CN107058501A

CN107058501A - 一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的方法

Info

Publication number: CN107058501A
Application number: CN201710080969.8A
Authority: CN
Inventors: 李慧; 徐成功; 王玉; 张雪; 刘素; 冷雪琪; 裴倩倩; 崔雪君; 韩聪; 刘学娇; 秦艺菲; 涂玉琴
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明提供了一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的方法，其运用目标物循环技术、链置换反应技术和滚还复制放大技术来实现信号放大。本发明提供的检测方法价格低廉、分析检测速度快，灵敏高且特异性强。

Description

一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种检测氨苄青霉素的荧光检测方法。

背景技术

氨苄青霉素是一种广谱半合成青霉素，其抗菌性与青霉素类似。氨苄青霉素现在已经被广泛地运用，尤其在医药和细菌感染治疗中发挥着非常重要的作用。其能够有效地杀死多种细菌，例如：流感嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌等。然而氨苄青霉素的广泛利用对人们的健康生活也会产生了严重的影响，例如在畜牧业中滥用氨苄青霉素导致了食品和农产品中的药物残留以及由于这些残留引发的疾病，如：过敏反应，呼吸困难和癫痫发作等。因此，为了人们的健康，确定食品及农产品中的氨苄青霉素的残留量至关重要。

目前，对于氨苄青霉素残留所常用的检测方法有微生物检测法和高效液相色谱分析法。但是这两种方法都存在自身不可避免的缺点与限制。例如微生物分析法的分析检测耗时长，特异性和灵敏度都比较低；对于高效液相色谱分析法，其整个分析过程比较复杂繁琐，同时也需要昂贵的样品预处理，因此该方法也不适合被广泛的推广。因而，目前急需建立一种价格低廉、分析检测速度快，灵敏高且特异性强的检测方法来实现对氨苄青霉素进行高效检测分析。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明基于核酸适配体与目标物氨苄青霉素的特异性识别，具有链置换功能的DNA聚合酶的链延伸、置换作用、目标物循环反应，核酸内切酶（Nb.BbvCI）在特异性位点(5’---GCTGAGG---3’)对核酸链的切割作用、滚环复制而实现信号的放大作用以及分子信标中的荧光基团能产生荧光信号的特性构建了该荧光生物检测方法。该荧光检测方法具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补对于氨苄青霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测，保障食品安全。

本发明中一共用到了3种单链DNA和1种分子信标，其序列分别是：

Hairpin: 5’-GCG GGC GGT TGT ATA GCG GTT TTT TTG GAT CTT TTG TTC GCC CGC-3’

（SEQ ID NO:1）；

Replacement template：

5’-ACC GAA TAC AAA AGT AGT CTA TCC TCA GCG CGG GCG-3’（SEQ ID NO:2）；

Circular template：

5’-P-AAG TAG TCT ATT GGT CGG ATC TGG AGG TTG CAT GTG CTG AGG CGA ATT TAACGA CCC ACA CCG AAT ACA A-3’（SEQ ID NO：3）；

Molecular beacon：

5’-FAM-CAT GTG CTG AGG CGT TTC ACA TG-Dabcyl-3’（SEQ ID NO：4）。

其中Hairpin中5’端画横线的部分为目标物氨苄青霉素的适配体，在没有目标物氨苄青霉素的情况下，Hairpin能够维持发夹型结构，进而无法引发其他的生物化学反应；然而在有目标物氨苄青霉素的情况下，氨苄青霉素能够与其适配体进行高特异性地识别并紧密结合，因而能够将发夹型的Hairpin打开并释放出其3’端然后引发后续的生物化学反应。

Replacement template的5’端能够与被氨苄青霉素打开的Hairpin的3’端进行碱基互补配对，并且在phi29 DNA聚合酶和dNTPs的作用下沿着各自的3’端进行延伸。在延伸的过程中，与适配体结合的目标物会被新产生的DNA链竞争掉而释放到体系里进行到下一次循环利用反应，打开新的Hairpin；同样在延伸的过程中，会产生与Replacementtemplate中5’-CCTCAGC-3’的互补序列，其就会被Nb.BbvCI所识别，进而切断其互补序列中5’-AG-3’之间的磷酸二酯键，随着切割和链的不断延伸，将会引发链置换反应，从而不断地产生大量的单链DNA。Replacement template中5’-ACCGAATACAAAAGTAGTCTAT-3’的互补序列能够与Circular template的两端（黑体部分）碱基互补配对而形成挂锁结构。

Molecular beacon的5’端修饰有荧光基团FAM，3’段修饰有猝灭基团Dabcyl，在没有进行滚环扩增反应的时候，Molecular beacon无法被打开而维持发夹型的结构，此时FAM的荧光信号就被Dabcyl猝灭，因而就无法检测到荧光信号或者应该信号很弱；在进行滚环扩增反应之后，其产物能够将发夹型的Molecular beacon打开，使得荧光基团和猝灭基团远离，进而产生荧光信号。

