胞微孔中的荧光强度分布(图9)。图表显示了分别与所示的1个、2个、3个和4个微孔相比在所有零细胞微孔上的对数尺度原始强度平均值(图9B)。零细胞微孔平均值可用作背景以计算单个和多个细胞微孔中的净信号。
实施例9
该实施例证明了在单细胞中捕获和检测miR-223-3p。对数尺度散点图显示零细胞和单细胞微孔中的荧光强度分布(图10A)。图表显示了分别与1个、2个、3个和4个微孔相比在所有零细胞微孔上的对数尺度原始强度平均值(图10B)。零细胞微孔平均值可用作背景以计算单个和多个细胞微孔中的净信号。
实施例10
进行了大量miRNA检测的标准方法(针点阵微阵列)。在图11中示出了描绘图6-10中所示结果的验证的一系列图像。在该实施例中使用相同的细胞系THP-1，如图6-10中所示的研究。将细胞固定、透化，与miRNA捕获/DNA报告缀合物一起孵育，根据用于图6-10中所示研究的相同方法和步骤诱导释放报告链(A-M)(通过UV暴露)。然而，与图6-10中描述的研究不同，旋转细胞，将含有释放的报告链的上清液上样到由相同组的捕获DNA探针(A'-M')制成的针点阵微阵列上。针点阵微阵列的结果与图6-10中所示的单细胞平均值非常一致。
实施例11
该实施例通过标准定量PCR(qPCR)测定验证了本公开的单细胞测定。使用RNeasy试剂盒裂解THP-1细胞(约1百万个细胞)，并使用标准qPCR检测从大量样品释放的miRNA(如图11中所述)。对于最丰富的miRNA(miR16，miR221和miR150)，通过标准qPCR检测的这些miRNA中的每一种的水平与通过本公开的方法检测的这些miRNA中的每一种的水平相同(图13)。这些方法之间的差异包括miR145和miR155。通过本公开的方法检测MiR145，但不通过qPCR检测。MiR155通过qPCR检测，但不是通过本公开的方法检测，部分原因是miRNA加工的差异。根据本公开的方法，miRNA仍然与Ago蛋白结合，并且miRNA捕获序列可能无法获得序列的一部分。在标准qPCR中，miRNA完全从Ago蛋白质中剥离并且可能会快速降解。因此，通过qPCR分析的miRNA与本公开的方法可具有不同的降解机制和速率。
实施例12
该实施例使用各图14A和图14B中的荧光原位杂交(FISH)和荧光强度的定量验证了本发明的用于检测miR16的单细胞测定法。MiR16是检测到的最强信号之一，miRNA FISH证实了THP-1细胞的丰度。使用乱序FISH探针作为阴性对照。用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)显示细胞核。参见图14A-14C。
表1.miRNA靶标及其序列的列表
1.miR-146a-5p UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU(SEQ ID NO:1)
2.miR-145-5p GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU(SEQ ID NO:2)
3.miR-21-5p UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO:3)
4.miR-16-5p UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG(SEQ ID NO:4)
5.miR-150-5p UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG(SEQ ID NO:5)
6.miR-142-3p CAUAAAGUAGAAAGCACUACU(SEQ ID NO:6)
7.miR-155-5p UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU(SEQ ID NO:7)
8.miR-223-3p UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA(SEQ ID NO:8)
9.miR-424-5p CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA(SEQ ID NO:9)
10.miR-28-5p AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG(SEQ ID NO:10)
11.miR-122-5p UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG(SEQ ID NO:11)
12.miR-221-3p AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(SEQ ID NO:12)
表2.DNA报告分子(A-M)/miRNA捕获序列(miRNA 1-13)缀合物的列表
1,miR-146a/A
5'生物素-AAA AAA AAA AAA ATA CGG ACT TAG CTC CAG GAT AAA AAA–PC接头–AAA AAA GAT ATA TTT TAA ACC CAT GGA ATT CAG TTC TCA/3InvdT/(SEQ ID NO:13)
