CN112505320A

CN112505320A - 一种氨苄青霉素残留的检测方法及应用

Info

Publication number: CN112505320A
Application number: CN202011289134.1A
Authority: CN
Inventors: 张万方; 何勇; 马瑞; 张同雨; 王蕊; 康瑞丽; 朱子任; 郭晋汝; 张晨雨
Original assignee: Xinxiang University
Current assignee: Xinxiang University
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2021-03-16

Abstract

本发明公开了一种氨苄青霉素残留的检测方法，其利用氨苄青霉素与核酸适配体的特异性结合能使其脱离纳米金粒子表面的特性，并利用杂交链式解链(HCR)将信号放大，通过纳米金溶液吸收光谱的变化建立了一种氨苄青霉素残留的高灵敏检测方法。本发明氨苄青霉素适配体的HCR放大纳米金比色法具有操作简便、解链快速、高灵敏度等优点，可用于氨苄青霉素残留量的快速检测。

Description

一种氨苄青霉素残留的检测方法及应用

技术领域

本发明涉及氨苄青霉素残留检测技术领域，更具体的说是涉及一种氨苄青霉素残留的检测方法及应用。

背景技术

氨苄青霉素(AMP)作为一种广谱抗生素，是一种β-内酰胺类广谱抗生素，除了具有抗感染以外，还具有促进动物生长的作用，因此其在农业领域如畜禽以及水产养殖中也被广泛地应用，广泛应用于人类生活的方方面面，给人类带来极大经济效益的同时抗生素的大量滥用，导致动植物体内抗生素残留，并进一步通过富集效应给大自然和人类带来了威胁。氨苄青霉素残留会对人类产生很多不良影响，如过敏反应，呼吸不畅及癫痫病等。伴随着人们生活水平的提高，食品安全越来越受到人们的重视，抗生素残留问题也越来越受到人们的关注。

目前，氨苄青霉素的常用检测方法微生物检测法、免疫学检测法、色谱联用技术等，这些检测方法因具有操作复杂，成本高，反应体系要求严苛等缺点很难投入大规模的使用。此外，纳米金也称胶体金，是一种粒径1-100nm 的球形纳米材料。核酸适配体是近年来出现的一种检测方法，该方法具有性能稳定，操作简单，靶分子范围广等优点。纳米金具有独特的光学特性，小粒径金纳米粒子(10～100nm)水溶液一般呈酒红色，吸收峰一般在520nm附近，当纳米金由于外在的作用发生聚集时，其吸收峰将发生红移到620nm附近区域，其颜色也由酒红色变为蓝紫色。核酸适配体是一种寡核苷酸生物识别分子，它可以根据空间互补与所检测靶标高特异性结合。

因此，根据上述内容，如何提供一种纳米金核酸适配体HCR放大比色法检测氨苄青霉素残留的方法是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种氨苄青霉素残留的检测方法，本发明通过设计开发一种发夹DNA探针，以核酸适配体为引发链，通过适配体与氨苄青霉素的结合引发适配体与发夹DNA探针的互补效应，进一步引发级联交叉互补放大效应，最终实现高效检测氨苄青霉素的方法，该方法具有操作简单，反应快速，成本低等优点，有利于进行大规模的推广。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种氨苄青霉素残留的检测方法，首先设计氨苄青霉素核酸适配体序列及配套发夹DNA探针，并配置成HCR溶液，再利用HCR放大纳米金比色法，通过HCR溶液和纳米金溶液测定氨苄青霉素的残留量；

其中，所述氨苄青霉素核酸适配体序列为：

AMP-1：5’-CCGCCCGCTTAGTAGTTACGCTTACCTCTTGTTAGCGGG CGGTTGTATAGCGG-3’；SEQ ID NO.1；

发夹DNA探针的序列为：

H1：5’-CATCTCGGTTTGGCTTTCTTGTTACGGGCATTAGTAGTTACG CTTACC-3’；SEQ IDNO.2；

H2：5-TAACAAGAAAGCCAAACCGAGATGGGTAAGCGTAACTAGT AATGCCCG-3’；SEQ IDNO.3。

优选地，具体包括以下步骤：

S1、氨苄青霉素核酸适配体及配套发夹DNA探针的合成：设计所述氨苄青霉素核酸适配体序列为：AMP-1，配套发夹DNA探针的序列为：H1和H2，所有的核酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成；

