CN103383355B - 基于非酶扩增及电化学发光原理的microRNA检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸检测技术领域，具体是一种基于非酶扩增及电化学发光原理的microRNA检测方法。该检测方法的步骤包括：1）设计DNA发卡探针，即根据非酶扩增原理及被检测microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡H1及发卡H2序列；2)电化学发光基团标记；3)发卡探针预处理；4)非酶扩增检测体系构建；5)产物清洗及分离；6)信号检测。该方法灵敏度高、准确、快速、操作简单，且整个扩增过程不需要酶的参与、大大降低了检测成本。

Description

基于非酶扩增及电化学发光原理的microRNA检测方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，特别涉及一种基于非酶扩增结合电化学发光原理检测microRNA的方法。

背景技术

microRNA（miRNA）是一类长度为19-25个核苷酸的非编码、内源性RNA。其广泛分布于真核生物细胞中。近年来，研究者已在动植物体内发现了数百种microRNA，并确定了microRNA的主要功能。该类RNA主要具有调控功能，其体内合成过程主要包括：首先，由基因组中非编码序列转录成较长的初级转录物；随后，初级转录物经过不同核酸酶的剪切、加工而产生。该类RNA可组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。据报道，哺乳动物基因组30%左右编码蛋白质的基因受到microRNA的调控。研究表明，microRNA参与许多重要的调节途径，主要包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。因此，发展一种灵敏，特异，经济，快速安全的检测microRNA的方法成为了近年来广大研究者关注的热点。

经典的microRNA检测手段主要是Northern杂交（Northern blotting）方法，但是其耗时，灵敏度不高，且需要专业人员操作，这大大降低了该方法的推广及普及。近年来，研究者提出了基于毛细管电泳、核酸扩增检测技术、纳米信号放大系统、表面等离子共振技术等方法。这些方法有着较高的检测灵敏度，耗时短，但是所需要的操作繁琐，属技术密集型，并且需要昂贵的仪器设备作为这些技术的支撑点。

发明内容

本发明目的在于，提供一种基于非酶扩增体系及电化学发光原理相结合的恒温检测方法。该方法灵敏度高、准确、快速、操作简单，且整个扩增过程不需要酶的参与、大大降低了检测成本。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于非酶扩增及电化学发光原理的microRNA检测方法，包括以下步骤：

1）设计DNA发卡探针

根据非酶扩增原理及被检测microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡H1及发卡H2序列；发卡H13’段标记6碳氨基，H23’端标记生物素；

2)电化学发光基团标记

取2.5OD发卡探针H1，离心五分钟使粘在的DNA落入管底，加入75ul0.1M硼酸钠，立即盖上管盖，充分上下振荡5min；离心收集，加入30ul11.2mM的活化钌，避光孵育12小时；加入1mL预冷的无水乙醇，放入超低温冰箱中2小时，离心（12000rpm，20min）；倒去浅黄色溶液，加入1mL预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱（-80℃）1h；离心（12000rpm，4℃，20min）；倒去溶液，加入1mL预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1h，离心（12000rpm，4℃，20min），加20ul水稀释，放-20℃保存；

3)发卡探针预处理

为了使发卡探针H1、H2充分形成发卡结构，向H2及已标记钌H1溶液中加入磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液终浓度为1X)，先加热至95℃之后，使其充分变性，而后再梯度降温，每分钟降5℃、直至常温为止，产物保存于4℃环境中备用；

4)非酶扩增检测体系构建

取一定量发卡探针H1（终浓度50nM）及H2(终浓度50nM)的预处理产物，并加入磷酸盐缓冲液（终浓度1X），再加DEPC水至100uL，并加入RNA酶抑制剂（终浓度1U/uL）。充分混匀后，加入待测样品，37℃温浴2小时，得到非酶扩增产物；

5)产物清洗及分离

非酶扩增检测体系中加入链霉亲和素包被的磁珠（终浓度0.2mg/mL），37℃温浴30min后，用磁分离器分离，去除溶液后，再加入100uL的PBs缓冲液溶解，再分离，由此反复清洗三次；

6)信号检测

将步骤5）的产物，放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。

所述的DNA发卡探针为自身可以形成特定双链茎部结构，其序列可根据待测microRNA的序列改变而做相应改变。

当扩增体系待测microRNA时，非酶扩增反应不会被激活，H1不能和H2反应，因此不会产生H1+H2双链产物。当扩增体系中含有待测microRNA，待测microRNA可与发卡探针H1结合，导致H1茎部打开，由此产生的部分单链结构与H2相作用，导致发卡探针H2茎部打开，并与H1形成H1+H2双链复合结构，在链霉亲和素磁珠的捕捉下，将H1+H2复合结构捕捉，由此产生电化学发光信号。

本发明相对于现有技术具有如下的优点：

(1)全过程不需要酶的参与，原理简单且成本低。

(2)实验在恒温条件下进行，只需37℃反应1h就能得到理想的实验结果，反应装置简单，用水浴锅加热即可。

(3)在电泳实验中，100pM实验组都能看到H1+H2复合结构的条带；电化学发光预实验的灵敏度已达到了10pM。

(4)非酶体系与电化学发光的结合，操作简单。

(5)该实验原理可用于DNA及RNA的检测，只要根据目标序列合理设计H1、H2序列即可。

附图说明

以下结合附图对本发明进行详细描述。

图1为非酶扩增体系扩增效率验证电泳图。

图2为非酶扩增/电化学发光检测平台灵敏度。

图3为非酶扩增/电化学发光检测平台特异性。

具体实施方式

实施例一

选取的与人类癌症紧密相关的microRNA-21作为被检测的microRNA。microRNA-21的序列为:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。

