CN112626178A - 利用双标记探针的检测信号增强的核糖核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents

利用双标记探针的检测信号增强的核糖核酸检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供如下的核糖核酸检测方法及试剂盒，即，在没有扩增靶核糖核酸的情况下，增强双标记的探针的检测信号，从而能够确定试样中微量存在的靶核糖核酸的存在与否并进行定量分析，上述双标记的探针当不与靶核糖核酸互补性结合时不产生检测信号，但当与靶核糖核酸互补性结合时产生检测信号。根据本发明，能够进行fM浓度范围为止的核糖核酸的检测，在利用表示关于核糖核酸浓度的荧光信号值的标准曲线的情况下，可以通过检测荧光信号值来计算核糖核酸浓度，因此能够确定试样中微量存在的靶核糖核酸的存在与否并进行定量分析。而且，本发明在检测靶核糖核酸时可以实时通过数值确认检测结果。

Description

利用双标记探针的检测信号增强的核糖核酸检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸(RNA)检测方法及试剂盒，更详细地，涉及如下的方法及试剂盒，即，增强从与作为检测对象的靶核糖核酸互补性结合的双标记的探针产生的检测信号，在没有扩增靶核糖核酸的情况下，迅速简便且特异度及敏感度高地检测靶核糖核酸。
并且，本发明涉及如下的核糖核酸检测方法及试剂盒，即，在没有扩增靶核糖核酸的情况下，增强双标记的探针的检测信号，从而能够确定试样中微量存在的靶核糖核酸的存在与否并进行定量分析，上述双标记的探针当不与靶核糖核酸互补性结合时不产生检测信号，但当与靶核糖核酸互补性结合产生检测信号。
而且，本发明涉及如下的多元方式的核糖核酸检测方法及试剂盒，即，将由产生互不相同波长的光的荧光物质和消光物质标记的多个探针与多个靶核糖核酸分别对应，通过增强从各个探针的互不相同波长的荧光信号来检测，从而可以同时检测所有多个靶核糖核酸。
背景技术
微核糖核酸(microRNA或miRNA)于1990年首次报告，直到2000年代初，其功能尚不明确，但是，最近发现人类基因组中编码(encoding)有约2500个微核糖核酸。微核糖核酸调节全部基因的60％至70％，并且，众所周知，按组织、按细胞以及按特定时期表现出表达差异的微核糖核酸同时多发性地调节多种基因。
已发现由于微核糖核酸的基因突变等引起的功能不协调，可能发生包括癌症在内的多种疾病，因此，进行将微核糖核酸活用作治疗用靶的研究。而且，已发现微核糖核酸在血液中以高浓度循环，因此还可以活用作诊断用靶。
但是，微核糖核酸的尺寸非常小(～22nt)，以比信使核糖核酸更加易于分解而周知，因此，将难以分离或检测其。并且，由于微核糖核酸与疾病的发生相关作用被周知，而关注将其用于诊断及治疗的可能性，但由于其与诱发疾病的相关性及准确率低，尚未应用于早期诊断/预测医疗的技术开发中。因此，波切需要开发将微核糖核酸用作生物标记物来诊断的新型分析方法及诊断技术。
常规且普遍化的代表性微核糖核酸分析技术已知有northern印迹杂交(NorthernBlot)分析和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR，quantitative reversetranscription-PCR)，但各分析方法均具有技术局限。northern印迹杂交方式可以通过条带的大小对微核糖核酸进行部分定量，但具有需消耗2天至3天的漫长分析时间和使用放射性同位素的问题，因此只能局限在实验室水平下进行。
到现在为止，通常将实时荧光定量聚合酶链式反应用作能够定量分析微核糖核酸的技术，但具有预处理过程复杂且分析时间长的缺点，因此以分析为目的使用时具有局限性。并且，需要昂贵的实时聚合酶链式反应设备，所生成的聚合酶链式反应产物大小相似，因此具有同时检测多种微核糖核酸的多元分析受限的缺点。即，实时荧光定量聚合酶链式反应具有复杂的执行步骤引起的错误和在经济上费用高等的缺点。
全世界都意识到微核糖核酸的重要性，因此正在研发应用多种平台的新型分析方法，大部分利用流式细胞仪(Flow Cytometer)或者研发高通量筛选(HTS)用大型设备来以开发为对多个微核糖核酸进行筛选的形态。作为代表性企业的Nanostring公司提供在面板形态的集成板上搭载80多个主要微核糖核酸来分析的服务，但无法满足特异度、敏感度、费用以及检测时间等层面上的需求。为了克服这些技术或经济上的局限，许多企业和研究机构都在开发微核糖核酸新型分析方法，但仍未提出特别的应对方案，大部分仅推出了特定微核糖核酸的筛选用产品。因此，为了开发利用微核糖核酸的分析技术，需要开发一种能够正确且迅速简便的分析微核糖核酸的新技术。