S2、HCR溶液的配制：将步骤S1中的H1、H2和AMP-1核酸序列使用 ddH₂O分别配制成1μM的核酸工作液，分别在90-95℃解链1-20min，再在0.5-2h内缓慢降温至4-30℃，将处理后的AMP-1核酸适配体，与处理后的H1 和H2发夹型核酸探针混匀，即为HCR溶液，-80～-20℃保存备用；

S3、纳米金溶液的制备：取氯金酸配制成澄清透明状的0.01-0.1％氯金酸溶液，在搅拌下不断加热至沸腾，加入0.1-5％的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸搅拌，烧杯中溶液由浅灰色变蓝、变紫最终为酒红色，即为纳米金溶液，保持搅拌至溶液降至室温，分装置于4-30℃中存放，并使用透射电子显微镜对纳米金溶液的聚集状态进行表征；

S4、氨苄青霉素残留的检测：分别取所述纳米金溶液和所述HCR溶液，再加入不同浓度的氨苄青霉素，室温下孵育0-120min，再加入0.1-4M的NaCl 溶液，室温孵育后酶标仪检测吸光度并进行分析，得到线性方程；采用同样方法测试待测食品的的吸光度，代入线性方程，得到食品中氨苄青霉素残留量。

优选地，在步骤S2中，处理后的AMP-1核酸适配体、处理后的H1和 H2发夹型核酸探针的体积比为：(1)：(1-10)：(1-10)。

优选地，在步骤S3中，所述氯金酸溶液与所述柠檬酸三钠溶液的体积比为：(100-2000)：(1-5)。

优选地，在步骤S4中，所述纳米金溶液、所述HCR溶液和所述氯化钠溶液的体积比为：(1)：(1-10)：(1-10)(100-1000)：(10-100)：(100-1000)。

优选地，所述线性方程为y＝0.1636x+0.025，R²＝0.9953，氨苄青霉素的检测范围是0-1.2μmol/L。

优选地，所述HCR体积浓度为11.5％。

采用上述技术方案的技术效果：HCR溶液中的核酸分子能够完全保护住纳米金粒子不被盐离子聚集，具有最优的效果。

优选地，所述NaCl溶液的浓度为1mol/L。

采用上述技术方案的技术效果：在纳米金溶液中加入高浓度盐后，盐离子会破坏纳米金粒子的表面电荷平衡，而引起纳米金粒子的聚集吸光值由 520nm转移到620nm，在NaCl溶液的浓度为1mol/L时，纳米金粒子已经完全聚集，具有最优的效果。

优选地，所述孵育的温度为37℃，时间为30min。

采用上述技术方案的技术效果：在37℃孵育30min时盐离子聚集纳米金溶液效果最好。

本发明还提供所述氨苄青霉素残留的检测方法在动物源食品中检测氨苄青霉素残留的应用

本发明纳米金核酸适配体HCR放大比色法原理是：如图1所示，纳米金粒子为金属粒子其表面带有负电荷，颗粒之间的由于相互排斥力的存在使得纳米金粒子分散在溶液中并保持稳定的状态。当向体系中加入发夹探针时，探针的单链粘性末端与纳米金粒子表面通过静电作用而吸附在纳米金周围，当向体系中加入高浓度盐时，由于发夹探针的保护使得纳米金依旧分散存在而不聚集。当体系中有目标物氨苄青霉素(AMP)存在时，AMP与其适配体 AMP-1相互作用，使得AMP-1的发夹打开，AMP-1序列中有一部分与发夹探针H1的单链粘性末端互补，因而导致H1发夹打开，而H1的末端序列由于H2的单链末端序列互补，因此又导致H2的发夹双链打开，H2序列中设计有一段与H1粘性单链末端相互补的序列，因此H2反过来又会使得新的 H1链的打开。由此往后H1，H2两条链不断的循环杂交，可形成无限延伸的杂交双链DNA，实现信号的放大。由于双链DNA的双螺旋结果使得其因磷酸骨架的暴漏而表现出负电性，与纳米金表面的负电相互排斥，使得纳米金粒子失去保护，在高盐浓度发生聚集。本发明在此原理下，通过优化实验条件，以寻找最优的检测氨苄青霉素的方法。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开的一种动物源食品中氨苄青霉素残留的检测方法，具有如下有益效果：

(1)本发明通过设计开发一种发夹DNA探针，以核酸适配体为引发链，通过适配体与氨苄青霉素的结合引发适配体与发夹DNA探针的互补效应，进一步引发级联交叉互补放大效应，最终实现高效检测氨苄青霉素的方法，该方法具有操作简单，反应快速，成本低等优点，有利于进行大规模的推广。

