CN105018603A

CN105018603A - 一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用

Info

Publication number: CN105018603A
Application number: CN201510381905.2A
Authority: CN
Inventors: 戴宗; 周雪晴; 邹小勇
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-01
Also published as: CN105018603B

Abstract

本发明公开了一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用。本发明通过设计一个特殊的颈环结构作为媒介体，触发恒温指数扩增反应（Isothermal？Exponential？Amplification？Reaction，EXPAR），并在聚合酶的链置换反应作用下形成靶序列循环，在短时间内扩增产生大量短链DNA片段，激活脱氧核酶（deoxyribozyme），切割荧光底物，形成靶序列循环，恒温指数放大反应，以及脱氧核酶催化反应三重循环放大过程的串联，建立更为高效、快速的恒温指数放大技术，并将其应用于microRNA的超灵敏荧光检测。

Description

一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一种长度为18-23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，广泛存在于病毒、植物和高等哺乳动物的细胞中，在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动过程中发挥重要的调控作用。MiRNA突变或异位表达与多种人类癌症相关，可起到肿瘤抑制基因或癌基因的功能，在癌症的诊断和治疗中可起重要作用。因此，建立快速、准确、高选择性和高灵敏度的miRNA检测方法，对深入研究miRNA的功能和调控作用，以及疾病的诊治，药物开发等均具有重要意义。然而，成熟的miRNA一般只有二十几个碱基，同族的miRNA之间通常只有一两个碱基的差别，而且绝大部分miRNA在细胞内的表达水平比较低，为准确灵敏检测miRNA提出严峻挑战。

当前，miRNA的常规检测方法有Northern印迹法、微阵列法等。Northern印迹法是最早被用于评价和定量检测miRNA表达的方法，也是现在检测miRNA表达水平最主要的手段之一。虽然经过多年的发展和改进，该方法仍然无法克服操作繁琐、费时费力、灵敏度低、样品需要量大等不足。微阵列技术可实现高通量、多组分同时检测，但其灵敏度和选择性较差，且实验和仪器费用较高。基于聚合酶链反应(PCR)的技术因其快速、简单、灵敏的优点常用于微量核酸物质的检测，但由于需要依赖精确的热循环控制仪器，不仅增加了检测成本，而且对于短链DNA引物的设计极其复杂，限制了其进一步应用。因此，建立恒温条件下的扩增技术受到极大关注，也成为当前miRNA检测技术发展的方向之一。

近期，一系列基于恒温靶序列循环的放大技术受到极大发展。李和徐提出利用核酸内切酶切割目标核酸/分子信标结合双链中的分子信标，不断释放目标核酸的靶序列循环方法。该方案能够显著放大信号,但由于核酸内切酶只能识别特殊序列，限制其应用于广泛的目标序列。随后，基于核酸外切酶的更通用的靶序列循环方法被提出。核酸外切酶III可以催化切割，并逐步消除单核苷酸3'羟基末端序列的双链。该方法在实现信号放大的同时克服了目标序列的限制。最近，基于核酸外切酶的二次酶放大技术(HQEA)被进一步提出。该方法显示了更高的信号放大能力，但由于核酸外切酶残余的活性会切割分子信标，引起高的背景信号，降低了信噪比。虽然可以通过将反应温度从37℃降低到4℃来抑制残余的外切酶活性，但分析时间必须从2小时延长到24小时。

发明内容

为了改善常规核酸分析中依赖PCR扩增技术导致的检测成本高，引物的设计复杂，测定假阳性率高的问题，解决现有恒温靶序列循环技术检测背景信号高，分析时间长的限制，实现高效、快速、高灵敏的核酸恒温分析目的。本工作通过设计一个特殊的颈环结构作为媒介体，触发聚合-链置换反应，形成靶序列循环，在短时间内扩增产生大量短链DNA片段，激活脱氧核酶(deoxyribozyme)，切割荧光底物，形成靶序列循环，恒温指数放大反应，以及脱氧核酶催化反应三重循环放大过程的串联，建立更为高效、快速的恒温指数放大技术，并应用于microRNA的超灵敏荧光检测。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：

