CN105087765A - 聚胸腺嘧啶模板、基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、atp的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚胸腺嘧啶模板、一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、以及一种ATP的检测方法。本发明提供的聚胸腺嘧啶模板为单链DNA序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列为(T)n，其中，所述n的取值范围为15～40之间的自然数。本发明提供的聚胸腺嘧啶模板能用于制备荧光铜纳米簇，且制备成本低、操作简便。本发明提供的ATP的检测方法成本低，而且检测步骤简单易行，现象明显，易于观察，能快速、高灵敏检测样品中ATP的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料以及分子检测领域，具体涉及一种聚胸腺嘧啶模板、一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、和一种ATP的检测方法。
背景技术
ATP对许多酶的活性有着重要影响，其增加或减少都会引起各种疾病，如低氧、低血糖、帕金森症以及恶性肿瘤等。因此，ATP的简单快速检测对相关疾病的治疗是至关重要的。目前检测ATP的方法主要是采用荧光素和荧光素酶检测。虽然其检测精度高，但成本高昂，而且步骤相对复杂，不适合快速检测。
因此，有必要提供一种成本低，而且简单易行，能快速、高灵敏检测ATP的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种聚胸腺嘧啶模板及其应用。本发明还提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法和应用。本发明还提供了一种ATP的检测方法。
本发明提供的聚胸腺嘧啶模板能用于制备荧光铜纳米簇；且制备成本低、操作简便。本发明提供的ATP的检测方法在生物医学研究和疾病早期诊断方面具有广阔的应用价值，不仅成本低，而且检测步骤简单易行，现象明显，易于观察，能快速、高灵敏检测样品中ATP的浓度。
本发明所述“ATP”是指三磷酸腺苷。
本发明所述“DNA”是指脱氧核糖核苷酸。
本发明所述的“A”、“T”、“C”、“G”、“U”分别为腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶。
本发明所述的“(Y)n”表示n个Y序列，Y为腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)。
第一方面，本发明提供了一种聚胸腺嘧啶模板，所述聚胸腺嘧啶模板为单链DNA序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列为(T)n，其中，所述n的取值范围为15～40之间的自然数。
具体地，本发明所述的“(T)n”表示n个T序列。
具体地，当n为25时，所述聚胸腺嘧啶序列为(T)25，所述(T)25的序列如SEQIDNO:1所示。
优选地，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚胞嘧啶序列。
进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列为“(C)m”，所述m的取值范围为5～20之间的自然数。
具体地，当n为10时，所述聚胞嘧啶序列为(C)n为(C)10，所述(C)10的序列如SEQIDNO:2所示。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚胸腺嘧啶序列依次间隔排列，且所述聚胞嘧啶序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1～3次。
具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列如SEQIDNO:3所示。
具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为2次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列如SEQIDNO:4所示。
优选地，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚鸟嘌呤序列。
进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列为“(G)q”，所述q的取值范围为5～20之间的自然数。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚鸟嘌呤序列依次间隔排列，且所述聚鸟嘌呤序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列的重复次数为1～3次。
优选地，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个10～20个碱基长度的随机序列。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述随机序列依次间隔排列，且所述随机序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述随机序列的重复次数为1～3次。
在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示。
优选地，所述聚胸腺嘧啶模板的5’端连接有生物素标记或链霉亲和素标记。
在此在此优选条件下，所述生物素标记或链霉亲和素标记通过行业内常规操作修饰在聚胸腺嘧啶模板的5’端。
在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为T25-biotin，其中，所述T25的序列如SEQIDNO:1所示。
具体的，所述T25-biotin表示在SEQIDNO:1所示序列的5’端标记生物素标签。
本发明提供的标记有生物素或链霉亲和素的聚胸腺嘧啶模板不仅可以用于制备荧光铜纳米簇，还可以用于纯化、富集、观察所制备的荧光铜纳米簇，方便所制备的荧光铜纳米簇的应用，在制备ATP检测试剂盒中具有较大的应用价值。
本发明提供的聚胸腺嘧啶模板选用15～40bp的寡聚胸腺嘧啶DNA单链序列作为制备荧光铜纳米簇的模板，制得的铜纳米颗粒与DNA单链结合紧密，荧光稳定性较双链更高，能在1小时之内保持稳定的荧光发光；其次，所制备的荧光铜纳米簇即使在无荧光仪精确定量的情况下也可在紫外灯下看出明显的现象，使得医疗、实验等检测工作更加简便、适用性更高；此外，寡聚胸腺嘧啶DNA单链成本相对于双链更加低廉，采用本发明提供的聚胸腺嘧啶模板制备ATP检测试剂盒能降低生产成本。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的聚胸腺嘧啶模板在制备荧光铜纳米簇、检测ATP或制备检测ATP的试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