与此相关地，韩国授权专利第10-1394200号中公开了如下的技术，即，确认微核糖核酸与能够产生可检测光的银纳米团簇探针的特异性碱基序列区域结合时光的产生减少乃至消失，从而可检测试样中是否存在微核糖核酸。但如上所述的韩国授权专利第10-1394200号的微核糖核酸检测技术虽为优秀的技术，但与其他优秀的技术相同地，可以进行无线改善。例如，需要提供如下的新的技术，即，当检测微核糖核酸时，从确认被检测光的减少或消失的方式改良为确认被检测光的产生或增强来使分析便捷，且可提高fM浓度范围为止的检测敏感度的同时能够在短时间(例如，小于一小时)内检测到，并且能够以多元的方式同时检测多种靶微核糖核酸。
另外，以上述背景技术说明的事项仅用于增进对本发明的背景的理解，应该理解的是，并未将其作为本发明的“现有技术”来引用。
现有技术文献
专利文献
韩国授权专利公报第10-1394200号(2014年05月14日)
发明内容
本发明的目的在于提供利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法及试剂盒。具体地，本发明的目的在于提供如下的方法及试剂盒，即，增强从与作为检测对象的靶核糖核酸互补性结合的双标记的探针产生的检测信号，在没有扩增靶核糖核酸的情况下，迅速简便且特异度及敏感度高地检测靶核糖核酸。
本发明的再一目的在于，提供如下的核糖核酸检测方法及试剂盒，即，在没有扩增靶核糖核酸的的情况下，增强双标记的探针的检测信号，从而能够确定试样中微量存在的靶核糖核酸的存在与否并进行定量分析，上述双标记的探针当不与靶核糖核酸互补性结合时不产生检测信号，但当与靶核糖核酸互补性结合产生检测信号。
本发明的另一目的在于，提供如下的多元方式的核糖核酸检测方法及试剂盒，即，将由产生互不相同波长的光的荧光物质和消光物质标记的多个探针与多个靶核糖核酸分别对应，通过增强从各个探针的互不相同波长的荧光信号来检测，从而可以同时检测所有多个靶核糖核酸。
但是，如前所述的本发明的目的仅为例示，本发明的范围并不限定于此。并且，可通过下述的发明详细说明、发明要求保护范围以及附图更加明确本发明的其他目的及优点。
为实现上述的发明技术问题并实现上述的发明目的，经过多次研究的结果，本发明人研究出如下的核糖核酸检测方法及试剂盒，即，在没有扩增靶核糖核酸的情况下，增强双标记的探针的检测信号，从而能够确定试样中微量存在的靶核糖核酸的存在与否并进行定量分析，上述双标记的探针当不与靶核糖核酸互补性结合时不产生检测信号，但当与靶核糖核酸互补性结合时产生检测信号。
在本发明中使用的术语“双标记探针(dual labeled probe)”指由荧光物质标记5`-末端、由消光物质标记3`-末端的寡核苷酸或多核苷酸。本发明的双标记探针可以与靶核糖核酸特异性地互补结合来形成脱氧核糖核酸-核糖核酸(DNA-RNA)异源双链，在不与靶核糖核酸结合的状态下，由于消光物质的干涉作用，不从荧光物质产生荧光信号，但在与靶核糖核酸互补性结合的情况下，随着消光物质的干涉作用消失，从荧光物质产生荧光信号。
在本说明书中使用的术语“核糖核酸分子”为在基因的编码、解码、调节以及表达中起到多种作用的聚合体分子，形成单链作为构成单位的核酸的构成成分中的作为戊糖的核糖的2`-碳上附着羟基，在碱基代替胸腺嘧啶(thymine)包含尿嘧啶(uracil)，从这方面区别于通常由双链构成的脱氧核糖核酸。核糖核酸分子包括对蛋白质进行编码的信使核糖核酸(mRNA)、作为核糖体的构成成分的核糖体核糖核酸(rRNA)、参与蛋白质的转译的转运核糖核酸(tRNA)、为了抑制特定基因的表达而合成的作为人造核糖核酸分子的小干扰核糖核酸(siRNA，small interfering RNA)以及负责调节特定基因表达的功能的由约22nt构成的作为小核糖核酸分子的微核糖核酸(microRNA或者miRNA)等。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法包括：步骤(a)，将由荧光物质标记的5`-末端、由消光物质标记的3`-末端的探针与靶核糖核酸互补性结合来形成脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链；步骤(b)，在上述脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链中利用酶仅切割上述探针来从上述靶核糖核酸释放上述探针的标记有荧光物质的5`-末端部分；步骤(c)，反复进行上述步骤(a)和上述步骤(b)；步骤(d)，冷却含有上述探针、上述靶核糖核酸及上述酶的反应液来降低上述酶的活性或使上述酶失活；以及步骤(e)，检测从上述步骤(a)至上述步骤(c)为止的从上述荧光物质中产生的荧光信号值。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，在上述步骤(d)中，可将上述反应液在约4℃的温度条件下冷却约5分钟至10分钟，来降低上述酶的活性或者使上述酶失活。例如，可以将上述反应液在冰中冷却5分钟至10分钟。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法的特征在于，在上述步骤(b)中，上述探针通过上述酶的切割分离为标记荧光物质的5`-末端片段和标记消光物质的3`-末端片段，从上述标记消光物质的3`-末端片段自由分离并脱落的上述标记荧光物质的5`-末端片段从上述荧光物质持续产生荧光信号。
在本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法中，上述步骤(b)可以在约60～65℃的温度范围内进行。
在本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法中，上述步骤(a)至上述步骤(c)为止可以进行30分钟至60分钟，通过上述步骤(a)至上述步骤(c)可以增强荧光信号值。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法还可以包括步骤(f)，准备示出根据靶核糖核酸的浓度变化的荧光信号值的变化的标准曲线，将步骤(e)中检测的荧光信号值代入上述标准曲线来计算上述靶核糖核酸的浓度。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，在上述步骤(a)中，可以准备多个靶核糖核酸和与这些靶核糖核酸分别特异性地互补结合的多个探针，上述多个探针分别由产生互不相同波长的光的荧光物质标记5`-末端、由消光物质标记3`-末端，在上述步骤(e)中，可以通过检测从上述多个探针各自产生的互不相同波长的荧光信号来同时检测所有上述多个靶核糖核酸。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法还可以包括步骤(f)，准备示出根据上述多个靶核糖核酸各自的浓度变化的荧光信号值的变化的各个标准曲线，将从上述多个探针各自产生的互不相同波长的荧光信号值代入上述各个标准曲线来计算上述多个靶核糖核酸的浓度。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法的特征在于，上述酶在脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链中不切割核糖核酸，仅切割脱氧核糖核酸。例如，上述酶可以为双链特异性核酸酶(DSN，Duplex-specific nuclease)。
并且，本发明提供用于如前所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法的核糖核酸检测试剂盒。本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测试剂盒包含：探针，与靶核糖核酸互补性结合，由荧光物质标记5`-末端，由消光物质标记3`-末端；酶，在通过上述靶核糖核酸与上述探针的互补性结合形成的脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链中，不切割核糖核酸，仅切割脱氧核糖核酸；缓冲液，包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)、氯化镁(MgCl2)以及二硫苏糖醇(DTT，Dithiothreitol)；以及冷却单元，冷却包含上述探针、上述靶核糖核酸、上述酶以及上述缓冲液的反应液。
在本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测试剂盒中，上述冷却单元将上述反应液在约4℃的温度条件下冷却大约5分钟至10分钟。例如，可以将上述反应液在冰中冷却约5分钟至10分钟。
本发明一具体例的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测试剂盒可以包含与多个靶核糖核酸分别特异性地互补结合的多个探针，上述多个探针可以分别由产生互不相同波长的光的荧光物质标记5`-末端、可以由消光物质标记3`-末端。
另外，在本发明中，双标记探针的一侧末端，例如5`-末端可以由如Cy5、Cy3、x-罗丹明、德州红、SYBR绿(SYBR green)、FAM、VIC、JOE、NED、HEX、TET以及TAMRA等的荧光物质标记，双标记探针的另一侧末端，例如3`-末端可以由如IABkFQ、DABCYL、BHQ(BHQ-1、BHQ-2等)、EBQ、ZEN-IBFQ等的消光物质标记。但本发明并不局限于此，而是可以使用本领域公知的多种荧光物质及消光物质。
根据本发明，增强从与作为检测对象的靶核糖核酸互补性结合的双标记探针产生的检测信号，在没有扩增靶核糖核酸的情况下，迅速简便地且特异度及敏感度高地检测靶核糖核酸。例如，本发明为通过直接增强从标记荧光物质和消光物质的双探针产生的荧光信号来检测方式，而不是通过靶核糖核酸的扩增过程来扩增检测信号的方式，因此，相比于需要2～3小时的聚合酶链式反应分析法，可以在不到1小时的时间内分析完毕，由于没有靶核糖核酸的扩增过程，不引起非特异性反应，因此定量特异度高。
并且，根据本发明，能够进行fm浓度范围为止的核糖核酸的检测，在利用表示核糖核酸浓度的荧光信号值的标准曲线(standard curve)的情况下，可以通过检测荧光信号值来计算核糖核酸浓度，因此能够确定试样中微量存在的靶核糖核酸的存在与否并进行定量分析。而且，本发明在靶核糖核酸检测时可以实时通过数值确认检测结果，因此具有在临床现场的应用度高、能够以多元方式同时检测多种靶核糖核酸的优点。
