CN107881215B - 侦测核苷酸片段的方法 - Google Patents

Abstract

一种核苷酸片段侦测的方法包括通过寡核苷酸探针捕获目标核苷酸片段以形成杂交双链段。寡核苷酸探针具有辨识序列与目标核苷酸片段为互补，寡核苷酸探针还具有可复制序列。移除杂交双链段以暴露可复制序列。产生可复制序列的重复片段。可复制序列的重复片段通过侦测探针标示，用来辨识及定量。当目标序列存在时，即形成杂交双链段，杂交双链通过双链特异性核酸酶自寡核苷酸探针上移除，暴露可复制序列，可复制序列的重复片段具有阳性结果放大作用亦可定量目标序列的数量。

Description

侦测核苷酸片段的方法

技术领域

本发明是关于侦测核苷酸片段的方法。更详细地说，本发明是关于通过端粒序列扩增或聚合酶复制侦测核苷酸片段的方法。

背景技术

小分子核糖核酸(microRNA)为短小的核糖核酸分子，包括大约21-25个碱基。已有许多研究指出关于小分子核糖核酸的调节与致病机制化疾病发展的相关性，包括癌症、心脏疾病和帕金森氏症。除此之外，循环的小分子核糖核酸的调节脚色，对于生物功能显现出举足轻重的影响。小分子核糖核酸的调节功能会影响细胞作用程序，像是增生或细胞自然死亡。其中，小分子核糖核酸与癌症病程发展的相关性相当高。研究显示指出小分子核糖核酸为不同疾病的重要生物标记(biomarker)。因此，本领域迫切需要可以加速分析愈来愈多已知的、表现型的真核生物小分子核糖核酸生物标记的工具。

发明内容

根据本发明一些实施方式提供一种侦测核苷酸片段的方法，包括通过寡核苷酸探针捕获目标核苷酸片段，以形成杂交双链段，所述的寡核苷酸探针具备识别序列及可复制序列，所述的识别序列与所述的目标核苷酸片段彼此互补。移除所述的杂交双链段，以暴露出所述的寡核苷酸探针的可复制序列。产生所述的可复制序列的重复片段。通过侦测探针辨识所述的可复制序列的重复片段。

根据本发明一些实施方式，移除所述的杂交双链段，以暴露出所述的寡核苷酸探针的可复制序列，更包括通过双链特异性核酸酶(duplex specific nuclease)将所述的杂交双链段从寡核苷酸探针中移除。

根据本发明一些实施方式，产生所述的可复制序列的重复片段，更包括添加端粒酶(telomerase)。

根据本发明一些实施方式，产生所述的可复制序列的重复片段，更包括添加循环扩增模板，所述的循环扩增模板具有与所述的可复制序列互补的序列片段。

根据本发明一些实施方式，所述的侦测探针包括信号标志，所述的信号标志产生可侦测的信号，可侦测的信号包括荧光信号、电化学信号及化学荧光信号。

根据本发明一些实施方式，所述的寡核苷酸探针固定在基材上。

根据本发明一些实施方式，通过空间解析度辨识所述的目标核苷酸片段。

根据本发明一些实施方式，侦测核苷酸片段的方法，更包括基材，所述的基材包括多个反应孔，且每个反应孔内具有多个所述的寡核苷酸探针。

根据本发明一些实施方式，侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，更包括通过计算具备侦测探针存在的反应孔的数量，定量目标核苷酸片段的数目。

根据本发明一些实施方式，侦测核苷酸片段的方法，更包括提供具备固定式探针的基材。通过固定式探针捕获所述的可复制序列的重复片段，所述的固定式探针具备与所述的寡核苷酸探针互补的序列。