1)提供聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液，其中，所述聚胸腺嘧啶模板为单链DNA序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列为(T)n，其中，所述n的取值范围为15～40之间的自然数；
2)将步骤(1)所述聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液加入到缓冲溶液中，轻微混匀并反应，得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，其中，所述聚胸腺嘧啶模板和Cu2+的摩尔比为1：100～1：500。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚胞嘧啶序列。
进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列为“(C)m”，所述m的取值范围为5～20之间的自然数。
具体地，当n为10时，所述聚胞嘧啶序列为(C)n为(C)10，所述(C)10的序列如SEQIDNO:2所示。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚胸腺嘧啶序列依次间隔排列，且所述聚胞嘧啶序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1～3次。
具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列如SEQIDNO:3所示。
具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为2次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列如SEQIDNO:4所示。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚鸟嘌呤序列。
进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列为“(G)q”，所述q的取值范围为5～20之间的自然数。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚鸟嘌呤序列依次间隔排列，且所述聚鸟嘌呤序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列的重复次数为1～3次。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个10～20个碱基长度的随机序列。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述随机序列依次间隔排列，且所述随机序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述随机序列的重复次数为1～3次。
在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板的5’端连接有生物素标记或链霉亲和素标记。
在此在此优选条件下，所述生物素标记或链霉亲和素标记通过行业内常规操作修饰在聚胸腺嘧啶模板的5’端。
在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为T25-biotin，其中，所述T25的序列如SEQIDNO:1所示。
具体的，所述T25-biotin表示在SEQIDNO:1所示序列的5’端标记生物素标签。
优选地，所述步骤(2)中，所述含Cu2+的溶液为CuSO4或Cu(NO3)2溶液。
进一步优选地，所述步骤(2)中，所述聚胸腺嘧啶模板和Cu2+的摩尔比为1：200～1:300。
优选地，所述步骤(2)中，所述Cu2+的终浓度为50uM～250uM。
进一步优选地，所述步骤(2)中，所述Cu2+的终浓度为100uM～150uM。
本发明采用的聚胸腺嘧啶模板和Cu2+的摩尔比为1：100～1：500，优选为1：200～1:300；本发明采用的聚胸腺嘧啶模板和Cu2+的摩尔比有利于制备荧光强度高的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，改变聚胸腺嘧啶模板或Cu2+的含量会导致荧光的降低。
优选地，所述还原剂为抗坏血酸或羟胺。
本发明采用的还原剂能将Cu2+离子还原为Cu+离子，进而还原为铜原子(Cu0)，所得到的铜原子依赖本发明提供的聚胸腺嘧啶模板形成荧光铜纳米簇。
本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇为包括Cu纳米颗粒与聚胸腺嘧啶的复合物。
相比硼氢化钠、苯酚、柠檬酸钠，本发明采用的抗坏血酸或羟胺，具有较弱的还原性，在保持还原能力的同时也不会破换DNA的结构。
优选地，所述缓冲溶液的缓冲pH范围为7.2～11。
进一步优选地，所述缓冲溶液为MOPS缓冲液，所述MOPS缓冲液为领域内常规配置方法配置。
进一步优选地，所述缓冲溶液为HEPES缓冲液，所述HEPES缓冲液为领域内常规配置方法配置。
优选地，所述反应的时间为5～20min。
优选地，所述反应的温度为室温。
优选地，所述室温优选为0～55℃。
进一步优选地，所述室温优选为25～55℃。
优选地，所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的大小为10～20nm。
本发明提供的反应时间为5～20min，在此反应时间下，能使得铜离子充分还原并在聚胸腺嘧啶模板上生长，形成大小为10～20nm铜纳米簇，所述大小为10～20nm铜纳米簇具有荧光效应，若反应时间太少，则Cu2+离子还原不充分，不能得到足够的Cu0，制备的荧光铜纳米簇会减少。若反应时间太长，铜纳米簇生长过大，得不到有效的具有荧光效应的铜纳米簇。采用本发明制备方法制备的荧光铜纳米簇在一个小时以内的荧光强度基本保持不变。
第四方面，本发明提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇为采用第二方面所述的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法所制得的复合物。
第五方面，本发明提供了一种如第四方面所述的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇在检测ATP或制备检测ATP的试剂盒中的应用。
第六方面，本发明提供了一种基于荧光铜纳米簇的ATP检测方法，包括如下步骤：
提供基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，及
加入待测样品，混匀，室温下反应，并在混匀后5～80分钟之内进行荧光检测。