(1)发夹探针：包括5’端颈部、环部与3’端颈部，环部与待检核酸序列互补，3’端颈部延伸至少2nt碱基作为恒温指数扩增模板区，恒温指数扩增模板区含有切口酶识别位点；

(2)恒温指数扩增引物：包括5’端序列和3’端序列，3’端序列与发夹探针的恒温指数扩增模板区互补；

(3)脱氧核酶：从5’至3’依次包括启动区与催化区；启动区为发夹结构，其环部与恒温指数扩增引物的5’端序列相同，3’端颈部至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；催化区为锤头状核酶，其3’端至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；

(4)脱氧核酶底物：其5'端和3'端分别标记有荧光和淬灭基团，中部含有1个核糖核苷酸，核糖核苷酸两端的序列分别与脱氧核酶启动区的3’端颈部、催化区的3’端互补。

作为优选的，所述核糖核苷酸为腺嘌呤核糖核苷酸。

作为优选的，所述发夹探针的颈部长6-8bp。

作为优选的，所述扩增引物的5’端至少有15nt与脱氧核酶的环部相同。

作为优选的，所述试剂盒中还包括：

(1)切口酶：其可识别发卡探针中的切口酶识别位点，并进行切割形成切口；

(2)DNA聚合酶。

进一步优选的，所述试剂盒中还包括：dNTP、Mg²⁺。

一种miR-27a的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：

(1)发夹探针：5'-TTGACTCGCGGAACTTAGCCACTGTGAAGAGTCAAAT-3'；

(2)恒温指数扩增引物：5'-TTGTTATCACCTATGATTTGACTC-3'；

(3)脱氧核酶：5'-AAGAGAGTTGTTATCACCTATGCTCTCTTCAGCGATCCGGAACGGCACCCATGTTAG TGA-3'；

(4)脱氧核酶底物：5'-TAMRA-TCA CTATrAGGAA GAG-BHQ₂-3'，rA表示腺嘌呤核糖核苷酸。

作为优选的，所述miR-27a恒温指数放大检测试剂盒中还包括切口酶、DNA聚合酶。

作为优选的，所述切口酶为Nt.BstNBI切口酶。

一种miRNA的检测方法，包括如下步骤：

(1)将发卡探针、dNTP、恒温指数扩增引物混合制成A反应液，将A反应液于80～95℃下温育5～8分钟，然后冷却至50～55℃；

(2)将待检样品、切口酶、DNA聚合酶混合制成B反应液，加到步骤(1)的混合物中，50～55℃下温育50～60分钟；

(3)将Mg²⁺、脱氧核酶和脱氧核酸酶底物混合制成C反应液，加到步骤(2)的混合物中，混匀；

(4)检测步骤(3)混合物的荧光强度，根据建立的标准曲线计算待检样品中目标miRNA的含量；

所述发卡探针、扩增引物、脱氧核酶、脱氧核酶底物的序列组成如上所述。

作为优选的，各反应液的组成如下：

A反应液中含有：0.1μM发夹探针，250μMdNTP，40nM恒温指数扩增引物，0.8U·μL^-1RNA酶抑制剂；

B反应液中含有：待测miRNA样品，0.5×Nt.BstNBI缓冲液，1×ThermoPol缓冲液，0.4U·μL^-1Nt.BstNBI切口酶，0.32U·μL^-1Bst DNA聚合酶；

C反应液含有：2mM Mg²⁺，2μM脱氧核酸酶底物，1μM的脱氧核酶；

A、B、C反应液的添加体积比为：10：15：5。

本发明中各核酸探针的设计原理如下：

1、发卡探针的设计：根据待测miRNA的序列设计发夹型探针(如图1所示)。探针环部序列与待测miRNA完全互补；3'端颈部延伸出至少2nt的碱基作恒温指数扩增模板区，其包含切口酶的识别序列。