2,miR-145/B
5'生物素AAA AAA AAA AAA ATA GGC ATG ATT CAA TGA GGC AAA AAA–PC接头–AAA AAA GAT ATA TTT TAA GGG ATT CCT GGG AAA ACT GGA C/3InvdT/(SEQ ID NO:14)
3,miR-21/C
5'生物素-AAA AAA AAA AAA GCG ATA GTA GAC GAG TGC AAA AAA–PC接头–AAAAAA GAT ATA TTT TAT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA/3InvdT/(SEQ ID NO:15)
4,hsa-miR-16-5p/D
5'生物素AAA AAA AAA AAA ATA CTC TGA CAT CTC GAC CAT AAA AAA–PC接头–AAA AAA CGCCAATATTTACGTGCTGCTA/3InvdT/(SEQ ID NO:16)
5,hsa-miR-150-5p/E
5'生物素AAA AAA AAA AAA ATA GAT ACT GCC ACT TCA CAT AAA AAA–PC接头–AAA AAA ACTGGTACAAGGGTTGGGAGA/3InvdT/(SEQ ID NO:17)
6,hsa-miR-142-3p/F
5'生物素AAA AAA AAA AAA ATA CCG TGA ACC TTA CCT GAT AAA AAA–PC接头–AAA AAA TCCATAAAGTAGGAAACACTACA/3InvdT/(SEQ ID NO:18)
7,hsa-miR-155-5p/G
5'生物素AAA AAA AAA AAA TGC TCG GGA AGG CTA CTC AAA AAA–PC接头–AAAAAA CCTATCACGATTAGCATTA/3InvdT/(SEQ ID NO:19)
8,hsa-miR-223-3p/H
5'生物素AAA AAA AAA AAA ACG CAC CGC AGT TTG GTC AAT AAA AAA–PC接头–AAA AAA TGGGGTATTTGACAAACTGACA/3InvdT/(SEQ ID NO:20)
9,hsa-miR-424-5p/I
5'生物素AAA AAA AAA AAA ATC CGA CGC AAC AAT AGG GCA AAA AAA–PC接头–AAA AAA TTCAAAACATGAATTGCTGCT/3InvdT/(SEQ ID NO:21)
10,hsa-miR-28-5p/J
5'生物素AAA AAA AAA AAA ACC TGC TCG ACA ACT AGA AGA AAA AAA–PC接头–AAA AAA TCA ATA GAC TGT GAG CTC CT/3InvdT/(SEQ ID NO:22)
11,hsa-miR-122-5p/K
5'生物素AAA AAA AAA AAA ACC GCG ACC AGA ATT AGA TTA AAA AAA–PC接头–AAA AAA AAACACCATTGTCACACTCCA/3InvdT/(SEQ ID NO:23)
12,hsa-miR-221-3p/L
5'生物素AAA AAA AAA AAA AGC CGA AGC AGA CTT AAT CAC AAA AAA–PC接头–AAA AAA GAT ATA TTT TAG AAA CCC AGC AGA CAA TGT AGC T/3InvdT/(SEQ ID NO:24)
13,对照:miSpike/M
5'生物素AAA AAA AAA AAA AAC AGG TTC AGA ATC CTC GAC AAA AAA–PC接头–AAA AAA GAT ATA TTT TAA GAC CGC TCC GCC ATC CTG AG/3InvdT(SEQ ID NO:25)
表3.捕获DNA探针及其序列的列表
A’→1:miR-146a
5'-AAA AAA AAA AAA AAT CCT GGA GCT AAG TCC GTA-3'
B’→2:miR-145
5'-AAA AAA AAA AAA AGC CTC ATT GAA TCA TGC CTA-3'
C’→3:miR-21
5'-AAA AAA AAA AAA AGC ACT CGT CTA CTA TCG CTA-3'
D’→4:miR-16
5'-AAA AAA AAA AAA AAT GGT CGA GAT GTC AGA GTA-3'
E’→5:miR-150
5'-AAA AAA AAA AAA AAT GTG AAG TGG CAG TAT CTA-3'
F’→6:miR-142
5'-AAA AAA AAA AAA AAT CAG GTA AGG TTC ACG GTA-3'
G’→7:miR-155
5'-AAA AAA AAA AGA GTA GCC TTC CCG AGC ATT-3'
H’→8:miR-223
5'-AAA AAA AAA AAT TGA CCA AAC TGC GGT GCG-3'