另外，本发明的范围并不局限于如前所述的效果。
附图说明
图1a至图1e为示出在使用本发明一具体例的利用双标记探针的核糖核酸检测方法及试剂盒的情况下，在作为靶核糖核酸的miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290的整体浓度范围(0nM至200nM)中，荧光信号值随着靶核糖核酸浓度的增加而增加，在规定水平以上的靶核糖核酸浓度中，荧光信号值达到饱和的曲线图。
图2a至图2e为示出在使用本发明一具体例的利用双标记探针的核糖核酸检测方法及试剂盒的情况下，在作为靶核糖核酸的miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290的特定浓度范围中，荧光信号值以靶核糖核酸的浓度依赖性地线性增加的曲线图(在miR-31-5p的情况下，浓度为0nM至120nM；在miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p的情况下，浓度为0nM至80nM；在miR-1290的情况下，浓度为0nM至60nM)。
图3a至图3e为示出在使用本发明一具体例的利用双标记探针的核糖核酸检测方法及试剂盒的情况下，除作为靶核糖核酸的miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290之外，即使在试样中添加HEK293细胞的全部核糖核酸，也不会影响靶核糖核酸的浓度依赖性的荧光信号值的增加的曲线图(在miR-31-5p的情况下，浓度为0nM至120nM；在miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p的情况下，浓度为0nM至80nM；在miR-1290的情况下，浓度为0nM至60nM)。
图4a至图4e为示出在使用本发明一具体例的利用双标记探针的核糖核酸检测方法及试剂盒的情况下，除作为靶核糖核酸的miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290之外，即使在试样中添加非靶核糖核酸也不会影响靶核糖核酸的检测的柱状图。
图5a至图5e为示出在使用本发明一具体例的利用双标记探针的核糖核酸检测方法及试剂盒的情况下，除作为靶核糖核酸的miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290之外，即使在试样中添加酵母的转运核糖核酸或者全部核糖核酸也不会影响靶核糖核酸的检测的柱状图。
图6的A部分为示出使用本发明一具体例的利用双标记探针的核糖核酸检测方法及试剂盒来从妊娠中毒患者血清中检测miR-155-5p的结果的柱状图，B部分为利用合成miR-155-5p得到的标准曲线，C部分示出从这些柱状图结果和标准曲线计算的患者血清中的miR-155-5p的浓度。
图7的A部分示出通过以本发明一具体例的利用双标记探针的核糖核酸检测方法为基础多元方法检测的妊娠中毒患者血清中的miR-31-5p的浓度，B部分示出miR-155-5p的浓度，C部分示出miR-214-5p的浓度。
具体实施方式
以下，在下述实施例中更为详细地记述本发明。但是，下述实施例仅用于例示本发明的内容，而非限制或限定本发明的发明要求保护范围。本发明所属领域的普通技术人员可通过本发明的详细说明及实施例轻易类推的内容也应解释为属于本发明的发明要求保护范围。本发明中引用的参考文献整合为本发明的参考。
在说明书全文中，当提及一部分“包括”一结构要素时，除非具有特别反对的记载，则还可以包括其他结构要素，而不是排除其他结构要素。
实施例1：制备与靶核糖核酸特异性地互补结合的双标记探针
制备不与靶核糖核酸互补性结合时不产生检测信号且与靶核糖核酸互补性结合时产生检测信号的双标记探针。选择miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290作为靶核糖核酸。
合成了与序列1的miR-31-5p特异性地互补结合的序列6的探针、与序列2的miR-155-5p特异性地互补结合的序列7的探针、与序列3的miR-214-5p特异性地互补结合的序列8的探针、与序列4的miR-455-5p特异性地互补结合的序列9的探针以及与序列5的miR-1290特异性地互补结合的序列10的探针，由FAM(最大吸收波长：495nm，最大发射波长：520nm)标记这些探针的5`-末端，由作为消光物质的BHQ-1标记3`-末端。并且，为了后述的敏感度及特异度检测，还合成了序列1的miR-31-5p、序列2的miR-155-5p、序列3的miR-214-5p、序列4的miR-455-5p以及序列5的miR-1290。
如前所述的所有探针及微核糖核酸都委托(株)Bioneer公司(地址在韩国大田广域市)来合成。作为本发明的非限制例，可以在Taqman探针的5`-末端标记荧光物质且在3`-末端标记消光物质来准备双标记探针。另外，如前所述的微核糖核酸作为例示而选定，还可将本领域公知的多种微核糖核酸、核糖体核糖核酸等用作靶核糖核酸。并且，标记探针的荧光物质及消光物质也并不限定于如上所述的例示，也可以使用本领域公知的多种荧光物质及消光物质。在本实施例中使用的靶核糖核酸及双标记探针的碱基序列如下述表1所示。
