CN102618664B - 一种miRNA检测探针和可视化检测miRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种miRNA检测探针和可视化检测miRNA的方法。本发明的miRNA检测探针包括三个部分：靠近3'端为G-四链体形成序列，中间是待测靶标miRNA互补序列，5'端为干扰序列。探针在通常条件下为hairpin结构，加入靶标后，由于DNA-RNA杂合体的碱基对数与稳定性均高于干扰序列形成的DNA双链，hairpin结构将打开。打开的hairpin结构在双链特异内切酶的作用下可释放出G-四链体形成序列，再在钠钾离子作用下使之形成G-四链体，与Hemin组装从而产生有过氧化物酶活性的催化剂。本发明检测miRNA的方法只需一条探针，产生的信号可视化，而且不需昂贵仪器。

Description

一种miRNA检测探针和可视化检测miRNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种miRNA检测探针和可视化检测miRNA的方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是真核细胞中发现的一类有调控功能的非编码RNA，通常大约有20～25个核苷酸。miRNAs是由较长的含有hairpin结构的前体经过Dicer酶的剪切加工形成的，随后与RNA诱导的沉默复合体(miRISCs)结合，并通过碱基互补配对识别相应的信使RNA(mRNA)。由于互补程度的不同，miRNA可以降解或阻遏靶mRNA阻遏靶mRNA的翻译。miRNA在动植物中有广泛表达，参与细胞增殖凋亡、发育、病毒防御、造血、器官形成、脂肪代谢等多种调节过程。miRNA具有保守性，特异性和时序性，只在特定的细胞和组织中表达，因此决定了细胞和组织功能的特异性。区别于寡核苷酸和RNA的降解片段，miRNA3’端为羟基，5’端有一个磷酸基。目前，miRNA的功能仅被部分阐明，近年来，有报道miRNA与细胞癌变具有密切关联。miRNA的功能类似于癌基因或抑癌基因，有些miRNA会协同行使癌基因的功能，使一些凋亡蛋白受到抑制而另外一些miRNA在正常组织中高表达，它们的缺失或低表达可以导致细胞的转化和一些癌基因的激活。因此，miRNA可以作为一个重要的肿瘤标识物，针对miRNA的检测对于早期诊断和愈后诊断有重要意义，同时也为其功能研究提供重要依据。

miRNA由于同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。目前的miRNA检测方法仍然以传统的Northern Blot为主，依赖于转印迹与杂交。这种方法主要的缺点在于工作流程长，操作复杂，费时，同时需要的样本量大，灵敏度有限，而且探针需要放射性或碱性磷酸酶等标记，这些都产生环境污染与资源浪费。近年发展了一些新的检测方法。芯片技术的发展为高通量检测及筛选带来重大突破，芯片的应用结合不同标记包括碱性磷酸酶，荧光标记，量子点纳米金等，提供了多种信号放大的途径，大大提高了检测的灵敏度。但是芯片及各种标记法均带来检测成本的提高。随后，分子信标的应用为miRNA的检测带来了新的途径，但是在检测miRNA的应用中由于miRNA长度的限制，使得分子信标环状区的长度局限于20-25个碱基左右，因而往往无法完全打开茎秆区而仅产生较低信号，同时分子信标荧光的产生只能是线性扩增，放大倍数不高。随后，RT-PCR的应用，滚环扩增，恒温指数扩增等均发展用来检测miRNA，这些方法各有优势，但是复杂的标记及探针设计，仪器的要求等仍然限制着它们的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种miRNA检测探针和高灵敏低成本检测miRNA的方法。

本发明是基于G-四链体与血红素Hemin形成的复合物具有过氧化物酶活性，催化底物2，2′联氮双(3′-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)被过氧化氢氧化，产生绿色产物。

本发明的探针在靶标miRNA存在的条件下被双链特异性内切酶的酶切后释放出G-四链体形成序列，在钠钾离子及Hemin的共同作用下形成有过氧化物酶活性的复合物，对过氧化氢催化底物ABTS反应，产生绿色产物。此过程可肉眼观察，从而实现miRNA的可视化检测。工作原理如图1所示。

