CN106884047A

CN106884047A - 基于核酸适配体检测miRNA‑155的方法

Info

Publication number: CN106884047A
Application number: CN201710080037.3A
Authority: CN
Inventors: 李慧; 徐成功; 王玉
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2017-06-23
Anticipated expiration: 2037-02-15
Also published as: CN106884047B

Abstract

本发明提供了一种基于核酸适配体检测miRNA‑155的方法，本发明是基于核酸适配体与目标物的特异性识别，利用phi29 DNA聚合酶在滚环扩增中的链延伸作用以及核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用以及分子信标的荧光基团能够产生荧光信号的特性构建了该生物检测方法。该检测方法具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补miRNA‑155现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

Description

基于核酸适配体检测miRNA-155的方法

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测miR-155的方法。

背景技术

MiRNA是一类长度为17-25个核苷酸的非编码RNA分子，其在肿瘤发生、细胞分化、细胞凋亡和蛋白质合成等生命现象中扮演着重要的角色。miRNA的异常表达与人类多种疾病如癌症，糖尿病，心血管疾病和神经病症等直接相关，因此miRNA已经成为对于癌症等多种疾病进行早期预防和诊断的重要生物标志物。miRNA-155作为miRNA的一种，它的过量表达将会导致乳腺癌的发生，因此通过对miR-155的高灵敏检测来实现对乳腺癌的早期诊断和预防是非常有必要的。

目前报道的对于miR-155的检测方法包括实时定量PCR法、Northern印迹杂交、基因芯片检测等方法，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵、检测灵敏度低等问题，已经难以满足对miR-155进行方便、快捷、高灵敏检测的要求。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏度高且特异性强的检测方法来对miR-155进行检测，以实现对乳腺癌的早期诊断和预防。

发明内容

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，利用phi29 DNA聚合酶在滚环扩增中的链延伸作用以及核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用以及分子信标的荧光基团能够产生荧光信号的特性构建了该生物检测方法。该检测方法具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补miRNA-155现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明中一共用到了4种DNA链和1种分子信标，其序列分别是：

Circular template 1:

5’-P-CCC CTA TAT AGA AGT CTG ATA GCA CAG ACG CGC CAT CGA TAG GCG TGG AGCATT ACC CGT GGC TTC TTC GTA CTA G-3’ (SEQ ID NO:1)；

Circular template 2:

5’-P-AAG TAG TCT ATT GGT CGG ATC TGG AGG TTG CAT GTG CTG AGG CGA ATT TAACGA CCC ACA CCG AAT ACA A-3’(SEQ ID NO:2)；

Hairpin 1:

5’-CCC CTA TCA CGA TTA GCA TTA ACA TTG AGG ATT TCT ATA TAG GGG-3’(SEQ IDNO:3)；

Hairpin 2:

5’-TGGAGCATTACCCGTTTTTACCTCCAGA-3’(SEQ ID NO:4)；

Molecular beacon:

5’-FAM-CATGTGCTGAGGCGTTTCACATG-Dabcyl-3’(SEQ ID NO:5)。

其中在Hairpin1结构的序列中，5’端画横线的部分为目标物miRNA-155的适配体，可以与目标物通过碱基互补配对作用而紧密结合，因而可以将Hairpin1打开然后释放出它的3’端从而进行下一步的反应。

Molecular beacon的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团，由于其自身能维持发夹型结构，因此就使荧光基团和猝灭基团临近，因而在激发波的作用下无法检测到荧光信号或者荧光信号很弱；如果将发夹型的分子信标打开或者将其切断使得荧光基团和猝灭基团远离，在激发波的作用下就会检测到强烈的荧光信号，我们就是通过检测荧光信号的强度来达到定量检测目标物的目的。

本发明中用到了两种酶：phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI核酸内切酶。phi29 DNA聚合酶具有链延伸的功能；核酸内切酶可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是:5’---GCTGAGG---3’，切割位点位于靠近5’端的第二个和第三个碱基之间。