优选地，所采用的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇为含有基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的溶液，所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的浓度为50～500uM。
优选地，所述待测样品为含有ATP的溶液，所述待测样品中ATP的浓度范围在0～100mM之间。
优选地，在将待测样品加入所述含有基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的溶液后的5～60分钟之内进行荧光检测。
优选地，所述含有基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的溶液与所述待测样品的体积比为3～19:1。
进一步优选地，所述待测样品的体积比为10μL～50μL。
进一步优选地，所述含有基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的溶液与所述待测样品的体积比为150μL：50μL、190μL：10μL或180μL：20μL。
本发明采用的ATP检测方法反应非常灵敏、快速，将待测样品加入所述含有基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇溶液中后，5分钟左右即可进行荧光检测，并且80分钟以内可以稳定保持检测结果的精确度和灵敏性。
优选地，所述提供基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的步骤包括：
1)提供聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液，其中，所述聚胸腺嘧啶模板为单链DNA序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列为(T)n，其中，所述n的取值范围为15～40之间的自然数；
2)将步骤(1)所述聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液加入到缓冲溶液中，轻微混匀并反应，得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，其中，所述聚胸腺嘧啶模板和Cu2+的摩尔比为1：100～1：500，改变Cu2+或抗坏血酸的浓度会降低荧光强度。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚胞嘧啶序列。
进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列为“(C)m”，所述m的取值范围为5～20之间的自然数。
具体地，当n为10时，所述聚胞嘧啶序列为(C)n为(C)10，所述(C)10的序列如SEQIDNO:2所示。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚胸腺嘧啶序列依次间隔排列，且所述聚胞嘧啶序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1～3次。
具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列如SEQIDNO:3所示。
具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为2次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列如SEQIDNO:4所示。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚鸟嘌呤序列。
进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列为“(G)q”，所述q的取值范围为5～20之间的自然数。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚鸟嘌呤序列依次间隔排列，且所述聚鸟嘌呤序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列的重复次数为1～3次。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个10～20个碱基长度的随机序列。
进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述随机序列依次间隔排列，且所述随机序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
更进一步优选地，所述随机序列的重复次数为1～3次。
在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示。
优选地，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板的5’端连接有生物素标记或链霉亲和素标记。
在此在此优选条件下，所述生物素标记或链霉亲和素标记通过行业内常规操作修饰在聚胸腺嘧啶模板的5’端。
在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为T25-biotin，其中，所述T25的序列如SEQIDNO:1所示。
具体的，所述T25-biotin表示在SEQIDNO:1所示序列的5’端标记生物素标签。
优选地，所述步骤(2)中，所述含Cu2+的溶液为CuSO4或Cu(NO3)2溶液。
进一步优选地，所述步骤(2)中，所述聚胸腺嘧啶模板和Cu2+的摩尔比为1：200～1:300。
优选地，所述步骤(2)中，所述Cu2+的终浓度为50uM～250uM。
进一步优选地，所述步骤(2)中，所述Cu2+的终浓度为100uM～150uM。
优选地，所述还原剂为抗坏血酸或羟胺。
优选地，所述缓冲溶液的缓冲pH范围为7.2～11。
进一步优选地，所述缓冲溶液为MOPS缓冲液，所述MOPS缓冲液为领域内常规配置方法配置。
进一步优选地，所述缓冲溶液为HEPES缓冲液，所述HEPES缓冲液为领域内常规配置方法配置。
优选地，所述反应的时间为5～20min。
优选地，所述反应的温度为室温。
优选地，所述室温优选为0～55℃。
进一步优选地，所述室温优选为25～55℃。
优选地，所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的大小为10～20nm。
本发明提供的基于荧光铜纳米簇的ATP检测方法中，ATP与聚胸腺嘧啶为模板合成的铜纳米颗粒相互作用时，ATP的嘌呤基团与胸腺嘧啶互补配对，导致铜纳米颗粒的荧光发生淬灭甚至消失。由于ATP与聚胸腺嘧啶的配对结合效率非常高、仅需要5分钟即可得到明显的荧光衰减现象，且在常温下即可完成。所以，本发明提供的基于荧光铜纳米簇的ATP检测方法操作简单快捷，成本相对低廉，现象快速明显。此外，由于荧光衰减现象非常明显，可采用紫外照射便可判断待测样品中ATP的有无；若需要精确检测待测样品中ATP的浓度，可先制作标准曲线，再用荧光检测仪器检测荧光，并折算出待测样品中ATP的浓度。
