CN113281315B - 基于发夹结构dna为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法，是将发夹结构DNA为模板的铜纳米簇作为荧光探针，利用核酸适配体的识别作用，免标记、快速、高灵敏度、高特异性定量检测复杂体系中链霉素含量。具体来说，以核酸适配体作为识别因子，以聚AT‑TA双链DNA模板合成的铜纳米簇作为荧光探针，通过荧光强度变化特异性检测溶液中链霉素含量。该方法简单、快速，检测线性范围宽，检出限低，具有较好的检测灵敏度和特异性，在食品、药品、化妆品、环境等方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种链霉素检测方法，具体涉及一种基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法。属于生物检测技术领域。
背景技术
链霉素是最基本的一种氨基糖苷类抗生素，是由灰色链霉菌产生的一种抗菌有机碱，在人类、兽医和农业中都有广泛的应用。在农业上，它用于控制某些水果、蔬菜、种子、大田作物、观赏作物的细菌和真菌病害，在观赏池塘和水族馆中用于控制藻类。其不合理使用会导致其残留于动物体内，并通过食物链富集进入人体从而造成不良影响。由于链霉素及其衍生物有肾毒性和耳前庭毒性，也有研究表明链霉素还具有潜在的致畸作用。食品中的链霉素残留已引起各国高度重视。我国GB 3150-2009《食品中兽药最大残留量》中规定，牛奶中链霉素最大残留限量为200μg/kg，畜禽肌肉、脂肪、肝脏中为600μg/kg，肾脏中为1000μg/kg。欧盟规定，乳品中链霉素最大残留限量为200μg/kg，肌肉、脂肪、肝脏中为500μg/kg，肾脏中为1000μg/kg。
目前，链霉素的常用测定方法包括液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、免疫分析法、分光光度法、微生物法等。虽然上述测定方法具有较高的准确度和灵敏度，但也存在着一些局限性，如仪器昂贵、测定时间长、样品制备过程复杂、需要专业的操作人员等。因此，需要建立一种简单、经济、快速、便携的测定链霉素的方法。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法，采用铜纳米簇作为荧光探针，运用核酸适配体的识别作用，实现对溶液中链霉素含量进行免标记、快速定量检测。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针的制备方法，先将DNA冻干粉利用MOPS缓冲液溶解制成DNA溶液；然后将DNA溶液与第一部分磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合得到混合液，90℃保温10分钟，自然冷却至室温(25℃)，得到发夹结构DNA；接着将发夹结构DNA与第二部分磷酸缓冲盐溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液混匀，室温避光反应3分钟，得到荧光铜纳米簇溶液，即为所述的荧光探针。
优选的，DNA的序列如下：
5’-ATATATATATATGGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCATATATATATAT-3’，如SEQ ID NO.1所示。
优选的，MOPS缓冲液包含：3-吗啉丙磺酸20mmol/L，氯化钠300mmol/L，pH＝7.5。
优选的，DNA溶液、第一部分磷酸缓冲盐溶液、第二部分磷酸缓冲盐溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液的体积比为5：40：35：10：10，其中，DNA溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液的浓度依次为10μmol/L、2mmol/L、10mmol/L。
进一步优选的，所述的第一部分磷酸缓冲盐溶液、第二部分磷酸缓冲盐溶液的组成相同，配方如下：磷酸二氢钾0.24g/L，磷酸氢二钠1.44g/L，氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L，pH＝7.4。
2、利用上述制备方法得到的基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针。
3、上述铜纳米簇荧光探针在链霉素定量检测中的应用。
4、基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法，具体步骤如下：先向盛有前述铜纳米簇荧光探针的离心管中加入链霉素溶液，混合孵育，并利用荧光分光光度计测定链霉素溶液加入前后的荧光强度，进而根据线性回归方程计算溶液中链霉素的含量。
优选的，孵育条件为：室温条件下避光孵育10分钟。
优选的，链霉素浓度在0～20mg/L的范围内，铜纳米簇的荧光强度降低值与链霉素的浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝-10.31x+240.17，其中，x为链霉素浓度，y为荧光强度降低值，线性回归系数R2为0.9954，检出限为4.36μg/L。