本发明中miRNA-155的检测是在均相溶液中实现的，通过利用三步信号放大技术来实现对目标物的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：发夹结构的Hairpin1中有目标物的适配体，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹结构的Hairpin1打开并且释放出Hairpin1的3’ 端，释放出的Hairpin1的3’端能够与Circular template1的一段核酸序列互补配对，在phi29 DNA聚合酶和dNTPs的作用下进行第一步滚环扩增反应，从而产生一段单链DNA。这一段单链DNA又能够打开大量的发夹型Hairpin2进而释放出Hairpin2的3’端，然后释放出的Hairpin2的3’端又能够与Circulartemplate2的一段核酸序列互补配对，从而进行第二步滚环扩增反应，并且释放出一条长的单链DNA序列。作为第二步滚环扩增反应的产物，这一条长的单链DNA序列又能够打开发夹状的分子信标，使得修饰在分子信标5’端和3’端的荧光基团和猝灭基团分离，从而能够产生荧光信号。同时，被打开的分子信标又会暴露出一种核酸内切酶（Nb.BbvCI）的酶切位点,从而将结合在第二次滚环扩增产生的单链DNA上的MB切割后将MB释放下来，然后第二次滚环扩增所产生的单链又能够进行下一步的反应，最终不断地将MB打开、切割、释放从而实现第三步信号放大反应，产生强烈的荧光信号。

在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是70 min。

该发明的检测方式是荧光检测，利用的是一台安捷伦荧光分析仪。所有分析检测过程中激发波、发射波的狭缝都为5nm，电压为950V，激发波为486nm，在发射光谱的518nm处获得发射波的强度，根据不同的荧光强度来检测目标物miRNA-155的浓度。

具体检测方法如下：

1）将1μL， 1.0μM 的Hairpin1，1μL，1.0μM 的Circular template 1, 1μL，1.0μM 的Hairpin2， 1μL，1.0μM的 Circular template 2，Molecular beacon（1μL，1.0μM），1μL，10×的phi29 DNA聚合酶，1μL，10×的Nb.BbvCI , NEB buffer(5μL，10×)和待测物加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min；

2）将反应好的溶液从水浴锅中取出，放入85℃的水浴锅中水浴加热10min，使体系中的酶失活；

3）10 min后，从水浴锅中取出混合溶液，然后用安捷伦荧光检测仪测定混合溶液的荧光强度，据此检测目标物。

有益效果

1、通过利用碱基互补配对原则，使得核酸适配体能够高特异性地识别目标物miRNA-155，最终实现了对其的高特异性检测；

2、利用了三步信号放大技术极大地增强了荧光信号，从而提高了检测的灵敏度，实现对目标物miRNA-155的高灵敏检测；

3、该生物传感器的检测反应过程均是在均相中进行的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了对目标物的快速，简单，灵敏的检测；

4、制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于人体组织中miRNA-155的检测和生物传感器产业化的实际应用；

5、制作该生物传感器的工艺成本低，符合产业化中价格价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1 Hairpin1浓度优化检测结果图；

图3为实施例2 Circular template1浓度优化检测结果图；

图4为实施例3 Hairpin2浓度优化检测结果图；

图5为实施例4 Circular template2浓度优化检测结果图；

图6为实施例5 Molecular beacon浓度优化检测结果图；

图7为实施例6传感器检测的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，下述说明仅是实例性的，不限定本发明的保护范围。

实施例1

a、将1μL不同浓度的Hairpin1（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Circular template1（1μL， 10μM），Hairpin2（1μL，10μM）,Circular template 2（1μL，10μM）, Molecular beacon（1μL，100μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），Nb.BbvCI(1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（miRNA-155）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min。

b、将反应好的溶液从水浴锅中取出，放入85℃的水浴锅中水浴加热10min，使体系中的酶失活。

c、 10 min后，从水浴锅中取出混合溶液。然后用安捷伦荧光检测仪测定混合溶液的荧光强度，据此检测目标物。

其实验原理图如图1，结果见图2，从图中可以看出，检测到的荧光强度随着Hairpin1的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，荧光强度值趋于稳定。所以Hairpin1的最佳终浓度为1.0μM。

实施例2

a、将1μL不同浓度的Circular template1（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Hairpin1（1μL， 10μM），Hairpin 2（1μL，10μM）, Circular template 2（1μL，10μM）, Molecular beacon（1μL，100μM），phi29 DNA聚合酶（1μL,10×），Nb.BbvCI(1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（miRNA-155）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min。

c、10 min后，从水浴锅中取出混合溶液。然后用安捷伦荧光检测仪测定混合溶液的荧光强度，据此检测目标物。

结果见图3，从图中可以看出，检测到的荧光强度值随着Circular template1的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，荧光强度值趋于稳定。所以Circular template1的最佳终浓度为1.0μM。