2、恒温指数扩增引物的设计：恒温指数扩增引物的结构见图2，恒温指数扩增引物的3’端的序列与发卡探针的恒温指数扩增模板区互补；5’端的序列与脱氧核酶启动区发夹结构的环部相同。

3、脱氧核酶：其具有RNase酶活性，可以水解具有RNA核苷酸的底物，结构如图3所示，包括启动区与催化区，启动区环部与扩增引物的5’端序列相同，3’端颈部与底物序列互补，定义为底物结合位点1；催化区的3’端序列也与底物序列互补，定义为底物结合位点2；当启动区的发夹结构闭合时，脱氧核酶无催化活性，当发夹结构被打开时，脱氧核酶被激活，从而启动催化反应。

4、脱氧核酶底物：5'端和3'端分别标记有荧光和淬灭基团，序列中含有RNA核苷酸，能被脱氧核酶催化，切割，从而释放出荧光信号。RNA核苷酸两端的序列分别与脱氧核酶上的底物结合位点1、2互补，从而将脱氧核酶结合到底物上，启动催化反应。

本发明的技术原理如图4所示。以发夹探针(Hairpin probe)为模板，待测目标miRNA与其环部完全互补，能够将其打开，恒温指数扩增引物(Primer)与打开后的发夹探针颈部杂交，在聚合酶的作用下向下延伸置换出目标miRNA，形成第一个循环放大反应(targetrecycle)；生成的双链含有切口酶的识别序列，切口酶可在该位点剪切形成一个切口，DNA聚合酶结合在该切口上，开启第二轮链置换反应，将被切断的恒温指数扩增引物置换下来形成第二个循环放大反应，并生成大量短链DNA片段(即恒温指数扩增引物5’端的互补序列片段)；生成的短链DNA片段与脱氧核酶的环部互补，从而打开脱氧核酶的茎环结构，激活脱氧核酶催化活性，其结合到标记有荧光和淬灭基团的底物上，并催化切割底物，释放出荧光信号；脱氧核酶释放出被切割的底物，并继续杂交和切割新的底物，形成第三个循环放大反应，产生大量荧光信号。

本发明的有益效果是：

本方法设计并优化发夹探针和引物探针序列，降低了体系背景信号，提高了分析特异性。结合靶序列循环、链置换扩增反应和DNA酶的催化作用，建立了三重循环放大串联方法，实现了miRNA的高灵敏度高选择性荧光检测。该方法较现有的分析方法，具有以下优点：

(1)方法无需精确的控温装置，在恒温条件下即可实现高效信号放大，简化了分析的操作步骤，降低测定成本；

(2)方法实现指数形式的信号放大，相比于现有恒温靶序列循环信号放大技术，放大效率更高，分析时间更短；

(3)方法解决了现有恒温靶序列循环技术检测背景信号高的问题，改善了信噪比，分析灵敏度更高；

(4)方法基于发夹探针和脱氧核酶双重选择性，特异性更好，能准确区分单碱基错配的miRNA，有效地避免假阳性的检测结果；

(5)方法为均相反应，表现出高的精确性，重复性和稳定性。

附图说明

图1为发夹探针结构示意图。

图2为恒温指数扩增引物结构示意图。

图3为脱氧核酶结构示意图。

图4为本发明方法原理示意图。

图5为miRNA特异性验证结构图：(A)经靶序列循环和恒温指数扩增反应两重放大反应串联后各种miRNA检测荧光光谱图；(B)经靶序列循环、恒温指数扩增反应和脱氧核酶催化反应三重放大反应串联后的各种miRNA检测荧光光谱图；插图(A)聚丙烯酰胺凝胶(15％)电泳分析扩增产物；插图(B)经两重放大反应和三重放大反应后对单碱基错配以及非杂交miRNA的检测特异性。

图6为不同影响因素对扩增效率的影响：荧光强度随(A)镁离子浓度，(B)温育时间，(C)温育温度，(D)缓冲体系中ThermoPol缓冲液和Nt.BstNBI缓冲液体积比的变化关系。