本发明中用到了三种酶：phi29 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和Nb.BbvCI核酸内切酶。Phi29 DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能；T4 DNA连接酶能够连接临近核苷酸的羟基和磷酸基团；核酸内切酶（Nb.BbvCI）可以在特异性位点实现对DNA链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是：5’--- GCTGAGG---3’，切割位点位于5’端的第二个碱基和第三个碱基之间。

本发明中氨苄青霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过目标物循环技术、链置换反应技术和滚环扩增反应技术来实现最终荧光信号的放大，从而达到对氨苄青霉素进行高灵敏检测的要求，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：发夹型的Hairpin中有目标物氨苄青霉素的适配体，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹型的Hairpin打开,释放出其3’端作为引物。然后该引物通过碱基互补配对作用结合在Replacement template的3’端，在phi29 DNA聚合酶的作用下，结合的两条链分别以对方作为模板进行延伸反应，在延伸的过程中，新产生的DNA链会将结合在适配体上的目标物氨苄青霉素竞争下来而进行重复利用，同时链的延伸反应也会产生Nb.BbvCI的识别和切割位点，在Nb.BbvCI的特异性切割和phi29 DNA聚合酶的链延伸作用下，产生链置换反应，因而就能够产生大量的单链DNA。产生的单链DNA又能够与Circular template的两端碱基互补配对，进而形成挂锁结构，然后在T4 DNA连接酶的作用下，使得Circular template成为完整的环状模板，然后在phi29 DNA聚合酶和dNTPs的辅助下，以链置换反应所产生的单链DNA为引物进行滚环扩增反应，从而产生一段长链DNA序列。此时产生的长链DNA又能够与发夹型的Molecular beacon完全互补配对，从而将发夹型的Molecular beacon打开，使其修饰的荧光基团和猝灭基团远离，从而在激发波(486nm)的作用下在518nm出获得强烈荧光信号。从而根据荧光信号的强度得到目标物氨苄青霉素的浓度。

在均相反应中，phi29 DNA聚合酶、Nb.BbvCI的反应条件为37℃，反应条件为37℃，T4DNA连接酶的反应温度是16℃，其中同时进型的目标物循环和链置换反应需要30min，T4DNA 连接酶催化的连接反应需要12h，同时进行滚环扩增和打开分子信标的反应需要30min。

该发明的检测方式是荧光检测，利用的是一台安捷伦荧光分析仪。所有分析检测过程中激发波、发射波的狭缝都为5nm，电压为950V，激发波为486nm，在发射光谱的518nm处获得发射波的强度，根据不同的荧光强度来确定目标物氨苄青霉素的浓度。

有益效果

1、通过利用了核酸适配体的特异性识别，使得核酸适配体能够高特异性地识别目标物氨苄青霉素，最终实现了对其的高特异性检测；

2、利用了三种信号放大技术极大地增强了荧光信号，从而提高了检测的灵敏度，实现对目标物氨苄青霉素的高灵敏检测；

3、该检测方法的检测反应过程均是在均相中进行的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了对目标物的快速，简单，灵敏的检测；

4、制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于对氨苄青霉素的产业化的实际应用；

5、该检测方法的检测成本低，符合产业化中价格价廉的要求。

附图说明

图1为该发明的原理图；

图2为实施例1 Hairpin浓度优化检测结果图；

图3为实施例2 Replacement template浓度优化检测结果图；

图4为实施例3 Circular template浓度优化检测结果图；

图5为实施例4 Molecular beacon浓度优化检测结果图；

图6为实施例5检测结果的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，下述说明仅是实例性的，不限定本发明的保护范围。

实施例1

a、将1μL不同浓度的Hairpin（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Replacement template（1μL， 10μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），dNTP（1μL），Nb.BbvCI （1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（氨苄青霉素）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中水浴30 min；

b、将反应好的溶液从水浴锅中取出，放入85℃的水浴锅中水浴加热10min，使体系中的酶失活，然后在EP管中加入Circular template（1μL，10×）、T4 DNA 连接酶（1μL，10×），在16℃条件下保温12 h；

c、 16℃保温处理以后，放入65℃的水浴锅中水浴15min，然后往EP管中加入Molecularbeacon（1μL，10×），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），在37度水浴锅中水浴30min。从水浴锅中取出混合溶液，用安捷伦荧光检测仪测定混合溶液的荧光强度。

具体检测原理图如图1，检测结果见图2，从图中可以看出，检测到的荧光强度随着Hairpin1的浓度在0.4-1.0μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，荧光强度值趋于稳定。所以Hairpin的最佳终浓度为1.0μM。

