CN103966320A - 用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法 - Google Patents

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Abstract

用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法，按如下步骤：（1）在基片上固定特异性核酸引物；（2）将固定特异性核酸引物的基片置于扩增管中；（3）将制备好的待检测基因提取物、扩增体系加入到扩增管中；（4）将扩增管置于基因扩增仪中扩增；（5）基因扩增完成后，检测基片上的荧光信号，从而获得基因信息。本发明去除了通用的核酸杂交的步骤，极大地提高了效益，降低了成本；基片上固定特异性核酸引物，并置于扩增管中进行在片PCR，使各个PCR反应能分开进行，解决了多重PCR中引物互相干扰问题；实现一体化同时检测多个基因信息，避免了扩增、产物转移过程中可能出现的污染；使用的仪器简单且通用，普通PCR仪和荧光显微镜即可完成检测。

Description

用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法
技术领域
本发明涉及一种在片PCR扩增的基因芯片，可以用于一体化检测基因信息，使得基因扩增、检测等相应功能在同一个封闭空间内即可完成，无需转移操作。
背景技术
目前，在分子生物学、基因检测、疾病的检测与诊断等各种涉及核酸分子的检测及研究过程中，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）都是不可或缺的技术之一。PCR的原理是DNA（脱氧核糖核酸，Deoxyribonucleic acid）的半保留复制，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物，按实验需要设计引物，以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。PCR扩增方法灵敏度极高，可以将原本浓度极低的待测基因扩增到数万至数百万倍的浓度，其扩增产物一般使用电泳的方法来检测。
但是，该技术存在如下问题：首先，因为PCR扩增的高灵敏度，在扩增和转移过程中很容易发生交叉污染，而且该污染很容易被放大，出现“假阳性”的现象，不仅影响对结果的判断，还常常需要其他实验加以验证。其次，使用电泳来检测PCR扩增产物，需经染色才能显现带型，最常用的是极毒的溴化乙锭（EB）染色法。另外，一次PCR反应一般情况下只能检测一个基因的信息。如果要检测多个基因，即多重PCR，引物之间、引物与待测基因之间会产生干扰，很难实现在同一时间在一个反应体系内对多个基因的检测，因此，还无法满足人们对于多基因同时检测的需求。
基因芯片（Genechip）又称DNA芯片（DNA Chip），也称为寡核苷酸阵列或杂交阵列分析，它是根据DNA双螺旋原理而发展的核酸链间分子杂交的技术。它是在基片表面制备成千上万的基因单元作为配基，对待测基因进行筛选。基片是指玻璃，硅片，石英，金属，高分子材料，塑料片、尼龙膜、硝酸纤维膜、多孔膜，凝胶这类固相基底材料，通过化学、物理方法对其进行改性后可得到的具有功能性基团的载体表面。待测基因通过PCR扩增技术得到数量放大，再进行荧光标记，使其在筛选过程中产生可识别的荧光发射或光谱转移。此荧光信号被检测仪器检出，达到基因识别的目的。将已知的DNA（探针）和未知的核酸序列之间的一方以有序的阵列固定到载玻片或硅片上，再与荧光标记的另一方进行杂交。当荧光标记的一方在DNA芯片上发现互补序列时即发生杂交，杂交的结果以荧光和模式识别分析来检测。DNA芯片技术可以快速分析大量的基因信息，从而使生物医学工作者可以研究并收集基因表达和变异信息。
基因芯片的出现，实现了同时检测多个基因的想法，使得高通量检测基因成为了可能。尽管利用基因芯片可以高通量地获得基因的信息，同时检测多个基因，但是其待测基因的扩增、扩增产物的转移以及杂交都是在不同的体系中完成的，这难免使得每个步骤的衔接过程都增大了污染的可能性，从而降低了实验检测的准确性和可靠性。基因芯片在高通量基因检测和筛选中有重要作用，但由于制造成本及杂交反应复杂性，在低通量的实际应用中受到了限制。为此，有科学家设计了一些方法来促进其应用，如管盖芯片，其使用普通PCR扩增管，在专用管盖内侧固定分子探针，扩增后与PCR产物杂交。但其还是有DNA杂交这一步骤，为此还专门设计改造扩增管。
发明内容
本发明提供了一种用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法，即将特异性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通扩增管中进行PCR扩增，检测中无需进行核酸分子杂交过程，减化了操作，提高基因检测的准确性和可靠性。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明所述的用于一体化检测的基因芯片，在基片上固定特异性核酸引物。
本发明所述的用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法，按如下步骤：
（1）在基片上固定特异性核酸引物；
（2）将固定特异性核酸引物的基片置于扩增管中；
（3）将制备好的待检测基因提取物、扩增体系加入到扩增管中；
（4）将扩增管置于基因扩增仪中扩增；
（5）基因扩增完成后，检测基片上的荧光信号，从而获得基因信息。
步骤（2）所述的扩增体系包括相应的酶和荧光标记的核酸引物系统等。