图7为标准曲线图：含有0,10aM,100aM,1fM,10fM,1pM,10pM,100pM,1nM和10nM miR-27a的待测溶液的荧光光谱图；插图为荧光强度与miR-27a浓度的对数关系图。

图8为大鼠主动脉弓形态学分析和miR-27a表达量分析：(A)(C)正常组，(B)(D)模型对照组。

具体实施方式

下面以miR-27a检测为例，建立一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测试剂盒及检测方法

实施例1用于检测miR-27a的基于三重放大反应串联的恒温指数放大试剂盒的组成：

(1)发夹探针：

5’端颈部环部 3’端颈部

5'-TTGACTC--GCGGAACTTAGCCACTGTGAA--GAGTCAA--AT-3'(SEQ ID NO.1)

恒温指数扩增模板区

发夹探针包括5’端颈部、环部和3’端颈部，3’端颈部延伸至少2nt形成扩增支点；3’端颈与扩增支点组成恒温指数扩增模板区，该段序列同样为切口酶识别序列。

(2)恒温指数扩增引物：

5'-TTGTTATCACCTATG--ATT TGACTC-3'(SEQ ID NO.2)

5’端序列 3’端序列

恒温指数扩增引物包括5’端序列和3’端序列，3’端序列与发夹探针的恒温指数扩增模板区互补，5’端序列与脱氧核酶的启动区环部相同，其在恒温指数扩增程序中产生大量的互补DNA短链可与脱氧核酶启动区环部互补，从而打开脱氧核酶启动区的发夹结构，激活脱氧核酶的催化活性。

(3)脱氧核酶：

5’颈部环部 3’颈部

5'-AAGAGAG--TTGTTATCACCTATG--CT-- --AGCGATCCGGAACGGCACCCATGT

启动区底物结合位点1 催化区

-3'(SEQ ID NO.3)

底物结合位点2

脱氧核酶包括启动区和催化区，启动区的环部与恒温指数扩增引物的5’端序列相同，3’颈部末端的6个碱基为底物结合位点1，与脱氧核酶底物的核酶结合位点1序列互补，催化区3’端6个碱基为底物结合位点2，与脱氧核酶底物的核酶结合位点2序列互补。

(4)脱氧核酶底物：

5'-TAMRA---TrAG---BHQ₂-3'(SEQ ID NO.4)

核酶结合位点2 核酶结合位点1

rA表示腺嘌呤核糖核苷酸，为锤头状脱氧核酶催化切割的识别位点。

(5)Nt.BstNBI切口酶

(6)Bst DNA聚合酶

实施例2 miR-27a的基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测方法的建立及特异性验证

在冰上分别制备A、B、C三种反应液：

A反应液：0.1μM发夹探针，250μMdNTP，40nM恒温指数扩增引物，0.8U·μL^-1RNA酶抑制剂和DEPC处理的水，总体积为10μL。

B反应液：待测miRNA，0.5×Nt.BstNBI缓冲液，1×ThermoPol缓冲液，0.4U·μL^-1Nt.BstNBI切口酶，0.32U·μL^-1Bst DNA聚合酶和DEPC处理过的水，总体积为15μL。

C反应液：2mM Mg²⁺，2μM脱氧核酸酶底物，1μM的脱氧核酶和DEPC处理过的水组成，总体积为5μL。

A溶液首先在95℃下温育5分钟以变性发夹探针和结合引物，然后冷却至55℃。加入B溶液混合，在55℃温育60分钟后加入C溶液。所得混合物用170μL水稀释后即用荧光检测。荧光检测条件：激发波长：494nm，扫描区间：490nm至700nm，激发和发射狭缝宽度：5nm。