I’→9:miR-424
5'-AAA AAA AAA ATG CCC TAT TGT TGC GTC GGA-3'
J’→10:miR-28
5'-AAA AAA AAA ATC TTC TAG TTG TCG AGC AGG-3'
K’→11:miR-122
5'-AAA AAA AAA ATA ATC TAA TTC TGG TCG CGG-3'
L’→12:miR-221
5'-AAA AAA AAA AGT GAT TAA GTC TGC TTC GGC-3'
M’→13:对照/miSpike
5'-Cy3-AAA AAA AAA AGT CGA GGA TTC TGA ACC TGT-3'

Claims (55)

1.一种方法，其中包括：
(a)将包含核酸靶标的细胞与至少两种缀合物接触，包含核酸诱饵链(i)的各缀合物通过(iii)可切割接头与(ii)核酸报告链连接，其中核酸诱饵链含有与目标核酸靶互补的核苷酸序列，以产生包含靶-缀合物复合物的修饰细胞；和
(b)将步骤(a)的修饰细胞加载到含有微孔的基板上，以产生负载的基板。
2.如权利要求1所述的方法，其中还包括：(c)将负载的基板与包含至少两组的至少两组固定化核酸捕获探针的覆盖基板接触，每个捕获探针包含与步骤(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以产生至少两个封闭的微孔，所述至少两个封闭的微孔中的每一个包含覆盖基板的一组至少两个不同的捕获探针。
3.如权利要求1或2的方法，其中还包括(d)切割缀合物的可切割接头以释放核酸报告链。
4.如权利要求3所述的方法，其中还包括将所述封闭的微孔维持在核酸杂交条件下以产生固定在所述覆盖基板上的报告-捕获复合物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括将含有固定的报告-捕获复合物的覆盖基板从基板上解离，并使至少一种固定在覆盖基板上的报告-捕获复合物可视化。
6.如权利要求5所述的方法，其中还鉴定至少一种(a)的目标核酸靶标。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使包含核酸靶标的细胞与至少三种缀合物接触。
8.如权利要求7所述的方法，其中步骤(a)包括使包含核酸靶标的细胞与至少5种缀合物接触。
9.如权利要求8所述的方法，其中步骤(a)包括使包含核酸靶标的细胞与至少10种缀合物接触。
10.如权利要求9所述的方法，其中步骤(a)包括使包含核酸靶标的细胞与至少50种缀合物接触。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞是透化的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞是固定的。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述核酸诱饵链含有与核糖核酸(RNA)靶标互补的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中RNA靶标选自mRNA靶标、tRNA靶标、rRNA靶标和miRNA靶标。
15.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述核酸诱饵链含有与脱氧核糖核酸(DNA)靶标互补的核苷酸序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述可切割接头选自光可切割接头和酶可切割接头。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述核酸报告链与可检测标记连接。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述基板是微芯片。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述基板含有2-20,000个微孔。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述基板含有5,000-20,000个微孔。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中每个微孔的体积为1-999纳升。
23.如权利要求22所述的方法，其中每个微孔的体积为1-10纳升。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括加载配制在体积为1-10纳升的悬浮液中的经修饰的细胞。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述基板由聚二甲基硅氧烷(PDMS)组成。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述覆盖基板由玻璃组成。
27.如权利要求2-26中任一项所述的方法，其中所述覆盖基板与所述基板形成密封，以防止所述封闭的微孔之间的流体连通。
28.一种方法，其中包括：