虽然目前ATP的检测已有专门的试剂盒，但主要使用荧光素与荧光素酶，其相对成本高昂，且步骤较为复杂；本发明是采用最新单链聚胸腺嘧啶为模板合成荧光铜纳米颗粒，成本相对低廉，反应速度快。
相对于其它ATP的检测方法，如采用适配子双链DNA合成铜纳米颗粒来检测ATP的方法，本发明提供的基于荧光铜纳米簇的ATP检测方法步骤更为简便、机理更加简单。
本发明提供了聚胸腺嘧啶模板、基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、ATP的检测方法具有如下有益效果：
(1)本发明提供的聚胸腺嘧啶模板选制得的铜纳米颗粒与DNA单链结合紧密，荧光稳定性较双链更高，能在1小时之内保持稳定的荧光发光；
(2)本发明提供的基于荧光铜纳米簇的ATP检测方法，利用ATP的嘌呤基团可与胸腺嘧啶互补配对的机理，先制备荧光铜纳米簇，然后加入待测ATP溶液，再通过观察、检测荧光强度来检测待测样品中的ATP，操作简单快捷，成本相对低廉，整个检测过程较为快速、且现象明显。
(3)本发明提供的聚胸腺嘧啶模板和基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇用于制备ATP检测试剂盒时成本更低。
附图说明
图1为本发明实施例2提供基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光光谱图；
图2为本发明实施例2提供基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的TEM图；
图3为本发明实施例2提供基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光强度随时间的变化规律图；
图4为本发明实施例2提供的不同Cu2+浓度制备的荧光铜纳米簇的荧光光谱图；
图5为本发明验证实施例1提供的聚胸腺嘧啶模板配对的示意图；
图6为本发明验证实施例1提供的模板制备的荧光铜纳米簇的荧光相对值柱状图；
图7为本发明验证实施例1提供的T25模板和A25-T25模板分别制备的荧光铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图8为本发明验证实施例2提供的荧光铜纳米簇在不同缓冲液中的荧光发射光谱图；
图9为本发明验证实施例2提供的荧光铜纳米簇在不同pH值条件下的荧光发射光谱图；
图10为本发明验证实施例2提供的荧光铜纳米簇在不同温度条件下的荧光发射光谱图；
图11为本发明效果实施例1提供的基于荧光铜纳米簇的ATP检测原理示意图；
图12为本发明效果实施例1提供的样品对的ATP进行检测的荧光实物图；
图13为本发明效果实施例1提供的样品对的ATP进行检测的荧光光谱图；
图14为本发明效果实施例1提供的样品对的ATP进行检测的荧光强度值标准化结果；
图15为本发明效果实施例2提供的样品的荧光实物图；
图16为本发明效果实施例2提供的样品的荧光相对值柱状图；
图17为本发明实施例7提供的微珠纯化的荧光铜纳米簇的荧光显微镜图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
若无特别说明，本发明实施例中所用试剂及耗材均为市售商品；本发明实施例中所涉及核酸序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；本发明涉及的部分英文说明：mM：毫摩尔；μM：微摩尔；biotin：生物素，CuNPs：本发明制备的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇。
若无特别说明，本发明实施例中的荧光检测采用的仪器为EdinburghInstruments公司的稳态荧光光谱仪FS920仪器，激发波长为340nm，扫描范围为500～800nm。
若无特别说明，本发明实施例中的EP管荧光检测实物图均为在紫外光照射条件下进行的实物拍摄。
实施例1
1)提供聚胸腺嘧啶模板
合成寡聚核苷酸T25、A25、T25-biotin、T25-a1、T25-b1、T25-b2、T25-C10-T25以及T25-C10-T25-C10-T25的核苷酸序列，如下表1所示:
表1.寡聚核苷酸T25、A25、T25-biotin、T25-a1、T25-b1、
T25-b2、T25-C10-T25以及T25-C10-T25-C10-T25的核苷酸序列
如表1中所述的寡聚核苷酸T25、A25、T25-biotin、T25-a1、T25-b1、T25-b2、T25-C10-T25以及T25-C10-T25-C10-T25均为单链脱氧核糖核酸。其中，T25、T25-biotin、T25-a1、T25-b1、T25-b2、T25-C10-T25或T25-C10-T25-C10-T25为聚胸腺嘧啶模板。
2)配置试剂
a、聚胸腺嘧啶模板溶液的配置：取步骤(1)所述T25单链聚胸腺嘧啶序列，将10OD的T25加510μL超纯水稀释至100μM，备用；同时，按相同的实验室常规操作分别配置A25、T25-biotin、T25-a1、T25-b1、T25-b2、T25-C10-T25以及T25-C10-T25-C10-T25溶液，若无特别说明，均配置为终浓度100μM。
b、MOPS缓冲液的配置：配置含10mMMOPS、150mMNaCl，pH为7.6的MOPS缓冲液10mL，待用，4℃保存。
c、硫酸铜溶液的配置：称取25mg五水硫酸铜晶体，溶于10mL超纯水中，备用，硫酸铜浓度为10mM。
d、抗坏血酸溶液的配置：称取14.1mg抗坏血酸，溶于1mL超纯水中，备用，抗坏血酸浓度为80mM。
e、ATP溶液的配置：称取55.1mg的ATP加1mL超纯水稀释，浓度为100mM，再分别按体积稀释成100μM，250μM，500μM，750mM，1mM，5mM。
后续实施例中所用试剂若无特殊说明，所用试剂浓度均为本实施例1步骤(2)中所述浓度。
实施例2
本实施例提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)按实施例1步骤(2)所述的操作配置MOPS缓冲液、100μM的T25、抗坏血酸以及硫酸铜溶液；
(2)在EP管里按顺序加入192μLMOPS缓冲液，1μLT25，5μL抗坏血酸，2μL硫酸铜溶液，轻轻摇晃5分钟，即可得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，所述荧光铜纳米簇的荧光为红色，其中，所述抗坏血酸为过量，所述T25与硫酸铜的摩尔比为1:200。