本发明所述的基片，包括玻璃、硅片、石英、金属、高分子材料、塑料片、尼龙膜、硝酸纤维膜、多孔膜或凝胶等。
本发明所述的基因扩增仪可以是各种现有的扩增仪器，也可以是改进的专用扩增和检测一体化仪器。
即将特异性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通扩增管中进行PCR扩增，扩增体系中包括荧光标记的相应引物。
本发明将固定在基片上的特殊DNA序列，作为特异性的核酸引物的一部分放入扩增管中， 加入相应的PCR扩增体系，包括所需的带荧光标记的引物、酶以及缓冲液及待检测基因，进行PCR扩增，基因扩增完成后，检测基片上的荧光信号，从而获得基因信息。
由于本发明将特异性的核酸引物固定于扩增管内的基片（玻璃，硅片，石英，金属，高分子材料，塑料片、尼龙膜、硝酸纤维膜、多孔膜，凝胶等）上，在扩增管内构成一个相对封闭的空间，使得本发明可以被应用于一体化检测基因，能在上述相对封闭的空间内完成。本发明使得基因扩增在一个相对封闭的空间内即可完成，避免了交叉污染，省去了核酸杂交操作过程，实现了基因在片扩增的一体化。
本发明有效地整合了PCR技术与基因芯片技术的优势，弥补了其缺陷，在实现一体化高通量检测多个基因信息的同时，有效地避免了扩增、扩增产物转移过程中可能出现的污染。同时去除了在基因芯片技术中通用的核酸杂交这一步骤，也去除了PCR扩增后的电泳这一步骤，减化了操作，降低了成本，提高了效益。
本发明提供了一种用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法，有效地整合了PCR技术与基因芯片技术的优势，在实现一体化检测多个基因信息的同时，有效地避免了扩增、扩增产物转移过程中可能出现的污染。去除了在基因芯片技术中通用的核酸杂交这一步骤，减化了操作，提高了效益。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
（1）固定特异性核酸引物于基片上，该引物起着引物和探针的双重作用，从而去除了通用的核酸杂交这一步骤，极大地提高了效益，降低了成本。
（2）基片上固定特异性核酸引物，并置于扩增管中进行在片PCR，使各个PCR反应能分开进行，解决了多重PCR中引物互相干扰问题。
（3）实现一体化同时检测多个基因信息，避免了扩增、产物转移过程中可能出现的污染。
（4）使用的仪器简单且通用，普通PCR仪和荧光显微镜即可完成检测，将大大推动基因芯片技术应用。
附图说明
图1是本发明实施例1的示意图。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。
本发明的用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法，即将特异性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通扩增管中进行PCR扩增。固定在基片上的特殊DNA序列，作为引物的一部分放入扩增管中，加入相应的PCR扩增体系，包括所需的带荧光标记的引物、待检测基因、扩增体系（dNTP、相应的酶和缓冲液等），进行PCR扩增，基因扩增完成后，检测基片上的荧光信号，从而获得基因信息。扩增管内的扩增体系包括用于管内在片PCR反应的基片、基片上固定的引物系统、带标记的核酸引物系统、扩增体系（dNTP、相应的酶和缓冲液等）。
本发明的用于一体化检测基因的在片PCR基因芯片，其使用方法如下：
（1）芯片的制备
塑料基片经清洗、等离子处理、化学修饰后在基片上得到活性基团，设计特异性的核酸引物使其一段带有相应的活性基团，通过手工或点样仪将核酸探针按照一定的阵列固定到经化学处理的基片上，制备出基因芯片。
（2）基因扩增
将制备的基因芯片置于扩增管内，扩增管管内加入相应的PCR扩增体系，包括所需的带荧光标记的引物、待检测基因、扩增体系（dNTP、相应的酶和缓冲液等）。盖好管盖，将扩增管置于PCR扩增仪上扩增。
（3）芯片检测
将扩增后的基因芯片置于荧光显微镜下，逐个扫描，检查结果。
实施例2。
本发明的用于一体化检测的基因芯片及在片扩增方法，即将特异性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通扩增管中进行PCR扩增，用于检测转基因大豆。在管内玻璃芯片上通过点样仪固定上转基因大豆转入基因的特异性引物；扩增管内加入带标记的特异性的引物、待测基因、扩增体系（dNTP、相应的酶和缓冲液等）。PCR扩增后，经荧光扫描，若出现荧光，则基因扩增反应发生，待测基因中含有转入基因，表明该样品来源于转基因大豆。

Claims (4)

1.一种用于一体化检测的基因芯片，其特征是在基片上固定特异性核酸引物。
2.一种权利要求1所述的用于一体化检测的基因芯片的在片扩增方法，其特征是按如下步骤：
（1）在基片上固定特异性核酸引物；
（2）将固定特异性核酸引物的基片置于扩增管中；
（3）将制备好的待检测基因提取物、扩增体系加入到扩增管中；
（4）将扩增管置于基因扩增仪中扩增；
（5）基因扩增完成后，检测基片上的荧光信号，从而获得基因信息；
步骤（2）所述的扩增体系包括相应的酶和荧光标记的核酸引物系统。
3. 根据权利要求2所述的用于一体化检测的基因芯片的在片扩增方法，其特征是所述的基片为塑料片、玻璃、硅片、石英、尼龙膜、硝酸纤维膜制成。
4.根据权利要求2所述的用于一体化检测的基因芯片的在片扩增方法，其特征是所述的基因扩增仪为扩增仪器，或专用扩增和检测一体化仪器。
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