CN103031375B - 一种dna甲基化检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布一种DNA甲基化检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒通过制备具有石墨烯氧化物的玻片，根据特定基因序列设计甲基化检测探针，合成具有AuNP或者其他能淬灭石墨烯氧化物检测荧光的物质标记的单链DNA，并物理吸附到带有石墨烯氧化物点阵的玻片上，运用石墨烯氧化物吸附单链DNA，双链DNA脱离石墨烯氧化物的特性，实现高通量、低成本、准确、快速地对DNA甲基化的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA甲基化检测试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒检测DNA甲基化的方法。
背景技术
目前存在的几种甲基化检测方法，如甲基化特异性聚合酶链式反应，甲基化敏感单核苷酸引物延伸，DNA测序等存在一些局限性：甲基化的信息不完整、检测的通量低、准确性低等。
2004年英国曼彻斯特大学的两位科学家安德烈·海姆（Andre Geim）和康斯坦丁·诺沃肖罗夫（Konstantin Novoselov）首次制备出是一种新型的二维碳纳米材料-石墨烯，并获2010年的诺贝尔物理学奖，受到了全世界研究人员的关注。
石墨烯氧化物是石墨烯的氧化物，其制备简单，成本也比较低，对单链DNA有较强的吸附能力（N.Varghese,U.Mogera,A.Govindaraj,et al.Chem Phys Chem2009,10,206–210;Z.Liu,J.T.Robinson,X.Sun,H.Dai,J.Am.Chem.Soc.2008,130,10876–10877.)，单链DNA吸附到石墨烯氧化物上，双链DNA从石墨烯氧化物上脱落。生物芯片是一种高通量的工具，利用石墨烯氧化物的特性，把生物芯片与石墨烯氧化物相结合，发展一种高通量、低成本、准确、快速的DNA甲基化检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服一些检测方法的缺陷，研制一种DNA甲基化检测试剂盒及其检测方法。
本发明所述DNA甲基化的检测试剂盒，包括以下成分：
(1)反应液A:0.3mg/ml的石墨烯氧化物溶液
(2)反应液B:0.5mM的EDCI（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）
(3)反应液C:1.0mM sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）。
本发明的还提供了一种DNA甲基化检测试剂盒检测DNA甲基化的方法，其主要步骤包括：
1）制备具有石墨烯氧化物点阵的玻片，具体是将1ml反应液A点在氨基修饰的玻片上，干燥后，用超纯水冲洗,加入1ml反应液B和反应液C后在37℃下保存60min；
2）待测DNA样本的制备：从组织或血液中提取基因组DNA，以亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，通过PCR扩增，制备待检测的DNA样本；
3）检测探针吸附到具有石墨烯氧化物点阵的玻片：合成具有淬灭石墨烯氧化物检测荧光物质标记的DNA甲基化检测探针在杂交盒中和1）制备的玻片进行物理吸附12h，用PBS洗去多余的探针，扫描记录玻片上石墨烯氧化物点阵的荧光强度；
4）DNA甲基化检测：在3）中加入2）中制备的DNA样本，在37℃下杂交60min，PBS冲洗后进行扫描，吸附AuNP标记的探针时的石墨烯氧化物的荧光强度与加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度的比值来检测DNA甲基化。
本发明所述淬灭石墨烯氧化物检测荧光的物质为AuNP或其他能淬灭石墨烯氧化物检测荧光的金属颗粒。
本发明中，吸附AuNP标记的探针时的石墨烯氧化物的荧光强度与加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度的比值接近为0，加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度与未吸附AuNP标记的探针时的石墨烯氧化物的荧光强度接近1，证明检测到DNA甲基化。
本发明具有以下优点：
1.本发明把石墨烯氧化物和微阵列芯片技术相结合,能高通量、低成本、准确、快速对DNA甲基化进行大规模检测。
2.本发明充分运用单链DNA能吸附到石墨烯氧化物，双链DNA脱离石墨烯氧化物的特性进行DNA甲基化检测,具有较高的检测特异性，实施简单而且有效。
附图说明
图1是本发明的流程示意图。
图2a)AuNP标记的DNA吸附到石墨烯氧化物后的荧光图，b)加入DNA甲基化样本后荧光图。
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应该当作本发明的限制。
实施例1：