为实现上述目的，本发明所提供的检测探针如下：

一种miRNA检测探针，包括三个部分：靠近3′端为G-四链体形成序列，中间是待测靶标互补序列，5′端为干扰序列；

所述G-四链体形成序列含有4段GGG序列参与G-四链体形成；

所述待测靶标互补序列为loop环，与相应的靶miRNA完全互补；

所述干扰序列有5-10个与G-四链体形成序列互补的碱基。

所述G-四链体形成序列在非工作条件下，与干扰序列互补配对而不形成G4，整个探针为hairpin结构。仅当有待测靶标存在时，hairpin结构打开，在双链特异内切酶的作用下，G4序列被释放出来形成四链体结构，产生过氧化物酶活性。

在没有靶标miRNA的情况下，由于干扰序列形成双链区具备一定的稳定性，hairpin结构仍然保持。加入靶标后，由于DNA-RNA杂合体的碱基对数与稳定性均高于干扰序列形成的DNA双链，hairpin结构将打开。我们引入一种双链特异的内切酶，只对双链DNA及DNA-RNA杂合体中的DNA链切割，而对于单链DNA及RNA不切割。打开的hairpin结构在这种酶切的作用下可释放出G-四链体形成序列，再在钠钾离子作用下使之形成G-四链体，从而产生有过氧化物酶活性的催化剂。

为减少探针自身在钠钾离子条件下形成G-四链体或干扰序列在酶作用下被切割而释放出G-四链体导致的背景升高，我们对干扰序列的长度进行了优化。优化结果显示，当干扰序列的长度为8个碱基时，其检测的效果是最佳的，阳性信号和阴性信号的差别最大，可以达到16。

为方便使用，本发明还提供包括含有上述miRNA检测探针的试剂盒。

本发明还提供一种可视化检测miRNA的方法，其包括如下步骤：

1)、设计DNA过氧化物酶检测探针体系：根据待测miRNA设计合成本发明所述的miRNA检测探针；

2)、将合成的miRNA检测探针与待测miRNA互补配对，并加入双链特异内切酶，通过酶切释放出G-四链体；

3)、加入钠钾离子，并与Hemin共同培育，然后通过过氧化物酶所催化的显色反应，来检测相应靶miRNA。

当待测miRNA为miR141时，上述检测方法的优选的条件是：

miRNA检测探针干扰序列的长度设置为8个碱基，miRNA检测探针的浓度为1000nM，双链特异性核酸内切酶的用量为0.1U。

本发明的优点和有益效果在于：

1、本发明的检测miRNA的方法中，设计的每一个探针针对一个特定的miRNA序列；只需单一探针，不需要额外模板序列，组装探针或是竞争序列；信号强度与背景可相差16倍，探针对靶标的特异性识别，在其他不与之完全配对的miRNA存在的情况下不产生明显增强信号；所有结果均仅用肉眼观察即可明确地区分靶标miRNA。

2、本发明的miRNA检测探针可满足不同检测需要。探针可用于快速筛查样本中是否含有靶标miRNA；对于已知存在靶标miRNA的，通过本探针与标准品作工作曲线从而计算出实际样品的靶标含量。

3、本发明设计的探针对实际临床样本中的靶标有较好响应，且对于不同表达量的样品有较好区分度。

附图说明

图1本发明的可视化检测miRNA方法的工作原理图。

图2实施例1所检测的miRNA序列。

图350nM MiR141存在条件下系列优化探针干扰片段长度的响应。

图4不同浓度双链特异内切酶和DNA探针条件下的响应

图5探针浓度1μM，DSN浓度为0.1U时，miR141的浓度梯度。

图6不同浓度miR141体系产生的最大紫外吸收信号。

图7特异设计针对miR141的探针分别对miR141及miR429的响应。

图8从MCF-7及HeLa细胞提取的miRNA样本中，利用本发明设计的探针检测miR141的响应。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1

1.miRNA检测探针体系的设计

(1)探针包含三个部分，G-四链体序列，该G-四链体即为通常意义上的信号部分；干扰序列；与靶标互补序列，这部分序列设计为特异检测目标miRNA。探针在通常条件下为hairpin结构，其中干扰序列与3′端G-四链体形成序列部分互补形成双链，待测miRNA的互补序列为loop环。

