CN103388024B - 一种基于桥式pcr检测dna羟甲基化的方法 - Google Patents

一种基于桥式pcr检测dna羟甲基化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于桥式PCR的DNA羟甲基化的高通量芯片检测方法，首先将不同扩增DNA羟甲基化位点的正方向引物固定到芯片或微球。其次，用β-葡萄糖基转移酶将DNA上所有5hmC进行糖基化，再用MspI酶进行酶切，发生羟甲基化的CCGG不能够被切开，未发生羟甲基化的CCGG能够被切开。然后，再以酶切后基因组DNA为模板与芯片进行杂交，并进行在片桥式PCR:CCGG位点发生羟甲基化的因不能被酶切，而能够进行扩增；反之，CCGG位点未发生羟甲基化的因能被酶切，而不能进行扩增。最后，根据芯片不同矩阵点荧光的有无，即可判断出基因组DNA不同位置的CCGG是否发生了羟甲基化。有益效果是：实现了不同DNA羟甲基化位点的平行性检测，检测结果具有高通量和高灵敏的特点。

Description

一种基于桥式PCR检测DNA羟甲基化的方法
技术领域
本发明属于利用芯片进行DNA羟甲基化检测的高通量高灵敏检测技术。
背景技术
5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是新发现的一种的修饰碱基(KriaucionisandHeintz,2009;Tahilianietal.,2009),以低水平存在于哺乳动物的多种细胞类型中。5hmC是10-11易位(TET)家族的酶通过氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(MBD)与甲基化DNA的亲和性,具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能,而且参与了DNA去甲基化过程，5hmC可能成为某些疾病诊断的新的分子标志物。因此关于5hmC的研究日益受到学者们的青睐。而5hmC检测方法的研究则是进行5hmC功能分析的前提与重要保证。目前主要有如下检测方法：一种是基于5hmC敏感酶切方法，另一种是基于抗体识别5hmC的免疫共沉淀法。前一种方法，已有商品化试剂盒。其基本原理是，首先用β-葡萄糖基化酶处理5hmC,将其特异性地转变成β-葡萄糖基-5羟甲基胞嘧啶(5ghmC)，然后再基于甲基化敏感限制性内切酶MspI识别并切割未修饰胞嘧啶或5mC，5ghmC则不受影响。然后用定量或半定量PCR放大酶切后的基因片段，发生5hmC可以被扩增，未发生5hmC则不可以被扩增。该方法具有较低的成本，但检测通量有限。后一种方法主要包括5hmC免疫沉淀(5hmCimmunoprecipitation,5hmC-IP)[LiW,LiuM.Distributionof5-hydroxymethylcytosineindifferenthumantissues.JNucleicAcids,2011,2011:870726]、抗5-亚甲基磺酸胞嘧啶(antiserumtocytosine5-methylenesulphonate,anti-CMS)[PastorWA,PapeUJ,HuangY,etal.Genome-widemappingof5-hydroxymethylcytosineinembryonicstemcells.Nature,2011,473(7347):394-7]、结合蛋白J(J-bindingprotein,JBP)沉淀[SongCX,SzulwachKE,FuY,etal.Selectivechemicallabelingrevealsthegenome-widedistributionof5-hydroxymethylcytosine.NatBiotechnol,2011,29(1):68-72]、糖基化、高碘酸氧化和生物素化(glucosylation,periodateoxidation,biotinylation,GLIB)处理等[antiserumtocytosine5-methylenesulphonate,anti-CMS)[PastorWA,PapeUJ,HuangY,etal.Genome-widemappingof5-hydroxymethylcytosineinembryonicstemcells.Nature,2011,473(7347):394-7]。这些方法的基本原理是基于抗体能够识别5hmC位点，通过抗体对5hmC的免疫共沉淀，再将沉淀的5hmC片段进行克隆后sanger测序或高通量测序。这些检测方法虽能实现全基因组的5hmC位点所在片段序列及5hmC分布特征的检测，但因抗体免疫易出现非特异结合造成假阳性结果，难以精确分析特定碱基5hmC的情况以及检测成本高的缺点。基于以上分析，有必要发展一种检测5hmC的高通量、低成本及高特异的方法。