(a)使包含蛋白靶标的细胞与至少两种缀合物接触，每种缀合物包括通过(iii)可切割接头与(ii)核酸报告链连接的抗体(i)，其中抗体与目的蛋白质靶标特异性结合，以产生包含靶标-缀合物复合物的修饰细胞；和
(b)将步骤(a)的修饰细胞加载到含有微孔的基板上，以产生负载的基板。
29.如权利要求28所述的方法，其中还包括(c)使负载的基板与包含至少两组的至少两组固定化核酸捕获探针的覆盖基板接触，每个捕获探针包含与步骤(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，产生至少两个封闭的微孔，所述至少两个封闭的微孔中的每一个包含覆盖基板的一组至少两个不同的捕获探针。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中还包括(d)切割缀合物的可切割接头以释放核酸报告链。
31.如权利要求30所述的方法，其中还包括将所述封闭的微孔维持在核酸杂交条件下以产生固定在所述覆盖基板上的报告-捕获复合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中还包括将含有固定的报告-捕获复合物的覆盖基板从基板上解离，并使至少一种固定在覆盖基板上的报告捕获复合物可视化。
33.如权利要求32所述的方法，其还鉴定(a)的至少一种目标蛋白质靶标。
34.如权利要求28-33中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使包含蛋白质靶标的细胞与至少三种缀合物接触。
35.如权利要求34所述的方法，其中步骤(a)包括使包含蛋白质靶标的细胞与至少5种缀合物接触。
36.如权利要求35所述的方法，其中步骤(a)包括使包含蛋白质靶标的细胞与至少10种缀合物接触。
37.如权利要求36所述的方法，其中步骤(a)包括使包含蛋白质靶标的细胞与至少50种缀合物接触。
38.如权利要求28-37中任一项所述的方法，其中所述细胞是透化的。
39.如权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述细胞是固定的。
40.如权利要求28-39中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
41.如权利要求28-40中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化和/或嵌合抗体。
42.如权利要求28-41中任一项所述的方法，其中所述可切割接头选自光可切割接头和酶可切割接头。
43.如权利要求28-42中任一项所述的方法，其中所述核酸报告链与可检测标记连接。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
45.如权利要求28-44中任一项所述的方法，其中所述基板是微芯片。
46.如权利要求28-45中任一项所述的方法，其中所述基板含有2-20,000个微孔。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述基板含有5,000-20,000个微孔。
48.如权利要求28-47中任一项所述的方法，其中每个微孔具有1-999纳升的体积。
49.如权利要求48所述的方法，其中每个微孔具有1-10纳升的体积。
50.如权利要求28-49中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括加载配制在体积为1-10纳升的悬浮液中的经修饰的细胞。
51.如权利要求28-50中任一项所述的方法，其中所述基板由聚二甲基硅氧烷(PDMS)组成。
52.如权利要求28-51中任一项所述的方法，其中所述覆盖基板由玻璃组成。
53.如权利要求28-52中任一项所述的方法，其中所述覆盖基板与所述基板形成密封，以防止所述封闭的微孔之间的流体连通。
54.一种装置，其包括：
(a)包含微孔的基板，每个微孔含有至少一个含有至少两个靶-缀合物复合物的细胞，每个复合物包含与通过可切割接头与核酸报告链连接的核酸诱饵链结合的核酸靶；和
(b)包含至少两组的至少两组固定化核酸捕获探针的覆盖基板，每个捕获探针包含与(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述覆盖基板与所述基板接触以形成至少两个封闭的微孔，所述至少两个封闭的微孔中的每一个包含所述覆盖基板的一组至少两个捕获探针。
55.一种装置，其包括：
(a)包含微孔的基板，每个微孔含有至少一个含有至少两个靶-缀合物复合物的细胞，每个复合物包含与通过可切割接头与核酸报告链连接的抗体结合的蛋白质靶标；和
(b)包含至少两组的至少两组固定化核酸捕获探针的覆盖基板，每个捕获探针包含与(a)的核酸报告链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述覆盖基板与所述基板接触以形成至少两个封闭的微孔，所述至少两个封闭的微孔中的每一个包含所述覆盖基板的一组至少两个捕获探针。
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