为了充分说明本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇制备方法的有益效果，本实施例还提供了所制备的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光光谱数据(如图1所示)、高分辨率的透射电子显微镜(TEM)照片(如图2所示)、以及荧光强度随时间延长的变化规律(如图3所示)。其中，所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光光谱数据采用FS920稳态荧光光谱仪测定，激发波长340nm，图1中，曲线1为激发光谱，曲线2为发射光谱，由图1可知，本实施例提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇在630nm处有特征发射峰；由图2可知，本发明实施例提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇为直径为10～20nm的颗粒复合物，由图3可知，在EP管中加入最后一个成分硫酸铜溶液时，大约5分钟之后就能检测到很强的荧光强度，而且该荧光强度在之后的80分钟之内一直保持稳定。本发明实施例提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇在反应后5～80min内的荧光较为稳定。
为了进一步说明本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇制备方法的有益效果，本实施例还提供了实施例2的补充实验。所述补充实验采用不同Cu2+浓度制备基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，制备方法如实施例2所述，不同的是硫酸铜的浓度进行梯度设置(如下表2实施例2补充实验所示)：
表2.不同Cu2+浓度对基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光影响
实施例2的补充实验结果如图4所示，图4中，曲线1～7分别为Cu2+浓度为10、25、50、100、150、200以及250uM时，所制备的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光强度。由曲线1～7可知，Cu2+浓度为50uM～250uM之间时，本发明制备的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光强度较强；Cu2+浓度为10uM～150uM之间时，荧光强度基本稳定在较高水平，而更高或更低的Cu2+浓度会导致荧光的衰减。
验证实施例1
为了验证本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板在制备荧光铜纳米簇的序列依赖性和特异性，本验证实施例1采用实施例1提供的T25、A25、T25-a1、T25-b1、T25-b2进行实验室常规退火处理，得到如图5所示的A25-T25，a1-b1，以及a1-b2。然后分别以所得A25-T25，a1-b1，以及a1-b2链为模板制备荧光铜纳米簇。
(如实施例1表1中所述的A25可与T25可以完全配对成双链DNA，T25-a1的3’端的部分序列与T25-b1的3’端的部分序列反向互补，T25-a1的3’端的部分序列与T25-b2的3’端的部分序列正向互补，如图5所示。在图5中，A25与T25完全配对的双链DNA为A25-T25，T25-a1的3’端的部分序列与T25-b1的3’端的部分序列反向互补的DNA链为a1-b1，T25-a1的3’端的部分序列与T25-b2的3’端的部分序列正向互补的DNA链为a1-b2。)
本验证实施例1采用实施例2所述的步骤制备荧光铜纳米簇，不同的是将实施例2中的T25分别换成A25-T25、a1-b1和a1-b2，荧光观察结果如下表3所示：
| 模板 | 荧光观察结果 | 荧光相对值 |
| 实施例1(T25) | 有红色荧光 | 1000 |
| 验证实施例1(A25-T25) | 无红色荧光 | 0 |
| 验证实施例1(a1-b1) | 有红色荧光 | 2250 |
| 验证实施例1(a1-b2) | 有红色荧光 | 1000 |
表3.不同核酸模板制备的铜纳米簇的荧光现象
图6为实施例1(T25)、验证实施例1(a1-b1)和验证实施例1(a1-b2)为模板制备的荧光铜纳米簇的荧光相对值柱状图。图7为T25和A25-T25的荧光发射光谱图，图7中，曲线1和2分别为T25和A25-T25的荧光发射光谱。
由表3、图6、以及图7可知，A25-T25双链模板不能形成具有荧光特性的荧光铜纳米簇，这是因为具有聚胸腺嘧啶单链模板的聚胸腺嘧啶已经与A25配对，不能提供荧光铜纳米簇生长的有效序列，因此不能形成具有荧光特性的荧光铜纳米簇。而T25、a1-b1、a1-b2则能形成具有荧光特性的荧光铜纳米簇，这是由于T25、a1-b1、a1-b2中均含有有效的聚胸腺嘧啶单链模板，这进一步说明本发明提供的聚胸腺嘧啶单链模板能用于制备荧光铜纳米簇。
此外，a1-b1的荧光值为a1-b2的2倍多，这是因为，如图5所示，虽然a1-b1和a1-b1链中均含有聚胸腺嘧啶序列，然而，T25-a1的3’端的部分序列与T25-b1的3’端的部分序列采用反向互补的方式配对，所以a1-b1链中的聚胸腺嘧啶序列呈线性排布，；与此不同的是，T25-a1的3’端的部分序列与T25-b2的3’端的部分序列采用正向互补的方式配对，a1-b1链中的聚胸腺嘧啶序列不能自由舒展，从而减少了到能用于生长具有荧光特性的荧光铜纳米簇的有效聚胸腺嘧啶序列长度。
另外，a1-b1的荧光值为T25的2倍多，这从侧面说明相对于T25，间隔有随机序列的T25聚胸腺嘧啶模板(即a1-b1，间隔的随机序列即为T25-a1与T25-b1反向互补的序列)使得有效的聚胸腺嘧啶序列变长，能更高的促进具有荧光特性的荧光铜纳米簇的形成。
验证实施例2
为了验证本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板在制备荧光铜纳米簇在不同缓冲液、pH、温度下的荧光稳定性，本验证实施例2将实施例1提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇置于不同缓冲液、pH、温度下，并进行荧光检测，设置分别如下表4所示：
| 平行实验1 | 平行实验2 | 平行实验3 | 平行实验4 |
| 水 | PBS | MOPS | HEPES |
表4.检测不同缓冲液下的荧光强度实验设置
表4中PBS、MOPS以及HEPES缓冲液分别为磷酸缓冲液、吗啉丙磺酸缓冲液、以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。实验结果如图8所示，曲线1～4分别代表本发明实施例1提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇在水、PBS、MOPS以及HEPES缓冲液中的荧光强度。由图8可知，本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇在MOPS缓冲液中的荧光强最强。
| 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 | 组6 | 组7 | 组8 | 组9 |
| 6.07 | 6.46 | 6.62 | 6.90 | 7.20 | 7.42 | 7.73 | 8.60 | 10.87 |
表5.检测不同pH下的荧光强度实验设置