按照下列配方制作一种DNA甲基化的检测试剂盒
(1)反应液A:0.3mg/ml的石墨烯氧化物溶液。
(2)反应液B:0.5mM的EDCI。
(3)反应液C:1.0mM sulfo-NHS。
实施例2：
检测流程如图1。
1.DNA甲基化样本的制备：从组织或血液中提取基因组DNA，以亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，未发生甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶(U),甲基化的胞嘧啶则不变。具体步骤如下：(1)取适量胃癌组织放入离心管，加入50μl 10%SDS和500μl TE，用剪刀剪碎；(2)在12000rpm离心5min；(3)去除上清后加入2.5μl RNase酶和500μl TE，37℃水浴60min；(4)在离心管中加入9μl蛋白酶K，50℃水浴过夜；(5)加入等体积的饱和酚，混匀10min，在11000rpm离心5min后混合液分相，把上清液放置于另一离心管，重复该步骤4次；(6)在离心管中加入2倍体积预冷的乙醇，混匀后在-20℃放置30min；(7)12000rpm离心20min，迅速去除溶液；(8)用70%乙醇洗涤沉淀，去除溶液；(9)室温干燥10min后加入100μl灭菌水溶解；(10)用紫外分光光度计测定OD值后，-20℃保存。取1-3μg基因组DNA，加入5.5μl3M NaOH，用水补齐至55μl，37℃水浴30min变性，在变性的DNA中加入520μl新配制的3mol/l亚硫酸氢钠（pH5.0）和30μl0.5mmol/L的对苯二酚，混合后离心，用200μl石蜡油封层，50℃保持16-18h，去除石蜡油，在Wizard DNA Clean-Up System纯化后的DNA中加入NaOH，终浓度为0.3mol/l，然后室温放置5min。加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的乙醇，-20℃放置4小时，在4℃用12000rpm离心30min沉淀DNA。吹干后用双蒸水溶解，-20℃保存。待检测的基因P16的扩增引物IF5’-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3’（SEQ ID NO.1），IR:5’-TACCTAATTCCAATTCCCCTACAAACT-3’（SEQID NO.2），引物不包含CpG位点。PCR反应体系50μl，其中含3μl10×的缓冲液，1.8mmol/lMg2+，200μmol/l dNTPs，每条引物各10pmol，2μl模板DNA，2U Taq DNA聚合酶。在PCR上进行扩增，PCR的反应条件为95℃，5min；94℃，1min变性，62℃，1min退火，72℃，30sec延伸，共35个循环；72℃，7min终止延伸，4℃保存。
2.制备具有石墨烯氧化物点阵的玻片。1ml反应液A点在氨基修饰的玻片上，干燥后，用超纯水冲洗,加入1ml反应液B和反应液C后在37℃下60min。
3.石墨烯氧化物对单链DNA有较强的吸附作用，根据待测的基因设计检测用的DNA甲基化探针5’-ATCGACCTCCGACCGTAAC-3’（SEQ ID NO.3），合成具有1μl浓度为100pmol的AuNP颗粒标记的探针后在杂交盒中和1）制备的玻片进行物理吸附12h，AuNP能淬灭石墨烯氧化物发出的特定荧光，用PBS洗去多余的探针，在532nm波长下扫描记录玻片上石墨烯氧化物点阵的荧光强度（图2a）。
4.DNA甲基化检测：在3）中加入2）中制备的DNA甲基化样本，在37℃下杂交60min后，PBS冲洗后在532nm波长下进行扫描(图2b)，DNA甲基化样本与石墨烯氧化物上吸附的单链DNA结合后，形成双链DNA，双链DNA容易脱离石墨烯氧化物的吸附，吸附AuNP标记的探针时的石墨烯氧化物的荧光强度与加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度的比值接近为0，加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度与未吸附AuNP标记的探针时的石墨烯氧化物的荧光强度接近1，证明检测到DNA甲基化。
实施例3
1.DNA甲基化样本的制备：(1)取适量直肠癌组织放入离心管，加入50μl10%SDS和500μlTE，用剪刀剪碎；(2)在12000rpm离心5min；(3)去除上清后加入2.5μl RNase酶和500μl TE，37℃水浴60min；(4)在离心管中加入9μl蛋白酶K，50℃水浴过夜；(5)加入等体积的饱和酚，混匀10min，在11000rpm离心5min后混合液分相，把上清液放置于另一离心管，重复该步骤4次；(6)在离心管中加入2倍体积预冷的乙醇，混匀后在-20℃放置30min；(7)12000rpm离心20min，迅速去除溶液；(8)用70%乙醇洗涤沉淀，去除溶液；(9)室温干燥10min后加入100μl灭菌水溶解；(10)用紫外分光光度计测定OD值后，-20℃保存。