根据本发明一些实施方式，可复制序列包括辨识标签，辨识标签与目标核苷酸片段存在特异性。

根据本发明一些实施方式，更包括在具有固定式探针的基材表面捕获可复制序列的重复片段。通过鉴别辨识标签以分析其对应的目标核酸片段。

根据本发明一些实施方式，侦测核苷酸片段的方法更包括移除未杂交的核苷酸片段。

根据本发明一些实施方式，目标核苷酸片段包括小分子核糖核酸(micro RNA)。

根据本发明一些实施方式，寡核苷酸探针包括去氧核糖核酸(DNA)。

通过端粒重复片段或滚动循环扩增重复片段的扩增，阳性信号放大的效果更为显著。双链特异性核酸酶的酶反应程序可以辨别目标序列，并且暴露可复制序列，使得可复制序列可以扩增而且顺利被侦测到。这样的反应程序更易于应用在全自动核苷酸片段侦测与定量程序。具备目标单一性的探针可以分别固定在基材表面的不同位置，以得到空间解析度的资讯。从基材表面不同位置散发出的信号，代表了样本中不同目标核苷酸片段的种类。除此之外，目标核苷酸片段的数量亦可被定量。

此侦测方法可应用在生医研究或临床诊断工具，可从各式各样不同的生物样本中，达到具备特异性与高敏度的多重目标片段侦测手段。

附图说明

本发明的上述和其他方面以及特征请参照说明书内容并配合附图得到更清楚的了解，其中：

图1是根据本发明一些实施方式的流程图；

图2至图9是根据本发明一些实施方式的侦测核苷酸片段的方法过程中各个阶段的示意图；

图10是根据本发明一些实施方式的样本接收匣，应用于侦测核苷酸片段的方法；

图11是根据本发明一些实施方式的样本接收基材，应用于侦测核苷酸片段的方法；

图12至图17是根据本发明一些实施方式的侦测核苷酸片段的方法过程中各个阶段的示意图；

其中，符号说明：

1000 方法

1100、1200、1300、1400 步骤

112、114、116、118 匣

200、300、600 寡核苷酸探针

202、202’、206、206’ 第一寡核苷酸探针

202a、202b、202c 杂交双链段

204、208 第二寡核苷酸探针

210、210a、210b、710 基材

212固定锚 214可复制序列

222第一辨识序列 224第二辨识序列

232端粒重复片段 322第一核苷酸片段

326第二核苷酸片段 328第三核苷酸片段

342循环扩增模板 402双链特异性核酸酶

412端粒酶 422侦测探针

612锚 712固定锚点。

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所揭露的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，可在无此等特定细节的情况下实践本发明的实施例。

请参考图1，根据本发明一些实施方式绘示一种有关侦测核苷酸片段的方法1000的流程图。从步骤1100开始，目标核苷酸片段被寡核苷酸探针捕获形成杂交双链段。寡核苷酸探针具备辨识序列和可复制序列。辨识序列与目标核苷酸片段互补。继续至步骤1200，移除杂交双链段以暴露寡核苷酸探针的可复制序列。接下来，进行步骤1300。产生可复制序列的重复片段。再进行步骤1400，可复制序列的重复片段通过侦测探针标记。侦测探针的信号可以被分析，且根据所侦测的信号，可定量目标核苷酸片段的数量。侦测探针可以通过各种不同的化学或物理成分标记，这些化学或物理成分在适当的状况下可以产生可被侦测的信号。可被侦测的标记于本领域为习知技艺，其中包括量子点、荧光色素或电化学分子。以下讨论内容绘示了根据图1方法1000核苷酸片段侦测方法的实施例。虽然方法1000是依一连串步骤的绘示与描述，但是描述这些步骤的顺序并不限制本发明的技术内容。举例来说，某些步骤可发生于不同的顺序或同时发生，并不局限于本说明书的内容。除此之外，为了实现本发明，并非所有绘示的步骤皆为必须。另外，本说明书记载的一或多个步骤可能以单一形式、复合型式存在。