发明内容
发明目的：基于以上原因，本发明拟提供一种高通量、高特异性、高灵敏度、低成本、操作简便易行的5hmC位点检测的有效方法。
本发明是以如下技术解决方案实现的：
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于桥式PCR检测DNA羟甲基化的方法，首先将不同扩增DNA羟甲基化位点的正反向引物固定到芯片或微球；其次，用β-葡萄糖基转移酶将DNA上所有5hmC进行糖基化，再用MspI酶进行酶切，发生羟甲基化的CCGG不能够被切开，未发生羟甲基化的CCGG能够被切开；然后，再以酶切后基因组DNA为模板与芯片进行杂交，并进行在片桥式PCR:CCGG位点发生羟甲基化的因不能被酶切，而能够进行扩增；反之，CCGG位点未发生羟甲基化的因能被酶切，而不能进行扩增；最后，根据芯片不同矩阵点荧光的有无，判断出基因组DNA不同位置的CCGG是否发生了羟甲基化；
其中所述反向引物长为27bp：近5’端7个bp为T,近3’端20bp与每个CCGG位点的CGG后，包括CGG所在序列反向互补；，反向扩增引物序列为CCGG被MspI酶切后CGG+的反向互补序列；
正向引物长为20bp,且正向扩增引物序列为待检测CCGG位点近5’端的125bp处一段序列；
相邻微阵列点间的距离设为80um。
所述的芯片或微球；其表面修饰有丙烯酰胺、醛基或链霉亲和素修饰。
所述的丙烯酰胺修饰芯片上固定引物的5’端是丙烯酰胺修饰；醛基修饰芯片上固定引物的5’端为氨基修饰；链霉亲和素修饰芯片上固定引物的5’端是生物素修饰。
所述的芯片矩阵点荧光，是指在片桥式PCR过程中掺入的荧光dNTP分子，或扩增后产物用SUBGREEN染料染色后生成的荧光。
本发明的有益效果是：
a.实现基因组特定位点DNA羟甲基化位点的高通量检测。芯片上可以固定针对大量DNA羟甲基化位点的扩增引物（通常每平方厘米点阵密度高于400个），这种高密度芯片可以实现DNA羟甲基化高通量检测。
b.检测DNA羟甲基化位点信息的特异性与灵敏度较高。由于MspI内切酶能够特异性识别CCGG中5hmC，而不对其进行酶切，这样保证了检测结果的特异性。此外，桥式PCR具有极高的扩增效率，可以进行单分子的扩增，因而保证了检测过程具有极高的灵敏度。
c.低成本，对于一般芯片的检测来说，荧光探针是造成试验成本高的主要因素。本发明无需使用荧光检测探针，而是直接将荧光标记的dNTP参入扩增产物，这样极大降低了试验成本。
d.重复性高，本发明的整个操作具有标准化流程，保证芯片检测结果具有良好的重复性。
e.该芯片检测方法还具有制备简单、操作方便的特点。
附图说明
图1是检测DNA羟甲基化CCGG位点的原理示意图。
基因组DNA经糖基化修饰：发生羟甲基化胞嘧啶能被糖基化修饰。酶切：被糖基化修饰的CCGG不能被MspI酶切。芯片桥式PCR：未被酶切的DNA能够进行桥式PCR,否则不能扩增。注：C,正常胞嘧啶；5mC,甲基化胞嘧啶；5hmC,羟甲基化胞嘧啶；5ghmC，糖基化修饰的羟甲基化胞嘧啶。
图2是利用该方法检测慢性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因（GenbankACCESSIONNT_187012.1）4个CCGG位点(32048-34219)hmC的检测结果示意图。
1,阴性对照；2，32048位点和32198位点；3，3280和34100位点（每个位点样本重复2次）。绿色代表该位点发生了羟甲基化；无代表该位点没有发生羟甲基化。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的方法和效果。
实施例1
实现慢性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因（GenbankACCESSION：NT_039207）10个CCGG位点(32131-40796)hmC的检测。
针对上述10个CCGG位点，针对每个位点分别设计对应正反向扩增引物(反向引物长27碱基：近5’端7个碱基为T,近3’端20碱基与每个CCGG位点的CGG后(包括CGG)所在序列反向互补。正反向引物扩增长度为120bp；正向引物长为20bp,且正反向引物5’端均为丙烯酰修饰。
上述10个CCGG位点的正反引物对的核苷酸序列如下：
(1)32048-32167 F1  (T)7TACTGGGGCATATAAAGTTT  R1  (T)7ATGAACTAACCAGTACCCCG
(2)32198-32317 F2  (T)7CCTTTAGCTCCTTGGCTACT  R2  (T)7TCTCTTGTGAGACTATGCCG
(3)32808-32927 F3  (T)7TATGAACATAGTGGAGCATG  R3  (T)7AATTGGACATAGTACTACCG
(4)34100-34219 F4  (T)7TACTGGGGCATATAAAGTTT  R4  (T)7GCTGAGACAAGAGTGCCCCG
(5)37998-38017 F5  (T)7TGCAGTCAATAGCGCCACAG  R5  (T)7CTGCTTTTCAGGTTTCCCCG
(6)38238-38357 F6  (T)7GGCAAAGGAAGACTCTAGTG  R6  (T)7AGATCCTAGGCAGATGTCCG
(7)38564-38683 F7  (T)7AGTCACTAGTGGGAAGTGTA  R7  (T)7CCTATTTTGGGTGCTTCCCG
(8)38833-38952 F8  (T)7GCCATAAGCCATTAGAGCAA  R8  (T)7GACTAGGCGAGAGGCACCCG
(9)40474-40593 F9  (T)7ACACGTGACAAAACGTAAGG  R9  (T)7TCTCCGGGATCACACACCCG
(10)40589-40708 F10(T)7GGAGAGCAGAGTCCATTCAG R10  (T)7GCTTTTTAAGGGCGACACCG
所用芯片的表面修饰有丙烯酰胺，丙烯酰胺修饰芯片上固定引物的5’端是丙烯酰胺修饰。将每对引物稀释混合成20uM,按照检测位点的编号大小顺序固定于丙烯酰胺处理后的玻片上，相邻微阵列点间的距离设为80um。
先将1ug小鼠脊髓DNA[按照J.萨姆布鲁克等著《分子克隆实验指南（第三版）》中动物DNA提取步骤进行]经T4-BGT处理，让所有5-hmC糖基化，产生5-ghmC;再用MspI酶切糖基化的DNA（识别并切割5-mC和5-hmC，5-ghmC除外）（操作步骤按照NEB公司EpiMarkTM5-hmCand5-mC Analysis Kit进行）。再将酶切后产物同芯片37度温浴2h,TE溶液洗涤芯片2次，每次3min，将PCR反应液500ul(正反向引物中浓度为200uM，dNTP200uM（dNT为荧光dNT），Taq聚合酶10U,Mg2+1.5mM)加到芯片上，进行桥式PCR，反应条件为：90℃预变性1min,90℃变性15sec,55℃退火15sec，72℃延伸15sec，25循环后，72℃再延伸5min；随后洗涤芯片2次，扫描芯片。根据微阵列点荧光有无及强弱，即可判断出每个CCGG位点5hmC的有无。检测结果表明所检测的BDNF基因10个CCGG位点中只有(3)和(8)发生了明显的羟甲基化。
实施例2
实现慢性类风湿疼痛病人血浆DNA的BDNF基因(GenbankACCESSION:NC_000011.9)9个CCGG位点(1222-3705)hmC和COMT基因（GenbankACCESSION:NT_187012.1）8个CCGG位点(771-15422)hmC的同时检测。
针对上述12个CCGG位点，针对每个位点分别设计对应正反向扩增引物：反向引物长27碱基：近5’端7个碱基为T,近3’端20碱基与每个CCGG位点的CGG后(包括CGG)所在序列反向互补。正反向引物扩增长度为120bp，；正向引物长为20bp,且正反向引物5’端均为丙烯酰修饰，将每对引物稀释混合成20uM,固定于丙烯酰胺处理后的玻片上称为微阵列芯片。
BDNF基因检测正反向引物序列如下：
(1)1222-1341  F1  (T)7ATCCGCACGTGACAAACCGT  R1  (T)7TCGCCCGGATTACACACCCG
(2)1527-1646  F2  (T)7GCGGAGCGTTTGGAAAGCGA  R2  (T)7TAACCCAGTATACCAACCCG
(3)1676-1795  F3  (T)7AGGATCTAGCCACCGGGGTG  R3  (T)7TCCACCACGCGTCCTCTCCG