表1靶微核糖核酸及与其特异性地互补结合的双标记探针
Figure BDA0002698720780000101
实施例2：制备用于检测靶核糖核酸的反应液及靶核糖核酸的检测过程
将分别与根据实施例1合成的靶微核糖核酸特异性地互补结合的双标记探针与双链特异性核酸酶及10×主缓冲液(master buffer)混合来制备各个用于制备靶微核糖核酸的反应组合物。通过混合500mM的三(羟甲基)氨基甲烷(pH值为8.0)、50mM的氯化镁以及10mM二硫苏糖醇来制备10×主缓冲液。各个用于检测靶微核糖核酸的反应液的组成如下述表2所示。在下述表2的反应液混合焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水使最终体积成为30μL后用于实验。
表2
用于检测靶微核糖核酸的反应液的组成
Figure BDA0002698720780000111
并且，通过使用如血液(或血清)的样品替代在实施例1中合成的靶微核糖核酸来检测是否存在靶微核糖核酸的的反应液的组成可以如下述表3所示。
表3
用于检测如血液(或血清)的样品中的靶微核糖核酸的反应液的组成
Figure BDA0002698720780000112
在试管中很好地混合以如上所述的方式准备的表2或表3的反应液后，在大约60～65℃的温度条件下培养约30分钟。虽然双标记探针在不与靶微核糖核酸互补性结合时，因在3`-末端标记的消光物质的阻碍作用(干涉作用)而不从在5`-末端标记的荧光物质产生荧光信号，但若与靶微核糖核酸互补性结合，则从在5`-末端标记的荧光物质产生荧光信号。
并且，在大约60～65℃的温度范围内，通过上述反应液的培养，会发生通过双链特异性核酸酶的双标记探针的切割反应。双链特异性核酸酶仅切割脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链中的脱氧核糖核酸，来将双标记探针分离为标记荧光物质的5`-末端片段和标记消光物质的3`-末端片段。从标记消光物质的3`-末端片段自由分离而脱落的标记荧光物质的5`-末端片段从荧光物质持续产生荧光信号。而且，对于上述反应液内剩余的靶微核糖核酸特异性的其他双标记探针与微核糖核酸互补性结合，再次发生通过双链特异性核酸酶的双标记探针的切割反应，反复如前所述的过程约30分钟，标记荧光物质的5`-末端片段在上述反应液内持续累积，从而增强荧光信号。
在以往，为了中断通过双链特异性核酸酶的脱氧核糖核酸切割作用，使用作为双链特异性核酸酶的活性所需的与Mg2+形成络离子的螯合剂(chelating agent)的乙二胺四乙酸(EDTA)，但本发明人发现使用乙二胺四乙酸后荧光信号仍然增加的现象。这种现象会影响根据荧光信号值的靶微核糖核酸的定量结果的解释。考虑到上述问题，在本发明中，为了中断双链特异性核酸酶的作用，将反应液在约4℃的温度条件下冷却5分钟至10分钟(例如，放置在冰中)。即，本发明人确认，在双链特异性核酸酶反应后，将反应液放在冰中降温后放置约5～10分钟，可以在保持荧光模式的同时在反应结束后有效地降低酶的活性。
将反应液在约4℃的温度条件下冷却5分钟至10分钟后，将反应液移到96孔黑色培养板，使用荧光检测仪(BMG LABTECH CLARIOstar 96well reader)检测荧光信号值。将荧光检测仪的激发波长设置为494nm、发射波长设置为518nm来进行确认。
实施例3：靶核糖核酸的定量分析确认
利用实施例2的靶核糖核酸检测过程和表2的组成来进行靶核糖核酸的检测试验。本实施例中使用的合成微核糖核酸和与其特异性互补结合的双标记探针如表1所示。
在miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290的整体浓度范围(0nM至200nM)中，根据实施例2进行检测过程，并全面确认检测的荧光信号值的全图模式。在以规定浓度添加上述微核糖核酸的情况下，随着微核糖核酸的增加，荧光信号值也增加，当添加规定水平以上的微核糖核酸时，可以确认典型的饱和现象(参照图1a指图1e)。通过分析荧光信号值确认了是否在微核糖核酸浓度范围(在miR-31-5p的情况下，浓度为0nM至120nM；在miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p的情况下，浓度为0nM至80nM；在miR-1290的情况下，浓度为0nM至60nM)内形成标准曲线(基准线)，上述微核糖核酸浓度范围为通过确认如上所述的微核糖核酸总浓度范围内的荧光信号值模式来确立的条件。