取1-3μg基因组DNA，加入5.5μl3M NaOH，用水补齐至55μl，DNA中加入520μl新配制的3mol/l亚硫酸氢钠（pH5.0）和30μl0.5mmol/L的对苯二酚，混合后离心，用200μl石蜡油封层，50℃保持16-18h，去除石蜡油，在Wizard DNA Clean-Up System纯化后的DNA中加入NaOH，终浓度为0.3mol/l，然后室温放置5min。加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的乙醇，-20℃放置4小时，在4℃用12000rpm离心30min沉淀DNA。吹干后用双蒸水溶解，-20℃保存。待检测的基因hMLH1的引物IF5’-TTTTTTAGGAGTGAAGGA GG-3’（SEQ ID NO.4），
IR:5’-ATAAAACCCTATACCTAATCTATC-3’（SEQ ID NO.5），PCR反应体系50μl，其中含3μl10×的缓冲液，1.8mmol/l Mg2+，200μmol/l dNTPs，每条引物各10pmol，2μl模板DNA，2UTaq DNA聚合酶。在PCR上进行扩增，PCR的反应条件为95℃，3min；94℃，10sec变性，54℃10sec退火，72℃，15sec延伸，共35个循环；72℃，10min终止延伸，10C保存。
2.制备具有石墨烯氧化物点阵的玻片。1ml反应液A点在氨基修饰的玻片上，干燥后，用超纯水冲洗,加入1ml反应液B和反应液C后在37℃下60min。
3.石墨烯氧化物对单链DNA有较强的吸附作用，根据待测的基因hMLH1设计检测用的DNA甲基化探针5’-GATGAGGCGGCGATAGATTA-3’（SEQ ID NO.6），合成hMLH1具有1μl浓度为100pmol的AuNP颗粒标记的探针后在杂交盒中和1）制备的玻片进行物理吸附12h，AuNP能淬灭石墨烯氧化物发出的特定荧光，用PBS洗去多余的探针，在532nm波长下扫描记录玻片上石墨烯氧化物点阵的荧光强度,其检测结果类似图2a。
4.DNA甲基化检测：在3）中加入2）中制备的DNA甲基化样本，在37℃下杂交60min后，PBS冲洗后在532nm波长下进行扫描,其检测结果类似图2b，DNA甲基化样本与石墨烯氧化物上吸附的单链DNA结合后，形成双链DNA，双链DNA容易脱离石墨烯氧化物的吸附，吸附AuNP标记的探针时的石墨烯氧化物的荧光强度与加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度的比值接近为0，加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度与未吸附AuNP标记的探针时的石墨烯氧化物的荧光强度接近1，证明检测到DNA甲基化。
序列表
Claims (4)
1.一种DNA甲基化检测试剂盒检测DNA甲基化的方法，其特征在于该方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
1)制备具有石墨烯氧化物点阵的玻片；
2)待测DNA样本的制备：从组织中提取基因组DNA，以亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，通过PCR扩增，制备待检测的DNA样本；
3)检测探针吸附到具有石墨烯氧化物点阵的玻片：合成具有淬灭石墨烯氧化物检测荧光物质标记的DNA甲基化检测探针，该检测探针在杂交盒中和1)制备的玻片进行物理吸附12h，用PBS洗去多余的探针，扫描记录玻片上石墨烯氧化物点阵的荧光强度；
4)DNA甲基化检测：在3)中加入2)中制备的DNA样本，在37℃下杂交60min，PBS冲洗后进行扫描，吸附具有淬灭石墨烯氧化物检测荧光物质标记的DNA甲基化检测探针时的石墨烯氧化物的荧光强度与加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度的比值来检测DNA甲基化。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)是将1ml反应液A点在氨基修饰的玻片上，干燥后，用超纯水冲洗,加入1ml反应液B和反应液C后在37℃下保存60min；反应液A为0.3mg/ml的石墨烯氧化物溶液，反应液B为0.5mM的EDCI，反应液C为1.0mM sulfo-NHS。
3.根据权利1中所述的检测方法，其特征在于淬灭石墨烯氧化物检测荧光的物质为AuNP或其他能淬灭石墨烯氧化物检测荧光的金属颗粒。
4.根据权利1所述的检测方法，其特征在于吸附具有淬灭石墨烯氧化物检测荧光物质标记的DNA甲基化检测探针时的石墨烯氧化物的荧光强度与加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度的比值接近为0，加入DNA甲基化样本时的石墨烯氧化物荧光强度与未吸附具有淬灭石墨烯氧化物检测荧光物质标记的DNA甲基化检测探针时的石墨烯氧化物的荧光强度接近1，证明检测到DNA甲基化。
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