表5中组1～9代表9组平行实验，分别代表本发明实施例1提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇在pH为6.07～10.87之间的MOPS缓冲液中的荧光强度。组1～9的检测结果分别如图9中曲线1～9所示。由图9可知，本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇置于MOPS缓冲液中时，在溶液pH为7.2～11的碱性环境中，其荧光变化不明显，酸性环境下则基本无荧光。
| 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 | 组6 | 组7 |
| 7.5 | 17.5 | 27.5 | 37.5 | 47.5 | 57.5 | 67.5 |
表6.检测不同温度(℃)下的荧光强度实验设置
表6中组1～7代表7组平行实验，分别代表本发明实施例1提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇在温度为7.5～67.5下的MOPS缓冲液中的荧光强度。组1～7的检测结果分别如图10所示。由图10可知，本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇置于MOPS缓冲液中时，在温度为7.5～67.5℃下，其荧光强度较强，在27.5～57.5℃下荧光强度能保持较高水平。
实施例3
本实施例提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)按实施例1步骤(2)所述的操作配置MOPS缓冲液、100μM的T25-C10-T25、抗坏血酸以及硫酸铜溶液；
(2)在EP管里按顺序加入192μLMOPS缓冲液，1μLT25，5μL抗坏血酸，2μL硫酸铜溶液，轻轻摇晃5分钟，即可得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，所述荧光铜纳米簇的荧光为红色，其中，所述抗坏血酸为过量，所述T25与硫酸铜的摩尔比为1:200。
实施例4
本实施例提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)按实施例1步骤(2)所述的操作配置MOPS缓冲液、100μM的T25-C10-T25-C10-T25、抗坏血酸以及硫酸铜溶液；
(2)在EP管里按顺序加入192μLMOPS缓冲液，1μLT25，5μL抗坏血酸，2μL硫酸铜溶液，轻轻摇晃5分钟，即可得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，所述荧光铜纳米簇的荧光为红色，其中，所述抗坏血酸为过量，所述T25与硫酸铜的摩尔比为1:200。
实施例5～6
为充分说明本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇制备方法的有益效果，本发明还提供了实施例5～6，所述实施例5～6与实施例2的区别在于，将实施例2步骤(1)中的聚胸腺嘧啶模板T25分别替换为聚胸腺嘧啶模板T25-C10-T25和聚胸腺嘧啶模板T25-C10-T25-C10-T25，所述聚胸腺嘧啶模板T25-C10-T25和聚胸腺嘧啶模板T25-C10-T25-C10-T25的序列如实施例1所述。
荧光检测结果显示，相对于实施例2，实施例5和实施例6制备的荧光铜纳米簇具有更强的荧光，其中，实施例6制备的荧光铜纳米簇的荧光度最大。
这说明T25的重复次数越多，由于生长荧光铜纳米簇的有效聚胸腺嘧啶模板越多，荧光强度也越大。
效果实施例1
为了验证本实施例提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的对ATP的检测效果，采用实施例2～6所制备的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇对已知浓度的ATP溶液进行检测。
图11为本发明提供的基于荧光铜纳米簇的ATP检测原理示意图，结合图11，本发明效果实施例1提供了一种基于荧光铜纳米簇的ATP检测方法，包括如下步骤：
取实施例2～6所制备的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，分别记为P1、P2、P3、P4和P5；然后分别加入不同浓度的ATP溶液(实施例1步骤(2)配置的浓度梯度)，室温下孵育5分钟后，检测其荧光的衰减值；其中，所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇和所述待测ATP溶液的用量分别为180μL和20μL。
各反应的条件如下表7所示：
表7.不同待测ATP溶液浓度的荧光现象
表7中，待测ATP溶液浓度为0μM时，即不含ATP的空白对照，实验时，只需要取20μL超纯水即可。
检测结果显示，本发明实施例提供的P1～P5可用于检测ATP的浓度，所测得的荧光强度衰减值与ATP浓度成正比关系，即待测ATP的浓度越大，基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的荧光越弱，说明ATP与聚胸腺嘧啶进行反应并配对，与纳米铜形成竞争，使得荧光铜纳米簇所依赖的聚胸腺嘧啶模板减少，从而降低了荧光强度。
为充分说明本实施例提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的有益效果，本效果实施例1还提供了本发明实施例提供的P1在检测不同浓度ATP时的荧光观测结果图，如图12所示，图12中，1、2号为空白对照，3～8号为100μM、250μM、500μM、750mM、1mM以及5mM浓度的ATP，箭头表示3～8号EP管中溶液的荧光强度依次降低。由图12可知，ATP的浓度越大，所测得荧光强度越小，进一步说明了孵育后溶液的荧光强度与ATP浓度为反比关系，也进一步说明了本发明实施例提供的P1～P5可用于检测ATP的浓度。
图13为P1检测不同浓度ATP时的荧光检测值，图14为P1检测不同浓度ATP时的荧光检测值经标准化后的线性拟合图。
由图13可知，待测ATP样品中ATP浓度在0～100mM之间时，所测得的荧光强度与ATP浓度成反比关系；在待测ATP样品中ATP浓度在100μM～1mM之间时，所测得的经过标准化后的荧光强度衰减值与ATP浓度之间有很好的线性关系；线性关系如图14所示(线性系数为0.934，线性关系式为y＝16662.25-11.7044x)。
因此，本发明提供的ATP检测方法检测灵敏度高，可精确检测浓度范围为100μM～1mM的ATP样品，也可用于粗略估测浓度范围为0～100mM的ATP样品。
效果实施例2
为了验证本发明实施例提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的在检测ATP时的特异性，本效果实施例2采用实施例2所制备的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇(P1)对腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)溶液进行检测，包括如下步骤：