还确认了通过图1a至图1e所示的结果确立的特定微核糖核酸浓度范围内的荧光信号值是否微核糖核酸的浓度依赖性地线性增加。结果，完成了在特定微核糖核酸的浓度范围(在miR-31-5p的情况下，浓度为0nM至120nM；在miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p的情况下，浓度为0nM至80nM；在miR-1290的情况下，浓度为0nM至60nM)内，随着微核糖核酸浓度的增加而增加规定荧光信号值的线性图(Linear graph)(参照图2a至图2e)。这些结果表明，R2值为99％以上时的本实施例的微核糖核酸检测实验具有显著性，并可进行能够通过从标准曲线(基准线)中导出的Y轴值(荧光信号值)确认X轴值(微核糖核酸浓度)的微核糖核酸定量分析。
并且，为了确认本发明的靶核糖核酸检测方法是否可在除包含合成微核糖核酸之外包含全部核糖核酸的试样中微核糖核酸的浓度依赖性地示出荧光信号值，进行了尖峰(In SPIKE)实验。除miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290之外，在反应液中添加HEK 293细胞的全部核糖核酸，并根据实施例2的检测过程执行用于验证有效性的尖峰实验。尖峰实验的反应液组成如下述表4所示。下述表4的反应液为在添加5μL的HEK 293细胞的全部核糖核酸(total RNA)(原液浓度：2μg/μL，反应浓度：330ng/μL)后与焦炭酸二乙酯处理水混合使总体积成为30μL后用于实验。
表4包含全部核糖核酸的尖峰实验反应液的组成
Figure BDA0002698720780000131
Figure BDA0002698720780000141
如图3a至图3e所示，荧光信号值靶微核糖核酸浓度依赖性地增加，由此，确认了添加HEK 293细胞的全部核糖核酸不影响浓度依赖微核糖核酸的荧光信号值的增加。即，经确认，即使除作为靶核糖核酸的miR-31-5p、miR-155-5p、miR-214-5p、miR-455-5p以及miR-1290之外，向试样添加HEK 293细胞的全部核糖核酸，也不会影响浓度依赖靶标核糖核酸的荧光信号值的增加，R2值为99％以上，实验具有显著性。因此，在尖峰实验中确认了本发明的靶核糖核酸检测法的有效性，经确认，本发明为确认包括试验管内实验在内的实际的活细胞内的靶微核糖核酸的存在与否以及定量微核糖核酸的浓度的技术。
并且，韩国授权专利第10-1394200号的利用银纳米团簇探针的微核糖核酸检测方法为靶微核糖核酸的量增加时信号值减小的关闭(turn off)方式，与之相比，本发明的靶核糖核酸检测方法为靶微核糖核酸的量增加时信号值也增加的打开(turn on)方式，检测迅速且简便。而且，相比于韩国授权专利第10-1394200号的微核糖核酸检测范围为0.5～7.5μm，本发明的核糖核酸检测方法的微核糖核酸检测范围为1～100nM，具有大大提高敏感度的优点。
因此，根据本发明的靶核糖核酸检测方法，理论上能够检测fM浓度范围为止的核糖核酸，在利用示出核糖核酸浓度的荧光信号值的标准曲线的情况下，还可通过检测荧光信号值来计算核糖核酸的浓度，能够确认在试样中微量存在的靶核糖核酸存在与否并进行定量分析。而且，本发明在靶核糖核酸检测时可以实时通过数值确认检测结果，因此在临床现场的应用度高。
实施例4：本发明的靶核糖核酸检测方法的特异度验证
为了确认本发明的靶核糖核酸检测方法在除合成微核糖核酸之外包含全部核糖核酸的试样中能否表现出特异度高的荧光信号值，进行非靶微核糖核酸(Non-targetmiRNA)、酵母的转运核糖核酸(Yeast tRNA)以及与疾病无关的细胞的全部核糖核酸(Non-disease associated cell total RNA)的影响性确认实验。
在上述表4的反应液中添加3μL的非靶微核糖核酸(原液浓度：500Nm，反应浓度：50nM)后与焦炭酸二乙酯处理水混合使其最终体积成为30μL，之后根据实施例2的检测过程进行特异度实验。结果，如图4a至图4e所示，在添加靶微核糖核酸的反应液的情况下，即使添加非靶微核糖核酸也示出荧光信号值的增加，这与在仅添加靶微核糖核酸的反应液的情况下确认的荧光信号值没有多大差异。相反，在未添加靶微核糖核酸的反应液的情况下，与是否添加非靶微核糖核酸无关地，观察到的荧光信号值甚微。
并且，在上述表4的反应液中添加1μL的酵母的转运核糖核酸(原液浓度：10μg/μL，反应浓度：333ng/μL)或者5μL的全部核糖核酸(原液浓度：2μg/μL，反应浓度：333ng/μL)后与焦炭酸二乙酯处理水混合使其最终体积成为30μL，之后，根据实施例2的检测过程进行追加的特异度实验。结果，如图5a至图5e所示，在添加靶微核糖核酸的反应液的情况下，即使添加酵母的转运核糖核酸或全部核糖核酸也示出荧光信号值的增加，这与在仅添加靶微核糖核酸的反应液的情况下确认的荧光信号值没有多大差异。相反，在未添加靶微核糖核酸的反应液的情况下，与是否添加核糖核酸无关地，观察到的荧光信号值甚微。
本发明的靶核糖核酸检测方法为通过直接增从标记有强荧光物质和消光物质的双探针的荧光信号来检测的方式，而不是通过靶核糖核酸的扩增过程而扩增信号的方式，相比于需要2～3小时的聚合酶链式反应分析法，可以在不到1小时的时间内分析完毕，由于没有靶核糖核酸的扩增过程，不引起非特异性反应，因此定量特异度高。