实施例2

a、将1μL不同浓度的Replacement template（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Hairpin（1μL， 10μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），dNTP（1μL），Nb.BbvCI （1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（氨苄青霉素）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中水浴30 min；

结果见图3，从图中可以看出，检测到的荧光强度随着Replacement template的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，荧光强度值趋于稳定。所以Replacement template的最佳终浓度为1.0μM。

实施例3

a、将Hairpin（1μL， 10μM），Replacement template（1μL ，10μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），dNTP（1μL），Nb.BbvCI （1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（氨苄青霉素）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中水浴30 min；

b、将反应好的溶液从水浴锅中取出，放入85℃的水浴锅中水浴加热10min，使体系中的酶失活，然后在EP管中加入1μL不同浓度的Circular template（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM）、T4 DNA 连接酶（1μL，10×），在16℃条件下保温12 h；

结果见图4，从图中可以看出，检测到的荧光强度随着Circular template的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，荧光强度值趋于稳定。所以Circular template的最佳终浓度为1.0μM。

实施例4

a、将Hairpin（1μL， 10μM），Replacement template（1μL ，10μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），dNTPs（1μL），Nb.BbvCI （1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待测物（氨苄青霉素）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中水浴30 min；

b、将反应好的溶液从水浴锅中取出，放入85℃的水浴锅中水浴加热10min，使体系中的酶失活，然后在EP管中加入Circular template（1μL ，10μM）、T4 DNA 连接酶（1μL，10×），在16℃条件下保温12 h；

c、 16℃保温处理以后，放入65℃的水浴锅中水浴15min，然后往EP管中加入1μL不同浓度的Molecular beacon（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），phi29DNA聚合酶（1μL，10×），在37度水浴锅中水浴30min。从水浴锅中取出混合溶液，用安捷伦荧光检测仪测定混合溶液的荧光强度。

结果见图5，从图中可以看出，检测到的荧光强度随着Molecular beacon的浓度在0.4-1.0 μM区间内增大而增大，当浓度超过1.0μM后，荧光强度值趋于稳定。所以Molecularbeacon的最佳终浓度为1.0μM。

实施例5

a、将Hairpin（1μL， 10μM），Replacement template（1μL ，10μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），dNTPs（1μL），Nb.BbvCI （1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和不同浓度的待测物（氨苄青霉素）加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中水浴30 min；

c、 16℃保温处理以后，放入65℃的水浴锅中水浴15min，然后往EP管中加入Molecularbeacon（1μL， 10μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），在37度水浴锅中水浴30min。从水浴锅中取出混合溶液，用安捷伦荧光检测仪分别测定混合溶液的荧光强度。

检测结果如图6所示，图中我们可以看到，当氨苄青霉素浓度在5 pM到50 nM时荧光强度不断增加，反应稳定进行，而当浓度在500nM时，荧光强度增加不明显，因此氨苄青霉素的浓度在5 pM 到 50 nM时，氨苄青霉素浓度的对数与荧光强度的大小成正比关系，拟合曲线：F=123.4*lgC-8.6566（F是荧光强度，C是氨苄青霉素的浓度）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>济南大学

<120>一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的方法

<160>2

<210>1

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(45)

<223>引物

<400>1

GCG GGC GGT TGT ATA GCG GTT TTT TTG GAT 30

CTT TTG TTC GCC CGC 45

<210>2

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(46)

<223>引物

<400>2

ACC GAA TAC AAA AGT AGT CTA TCC TCA GCG 30

CGG GCG 46

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>引物

<400> 3

AAG TAG TCT ATT GGT CGG ATC TGG AGG TTG 30

CAT GTG CTG AGG CGA ATT TAA CGA CCC ACA 60

CCG AAT ACA A 70

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400> 4

CAT GTG CTG AGG CGT TTC ACA TG 23

Claims

1.一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）将1μL， 10μM 的Hairpin，1μL ，10μM的 Replacement template，1μL，10×的phi29DNA聚合酶，1μL 的dNTPs，1μL，10×的Nb.BbvCI ， 5μL，10×的NEB buffer和待测物加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中水浴30 min；

b）将溶液从水浴锅中取出，放入85℃的水浴锅中水浴加热10min，使体系中的酶失活，然后在EP管中加入1μL ，10μM的 Circular template、1μL，10×的T4 DNA 连接酶，在16℃条件下保温12 h；

c) 16℃保温处理以后，放入65℃的水浴锅中水浴15min，然后往EP管中加入1μL， 10μM的Molecular beacon，1μL，10×的phi29 DNA聚合酶，在37度水浴锅中水浴30min；

d）从水浴锅中取出混合溶液，用荧光检测仪检测荧光强度；

所述Hairpin的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；

所述Replacement template的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

所述Circular template的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；

所述Molecular beacon的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。