(2)本发明设计合成了一条核酸适配体DNA发夹，和两条DNA发夹探针，利用发夹之间的序列互补杂交的方法实现信号的级联放大。研究表明该方法的灵敏度范围为0-1.4μmol/L，最低检测限可达到10nmol/L，并且特异性好对其他类型的抗生素没有非特异性反应，对鱼肉和猪肉的回收率为 92.3％-103.27％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为纳米金核酸适配体HCR放大比色法原理图。

图2附图为本发明实施例1中纳米金溶液的表征图。

其中，A为纳米金溶液吸收光谱，B为加入高浓度盐后溶液的吸收光谱， C为加入不同浓度的NaCl后纳米金溶液的颜色变化，D为纳米金溶液透射电子显微镜下的状态，E为加入高浓度盐后纳米金溶液在电子显微镜下的聚集状态。

图3为本发明实施例1中实验条件的优化图。

其中，A为NaCl浓度的优化，B为HCR溶液使用量的优化。

图4为本发明实施例1中氨苄青霉素检测体系的性能评价图。

其中，A为检测体系对氨苄青霉素的灵敏度评价，B为检测氨苄青霉素的标准曲线，C为检测体系的特异性评价。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，氨苄青霉素，购于美国Sigma公司，氯化钠、檬酸三钠、氯金酸(HAuCl₄)均是分析纯购于上海化学试剂公司。

实施例1

本实施例提供了一种动物源食品中氨苄青霉素残留的检测方法，具体包括以下步骤：

S1、氨苄青霉素核酸适配体及配套发夹DNA探针的合成

根据现有技术可知，氨苄青霉素的适配体序列为：

5’-GCGGGCGGTTGTATAGCG-3’；SEQ ID NO.4，

根据HCR放大技术的需要在此基础上重新设计氨苄青霉素适配体序列为：

发夹DNA探针的序列为：

H2：5’-TAACAAGAAAGCCAAACCGAGATGGGTAAGCGTAACTAGT AATGCCCG-3’；SEQ IDNO.3；

所有的核酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

S2、杂交链式解链(HCR)溶液的配制

合成的核酸序列，使用ddH₂O稀释成1μM的核酸工作液备用。将稀释后的H1、H2和AMP的核酸溶液分别取100μl于PCR管，95℃，10min，之后在1h内缓慢降温至25℃，取一个EP管加入处理后的适配体和发夹探针 100μL，混匀，即为HCR后的溶液，-20℃保存备用。

S3、纳米金溶液的制备

取氯金酸配制成澄清透明状的0.01％氯金酸溶液200mL。打开磁力搅拌器，加热不断搅动。当观察到烧杯中的液体沸腾时，加入5mL，1％的柠檬酸三钠溶液。继续煮沸搅拌，烧杯中溶液由浅灰色变蓝、变紫最终为酒红色，即为纳米金溶液。停止加热，保持搅拌至溶液降至室温，分装置于4℃中存放。

上述纳米金溶液的表征：使用透射电子显微镜对纳米金溶液的聚集状态进行表征。实验分为两组，(a)取4mL上述制备好的纳米金溶液；(b)取 3mL纳米金+1mL NaCl溶液(4M)，按照要求将两种溶液分别滴加到铜网表面，室温下晾晒自然干燥。利用JEM-1200EX透射电子显微镜拍摄样品，利用计算机上Nano Measurer软件，分析纳米金的粒径大小。

S4、基于HCR的纳米金检测的氨苄青霉素比色传感方法

向每个解链管中加入100μL纳米金溶液和优化后的的HCR溶液，向试验管中加入不同浓度的氨苄青霉素，室温下孵10min，最后向所有管中各加入 100μL NaCl，室温孵育后酶标仪检测吸光度并进行分析，得到线性方程；采用同样方法测试待测样品的的吸光度，代入线性方程，得到样品中氨苄青霉素残留量。

本发明为了得到纳米金的表征，还进行了一系列测试，具体包括以下内容：

分别将新制备的纳米金溶液添加到比色皿中，设置双蒸水为空白对照。设定计算机软件参数：扫描波长为400-800nm，扫描步长为5nm。结果显示，新制备的纳米金溶液呈酒红色，在520nm出出现最高吸收峰，之后随着波长的增加，吸光值逐渐降低(如图2A所示)。将3mL纳米金+1mL NaCl(1M， 2M，4M)溶液混匀，观察颜色变化，发现随着盐浓度的升高，溶液逐渐由酒红色变成蓝色(如图2C所示)。取加入4MNaCl的溶液检测吸光值，发现最高吸收峰转移到620nm处，并且只有一个吸收峰(如图2B所示)，因此推测此时纳米金溶液已经全部被盐集聚起来。将纳米金溶液和聚集后的溶液使用电子显微镜，检测颗粒的分散状态和粒径大小，结果显示，新制备的纳米金溶液成分散状态，粒径大小约为13nm(如图2D所示)，加入4M NaCl溶液后，纳米金粒子聚集到一起，成团状存在(如图2E所示)。