基于发夹探针的链置换扩增产物可以用SYBR Green II染料标记产生荧光信号来表征，同时用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(图5)。本实施例以miR-27a为阳性对照，miR-27b、miR-142s和blank为阴性对照对本发明检测方法的特异性进行验证。如图5中A所示，miR-27a引发了链置换扩增，相对于miR-27b和miR-142s链产生了显著的荧光信号。图5中A插图中，泳道d为扩增产生的DNA标准链标记物，泳道b和c分别为miR-27b和miR-27a的扩增产物，泳道a是不含target链的扩增反应产物(blank)。从图5中A插图可知，miR-27a引发了链置换扩增反应产生了大量单链DNA片段和长链产物，而miR-27b和blank很难引发扩增反应没有得到扩增产物。电泳结果进一步表明靶序列miR-27a经过链置换扩增反应进行了特异、高效的扩增。

链置换扩增反应后，所产生的短寡核苷酸激活了一个锤头型脱氧核酶实现了第三级扩增循环。脱氧核酶具有RNase酶活性，可以水解具有腺嘌呤核苷酸的底物。标记有荧光和淬灭基团的底物因为被切割而产生大量荧光信号。在不存在短寡核苷酸链时，脱氧核酶是“失活”的状态，则底物不能被切割而不出现荧光信号。相反，扩增反应产生的短寡核酸链通过打开脱氧核酶的分子信标模块从而激活脱氧核酶，实现底物的结合和切割。切割后底物释放出来，另一个底物随后结合。结合和切割的连续循环导致荧光信号的放大。因此，通过目标循环，等温EXPAR和脱氧核酶催化的三级扩增循环，快速放大策略得以实现。

实施例3基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测方法的优化

该方法的扩增效率受镁离子，孵育时间和温度，以及工作缓冲液的浓度等因素的影响。通过优化，如图6所示，得出了最佳的实验条件为：Mg²⁺浓度2mM；温育时间60min；温育温度55℃；缓冲体系为ThermoPol缓冲液:Nt.BstNBI缓冲液＝1:1。

实施例4标准曲线的制备

配制一系列分别含有0,10aM,100aM,1fM,10fM,1pM,10pM,100pM,1nM和10nMmiR-27a的待测溶液，在最佳实验条件下，按照上述步骤制备杂交扩增体系，荧光检测获得miR-27a各浓度下的荧光光谱响应，得到miR-27a浓度的(图7)，通过拟合，得标准曲线方程为：F＝(8402±1273)e^0.345logc+(47.22±12.43)，为指数扩增形式。

实施例5本发明方法用于大鼠动脉粥样硬化中miR-27a的测定

(1)构建动物模型

选取健康SD大鼠8只，雌雄各半，体重200-250g，随机分为2组，每组4只。模型组：每只大鼠按700000U/kg的总剂量腹腔注射VD₃，分3天给完，并且每天给予高脂饲料，连续喂养56d；正常组：每只大鼠以等体积的生理盐水腹腔注射3天，每日给予标准饲料，连续喂养56d。

(2)miRNA提取测定

取适量组织剪碎置1.5mlEP管中，加Trizol 0.8ml，充分振荡。加入氯仿0.2ml，盖紧盖子，用力摇动15s，15-30℃孵育2-3min，4℃12000r/min离心15min，取上清液至新的1.5mlEppendorf管。加与上清液等体积的异丙醇，15-30℃孵育样品10min，4℃12000r/min离心10min，弃上清液。75％乙醇(含DEPC水)800ul洗涤沉淀一次，4℃7500r/min离心5min，弃乙醇。空气或真空干燥5-10min(不要完全干燥)，加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。取4μl RNA模板做逆转录反应，仪器为BIO-RAD定性PCR仪。

(3)大鼠主动脉弓形态学改变

对照组血管内皮完整，中膜可见梭形平滑肌细胞，弹力纤维层结构清晰完整，呈环行排列，外膜为薄层疏松结缔组织(图8中A)；模型组可见大鼠主动脉壁管壁明显增厚，内皮向管腔突起，中膜平滑肌细胞增生，排列紊乱，弹力纤维层结构不清，外膜为薄层疏松结缔组织(图8中B)。