本发明的技术关键在于核酸适配体的筛选，申请人进行了以下研究：
第一，在核酸适配体的序列两端增加能够形成茎环结构的茎部分序列，通过软件来筛选能够形成单一的茎环结构的序列；增加的茎部分也是形成铜纳米簇的关键序列。
第二，将筛选的序列进行实验，通过荧光值来判断哪个更合适。荧光值高的，在加入目标物后荧光降低，对比会更明显；如果茎环结构形成的铜纳米簇本身荧光值就不太高，加入目标物荧光降低，对比就不太明显。
由于要形成茎环结构，对序列有一定要求，不能在序列内部形成发夹结构。基于DNA双链制备铜纳米簇，对DNA双链的序列有一定要求，不是任何一个DNA双链都可以制备铜纳米簇。本申请采用简单AT重复序列，重复个数与制备的铜纳米簇的荧光值有一定关系，且不易与核酸适配体序列互补，降低了非特异性发夹结构形成的概率。
具体筛选过程如下：
链霉素(Streptomycin)Aptamer:40bp：
(SPC Aptamer)：
5’-CCCGTTTAAA GTAGTTGAGA GTATTCCGTT TCTTTGTGTC-3’，如SEQ ID NO.2所示。
一、合适的茎环结构DNA的筛选
根据文献参考，由AT-TA、AAT-TTA序列组成的DNA双链可以作为荧光铜纳米簇形成的良好模板，同时结合适配体与靶标之间的特异结合作用以及茎环结构DNA的特性，申请人设计了以下序列：
1、SPC-1：5’-AAT AAT AAT ATACCCGTTTAAA GTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCTAT ATT ATT ATT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
DNA结构分析软件mold version 3.5中结果见图5。
2、SPC-2：5’-ATATATATATATCCCGTTTAAA GTAGTTGAGA GTATTCCGTTTCTTTGTGTCATATATATATAT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
DNA结构分析软件mold version 3.5中结果见图6。
3、SPC-3：5’-AAT AAT AAT ATAGGCCCGTTTAAA GTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCTAT ATT ATT ATT-3’，如SEQ ID NO.5所示；
DNA结构分析软件mold version 3.5中结果见图7。
4、SPC-4：5’-ATATATATATATGGCCCGTTTAAA GTAGTTGAGA GTATTCCGTTTCTTTGTGTCATATATATATAT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
DNA结构分析软件mold version 3.5中结果见图8。
结论：根据以上DNA结构分析结果，序列SPC-3和SPC-4均能形成单一的茎环结构，符合实验设计需求，因此先选择这两条序列进行实验。
二、通过实验对软件分析结果较好的SPC-3和SPC-4的筛选：
1.0μM浓度的SPC-3序列和SPC-4序列与200μM CuSO4、1mM抗坏血酸混合反应3min，加入SPC-3序列检测到的荧光强度明显低于SPC-4序列，SPC-4序列形成荧光铜纳米簇能力更强，因此选择SPC-4序列更有利于目标物的检测(图9中可以看出SPC-3的空白响应比值为2.03，SPC-4的空白响应比值为210.21)。
本发明的有益效果：
本发明将发夹结构DNA为模板的铜纳米簇作为荧光探针，利用核酸适配体的识别作用，免标记、快速、高灵敏度、高特异性定量检测复杂体系中链霉素含量。具体来说，以核酸适配体作为识别因子，以聚AT-TA双链DNA模板合成的铜纳米簇作为荧光探针，通过荧光强度变化特异性检测溶液中链霉素含量。该方法简单、快速，检测线性范围宽，检出限低，具有较好的检测灵敏度和特异性，在食品、药品、化妆品、环境等方面具有很好的应用前景。具体如下：
(1)合成的铜纳米簇具有稳定的光学性质，合成方法简单、快速，成本低，合成材料荧光性能好。
(2)利用合成的具有独特光学性能的铜纳米簇作为荧光探针，采用核酸适配体作为识别因子，高特异性传感检测链霉素的含量，操作简单、快速，可以直接实现对链霉素的特异性检测。
铜纳米簇作为一种新型的功能性纳米颗粒，由于其合成简单、光稳定性好以及在水溶液中具有良好的分散性，使其作为荧光探针在生物传感领域具有广阔的应用前景。本发明采用铜纳米簇作为荧光探针，运用核酸适配体的识别作用，实现对溶液中链霉素含量进行免标记、快速定量检测。
荧光金属纳米分析方法具有操作简单、速度快、灵敏度高、选择性好等优点，已经引起了研究人员的广泛研究兴趣。
(3)利用铜纳米簇体系中加入链霉素后，铜纳米簇的荧光强度下降，该方法可以实现对链霉素的定量检测，检测线性范围宽，检出限低。
(4)本发明可以方便地对食品、药品、化妆品、环境样品中的链霉素含量进行检测。
附图说明
图1：以发夹结构DNA为模板合成的铜纳米簇的荧光激发光谱和发射光谱图，表明最大激发波长为340nm，最大发射波长为590nm。