图2至图9为根据本发明一些实施方式绘示核苷酸片段侦测方法的各个阶段。

请参考图2，绘示基材具有多个寡核苷酸探针。基材210具有平坦表面与多个寡核苷酸探针200键结。基材210的材料可以是但不局限于聚苯乙烯(polystyrene)、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、玻璃、硅和金。根据本发明一些实施方式，每一个寡核苷酸探针200皆为单链且具有固定锚、可复制序列和辨识序列。根据不同辨识序列，寡核苷酸探针200可包括不同种类的寡核苷酸探针。举例来说，如图2所示，寡核苷酸探针200包括第一寡核苷酸探针202与第二寡核苷酸探针204。每一个第一寡核苷酸探针202具有固定锚212、可复制序列214与第一辨识序列222。固定锚212使得第一寡核苷酸探针202通过例如像是共价键附着在基材210的表面上。根据本发明一些实施方式，可复制序列214的3’端包括端粒酶(telomerase)辨别序列。第一辨识序列222附着在可复制序列214的3’端。第一辨识序列222包括与第一种核苷酸片段互补的序列，因此会吸引第一种核苷酸片段的键结。

请继续参考图2。同样地，每一个第二寡核苷酸探针204具备固定锚212、可复制序列214和第二辨识序列224。固定锚212和可复制序列214与第一寡核苷酸探针202的固定锚212和可复制序列214相同。根据本发明一些实施方式，可复制序列214具有端粒酶(telomerase)特异性。也就是说，可复制序列214可以被端粒酶辨识出来，进而产生后续扩增作用。第一寡核苷酸探针202与第二寡核苷酸探针204不同之处在于第一辨识序列222与第二辨识序列224。第二辨识序列224附着于可复制序列214的3’端，且第二辨识序列224包括与第二种核苷酸片段互补的序列。因为不同的辨识序列，第一寡核苷酸探针202与第二寡核苷酸探针204吸引不同种类的核苷酸片段。寡核苷酸探针的数量可依侦测的需要而不同，且寡核苷酸探针的种类可为一、二、三或更多，本发明并不以此为限。

请参考图3与图1步骤1100，绘示样本的添加。样本可以包括不同的核苷酸片段。核苷酸片段可以是自然界存在的核苷酸以及/或非自然界既有的核苷酸片段。根据本发明一些实施方式，核苷酸片段为小分子核糖核酸(microRNA)。根据本发明一些实施方式，样本包括第一核苷酸片段322、第二核苷酸片段326和第三核苷酸片段328，如图3所示。第一、第二和第三核苷酸片段322、326、和328可以为相同或不同种类的核苷酸，且每一个核苷酸片段具备一段序列足以与其它核苷酸片段做出区隔。也就是说，核苷酸片段322、326和328彼此不完全相同。核苷酸片段之间至少有一或多个碱基不同。

请参考图4与图1步骤1100，绘示形成杂交双链段。第一寡核苷酸探针202与第二寡核苷酸探针204各自包括与目标序列互补的序列。根据本发明一些实施方式，如图4所示，第一核苷酸片段322包括了目标序列。此目标序列使得第一核苷酸片段322成为目标核苷酸片段。举例来说，目标序列可能反应了特殊症状的高风险群或某种主要细胞功能。须特别注意，第一核苷酸片段322可能包括序列长度超过目标序列的碱基数。第一寡核苷酸探针202的第一辨识序列222自样本中捕获第一核苷酸片段322，因为第一辨识序列222与第一核苷酸片段322的目标序列互补。第二与第三核苷酸片段326和328不符合第一辨识序列222或第二辨识序列224包含的目标序列。因此第二与第三核苷酸片段326和328不会被寡核苷酸探针200保留(未键结)，随后将被清洗移除。

请继续参考图4。第一辨识序列222与第一核苷酸片段322键结，使得原本为单链的第一寡核苷酸探针202，部分转变为杂交双链段。第一核苷酸片段322被第一辨识序列222捕获，而此结合造成杂交双链段202a、202b和202c。第一寡核苷酸探针202的其他部分，包括可复制序列214和固定锚212，还是保持着单链的状态，如图4所示。第二寡核苷酸探针204没有捕获到具有与第二辨识序列224互补的目标序列的核苷酸片段，因此第二寡核苷酸探针204在基材210表面保持单链状态。