(4)大鼠主动脉弓miR-27a表达改变

应用定量PCR技术和该方法检测对照组和模型组大鼠主动脉弓miR-27a的表达量，两种方法获得的miR-27a表达量相近，且均显示大鼠在动脉粥样硬化后，MiR-27a表达量会上调(图8中C，图8中D)，说明该方法具有很好的准确性。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 中山大学

<120> 一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgactcgcg gaacttagcc actgtgaaga gtcaaat 37

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgttatcac ctatgatttg actc 24

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagagagttg ttatcaccta tgctctcttc agcgatccgg aacggcaccc atgttagtga 60

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> a

<222> (8)..(8)

<223> 腺嘌呤核糖核苷酸

<400> 4

tcactatagg aagag 15

Claims

1.一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：

（1）发夹探针：包括5’端颈部、环部与3’端颈部，环部与待检核酸序列互补，3’端颈部延伸至少2nt碱基作为恒温指数扩增模板区，恒温指数扩增模板区含有切口酶识别位点；

（2）恒温指数扩增引物：包括5’端序列和3’端序列，3’端序列与发夹探针的恒温指数扩增模板区互补；

（3）脱氧核酶：从5’至3’依次包括启动区与催化区；启动区为发夹结构，其环部与恒温指数扩增引物的5’端序列相同，3’端颈部至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；催化区为锤头状核酶，其3’端至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；

（4）脱氧核酶底物：其5'端和3'端分别标记有荧光和淬灭基团，中部含有1个核糖核苷酸，腺嘌呤核苷酸两端的序列分别与脱氧核酶启动区的3’端颈部、催化区的3’端互补。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱氧核酶底物中的核糖核苷酸为腺嘌呤核糖核苷酸。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发夹探针的颈部长6-8bp。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物的5’端至少有15nt与脱氧核酶的环部相同。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

（1）切口酶：其可识别发卡探针中的切口酶识别位点，并进行切割形成切口；

（2）DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：dNTP、Mg²⁺。

7.一种miR-27a的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：

（1）发夹探针：5'-TTGACTCGCGGAACTTAGCCACTGTGA AGAGTCAAA T-3'；

（2）恒温指数扩增引物：5'-TTGTTATCACCTATGATTTGACTC-3'

（3）脱氧核酶：5'-AAGAGAGTTGTTATCACCTATGCTCTCTTCAGCGATCCGGAACGG CACCCA TGTTAG TGA-3'；

（4）脱氧核酶底物：5'-TAMRA-TCA CTATrAGGAA GAG-BHQ₂-3'，rA表示腺嘌呤核糖核苷酸。

8.根据权利要求7所述的miR-27a的恒温指数放大检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括Nt.BstNBI切口酶、DNA聚合酶。

9.一种miRNA的检测方法，包括如下步骤：

（1）将发卡探针、dNTP、恒温指数扩增引物混合制成A反应液，将A反应液于80～95℃下温育5～8分钟，然后冷却至50～55℃；

（2）将待检样品、切口酶、DNA聚合酶混合制成B反应液，加到步骤（1）的混合物中，50～55℃下温育50～60分钟；

（3）将Mg²⁺、脱氧核酶和脱氧核酸酶底物混合制成C反应液，加到步骤（2）的混合物中，混匀；

（4）检测步骤（3）混合物的荧光强度，根据建立的标准曲线计算待检样品中目标miRNA的含量；

所述发卡探针、扩增引物、脱氧核酶、脱氧核酶底物的序列组成如权利要求1-4、7任一项所述。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，各反应液的组成如下：

A反应液中含有：0.1μM发夹探针，250μMdNTP，40nM恒温指数扩增引物，0.8U·μL^-1 RNA酶抑制剂；

B反应液中含有：待测miRNA样品，0.5×Nt.BstNBI缓冲液，1×ThermoPol缓冲液，0.4 U·μL^-1Nt.BstNBI切口酶，0.32 U·μL^-1Bst DNA聚合酶；

A、B、C反应液的添加体积比为：10：15：5。