即，根据本发明的靶核糖核酸检测方法，可以确认即使在添加除靶核糖核酸之外的非靶核糖核酸、酵母转运核糖核酸或细胞的全部核糖核酸时，也不会影响荧光信号值。因此，可以确认本发明的靶核糖核酸检测方法为在包括试验管内实验在内的实际的活细胞内以高特异度高检测靶微核糖核酸的技术。
实施例5：妊娠中毒症患者血清内miR-155-5p的检测
根据实施例2的靶核糖核酸检测过程，进行血清内靶miRNA-155-5p的检测试验。使用与miR-155-5p特异性地互补结合的实施例1的序列7的双标记探针来分析正常人和妊娠中毒症患者血清中的miRNA-155-p。分析3个正常人血清、2个二次妊娠中毒症患者的血清、3个三次妊娠中毒症患者的血清。反应液的组成参照上述表3来构成，将各血清试样的体积调整为400μL。将检测结果(图6的A部分)代入使用合成miRNA-155-p来绘制的标准曲线(图6的B部分)来计算各个400μL的血清中包含的miR-155-5p的浓度。结果，在二次妊娠中毒症患者的血清中检测出比正常人血清高出约3倍的miR-155-5p信号值，在三次妊娠中毒症患者的血清中检测出比正常人血清高出约2.8倍的miR-155-5p信号值。
因此，可以确认本发明的靶核糖核酸检测方法为在包括试验管内的实验在内的实际的患者的血液或血清试样中直接特异度高地检测靶微核糖核酸的技术。
实施例6：血清中多种靶核糖核酸的多元检测
以实施例2的检测过程为基础开发多元靶核糖核酸检测方法，以利用1个患者的样品同时检测多种靶微核糖核酸。在实施例1的表1所示的双标记探针中，分别由互不相同的荧光物质(产生互不相同波长的光且产生的光互不干涉)标记作为用于检测miR-31-5p的探针的序列6的探针、作为用于检测miR-155-5p的探针的序列7的探针以及作为用于检测miR-214-5p的探针的序列8的探针的5`-末端，来准备多元用双标记探针。
由FAM标记作为用于检测miR-31-5p的探针的序列6的探针的5`-末端，由TAMRA标记作为用于检测miR-155-5p的探针的序列7的探针的5`-末端，由Cy5标记作为用于检测miR-214-5p的探针的序列8的探针的5`-末端，由此，当检测各个靶微核糖核酸时，从它们产生互不相同波长的荧光信号。
根据实施例5的方法分析3个正常人血清、2个二次妊娠中毒症患者的血清、3个三次妊娠中毒症患者的血清。在各个血清试样中检测出3种互不相同波长的荧光信号来同时检测出miR-31-5p、miR-155-5p以及miR-214-5p，将检测结果代入使用各个合成微核糖核酸绘制的标准曲线来计算各个400μL的血清中包含的miR-31-5p、miR-155-5p以及miR-214-5p的浓度(参照图7)。
其结果，miR-31-5p、miR-155-5p以及miR-214-5p均在二次妊娠中毒症患者中检测到最高浓度的微核糖核酸，由此可以确认本发明的核糖核酸检测方法可以通过对3个正常人血清、2个二次妊娠中毒症患者的血清、3个三次妊娠中毒症患者的血清适用多元方法来同时检测miR-31-5p、miR-155-5p以及miR-214-5p并进行同时定量。由此可以确认本，发明的靶核糖核酸检测方法为在包括试验管内实验在内的实际的患者的血内或血清试样中以多元方式同特异度高地同时检测多个靶微核糖核酸并进行同时定量的技术。
以上，通过上述实施例说明了本发明，但本发明并不局限于此。应该理解的是，只要是本技术领域的普通技术人员可以在不脱离本发明的主旨及范围内进行修改和变更，这种修改和变更也属于本发明。
序列表
<110> 首琳生物科学株式会社
<120> 利用双标记探针的检测信号增强的核糖核酸检测方法及试剂盒
<130> FP-20-000
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic miR-31-5p
<400> 1
aggcaagaug cuggcauagc u 21
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic miR-155-5p
<400> 2
uuaaugcuaa ucgugauagg gguu 24
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic miR-214-5p
<400> 3
ugccugucua cacuugcugu gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic miR-455-5p
<400> 4
uaugugccuu uggacuacau cg 22
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic miR-1290
<400> 5
uggauuuuug gaucaggga 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-31-5p probe
<400> 6
agctatgcca gcatcttgcc t 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-155-5p probe