图2：荧光铜纳米簇荧光光谱图；其中，1.hp-DNA+Cu2++抗坏血酸；2.hp-DNA+Cu2++抗坏血酸+链霉素。
图3：铜纳米簇检测溶液中的链霉素的线性图，线性范围0～20mg/L，检出限为4.36μg/L；其中，A为不同浓度链霉素的发射光谱图，链霉素的浓度分别为：0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0和40.0mg/L；B为590nm处荧光强度与链霉素浓度的校正曲线图。
图4：铜纳米簇检测溶液中的链霉素的特异性分析实验结果图；
图5：SPC-1的DNA结构分析软件mold version 3.5结果图；
图6：SPC-2的DNA结构分析软件mold version 3.5结果图；
图7：SPC-3的DNA结构分析软件mold version 3.5结果图；
图8：SPC-4的DNA结构分析软件mold version 3.5结果图；
图9：序列筛选荧光光谱图，其中，1.SPC-4+Cu2++抗坏血酸；2.SPC-4+Cu2++抗坏血酸+链霉素；3.SPC-3+Cu2++抗坏血酸；4.SPC-3+Cu2++抗坏血酸+链霉素。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明所用试剂均为分析纯，所用试剂及生产厂家如下：抗坏血酸、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)，长沙市裕丰化玻器械有限公司；链霉素、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、甘氨酸、四环素、氨苄青霉素、土霉素、卡那霉素、精氨酸、半胱氨酸以及DNA序列，上海生工生物工程股份有限公司，其中DNA序列为5’-ATATATATATATGGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCATATATATATAT-3’，如SEQ ID NO.1所示。
实施例1
以发夹结构DNA为模板合成的铜纳米簇的制备按照如下步骤进行：
(1)磷酸缓冲盐溶液(PBS)的配制：称取0.24g磷酸二氢钾，1.44g磷酸氢二钠，8g氯化钠，0.2g氯化钾，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
(2)2mmol/L CuSO4溶液的配制：称取0.049g CuSO4·7H2O于超纯水中溶解，定容至100mL。
(3)10μmol/L DNA溶液的制备：将DNA冻干粉用MOPS(20mmol/L MOPS,300mmol/L氯化钠，PH＝7.5)缓冲液溶解成100μmol/L的DNA母液，然后吸取20μL DNA母液与90μL MOPS缓冲液混合制备成10μmol/L DNA待用。
(4)铜纳米簇的制备：将5μL DNA溶液与40μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合，再将混合液置于90℃水浴锅中水浴10min后自然冷却，使DNA形成发夹结构。室温条件下将45μL合成的发夹结构DNA、35μL PBS溶液、10μL CuSO4、10μL抗坏血酸(10mM)混匀避光条件下反应3min，得到荧光铜纳米簇溶液。在荧光分光光度计上进行荧光激发光谱和发射光谱扫描(图1)，表明最大激发波长为340nm，最大发射波长为590nm。
实施例2
1、以发夹结构DNA为模板合成的铜纳米簇的制备参照实施例1；
2、以铜纳米簇作为荧光探针检测溶液中的链霉素的可行性分析，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)链霉素母液配置：称取0.05g链霉素溶于100mL超纯水中，配制成500mg/L的母液，低温保存待用；
(2)取100μL荧光铜纳米簇溶液利用荧光分光光度计测定其荧光强度，在激发波长为340nm的激发下进行发射光谱扫描，该探针在590nm处表现出较强发射。
(3)向离心管中加入90μL荧光铜纳米簇溶液与10μL 20mg/L的链霉素溶液，混合均匀后，在室温条件下避光孵育10min，利用荧光分光光度计测定其荧光强度，此时的荧光强度明显降低，可以利用荧光发射光谱强度的降低值证明铜纳米簇作为荧光探针检测链霉素的可行性(图2)。
实施例3
1、以发夹结构DNA为模板合成的铜纳米簇的制备参照实施例1；
2、以铜纳米簇作为荧光探针检测溶液中的链霉素的含量分析，其特征在于按照如下步骤进行：
向离心管中加入90μL荧光铜纳米簇溶液与10μL不同浓度的链霉素溶液，混合均匀后，在室温条件下避光孵育10min，分别用荧光分光光度计测定其荧光强度。实验结果表明(图3，其中，A为不同浓度链霉素的发射光谱图，B为590nm处荧光强度与链霉素浓度的校正曲线图)，在链霉素浓度为0～20mg/L的线性范围内，铜纳米簇的荧光强度降低值与链霉素的浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝-10.31x+240.17，线性回归系数R2为0.9954，检出限为4.36μg/L。
实施例4
1、以发夹结构DNA为模板合成的铜纳米簇的制备参照实施例1；
2、链霉素溶液的配置参照实施例2；