请参考图5与图1步骤1200，绘示添加双链特异性核酸酶(duplex-specificnuclease,DSN)。基材210表面具有双链与单链的片段。第一辨识序列222与第一核苷酸片段322形成杂交双链段202a、202b和202c，第二寡核苷酸探针204与第一寡核苷酸探针202的剩余部分为单链。双链结构吸引了双链特异性核酸酶402，单链结构的片段则不会吸引双链特异性核酸酶402。

请参考图6与图1步骤1200，绘示双链段的分割移除。双链特异性核酸酶402辨识出杂交双链段202a、202b和202c，且自第一寡核苷酸探针202上移除第一辨识序列222与第一核苷酸片段322。第二寡核苷酸探针204维持其完整性，因为第二寡核苷酸探针204为单链状态，不会与双链特异性核酸酶402交互作用。第二寡核苷酸探针204完整保留在基材210的表面上，而第一寡核苷酸探针202’只有一部分被保留下来。更详细地说，根据本发明一些实施方式，杂交双链段202a、202b和202c被分割移除，单链状态的端粒序列214与固定锚212被保留在基材210表面。分割移除杂交双链段202a、202b和202c同时造成第一寡核苷酸探针202’的端粒序列214暴露。端粒序列214的暴露，等于是目标序列的阳性反应指标。第二辨识序列224仍然附着在第二寡核苷酸探针204的端粒214的一端，因此第二寡核苷酸探针204的端粒序列214没有暴露出来。端粒的暴露，使得接下来的其它反应得以进行。

请参考图7与图1步骤1300，绘示产生端粒序列的重复片段。杂交双链段202a、202b和202c经过分割移除，端粒序列214暴露出来。端粒酶，也被称作末端转移酶(terminaltransferase)，是一种核糖核蛋白，可在端粒序列的3’端依物种而定扩增端粒重复序列(species-dependent telomere repeat sequence)。举例来说，人类的端粒重复序列具有6个碱基。当端粒酶412添加到反应容器中，第一寡核苷酸探针202’暴露的端粒序列214提供了端粒酶412的键结点。第二寡核苷酸探针204端粒序列214没有被暴露，因为第二辨识序列224还附着在端粒序列214的一端。端粒酶412无法在第二寡核苷酸探针204上找到相对应的键结点，因为第二辨识序列224的端粒序列214的3’端已经被占据了。这样的鉴别方式使得端粒酶412可以在第一寡核苷酸探针202’暴露的端粒序列214的3’端产生端粒重复片段。端粒重复片段232自第一寡核苷酸探针202的端粒序列214的3’端扩增延伸，且可延伸至数以千计的6碱基重复片段。

根据本发明一些实施方式，端粒重复片段232标示了目标序列存在的阳性结果，而第二寡核苷酸探针204没有捕获到相对应的互补序列，则可被视为阴性(没有端粒重复片段)。阳性与阴性的反应结果，可以进一步通过侦测探针422达到肉眼或其他器材可视的状态。

请参考图8与图1步骤1400，绘示添加侦测探针以极侦测探针与寡核苷酸探针的结合。通过与端粒重复片段232或滚动循环扩增重复片段的结合，阳性第一寡核苷酸探针202’可以被侦测探针422辨识。侦测探针与端粒重复片段232或滚动循环扩增重复片段的结合，可以通过不同的习知手段达成，例如混成探针或接合探针作用等。侦测探针422可以包括在特定波长下肉眼可视的荧光信号。侦测探针422标示了阳性第一寡核苷酸探针202’而且指出群聚的位置。

