CN104328038A - 一体化pcr基因芯片扩增检测管 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及基因芯片，本发明一体化PCR基因芯片扩增检测管包括：以PCR基因芯片为底部的PCR管；PCR基因芯片，上面分别阵列a1；PCR管内的：带荧光标记的a2、用于扩增目标基因的扩增体系；所述a1和a2为一对扩增目标基因的特异性核酸引物。本发明技术方案简单实用，易于推广。

Description

一体化PCR基因芯片扩增检测管

技术领域

本发明涉及一种一体化PCR基因芯片扩增检测管，可以用于完全一体化进行检测基因信息，使得基因扩增、检测等相应功能在管体的封闭空间内即可完成，即扩增及检测过程中无需转移操作。

背景技术

目前，在分子生物学、基因检测、疾病的检测与诊断等各种涉及核酸分子的检测及研究过程中，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）都是不可或缺的技术之一。PCR的原理是DNA（脱氧核糖核酸，Deoxyribonucleic Acid）的半保留复制，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物，按实验需要设计引物，以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。PCR扩增方法灵敏度极高，可以将原本浓度极低的待测基因扩增到数万至数百万倍的浓度，其扩增产物一般使用电泳的方法来检测。

但是，该技术存在如下问题：首先，因为PCR扩增的高灵敏度，在扩增和转移过程中很容易发生交叉污染，而且该污染很容易被放大，出现“假阳性”的现象，不仅影响对结果的判断，还常常需要其他实验加以验证。其次，使用电泳来检测PCR扩增产物，需经染色才能显现带型，最常用的是极毒的溴化乙锭（EB）染色法。另外，一次PCR反应一般情况下只能检测一个基因的信息。如果要检测多个基因，即多重PCR，引物之间、引物与待测基因之间会产生干扰，很难实现在同一时间在一个反应体系内对多个基因的检测，因此，还无法满足人们对于多基因同时检测的需求。

基因芯片（Genechip）又称DNA芯片（DNA Chip），也称为寡核苷酸阵列或杂交阵列分析，它是根据DNA双螺旋原理而发展的核酸链间分子杂交的技术。它是在基片表面制备成千上万的基因单元作为配基，对待测基因进行筛选。基片是指玻璃，硅片，石英，金属，高分子材料，塑料片、尼龙膜、硝酸纤维膜、多孔膜，凝胶这类固相基底材料，通过化学、物理方法对其进行改性后可得到的具有功能性基团的载体表面。待测基因通过PCR扩增技术得到数量放大，再进行荧光标记，使其在筛选过程中产生可识别的荧光发射或光谱转移。此荧光信号被检测仪器检出，达到基因识别的目的。将已知的DNA（探针）和未知的核酸序列之间的一方以有序的阵列固定到载玻片或硅片上，再与荧光标记的另一方进行杂交。当荧光标记的一方在DNA芯片上发现互补序列时即发生杂交，杂交的结果以荧光和模式识别分析来检测。DNA芯片技术可以快速分析大量的基因信息，从而使生物医学工作者可以研究并收集基因表达和变异信息。

基因芯片的出现，实现了同时检测多个基因的想法，在高通量基因检测和筛选中有重要作用，但由于制造成本及杂交反应复杂性，在低通量的实际应用中受到了限制。为此，有科学家设计了一些方法来促进其应用，如管盖芯片，其使用普通PCR扩增管，在专用管盖内侧固定分子探针，扩增后与PCR产物杂交。

利用基因芯片可以获得基因的信息，同时检测多个基因，但是其待测基因的扩增、扩增产物的转移杂交以及信号的检测都是在不同的空间体系中完成的，增大了污染的可能性。一方面，增加了实验体系被外界污染的可能性；另一方面，也增加了实验体系污染外界环境和操作人员的可能性，特别是当实验人员对烈性实验对象进行实验操作时，将增大实验人员暴露于生物污染环境的风险。污染可能性的增加会降低实验检测的准确性和可靠性甚至人员的安全性，这必然对实验中每个步骤的衔接过程，实验操作环境，实验人员操作规范都提出很高的要求。

发明内容

本发明提供了一种一体化PCR基因芯片扩增检测管，即将PCR管与基因芯片相集成：把固定了特异性核酸引物的透明基片作为PCR实验管的底部。实验中无需进行核酸分子杂交过程，信号检测过程无需进行基因芯片的转移，简化了操作过程，从根本上降低了污染的可能性，提高了基因检测的准确性和可靠性，和实验人员的安全性。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种一体化PCR基因芯片扩增检测管包括：

以PCR基因芯片为底部的PCR管；PCR基因芯片，上面分别阵列a1；PCR管内的：带荧光标记的a2以及用于扩增目标基因的扩增体系；所述a1和a2为一对扩增目标基因A的特异性核酸引物。