本发明为了得到最优的实验条件，还对实验条件进行优化，具体包括：

(1)NaCl浓度优化：分别向100μl纳米金溶液中加入不同浓度的NaCl 溶液，室温条件下孵育10min后用多功能酶标仪测定各个样品的吸光值，寻找最佳NaCL浓度，结果将表1所示。

在纳米金溶液中加入高浓度盐后，盐离子会破坏纳米金粒子的表面电荷平衡，而引起纳米金粒子的聚集吸光值由520nm转移到620nm，因此向纳米金溶液中加入浓度梯度的NaCl溶液后，结果显示随着NaCl浓度的升高，吸光值A620/520的比值逐渐升高，当NaCl溶液的浓度为1mol/L时达到峰值，说明此时纳米金粒子已经完全聚集，因此确定NaCl溶液的最佳浓度为1mol/L (如图3A所示)。

表1 NaCl浓度优化数据表

(2)解链时间的优化：将纳米金溶液与HCR溶液混合后，将孵育时间设置为变量。以加入样品组与空白组差值最大的温度作为最优解链温度。

经过一系列温度梯度和不同反应时间的优化实验发现HCR溶液与纳米金在37℃孵育30min时盐离子聚集纳米金溶液效果最好因此选用条件为最佳反应条件。

(3)HCR溶液使用量的优化：取灭菌后的离心管，加入100μl纳米金溶液再分别加入不同体积的HCR溶液。随后，向管中加入100μl，1M的NaCl 溶液。室温孵育后酶标仪检测分析，具体包括以下内容：

加入100μl纳米金溶液再分别加入不同体积的HCR溶液，37℃孵育 30min ，然后向管中加入100μl，1M的NaCl溶液，使用酶标仪检测分析520nm和 620nm处的吸光值，数据见表2所示。结果显示当加入的HCR溶液为30μl 时反应达到平衡状态(如图3B所示)，说明此时HCR溶液中的核酸分子能够完全保护住纳米金粒子不被盐离子聚集，因此选取30μl HCR溶液即HCR 溶液的终浓度为11.5％(v/v)为最佳浓度。

表2 HCR溶液使用量的优化数据表

本发明还对氨苄青霉素检测体系进行了性能评价，具体包括以下内容：

(1)体系灵敏度评价

为了寻找HCR放大法检测灵敏度，向优化后的检测体系中加入浓度范围为0～2μmol/L梯度稀释的氨苄青霉素，具体浓度为0μmol/L，0.05μmol/L， 0.1μmol/L，0.2μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8μmol/L，1μmol/L， 1.2μmol/L，1.4μmol/L，1.6μmol/L，1.8μmol/L，2μmol/L。结果见表但所示，可知随着氨苄青霉素浓度的升高，体系吸光度比值逐渐升高，拟合方程为：y＝-0.0087x²+0.261x-0.1307，R²＝0.9924(如图4A所示)。其中当氨苄青霉素浓度在0-1.2μmol/L范围内呈现线性关系，线性方程为y＝0.1636x+0.025， R²＝0.9953(如图4B所示)，最低检测限可达到10nmol/L，以上结果表明，该方法有较高的灵敏度。

表3 HCR放大法检测灵敏度的数据表

(2)体系特异性评价

为了验证该检测体系的特异性，选取了庆大霉素，四环素，卡那霉素，新链霉素等抗生素与氨苄青霉素进行特异性分析，各种抗生素均添加的终浓度为1μmol/L，检测结果取显示，当更换为其他抗生素时，反应液的A620 的吸光值非常低，而氨苄青霉素的吸光值比值显著高于其他抗生素(如图4C 所示)，表明该检测体系只对氨苄青霉素具有特异性反应。