应用基于非酶扩增及电化学发光原理的microRNA检测方法进行检测microRNA-21的步骤如下：

1）设计DNA发卡探针

根据非酶扩增原理及microRNA-21序列设计非酶扩增体系所需的发卡H1及发卡H2序列；其中，microRNA-21序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，发卡H1及发卡H2序列参见表1。发卡H13’段标记6碳氨基，H23’端标记生物素。

表1

名称	序列(5’-3’)
		H1	TCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACT(3’端标记六碳氨基)
H2	TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA（3’端标记生物素）

2)电化学发光基团标记

取2.5OD发卡探针H1，离心五分钟使粘在的DNA落入管底，加入75ul0.1M硼酸钠，立即盖上管盖，充分上下振荡5min；离心收集，加入30ul11.2mM的活化钌，避光孵育12小时；加入1mL预冷的无水乙醇，放入超低温冰箱中2小时，离心（12000rpm，20min）；倒去浅黄色溶液，加入1mL预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱（-80℃）1h；离心（12000rpm，4℃，20min）；倒去溶液，加入1mL预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1h，离心（12000rpm，4℃，20min），加20ul水稀释，放-20℃保存。

3)发卡探针预处理

为了使发卡探针H1、H2充分形成发卡结构，向H2及已标记钌H1溶液中加入磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液终浓度为1X)，先加热至95℃之后，使其充分变性，而后再梯度降温，每分钟降5℃、直至常温为止，产物保存于4℃环境中备用。

4)非酶扩增检测体系构建

非酶扩增体系设置为100ul，取预处理后的发卡探针H1及H2，H1、H2的终浓度均为50nM，加入5ulPBS(20X)，使PBS终浓度为1X，加入RNA酶抑制剂（终浓度为1U/uL），最后加DEPC处理水补至100ul。充分混匀。加入待测microRNA21，37℃温浴1小时后，得到非酶扩增产物。

5)产物清洗及分离

非酶扩增检测体系中加入链霉亲和素包被的磁珠（终浓度0.2mg/mL），37℃温浴30min后，用磁分离器分离，去除溶液后，再加入100uL的PBs缓冲液溶解，再分离，由此反复清洗三次。

6)信号检测

将步骤5）的产物，放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。

非酶扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以验证非酶扩增原理可行性及扩增效率。实验结果如图1所示，从图1中看出，该体系扩增稳定，充分验证了非酶扩增体系的可行性。

为了验证非酶扩增/电化学发光检测平台的灵敏度，分别设置microRNA21浓度为100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM的，检测电化学发光信号，实验结果如图2所示。由图2可知，该检测平台的灵敏度能达到10pM。

为验证非酶扩增/电化学发光检测平台特异性，分别向该平台加入microRNA210及microRNA214，检测电化学发光信号，实验结果如图3所示。由图3可知，该平台特异性较好。

以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种基于非酶扩增及电化学发光原理的microRNA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计DNA发卡探针

根据非酶扩增原理及被检测microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡H1及发卡H2序列；发卡H13’段标记6碳氨基，H23’端标记生物素；

2)电化学发光基团标记

取2.5OD发卡探针H1，离心五分钟使粘在管壁上的DNA落入管底，加入75ul0.1M硼酸钠，立即盖上管盖，充分上下振荡5min；离心收集，加入30ul11.2mM的活化钌，避光孵育12小时；加入1mL预冷的无水乙醇，放入超低温冰箱中2小时，12000rpm离心20min；倒去浅黄色溶液，加入1mL预冷80％乙醇洗涤，放入-80℃超低温冰箱1h；12000rpm，4℃离心20min；倒去溶液，加入1mL预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1h，12000rpm，4℃离心20min，加20ul水稀释，放-20℃保存；

3)发卡探针预处理

为了使发卡探针H1、H2充分形成发卡结构，向H2及已标记钌H1溶液中加入终浓度1X的磷酸盐缓冲液，先加热至95℃之后，使其充分变性，而后再梯度降温，每分钟降5℃、直至常温为止，产物保存于4℃环境中备用；

4)非酶扩增检测体系构建

取终浓度50nM的发卡探针H1及终浓度50nM的H2的预处理产物，并加入终浓度1X的磷酸盐缓冲液，再加DEPC水至100uL，并加入终浓度1U/uL的RNA酶抑制剂；充分混匀后，加入待测样品，37℃温浴2小时，得到非酶扩增产物；

5)产物清洗及分离

非酶扩增检测体系中加入链霉亲和素包被的磁珠，该磁珠的终浓度为0.2mg/mL，37℃温浴30min后，用磁分离器分离，去除溶液后，再加入100uL的PBS缓冲液溶解，再分离，由此反复清洗三次；

6)信号检测

将步骤5)的产物，放入电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据；

所述的DNA发卡探针为自身可以形成特定双链茎部结构，其序列可根据待测microRNA的序列改变而做相应改变；

所述方法用于测定microRNA-21；

所述H1的序列为TCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACT，

所述H2的序列为TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA。

2.根据权利要求1所述的基于非酶扩增及电化学发光原理的microRNA检测方法，其特征在于：所述电化学发光全自动免疫分析仪为罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪。