JP5710190B2 - βアクチン遺伝子のためのプライマーセット、プローブ、アッセイキットおよび検出方法 - Google Patents
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当該FIPプライマーが、配列番号3、配列番号17および配列番号19並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも1選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該F3プライマーが、配列番号1および配列番号21並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも1選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該BIPプライマーが、配列番号4および配列番号20並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも1選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該B3プライマーが配列番号2、配列番号18および配列番号22並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも1選択されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセットである。
1態様に従うと、βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するための増幅用核酸プライマーセットが提供される。
20mM Tris−HCL(pH8.8)
10mM KCL
8mM MgSO4
10mM (NH4)2SO4
0.1% Tween20
0.8M Betaine
1.4mM dNTPs
16U Bst DNA polymerase
0.625U AMV Reverse transcriptase。
プライマー添加量
FIPプライマー 40pmoL
BIPプライマー 40pmoL
F3プライマー 5pmoL
B3プライマー 5pmoL。
FIPプライマーが、配列番号3を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号17を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号19を含むポリヌクレオチドであり、
F3プライマーが、配列番号1を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号21を含むポリヌクレオチドであり、
BIPプライマーが、配列番号4を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号20を含むポリヌクレオチドであり、
B3プライマーが、配列番号2を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号18を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号22を含むポリヌクレオチドであるプライマーセットであり、
このプライマーセットは、更に、ループプライマーとして、配列番号13を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号14を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号15を含むポリヌクレオチドおよび/または配列番号16を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。
(b)FIPプライマーが配列番号17を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号4を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号1を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号18を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(c)FIPプライマーが配列番号19を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号20を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号21を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号22を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(d)FIPプライマーが配列番号17を含むポリヌクレオチドおよび配列番号19を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号4を含むポリヌクレオチドおよび配列番号20を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号1を含むポリヌクレオチドおよび配列番号21を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号18を含むポリヌクレオチドおよび配列番号22を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(e)FIPプライマーが配列番号3を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号4を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号1を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号2を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号14を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(f)FIPプライマーが配列番号17を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号4を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号1を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号18を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号14を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(g)FIPプライマーが配列番号3を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号4を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号1を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号2を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号15を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(h)FIPプライマーが配列番号17を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号4を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号1を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号18を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号15を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(i)FIPプライマーが配列番号19を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号20を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号21を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号22を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号14を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット;