根据本发明一些实施方式，目标序列是通过滚动循环扩增(rolling-circleamplification,RCA)的方式达到可视效果。请参考图9与图1步骤1300。每一个寡核苷酸探针300包括固定锚312与引子序列314。寡核苷酸探针200与300不同之处在于可复制序列214与引子序列314和316。与可复制序列214不同之处在于，引子序列314和316包括特别设计的引子序列，此引子序列可通过滚动循环扩增的技术扩增。举例来说，在分割移除双链段之后，引子序列314暴露出来，如图6所示，引子序列314被拿来当作接下来扩增序列的引子。如图9所示，循环扩增模板342被添加进入样本中，使得滚动循环扩增反应被启动。所添加的循环扩增模板342包括与引子序列314互补的序列，而且循环扩增模板342具备另一特异序列片段，可供辨别使用。循环扩增模板342与引子序列314的结合造成重复片段332产生在基材310上，重复片段332可通过侦测探针辨识，如图8所示。如上所述，循环扩增模板342导致重复片段332的存在，即可等同于样本中包括目标序列存在的阳性反应标志。

根据本发明一些实施方式，寡核苷酸探针300的引子序列314可包括人工单一性核苷酸序列，用来当作不同目标序列的相对应辨识标签。每一个辨识标签对其中一个目标序列具有单一性，可通过接下来的侦测步骤被辨识。举例来说，如图8所示，引子序列314和316包含不同种类的辨识标签，分别对应到不同的目标序列。用来鉴别与定量辨识标签的方法为本领域习知，其中包括混成探针、接合探针技术以及序列分析。通过在寡核苷酸探针300的引子序列314和316使用辨识标签，可以侦测到目标序列且同步分析为何种目标序列。

请参考图10，根据本发明一些实施方式绘示基材立体图。阳性第一寡核苷酸探针202’因为侦测探针422，得以在基材210a上被视觉化，阴性第二寡核苷酸探针204不会在基材210a上被看见，因为阴性第二寡核苷酸探针204没有与侦测探针422键结。不同种类的寡核苷酸探针被聚集在基材210a的不同区域，如此一来，阳性的结果同时伴随着空间解析度的区隔。需特别注意，根据本发明一些实施方式，所有寡核苷酸探针200的固定锚212与可复制序列214皆为相同的。举例来说，如果有四种不同寡核苷酸探针(四种不同目标序列)，这四种不同的寡核苷酸探针会依种类，在基材210a上安排区分为四个群聚。当目标序列存在于样本中，阳性寡核苷酸探针藉由侦测探针视觉化。藉由辨别这些阳性寡核苷酸探针在基材210a上的位置，就可以得知特定目标序列的存在。

请参考图11，根据本发明一些实施方式，绘示基材立体图。基材210b与基材210a不同之处在于，基材210b的匣设计。根据本发明一些实施方式，基材210b具有四个匣112、114、116和118。匣112、114、116和118为在基材210b上彼此纵向平行的浅凹槽。每一条匣112、114、116和118包括一种寡核酸探针。核苷酸片段的空间解析度视通过每一条渠道定义。举例来说，如图11所示，第一寡核苷酸探针202设置于匣112中，第二寡核苷酸探针204设置于匣114中。根据本发明一些实施方式，第二寡核苷酸探针204可以设置于匣116或118。在阳性寡核苷酸探针经过可视化步骤之后，匣112显示出侦测探针422的信号。这项资讯可以被解读为第一寡核苷酸探针202的目标序列存在于样本中，而第二寡核苷酸探针204的目标序列没有。空间解析度通过一条条的匣112、114、116和118显现出来。

根据本发明一些实施方式，寡核苷酸探针300具有不同的辨识标签，辨识标签可同步分析生物样本中多个不同的目标序列。每一个辨识标签被分配到一种识别信号，识别信号与目标序列具有单一性。根据本发明一些实施方式，寡核苷酸探针300具有各种不同辨识标签，不需要藉由基材310上的空间隔离来区别。根据本发明一些实施方式，寡核苷酸探针300具有各种不同辨识标签，在基材310上仍然依据空间隔离达到区别的目的。