1)腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶溶液的配置：分别称腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶，溶于1mL超纯水中，4℃保存，备用。溶液浓度5mM。
2)腺嘌呤的特异性检测：取200μL实施例1制得的P1，分别加入5mM的T25、腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶溶液50μL，终体积均为250μL，在37℃下，孵育5min，观察各溶液荧光的变化。
荧光观察结果如图15所示；相应的荧光相对值如图16所示；P1中分别加入T25、腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶溶液分别对应图15中的T25、A、U、G、C对应的试管(即1～5号EP管)，并分别对应图16中T25、A、U、G、C对应的柱子。
由图15可知，相对于T25对照组，在P1中加入G、U或C，对P1的荧光影响不大，只有在P1中加入A，溶液的荧光大大降低；这是由于本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇中的聚胸腺嘧啶能特异性地与腺嘌呤进行配对，从而破坏荧光铜纳米簇，降低发光现象。由于ATP中含有腺嘌呤，因此，本效果实施例2从侧面进一步说明了本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇能特异地对ATP进行检测。
实施例7
本实施例提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
(1)按实施例1步骤(2)所述的操作配置MOPS缓冲液、100μM的T25-biotin、抗坏血酸以及硫酸铜溶液；
(2)在EP管里按顺序加入192μLMOPS缓冲液，1μLT25-biotin，5μL抗坏血酸，2μL硫酸铜溶液，轻轻摇晃5分钟，即可得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，所述荧光铜纳米簇的荧光为红色，其中，所述抗坏血酸为过量，所述T25-biotin与硫酸铜的摩尔比为1:200。
采用链霉素(streptavidin)修饰的微珠纯化所得基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，并用荧光显微镜进行观察，观察结果如图17所示，图17中，箭头所指的是纯化所得基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇。由图17可知，本发明提供的带有生物素标签的聚胸腺嘧啶模板能制备荧光铜纳米簇；此外，采用生物素标签修饰本发明提供的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，能采用生物素-链霉亲和素常规纯化操作进行纯化，而且不影响其荧光发光。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚胸腺嘧啶模板，其特征在于，所述聚胸腺嘧啶模板为单链DNA序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列为(T)n，其中，所述n的取值范围为15～40之间的自然数。
2.如权利要求1所述的聚胸腺嘧啶模板，其特征在于，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚胞嘧啶序列、聚鸟嘌呤序列或随机序列。
3.如权利要求1所述聚胸腺嘧啶模板，其特征在于，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胸腺嘧啶模板的5’端修饰有生物素或链霉亲和素的标签。
4.一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提供聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液，其中，所述聚胸腺嘧啶模板为单链DNA序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列为(T)n，其中，所述n的取值范围为15～40之间的自然数；
2)将步骤(1)所述聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液加入到缓冲溶液中，轻微混匀并反应，得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，其中，所述聚胸腺嘧啶模板和Cu2+的摩尔比为1：100～1:500。
5.如权利要求4所述的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚胞嘧啶序列、聚鸟嘌呤序列或随机序列。
6.如权利要求4所述的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胸腺嘧啶模板的5’端修饰有生物素或链霉亲和素的标签。
7.如权利要求4所述的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述还原剂为抗坏血酸或羟胺，所述还原剂的用量为过量。
8.如权利要求4所述的基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的大小为10～20nm。
9.一种基于荧光铜纳米簇的ATP检测方法，包括如下步骤：
提供基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，及
加入待测样品，混匀，室温下反应，并在混匀后5～80分钟之内进行荧光检测。
10.一种如权利要求1所述的聚胸腺嘧啶模板在检测ATP或制备检测ATP的试剂盒中的应用。
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Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN105087765A (zh) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105486670A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-04-13 | 大连理工大学 | 一种二价钴离子的检测方法 |
| CN105486671A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-04-13 | 大连理工大学 | 一种检测汞离子的方法 |
| CN105505383A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-04-20 | 大连理工大学 | 一种荧光铜纳米簇的合成方法 |
| CN105548119A (zh) * | 2016-01-24 | 2016-05-04 | 湖南科技大学 | 一种快速检测t-2毒素的方法 |