(j)FIPプライマーが配列番号17を含むポリヌクレオチドおよび配列番号19を含むポリヌクレオチド、BIPプライマーが配列番号4を含むポリヌクレオチドおよび配列番号20を含むポリヌクレオチド、F3プライマーが配列番号1を含むポリヌクレオチドおよび配列番号21を含むポリヌクレオチド、B3プライマーが配列番号18を含むポリヌクレオチドおよび配列番号22を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号14を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット
である。
本発明は更に、上述のプライマーにより増幅されたβアクチン遺伝子或いはその転写産物に由来する核酸を検出するための核酸プローブおよび核酸プローブセットを提供する。
上述した核酸プローブが基体に固定化された核酸プローブ固定化基体も本願の1つの態様である。ここにおいて使用する「DNAチップ」の語は、「核酸プローブ固定化基体」または「核酸プローブ固定化基板」と交換可能に使用されてよい。
もう1つの態様に従うと、βアクチン遺伝子配列の検出および/または分類するためのアッセイキットが提供される。そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットと核酸プローブまたは核酸プローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよび核酸プローブまたは核酸プローブセットに加えて、LAMP増幅に必要な緩衝液を含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要な緩衝液、並びにそこにおいて当該増幅および/またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。
例1 プライマーDNAの選択
マウス、ラットまたはヒト由来の細胞などに感染した微生物やウイルスを検出する場合、細胞など検体からの核酸抽出や増幅および検出に問題がないかどうかをモニターできることが望ましい。その場合、マウス、ラットおよびヒトのβアクチン遺伝子をポジティブコントロールとすることが可能である。βアクチン遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれるものの1つで、種を超えて配列の保存性が高いことで知られている。従って、これら3種を共通のプライマーで増幅できることが期待される。NCBIよりマウス、ラットおよびヒトのβアクチン配列を取得し、マウスの配列に基づいてLAMP法プライマー設計支援ソフトを用いてプライマーを検索した。表1に示すプライマーおよびマウスゲノムDNAを用いて、基本組成および反応条件での増幅テストを行った。
(1)合成DNA
LAMPプライマーは、インビトロジェン(株)(現社名 ライフテクノロジーズジャパン)にカートリッジ精製品の合成を依頼した。DNAチップ用の核酸プローブは3’端にチオールを導入したHPLC精製品を同社に合成依頼した。
鋳型は、Novagen社から購入したマウス、ラットおよびヒトのゲノムDNAを使用した。
LAMP増幅は、以下に記載のLAMPキット推奨の組成を基本の条件とした(以下これを1×と表記する)。鋳型DNA量は、マウス、ラットまたはヒトのゲノムDNAを1反応あたり、20〜50ng添加した。また、増幅効率を高めるためにプライマーセットのスクリーニング工程を除き、添加前の鋳型に95℃5分の熱変性処理を行った。
例1にて選択されたプライマーセットの増幅で得られる2つのループに対して、マウス、ラットおよびヒトのβアクチン配列に基づいて核酸プローブを設計した。候補プローブを同一基板上に載せたチップを作製して、GenelyzerTMにて測定を行った。
DNAチップおよび電気化学測定
使用するDNAチップと自動電気化学測定装置は公知の文献に記載に従って用意した(SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 265-270, May 2008)。DNAチップは、3μMのチオール修飾核酸プローブを含む溶液を図5に模式的に示すようなDNAチップ上の電極にスポットして作製した。
Claims (7)
- βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、以下の(f)および/または(j)の組み合わせを含むプライマーセット;
(f)配列番号17で示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマーと、配列番号4で示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマーと、配列番号1で示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマーと、配列番号18で示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマーと、配列番号14で示されるポリヌクレオチドからなるループプライマーとを含む組み合わせ;および
(j)配列番号17で示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマーと、配列番号19で示されるポリヌクレオチドからなるFIPプライマーと、配列番号4で示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマーと、配列番号20で示されるポリヌクレオチドからなるBIPプライマーと、配列番号1で示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマーと、配列番号21で示されるポリヌクレオチドからなるF3プライマーと、配列番号18で示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマーと、配列番号22で示されるポリヌクレオチドからなるB3プライマーと、配列番号14で示されるポリヌクレオチドからなるループプライマーとを含む組み合わせ。 - 請求項1に記載のプライマーセットと、配列番号24、配列番号25、配列番号27、配列番号28、配列番号32、配列番号35および配列番号37並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドをそれぞれ含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から選択される少なくとも1とを含むβアクチン遺伝子を検出するためのアッセイキット。
- βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅する方法であって、試料に含まれる核酸を請求項1に記載のプライマーセットを用いてLAMP増幅することを特徴とする方法。
- βアクチン遺伝子を検出する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項1に記載のプライマーセットを用いてLAMP増幅することと、
前記LAMP増幅により生じた増幅産物の有無に基づいてのβアクチン遺伝子の存在の有無を判定することと
を具備する方法。 - βアクチン遺伝子を検知する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項1に記載のプライマーセットを用いてLAMP増幅することと、
前記LAMP増幅により生じた反応産物と、配列番号24、配列番号25、配列番号27、配列番号28、配列番号32、配列番号35および配列番号37並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドをそれぞれ含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から少なくとも1選択された核酸プローブとを反応させることと、
前記反応させた結果から、試料に存在するβアクチン遺伝子を検出することと
を具備する方法。 - 請求項5に記載の方法であって、前記核酸プローブが基体に固定されていることを特徴とする方法。
- 請求項3〜6の何れか1項に記載の方法であって、前記LAMP増幅が、RT−LAMP増幅であることを特徴とする方法。
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