根据本发明一些实施方式，基材210可以被用来当作定量样本中目标核苷酸片段数量的工具。更详细地说，基材210包括多个反应孔，反应孔的总数量为预定数量。除此之外，每一个反应孔包括多个寡核苷酸探针200，在同一个反应孔的寡核苷酸探针200具有相同的目标序列。将样本中包括目标核苷酸片段，通过随机分布的方式注入基材210的反应孔中，平均下来，每一个反应孔中将会存在一个或一个以下的目标核苷酸片段。每一个阳性反应的反应孔，代表了样本中为数一个的目标序列。定量结果可以通过帕松统计分析(Poisson statistical analysis)阳性与阴性的反应孔得到最后的数字，与数位反转录聚合酶链反应(digital PCR)的原理类似。这样的核苷酸片段侦测方法可以被视为数位计算目标序列的方法。

图12至图17为根据本发明一些实施方式绘示核苷酸片段侦测方法的各个阶段。

请参考图12，绘示多个寡核苷酸探针600。寡核苷酸探针600与寡核苷酸探针200不同之处在于其固定锚部分。寡核苷酸探针200具备固定锚212，寡核苷酸探针600并没有固定在基材上。每一个寡核苷酸探针600具有锚612。锚612并非固定在基材上，而是到了核苷酸片段侦测步骤的后面几个步骤才会被固定住。因此，寡核苷酸探针600在溶液中漂浮。第一寡核苷酸探针编号为206，第二寡核苷酸探针编号为208。寡核苷酸探针200与600具有大致上相同的结构，但是寡核苷酸探针600具有锚612而不是固定锚212。

请参考图12与图1步骤1100，绘示添加样本。根据本发明一些实施方式，样本包括第一核苷酸片段322、第二核苷酸片段326和第三核苷酸片段328，如图12所示。

请参考图13与图1步骤1100，绘示杂交双链段的形成。第一寡核苷酸探针206与第二寡核苷酸探针208各具有与目标序列互补的序列。根据本发明一些实施方式，如图13所示，第一核苷酸片段322包括目标序列。此目标序列使得第一核苷酸片段322成为目标核苷酸片段。第一寡核苷酸探针206的第一辨识序列222捕获第一核苷酸片段322，第二和第三核苷酸片段326、328不包含与第一辨识序列222或第二辨识序列224相符的目标序列。第二与第三核苷酸片段326、328不会被寡核苷酸探针200保留住，将被清洗移除。第一辨识序列222与第一核苷酸片段322的结合，让原本是单链的第一寡核苷酸探针206一部份变成杂交双链段。

请参考图14与图1步骤1200，绘示添加双链特异性核酸酶。第一辨识序列222与第一核苷酸片段322形成杂交双链段206a、206b和206c，第二寡核苷酸探针208与第一寡核苷酸探针206的剩余部分保持单链状态。双链状态吸引了双链特异性核酸酶402，单链的片段则不会吸引双链特异性核酸酶402。

请参考图14，绘示双链的分割移除。双链特异性核酸酶402辨别出杂交双链段206a、206b和206c，并将第一辨识序列222与第一核苷酸片段322形成的双链自第一寡核苷酸探针206上分割移除。第二寡核苷酸探针208可保持其完整性，因为单链状态不会诱发双链特异性核酸酶402的功能。移除杂交双链段206a、206b和206c造成第一寡核苷酸探针206’的端粒序列214的3’端暴露。端粒序列214的3’端暴露，可以被解读为目标序列存在的阳性结果。端粒序列的暴露导致接下来的其它反应发生。

请参考图15，绘示寡核苷酸探针的固定与端粒序列的扩增。首先提供基材710，基材710具有多个固定锚点712。根据本发明一些实施方式，可依据不同目标序列，在基材上使用不同种类的固定锚点，这样一来，可提供每一种目标序列的空间解析度。固定锚点712包括与锚612互补的序列，藉此可固定漂浮的寡核苷酸探针600。寡核苷酸探针600通过锚612辨识固定锚点712，在基材710上与固定锚点712结合。