3、以铜纳米簇作为荧光探针检测溶液中的链霉素的特异性分析，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)四环素、氨苄青霉素、土霉素、卡那霉素、甘氨酸、精氨酸、半胱氨酸、钾离子、钠离子、镁离子溶液配制：称取0.05g目标物溶于50mL超纯水中，配制成浓度为1000mg/L的溶液。
(2)向离心管中加入90μL荧光铜纳米簇溶液与10μL用于特异性分析的链霉素、四环素等溶液，混合均匀后，在室温条件下避光孵育10min，利用荧光分光光度计测定其荧光强度，此时加入链霉素的荧光强度明显降低，加入其他化合物的荧光强度与空白对照相比没有明显变化，证明铜纳米簇作为荧光探针检测链霉素的特异性很好(图4)。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 长沙市食品药品检验所
<120> 基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法
<130> 2021
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atatatatat atggcccgtt taaagtagtt gagagtattc cgtttctttg tgtcatatat 60
atatat 66
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cccgtttaaa gtagttgaga gtattccgtt tctttgtgtc 40
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aataataata tacccgttta aagtagttga gagtattccg tttctttgtg tctatattat 60
tatt 64
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atatatatat atcccgttta aagtagttga gagtattccg tttctttgtg tcatatatat 60
atat 64
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aataataata taggcccgtt taaagtagtt gagagtattc cgtttctttg tgtctatatt 60
attatt 66
Claims (6)
1.基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针的制备方法，其特征在于，先将DNA冻干粉利用MOPS缓冲液溶解制成DNA溶液；然后将DNA溶液与第一部分磷酸缓冲盐溶液混合得到混合液，90℃保温10分钟，自然冷却至室温，得到发夹结构DNA；接着将发夹结构DNA与第二部分磷酸缓冲盐溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液混匀室温避光反应3分钟，得到荧光铜纳米簇溶液，即为所述的荧光探针；
DNA的序列如下： 5’-ATATATATATATGGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCATATATATATAT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
MOPS缓冲液包含：3-吗啉丙磺酸20 mmol/L，氯化钠300mmol/L，pH=7.5；
DNA溶液、第一部分磷酸缓冲盐溶液、第二部分磷酸缓冲盐溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液的体积比为5：40：35：10：10，其中，DNA溶液、硫酸铜溶液、抗坏血酸溶液的浓度依次为10 μmol/L、2 mmol/L、10mmol/L。
2.利用权利要求1所述制备方法得到的基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针。
3.权利要求2所述铜纳米簇荧光探针在链霉素定量检测中的应用。
4.基于发夹结构DNA为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法，具体步骤如下：先向盛有权利要求2所述纳米簇荧光探针的离心管中加入链霉素溶液，混合孵育，并利用荧光分光光度计测定链霉素溶液加入前后的荧光强度，进而确定溶液中链霉素的含量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，孵育条件为：室温条件下避光孵育10分钟。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，链霉素浓度在0～20 mg/L的范围内，铜纳米簇的荧光强度降低值与链霉素的浓度呈线性关系，线性回归方程为y=-10.31x+240.17，线性回归系数R2为0.9954，检出限为4.36 μg/L。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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