(4)2421-2540  F4  (T)7CCCTTCTGTCCTCCCTCCCC  R4  (T)7TCAGTGAGGCATCCGGCCCG
(5)2537-2656  F5  (T)7ACTGAGCCCAGGTCCGAGTC  R5  (T)7CGCCCAGGCCCCCTCGCCCG
(6)2683-2802  F6  (T)7TTAGCTCCGTGCGGCGGCTG  R6  (T)7TCGCCCGGATTACACACCCG
(7)2826-2945  F7  (T)7ACTGGCGGTGGGTGGAGGTG  R7  (T)7CGGCAGTTCGCTGTCCCCCG
(8)2946-3065  F8  (T)7TTAGGCGCCCCTGGGCGGGG  R8  (T)7TGGGGCGAAAACTGCCACCG
(9)3586-3705  F9  (T)7CGCCCGCATCACCATCGCCA  R9  (T)7ACCCCCCCCCGCCCCTCCCG
COMT基因检测正反向引物序列如下：
(1)15-134   F1  (T)7CACCGGAAGCGCCCTCCTAA  R1  (T)7ACTGGACCCGCCCCGGTCCG
(2)195-314  F2  (T)7GGATTCGGGGCGGGGGCCTT  R2  (T)7GATTCCCCACCCCAAGTCCG
(3)2467-2586  F3  (T)7ATACTGAAGGAAAGTAGATG  R3  (T)7GCATGAGCCACCGGGCCCG
(4)2565-2684  F4  (T)7CGGGAGGCCGAGGTGGGCAA  R4  (T)7TGAGTGCACCACCACGCCCG
(5)2707-2826  F5  (T)7CTTGAACTGGGAGGTGGGGG  R5  (T)7GGCGTGAGCCACCGCTCCCG
(6)2907-3026  F6  (T)7AACCCCATCTCTACTAAAAA  R6  (T)7ATTGCAAGCTCCACCTCCCG
(7)3987-4106  F7  (T)7CGTGATCTCAGCTCACTGCA  R7  (T)7AAAACACAAAAAATTAGCCG
(8)4125-4244  F8  (T)7ACTGTGTTAGCAAGGATGGT  R8  (T)7AAAAAAGAAACCTTTCCCCG
(9)4573-4692  F9  (T)7CCCTGTCTCTACCAAAAAAT  R9  (T)7ACTGCAACCTCCATGTCCCG
(10)5372-5491 F10(T)7TCGCCACACTGGCCAGGCTG  R10  (T)7AAAAAATGTTATTTAGGGCCG
所用芯片的表面修饰有丙烯酰胺，丙烯酰胺修饰芯片上固定引物的5’端是丙烯酰胺修饰。将每对引物稀释混合成20uM,按照检测位点的编号大小顺序固定于丙烯酰胺处理后的玻片上，相邻微阵列点间的距离设为80um。
先将1ug人血浆脊髓DNA[按照J.萨姆布鲁克等著《分子克隆实验指南（第三版）》中动物DNA提取步骤进行]经T4-BGT处理，让所有5-hmC糖基化，产生5-ghmC;再用MspI酶切糖基化的DNA（识别并切割5-mC和5-hmC，5-ghmC除外）（操作步骤按照NEB公司EpiMarkTM5-hmCand5-mCAnalysis Kit进行）。再将酶切后产物同芯片37度温浴2h,TE溶液洗涤芯片2次，每次3分，将PCR反应液加入芯片上，将PCR反应液500ul(正反向引物中浓度为200uM，dNTP200uM（dNT为荧光dNT），Taq聚合酶10U,Mg2+1.5mM)加到芯片上，进行桥式PCR，反应条件为：90℃预变性1min,90℃变性15sec,55℃退火15sec，72℃延伸15sec，25循环后，72℃再延伸5min；随后洗涤芯片2次，扫描芯片。
根据微阵列点荧光有无及强弱，即可判断出每个CCGG位点5hmC的有无及发生频率。检测结果表明所检测的类风湿病人血浆DNA的BDNF基因9个CCGG位点中(1)和(4)发生了明显的羟甲基化；COMT基因10个CCGG位点中(6)和(9)发生了明显的羟甲基化。
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tttttttcgc ccaggccccc tcgcccg                                         27
 