| CN105598466A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-05-25 | 大连理工大学 | 一种荧光铜纳米簇的合成方法 |
| CN105834444A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-08-10 | 大连理工大学 | 一种以胸腺嘧啶为模板合成荧光铜纳米簇的方法 |
| CN105842211A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-08-10 | 大连理工大学 | 一种二价锰离子的检测方法 |
| CN108707644A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-10-26 | 南京工业大学 | 一种基于dna模板化铜簇探针检测焦磷酸根及碱性磷酸水解酶的方法 |
| CN109765203A (zh) * | 2018-10-29 | 2019-05-17 | 四川大学 | 一种荧光-稳定同位素双模态对三硝基甲苯的检测方法 |
| CN110954518A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-04-03 | 安徽师范大学 | 一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 |
| CN112816533A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-18 | 商丘师范学院 | 一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器 |
| CN113281315A (zh) * | 2021-05-16 | 2021-08-20 | 长沙市食品药品检验所 | 基于发夹结构dna为模板的铜纳米簇荧光探针快速定量检测溶液中链霉素的方法 |
| CN113913561A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-01-11 | 中国农业大学 | 基于引物设计和铜纳米簇的SARS-CoV-2德尔塔变异株检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101040054A (zh) * | 2004-07-02 | 2007-09-19 | 普罗美加公司 | 微生物atp提取及检测系统 |
| CN101993467A (zh) * | 2009-08-24 | 2011-03-30 | 香港科技大学 | 在纳米颗粒表面控制功能分子密度的方法 |
| CN103468670A (zh) * | 2012-06-08 | 2013-12-25 | 上海欧孚生物医药科技有限公司 | 全长cDNA核酸线性扩增方法及试剂盒 |
-
2014
- 2014-05-16 CN CN201410208517.XA patent/CN105087765A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101040054A (zh) * | 2004-07-02 | 2007-09-19 | 普罗美加公司 | 微生物atp提取及检测系统 |
| CN101993467A (zh) * | 2009-08-24 | 2011-03-30 | 香港科技大学 | 在纳米颗粒表面控制功能分子密度的方法 |
| CN103468670A (zh) * | 2012-06-08 | 2013-12-25 | 上海欧孚生物医药科技有限公司 | 全长cDNA核酸线性扩增方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ALEXANDRU ROTARU等: ""Selective dsDNA-Templated Formation of Copper Nanoparticles in Solution"，第5665 –5667页", 《ANGEW CHEM INT ED ENGL》 * |
| CHUNXIA SONG等: ""Label-free and non-enzymatic detection of DNA based on hybridization chain reaction amplification and dsDNA-templated copper nanoparticles"，第74-79页", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
| ZHIHE QING等: ""Poly(thymine)-templated selective formation of fluorescent copper nanoparticles",第9719-9722页", 《ANGEW CHEM INT ED ENGL》 * |
| ZHIXUE ZHOU等: ""Double-strand DNA-templated formation of copper nanoparticles as fluorescent probe for label-free aptamer sensor"，第5122-5127页", 《ANAL CHEM》 * |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105486670A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-04-13 | 大连理工大学 | 一种二价钴离子的检测方法 |
| CN105486671A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-04-13 | 大连理工大学 | 一种检测汞离子的方法 |
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| CN105598466A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-05-25 | 大连理工大学 | 一种荧光铜纳米簇的合成方法 |
| CN105486670B (zh) * | 2016-01-18 | 2018-07-13 | 大连理工大学 | 一种二价钴离子的检测方法 |
| CN105548119A (zh) * | 2016-01-24 | 2016-05-04 | 湖南科技大学 | 一种快速检测t-2毒素的方法 |
| CN105834444A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-08-10 | 大连理工大学 | 一种以胸腺嘧啶为模板合成荧光铜纳米簇的方法 |
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