本发明还进行了实际样品的检测，具体包括以下内容：

为了对检测方法的实际应用能力进行检验，选取鱼肉和猪肉两种样品，采用加标回收法进行验证。使用乙腈提取，经C18柱萃取后加入不同浓度的氨苄青霉素标准品，然后用建立的实验方法进行检测。结果如表1所示，可知氨苄青霉素的回收率在92.3％-103.27％，该实验结果表明纳米金核酸适配体 HCR放大比色法具有良好的检测性能。

表4动物性食品中氨苄青霉素检测结果表

综上，本发明采用纳米金核酸适配体杂交链式反应比色法进行氨苄青霉素的检测，该方法具有操作简单，反应快速，成本低等优点，有利于进行大规模的推广。本发明设计合成了一条核酸适配体DNA发夹，和两条DNA发夹探针，利用发夹之间的序列互补杂交的方法实现信号的级联放大。研究表明该方法的灵敏度范围为0-1.4μmol/L，最低检测限可达到10nmol/L，并且特异性好对其他类型的抗生素没有非特异性反应，对鱼肉和猪肉的回收率为 92.3％-103.27％。该方法操作便捷，特异性好，灵敏度高，是检测氨苄青霉素残留的新方法。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 新乡学院

<120> 一种氨苄青霉素残留的检测方法及应用

<140> 2020112891341

<141> 2020-11-17

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccgcccgctt agtagttacg cttacctctt gttagcgggc ggttgtatag cgg 53

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

catctcggtt tggctttctt gttacgggca ttagtagtta cgcttacc 48

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

taacaagaaa gccaaaccga gatgggtaag cgtaactagt aatgcccg 48

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gcgggcggtt gtatagcg 18

Claims

1.一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，首先设计氨苄青霉素核酸适配体序列及配套发夹DNA探针，并配置成HCR溶液，再利用HCR放大纳米金比色法，通过HCR溶液和纳米金溶液测定氨苄青霉素的残留量；

其中，所述氨苄青霉素核酸适配体序列为：

AMP-1：5’-CCGCCCGCTTAGTAGTTACGCTTACCTCTTGTTAGCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’；SEQ IDNO.1；

发夹DNA探针的序列为：

H1：5’-CATCTCGGTTTGGCTTTCTTGTTACGGGCATTAGTAGTTACGCTTACC-3’；SEQ ID NO.2；

H2：5’-TAACAAGAAAGCCAAACCGAGATGGGTAAGCGTAACTAGTAATGCCCG-3’；SEQ ID NO.3。

2.根据权利要求1所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S2、HCR溶液的配制：将步骤S1中的H1、H2和AMP-1核酸序列使用ddH₂O分别配制成1μM的核酸工作液，分别在90-95℃解链1-20min，再在0.5-2h内缓慢降温至4-30℃，将处理后的AMP-1核酸适配体，与处理后的H1和H2发夹型核酸探针混匀，即为HCR溶液，-80～-20℃保存备用；

S3、纳米金溶液的制备：取氯金酸配制成澄清透明状的0.01-0.1％氯金酸溶液，在搅拌下不断加热至沸腾，加入0.1-5％的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸搅拌，烧杯中溶液由浅灰色变蓝、变紫最终为酒红色，即为纳米金溶液，保持搅拌至溶液降至室温，分装，置于4-30℃中存放，并使用透射电子显微镜对纳米金溶液的聚集状态进行表征；

S4、氨苄青霉素残留的检测：分别取所述纳米金溶液和所述HCR溶液，再加入不同浓度的氨苄青霉素，室温下孵育0-120min，再加入0.1-4M的NaCl溶液，室温孵育后酶标仪检测吸光度并进行分析，得到线性方程；采用同样方法测试待测食品的吸光度，代入线性方程，得到食品中氨苄青霉素残留量。

3.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，处理后的AMP-1核酸适配体、处理后的H1和H2发夹型核酸探针的体积比为：(1)：(1-10)：(1-10)。

4.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，所述氯金酸溶液与所述柠檬酸三钠溶液的体积比为：(100-2000)：(1-5)。

5.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S4中，所述纳米金溶液、所述HCR溶液和所述氯化钠溶液的体积比为：(1)：(1-10)：(1-10)。

6.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，在步骤S4中，所述线性方程为y＝0.1636x+0.025，R²＝0.9953，氨苄青霉素的检测范围是0-1.2μmol/L。

7.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，所述HCR体积浓度为11.5％。

8.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，所述NaCl溶液的浓度为1mol/L。

9.根据权利要求2所述的一种氨苄青霉素残留的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃，时间为30min。

10.一种权利要求1-9任一项所述的氨苄青霉素残留的检测方法在动物源食品中检测氨苄青霉素残留的应用。