请参考图16，绘示端粒序列扩增。杂交双链段206a、206b和206c被移除之后，端粒序列214的3’端暴露。当端粒酶412添加至反应容器内，第一寡核苷酸探针206’暴露的端粒序列214提供了端粒酶412的键结处。第二寡核苷酸探针208的端粒序列214没有暴露出来，因为第二辨识序列224还是附着在端粒序列214的3’端。端粒重复片段232自第一寡核苷酸探针206’端粒序列214的3’端扩增，可扩增至数以千计的6碱基重复片段，但是对第二寡核苷酸探针208完全不起作用。

上述的阳性与阴性反应可通过添加侦测探针422达到视觉化的效果。请参考图17，绘示侦测探针422的添加与结合。阳性第一寡核苷酸探针206’的端粒重复片段232被侦测探针422辨识出来并与其结合。侦测探针422可以包括荧光信号，在特定辐射波长下肉眼可视。侦测探针422标志了阳性第一寡核苷酸探针206’同时指出了群聚的位置。端粒重复片段232的阳性标志，显示了目标序列存在于样本之中，第二寡核苷酸探针208并没有捕获到与其辨识序列互补的目标序列，维持阴性结果(没有端粒重复片段)。

总结来说，根据本发明一些实施方式提供一种辨识与定量生物性样本中的小分子核糖核酸的方法。寡核苷酸探针通过辨识序列捕获目标序列，并形成混成核苷酸双链段。混成核苷酸双链段之后被双链特异性核酸酶分割移除，造成寡核苷酸探针的可复制序列的3’端暴露。可复制序列的暴露即显示了目标序列的阳性结果。接下来，阳性寡核苷酸探针可通过侦测探针达到视觉化的效果。

虽然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (12)

1.一种侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，包括：

使包含目标核苷酸片段的样本与复数种寡核苷酸探针作用，其中所述复数种寡核苷酸探针包含第一寡核苷酸探针和第二寡核苷酸探针，所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针各者包含一识别序列和一可复制序列，其中所述第一寡核苷酸探针的所述识别序列不同于所述第二寡核苷酸探针的所述识别序列，其中所述目标核苷酸片段与所述复数种寡核苷酸探针中的至少一者形成杂交双链段；

将所述第一寡核苷酸探针和所述第二寡核苷酸探针分别固定在基材上的不同的位置的反应孔内，并且所述反应孔中平均每一个反应孔中会存在一个或一个以下的所述目标核苷酸片段；

移除所述的杂交双链段，以暴露出所述的寡核苷酸探针的可复制序列；

产生所述的可复制序列的重复片段；

通过侦测探针辨识所述的可复制序列的重复片段；以及

通过空间解析度辨识所述的目标核苷酸片段。

2.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，所述移除所述的杂交双链段，以暴露出所述的寡核苷酸探针的可复制序列，包括：

通过双链特异性核酸酶将所述的杂交双链段从寡核苷酸探针中移除。

3.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，所述产生所述的可复制序列的重复片段，包括：

添加端粒酶。

4.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，所述产生所述的可复制序列的重复片段，包括：

添加循环扩增模板，所述的循环扩增模板具有与所述的可复制序列互补的序列片段。

5.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，所述的侦测探针包括信号标志，所述的信号标志产生可侦测的信号，可侦测的信号包括荧光信号、或电化学信号。

6.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，更包括：

通过计算具有侦测探针存在的反应孔的数量，定量所述目标核苷酸片段。

7.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，更包括：

提供具有固定式探针的所述基材；以及

通过固定式探针捕获所述的可复制序列的重复片段，所述的固定式探针具有与所述的寡核苷酸探针互补的序列。

8.如权利要求1或7所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，所述的可复制序列包括辨识标签，所述的辨识标签与所述的目标核苷酸片段存在特异性。

9.如权利要求8所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于,更包括：

在具有固定式探针的所述基材表面捕获所述的可复制序列的重复片段；以及

通过鉴别所述辨识标签以分析其对应的目标核苷酸片段。

10.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，更包括：

移除未杂交的核苷酸片段。

11.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，所述的目标核苷酸片段包括小分子核糖核酸。

12.如权利要求1所述的侦测核苷酸片段的方法，其特征在于，所述的寡核苷酸探针包括去氧核糖核酸。

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