 
<210>  31
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  31
ttagctccgt gcggcggctg                                                 20
 
 
<210>  32
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  32
ttttttttcg cccggattac acacccg                                         27
 
 
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<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  33
actggcggtg ggtggaggtg                                                 20
 
 
<210>  34
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  34
tttttttcgg cagttcgctg tcccccg                                         27
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  35
ttaggcgccc ctgggcgggg                                                 20
 
 
<210>  36
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  36
ttttttttgg ggcgaaaact gccaccg                                         27
 
 
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<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  37
ttttttttgg ggcgaaaact gccaccg                                         27
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  38
tttttttacc cccccccgcc cctcccg                                         27
 
 
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<213>  人工序列
 
<400>  39
caccggaagc gccctcctaa                                                 20
 
 
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<213>  人工序列
 
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tttttttact ggacccgccc cggtccg                                         27
 
 
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<213>  人工序列
 
<400>  41
ggattcgggg cgggggcctt                                                 20
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  42
tttttttgat tccccacccc aagtccg                                         27
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  43
atactgaagg aaagtagatg                                                 20
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  44
tttttttgca tgagccaccg ggcccg                                          26
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  45
cgggaggccg aggtgggcaa                                                 20
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  46
ttttttttga gtgcaccacc acgcccg                                         27
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  47
cttgaactgg gaggtggggg                                                 20
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  48
tttttttggc gtgagccacc gctcccg                                         27
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  49
aaccccatct ctactaaaaa                                                 20
 
 
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<212>  DNA
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tttttttatt gcaagctcca cctcccg                                         27
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  51
cgtgatctca gctcactgca                                                 20
 
 
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<213>  人工序列
 
<400>  52
tttttttaaa acacaaaaaa ttagccg                                         27
 
 
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<211>  20
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<400>  53
actgtgttag caaggatggt                                                 20
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  54
tttttttaaa aaagaaacct ttccccg                                         27
 
 
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<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  55
ccctgtctct accaaaaaat                                                 20
 
 
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<213>  人工序列
 
<400>  56
tttttttact gcaacctcca tgtcccg                                         27
 
 
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<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  57
tcgccacact ggccaggctg                                                 20
 
 
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<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  58
tttttttaaa aaatgttatt tagggccg                                        28

Claims (1)

1.一种基于桥式PCR检测DNA羟甲基化的方法，其特征是：首先将不同扩增DNA羟甲基化位点的正反向引物固定到芯片或微球；其次，用β-葡萄糖基转移酶将DNA上所有5hmC进行糖基化，再用MspI酶进行酶切，发生羟甲基化的CCGG不能够被切开，未发生羟甲基化的CCGG能够被切开；然后，再以酶切后基因组DNA为模板与芯片进行杂交，并进行在片桥式PCR:CCGG位点发生羟甲基化的因不能被酶切，而能够进行扩增；反之，CCGG位点未发生羟甲基化的因能被酶切，而不能进行扩增；最后，根据芯片不同矩阵点荧光的有无，判断出基因组DNA不同位置的CCGG是否发生了羟甲基化；
其中所述反向引物长为27bp：近5’端7个bp为T,近3’端20bp与每个CCGG位点的CGG后，包括CGG所在序列反向互补；反向扩增引物序列为CCGG被MspI酶切后CGG+的反向互补序列；
正向引物长为20bp，且正向扩增引物序列为待检测CCGG位点近5’端的125bp处一段序列；
相邻微阵列点间的距离设为80um；所述的芯片或微球，其表面修饰有丙烯酰胺、醛基或链霉亲和素修饰；所述的丙烯酰胺修饰芯片上固定引物的5’端是丙烯酰胺修饰；或醛基修饰芯片上固定引物的5’端为氨基修饰；或链霉亲和素修饰芯片上固定引物的5’端是生物素修饰；所述的芯片矩阵点荧光，是指在片桥式PCR过程中掺入的荧光dNTP分子，或扩增后产物用SUBGREEN染料染色后生成的荧光。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN108300783A (zh) * 2017-01-11 2018-07-20 上海易毕恩基因科技有限公司 用于筛选肠癌和/或胃癌的基因标志物的方法、用该方法筛选的基因标志物及其用途
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CN110669831B (zh) * 2019-11-11 2023-09-19 益善生物技术股份有限公司 人sgip1、scand3和myo1g基因甲基化检测试剂盒
CN114438186A (zh) * 2022-01-28 2022-05-06 赛纳生物科技(北京)有限公司 一种芯片上恒温扩增测序的方法
CN114350774A (zh) * 2022-01-28 2022-04-15 赛纳生物科技(北京)有限公司 一种芯片表面固相引物剪切效率的检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103031375A (zh) * 2012-12-10 2013-04-10 江苏大学 一种dna甲基化检测试剂盒及其检测方法
CN103131754A (zh) * 2011-11-24 2013-06-05 深圳华大基因科技有限公司 一种检测核酸羟甲基化修饰的方法及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5580730A (en) * 1994-08-19 1996-12-03 Olympus America, Inc. Enzyme digestion method for the detection of amplified DNA

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103131754A (zh) * 2011-11-24 2013-06-05 深圳华大基因科技有限公司 一种检测核酸羟甲基化修饰的方法及其应用
CN103031375A (zh) * 2012-12-10 2013-04-10 江苏大学 一种dna甲基化检测试剂盒及其检测方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
余亮.5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的研究工具.《生物通》.2011, *

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