实施例3

a、将1μL不同浓度的Hairpin2（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Hairpin1（1μL， 10μM），Circular template 1（1μL，10μM）, Circular template 2（1μL，10μM）, Molecular beacon（1μL，100μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），Nb.BbvCI(1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（miRNA-155）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min。

结果见图4，从图中可以看出，检测到的荧光强度值随着Hairpin2的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，荧光强度值趋于稳定。所以，Hairpin2的最佳终浓度为1.0 μM。

实施例4

a、将1μL不同浓度的Circular template2（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Hairpin1（1μL， 10μM），Circular template 1（1μL，10μM）, Hairpin2（1μL，10μM）, Molecular beacon（1μL，100μM），phi29 DNA聚合酶（1μL,10×），Nb.BbvCI(1μL，10×), NEB buffer(5μL,10×)和待测物（miRNA-155）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min。

结果见图5，从图中可以看出，检测到的荧光强度值随着Circular template 2的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，荧光强度值趋于稳定。所以，Circular template2的最佳终浓度为1.0 μM。

实施例5

a、将1μL不同浓度的Molecular beacon（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Hairpin1（1μL， 10μM），Circular template 1（1μL，10μM）, Hairpin2（1μL， 10μM）, Circular template 2（1μL，10μM），phi29 DNA聚合酶（1μL,10×），Nb.BbvCI (1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（miRNA-155）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min。

结果见图6，从图中可以看出，检测到的荧光强度值随着Molecular beacon的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，荧光强度值趋于稳定。所以，Molecular beacon的最佳终浓度为1.0 μM。

实施例6

a、将Hairpin1（1μL， 1.0μM），Circular template 1（1μL，1.0μM）, Hairpin2（1μL，1.0μM）, Circular template 2（1μL，1.0μM），Molecular beacon（1μL，1.0μM）， phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），Nb.BbvCI (1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和不同浓度的待测物miRNA-155（0 aM，5 aM， 50 aM， 500 aM，5 fM， 500 fM，5 pM）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min。

检测结果如图7所示，图中我们可以看到，当miRNA-155浓度在5 aM到500 fM时荧光强度不断增加，反应稳定进行，而当浓度在5 pM时，荧光强度增加不明显，因此miRNA-155的浓度在5 aM 到 500 fM时，miRNA-155浓度的对数与荧光强度的大小成正比关系，拟合曲线：F=22.70511+103.58286*lgC（F是荧光强度，C是miRNA-155的浓度）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>济南大学

<120>基于核酸适配体检测miRNA-155的方法

<160>2

<210>1

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(75)

<223>引物

<400>1

CCC CTA TAT AGA AGT CTG ATA GCA CAG ACG 30

CGC CAT CGA TAG GCG TGG AGC ATT ACC CGT 60

GGC TTC TTC GTA CTA 75

<210>2

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(70)

<223>引物

<400>2

AAG TAG TCT ATT GGT CGG ATC TGG AGG TTG 30

CAT GTG CTG AGG CGA ATT TAA CGA CCC ACA 60

CCG AAT ACA A 70

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(45)

<223>引物

<400> 3

CCC CTA TCA CGA TTA GCA TTA ACA TTG AGG 30

ATT TCT ATA TAG GGG 45

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400> 4

TGG AGC ATT ACC CGT TTT TAC CTC CAG A 28

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400> 5

CAT GTG CTG AGG CGT TTC ACA TG 23

Claims

1.一种基于核酸适配体检测miR-155的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1) 将1μL， 1.0μM 的Hairpin1，1μL，1.0μM 的Circular template 1, 1μL，1.0μM 的Hairpin2， 1μL，1.0μM的 Circular template 2，1μL，1.0μM Molecular beacon，1μL，10×的phi29 DNA聚合酶，1μL，10×的Nb.BbvCI ，5μL，10× NEB buffer和待测物加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min；

3）10 min后，从水浴锅中取出混合溶液，然后用安捷伦荧光检测仪测定混合溶液的荧光强度，据此检测目标物，

Circular template 1的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；

Circular template 2的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

Hairpin1的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；

Hairpin2的碱基序列如SEQ ID NO:4所示；

Molecular beacon的碱基序列如SEQ ID NO:5所示。