(2)所需达到的检测目标：对于相应靶标miRNA探针能产生很好信号响应，颜色足够能达到肉眼可见，并且对非靶标miRNA不产生背景。为达到此目的，设计一系列探针，探针的显色序列一致，在探针的干扰序列之间彼此相差一个碱基。

2.验证探针的灵敏性和选择性

(1)寡核苷酸定量

根据各寡核苷酸(探针A，B，SIB，待测片段C)样品管上所标注的纳摩尔数加入10倍微升数的超纯水(电阻率为10¹⁸Ω)，充分溶解。取10μL寡核苷酸母液加入990μl双蒸水中，即稀释100倍，用于寡核苷酸定量，定量溶液95℃加热5分钟，取出迅速置于冰上冷却，混匀后离心，破坏高浓度寡核苷酸母液中可能存在的二级结构，保证寡核苷酸为单链状态。测定寡核苷酸定量溶液在260nm处的紫外吸收值，根据各寡核苷酸的毫摩尔吸光系数，得到母液浓度，根据需要将各寡核苷酸母液稀释成100μM或50μM，-20℃保存。

(2)双链特异性内切酶酶切反应

待测miRNA选取被研究较多的miRNA200家族的miR141及miR429，如图2所示。系列探针分别在在探针的干扰序列之间彼此相差一个碱基，这样可以影响探针在hairpin结构时的稳定性，使得探针既能在与靶标miRNA结合后能被打开，从而避免干扰序列形成的双链被酶切产生背景，又不至于在不存在靶标时由于自身不稳定而形成单链，在后续过程中形成G-四链体而产生背景。

每个样品为50μL反应体系，包括DEPC水，10×DSN缓冲溶液，双链特异内切酶(DSN)酶，RNA酶抑制剂，探针和靶标miRNA。具体的，取洁净无RNase的PCR管，按顺序加入上述组分，保证探针终浓度1μM，DSN酶0.1U，miRNA浓度梯度稀释。混匀后59℃温浴20min，之后冷至室温。从系列探针优化来看，干扰序列为8个碱基是响应最强，且背景相对较低，如图3所示，在图中，最高的一条曲线是干扰片段为8个碱基时对于50nM miR141的信号响应(当没有miRNA时，其背景为最低的曲线)，第二高的一条曲线是干扰片段为7个碱基时对于50nMmiR141的信号响应(当没有miRNA时，其背景为第三低的曲线)，第三高的一条曲线是干扰片段为9个碱基时对于50nM miR141的信号响应(当没有miRNA时，其背景为第二低的曲线)。双链特异内切酶原则上只切10个以上碱基对形成的双链或RNA-DNA杂合体，对10个以下碱基对不切割，但实验中发现对于干扰序列仍有少量切割，因此如果酶过量势必增加非特异切割，通过增加DNA探针用量并减少酶量发现，探针量为1000nM且酶量为0.1U每个反应的时候相对的信号强度和背景比例正合适，如图4所示。在图中，最高的曲线是探针量为1000nM且酶量为0.1U时的信号响应(当没有miRNA时，其背景为最低的曲线)，第二高的曲线是探针量为500nM且酶量为0.2U时的信号响应(当没有miRNA时，其背景为第二低的曲线)。

(3)检测样品的动力学测试

DNA过氧化物酶催化H₂O₂氧化ABTS^2-所生成的ABTS^·-在414nm处有最大吸收，我们通过监测检测体系在414nm的吸收来判断检测体系的过氧化物酶活性，进而推断靶miRNA存在与否。DNA过氧化物酶反应在缓冲液：25mMHEPES-NH₄OH(pH8.0)、200mM NaCl、20mM KCl、及1％DMSO中进行，反应底物H₂O₂和ABTS^2-的浓度均为2mM。每个样品含有指定浓度的各种寡核苷酸和50nM Hemin。从检测结果看，miRNA141浓度最低到20pM时，体系仍有明显响应，高浓度到200nM时有16倍信号增强，如图5及图6所示。在图中，曲线的高度依次降低时，分别反映的是从200nM miRNA、50nM、10nM、2nM、400pM、80pM、20pM以及没有miRNA时的信号响应。