<400> 7
aacccctatc acgattagca ttaa 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-214-5p probe
<400> 8
gcacagcaag tgtagacagg ca 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-455-5p probe
<400> 9
cgatgtagtc caaaggcaca ta 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-1290 probe
<400> 10
tccctgatcc aaaaatcca 19

Claims (11)

1.一种利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，将由荧光物质标记的5`-末端、由消光物质标记的3`-末端的探针与靶核糖核酸互补性结合来形成脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链；
步骤(b)，在上述脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链中利用酶仅切割上述探针来从上述靶核糖核酸释放上述探针的标记荧光物质的5`-末端部分；
步骤(c)，反复进行上述步骤(a)和上述步骤(b)；
步骤(d)，冷却含有上述探针、上述靶核糖核酸及上述酶的反应液来降低上述酶的活性或使上述酶失活；以及
步骤(e)，检测从上述步骤(a)至上述步骤(c)为止的从上述荧光物质中产生的荧光信号值。
2.根据权利要求1所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，在上述步骤(d)中，将上述反应液在4℃的温度条件下冷却5分钟至10分钟。
3.根据权利要求1所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，在上述步骤(b)中，上述探针通过上述酶的切割分离为标记荧光物质的5`-末端片段和标记消光物质的3`-末端片段，从上述标记消光物质的3`-末端片段自由分离并脱落的上述标记荧光物质的5`-末端片段从上述荧光物质持续产生荧光信号。
4.根据权利要求3所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，上述步骤(b)在60～65℃的温度范围内进行。
5.根据权利要求4所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，上述步骤(a)至上述步骤(c)为止进行30分钟至60分钟，通过上述步骤(a)至上述步骤(c)增强荧光信号值。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，还包括步骤(f)，准备示出根据靶核糖核酸的浓度变化的荧光信号值的变化的标准曲线，将步骤(e)中检测的荧光信号值代入上述标准曲线来计算上述靶核糖核酸的浓度。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，在上述步骤(a)中，准备多个靶核糖核酸和与这些靶核糖核酸分别特异性地互补结合的多个探针，上述多个探针分别由产生互不相同波长的光的荧光物质标记5`-末端、由消光物质标记3`-末端，在上述步骤(e)中，通过检测从上述多个探针各自产生的互不相同波长的荧光信号来同时检测所有上述多个靶核糖核酸。
8.根据权利要求7所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，还包括步骤(f)，准备示出根据上述多个靶核糖核酸各自的浓度变化的荧光信号值的变化的各个标准曲线，将从上述多个探针各自产生的互不相同波长的荧光信号值代入上述各个标准曲线来计算上述多个靶核糖核酸的浓度。
9.一种核糖核酸检测试剂盒，用于权利要求1至6中任一项所述的利用双标记探针的增强检测信号的核糖核酸检测方法，其特征在于，包含：
探针，与靶核糖核酸互补性结合，由荧光物质标记5`-末端，由消光物质标记3`-末端；
酶，在通过上述靶核糖核酸与上述探针的互补性结合形成的脱氧核糖核酸-核糖核酸异源双链中，不切割核糖核酸，仅切割脱氧核糖核酸；
缓冲液，包含三(羟甲基)氨基甲烷、氯化镁以及二硫苏糖醇；以及
冷却单元，冷却包含上述探针、上述靶核糖核酸、上述酶以及上述缓冲液的反应液。
10.根据权利要求9所述的核糖核酸检测试剂盒，其特征在于，在上述冷却单元中，将上述反应液在4℃的温度条件下冷却5分钟至10分钟。
11.根据权利要求9所述的核糖核酸检测试剂盒，其特征在于，包含与多个靶核糖核酸分别特异性地互补结合的多个探针，上述多个探针分别由产生互不相同波长的光的荧光物质标记5`-末端、由消光物质标记3`-末端。
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