具体步骤，取1.5mL离心管，加入约270μL超纯水、40μL 10×混合盐溶液、40μL 10×H-Buffer，之后加入每个在步骤(1)中经DSN酶切的反应体系。样品混和均匀后离心，95℃加热5分钟，取出冷却至室温；每个样品中加入4μL12.5μM Hemin溶液，Hemin终浓度为125nM，混匀后离心，室温放置1小时或4℃放置3小时。

检测反应在室温下进行，用Shimadzu UV-2550型分光光度计的动力学模式监测反应的动力学过程。414nm为监测波长，1秒记录1次数据，记录3分钟。反应前，每个样品中加入1.6μL 50mM ABTS溶液，混匀，取500μL样品于参比池，再取1.6μL 1MH₂O₂粘附在样品池内壁，将剩下的500μL样品沿粘附有H₂O₂的样品池内壁注入，关闭样品仓门，点击“开始”按钮，开始记录数据。从结果看，50nM miRNA浓度时，有很深肉眼可见的绿色产生，2nM时有肉眼可见绿色。特异设计针对miR141的探针对于miR141响应很强，针对与miR141同源的miR429序列响应很弱，如图7所示。

3.利用探针对细胞内提取的miRNA进行检测

选取miRNA141高表达及低表达的两种细胞MCF-7和HeLa细胞作对比。细胞按10⁶个/瓶的密度接种于T25培养瓶，24小时后提取miRNA。具体依照miRNA提取试剂盒提取高纯度miRNA。流程如下：

a.胰酶消化并收集10⁶个细胞，PBS洗涤一次，离心(400×g)5min取细胞，弃上清。加入1ml裂解液MZ，振荡器振荡或移液器吸打数次混匀，整个过程避免降解miRNA。

b.将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。

c.4℃13,400×g离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。

d.加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。

e.4℃13,400×g离心15分钟，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为500μl。把水相转移到新管中，进行下一步操作。

f.加215μl无水乙醇，混匀，出现少许沉淀。将得到的溶液和沉淀一起转入miRspin column中，室温13,400×g离心30秒，离心后弃掉miRspin column，保留流出液。

g.加525μl无水乙醇，混匀，出现少许沉淀。将得到的溶液和沉淀一起转入miRelute column中，室温13,400×g离心30秒，离心后弃掉流出液，保留miRelute column。

h.向miRelute column中加入500μl去蛋白液MRD，室温静置2分钟，室温13,400×g离心30秒，弃废液。

i.向miRelute column中加入700μl漂洗液RW，室温静置2分钟，室温13,400×g离心30秒，弃废液。

j.向miRelute column中加入500μl漂洗液RW，室温静置2分钟，室温13,400×g离心30秒，弃废液。

k.将miRelute column放入2ml收集管中，室温13,400×g离心1分钟，去除残余液体。

l.将miRelute column转入一个新的1.5ml离心管中，加10μl RNase-freeddH20，室温放置2分钟，室温13,400×g离心2分钟。

结果显示，我们的方法可以检测到105个细胞抽提得到的microRNA样品，且发现MCF7的miR141水平显著高于Hela，这与已知文献高度一致，如图8所示。

Claims (6)

1.一种miRNA检测探针，其特征在于，包括三个部分：靠近3'端为G-四链体形成序列，中间是待测靶标互补序列， 5'端为干扰序列；

所述G-四链体形成序列含有4段GGG序列参与G-四链体形成；

所述待测靶标互补序列为loop环，与相应的靶miRNA完全互补；

所述干扰序列有5-10个与G-四链体形成序列互补的碱基。

2.根据权利要求1所述的miRNA检测探针，其特征在于，干扰序列的长度为8个碱基。

3.含有权利要求1或2所述miRNA检测探针的试剂盒。

4.一种可视化检测miRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）、根据待测miRNA设计合成权利要求1或2所述的miRNA检测探针；

2）、将合成的miRNA检测探针与待测miRNA互补配对，并加入双链特异内切酶，通过酶切释放出G-四链体；

3）、加入钠钾离子，并与Hemin共同培育，然后通过过氧化物酶所催化的显色反应，来检测相应靶miRNA。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，待测miRNA为miR141。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，miRNA检测探针干扰序列的长度设置为8个碱基，miRNA检测探针的浓度为1000 nM，双链特异性核酸内切酶的用量为0.1U。

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