为了同时检测多种目标基因，PCR基因芯片，上面分别阵列多种特异性核酸引物a1、b1、c1、d1、e1、f1…如此类推；PCR管内的：带荧光标记的多种特异性核酸引物a2、b2、c2、d2、e2、f2…如此类推、以及用于扩增目标基因的扩增体系；所述PCR基因芯片，上面分别阵列的多种特异性核酸引物a1、b1、c1、d1、e1、f1…，分别对应的在PCR管内有扩增目标基因特异性核酸引物一对中的另一条a2、b2、c2、d2、e2、f2…。

所述的用于扩增目标基因的扩增体系为：Taq酶、dNTP、PCR缓冲液、BSA。

基因芯片PCR管检测目标基因的方法，包括：将待测样品加入基因芯片PCR管中，置于基因扩增仪中扩增，置于荧光检测仪上读取结果。

本发明所述的一体化PCR基因芯片扩增检测管，是以PCR基因芯片为管底部的管状与类管状结构管。

本发明所述的PCR基因芯片，在基片上固定特异性核酸引物。

本发明所述的基片，包括玻璃、硅片、石英、高分子材料、塑料片等。

本发明所述的基因扩增仪可以是各种现有的扩增仪器，也可以是改进的专用扩增和检测一体化仪器。

本发明将固定了作为特异性的核酸引物的一部分的DNA序列的基片替代原有PCR管的底部部分，加入相应的PCR扩增体系，包括所需的带荧光标记的引物、酶以及缓冲液及待检测基因，进行PCR扩增，基因扩增完成后，无需转移基因芯片即可检测基片上的荧光信号，从而获得基因信息。

由于本发明将PCR基因芯片作为传统PCR管的底部，PCR基因芯片既作为在片扩增过程的载体，又作为信号检测过程的信号载体，使得反应环境与检测环境在同一个封闭的空间，从而本发明可以使得实验反应与检测过程在上述同一封闭的空间内完成，避免了实验操作转移过程中与环境和实验人员的交叉污染，省去了核酸杂交与芯片检测转移操作过程，实现了基因在片扩增与检测的一体化。

本发明有效地整合了PCR技术、基因芯片技术和PCR管设计的优势，弥补了其缺陷，在实现一体化检测多个基因信息的同时，有效地避免了扩增、扩增产物转移，基因芯片检测过程中可能出现的污染，同时去除了在基因芯片技术中通用的核酸杂交这一步骤，也去除了PCR扩增反应后电泳检测这一步骤。减化了操作流程，减少了实验体系与环境和实验人员的接触，降低了成本，提高了效益和安全性。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）PCR基因芯片作为PCR反应管的底部，该芯片既作为在片扩增过程的载体，又作为信号检测过程的信号载体，从而避免了通常实验中需转移基因芯片到不同空间环境中进行信号检测的操作，从根本上降低了与外界环境和实验人员接触污染的可能性，提高了基因检测的准确性、可靠性和实验人员的安全性，极大地提高了效益。

（2）固定特异性核酸引物于基片上，该引物起着引物和探针的双重作用，从而去除了通用的核酸杂交这一步骤，极大地提高了效益，降低了成本。

（3）基片上固定特异性核酸引物进行在片PCR，使各个PCR反应能分开进行，解决了多重PCR中引物互相干扰问题。

（4）实现一体化同时检测多个基因信息，避免了扩增、产物转移过程中可能出现的污染。

（5）使用的仪器简单且通用， PCR仪和荧光显微镜即可完成检测，将大大推动基因芯片技术应用。

附图说明

图1是本发明管式PCR基因芯片的示意图；

图2实施例3荧光检测结果。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

实施例1

1、一体化PCR基因芯片扩增检测管制备：

根据目标基因A的序列，设计一对扩增目标基因A的特异性核酸引物a1及a2。

以聚二甲基硅氧烷基片为管底制成PCR反应管：聚二甲基硅氧烷基片经清洗、等离子处理、化学修饰后在基片上得到活性基团。通过手工或点样仪将特异性核酸引物a1按照一定的阵列固定到经化学处理的基片上，制备出基因芯片。

将该基因芯片作为PCR管底部制作成本发明。

2、将扩增目标基因A的特异性核酸引物a2连接上荧光标记物，得a2-荧光标记物，备用。

PCR管内还有a2-荧光标记物、以及用于扩增目标基因A的扩增体系（dNTP、Taq酶和缓冲液、BSA等）。

所以本发明一体化PCR基因芯片扩增检测管包括：

以PCR基因芯片为底部的PCR管；PCR管底基因芯片，上面连接有扩增目标基因A的特异性核酸引物a1；PCR管内的：带荧光标记的扩增目标基因A的特异性核酸引物a2、以及用于扩增目标基因的扩增体系（dNTP、Taq酶和缓冲液、BSA等）。

3、测定

在PCR管中加入待测样品溶液。盖好管盖，将扩增管置于PCR扩增仪上扩增，置于荧光显微镜下观察结果。

如果待测溶液中含有目标基因A，则目标基因A在PCR管内扩增（因为引物a1、a2及扩增体系齐全），并连接在PCR管底的基因芯片上，并带有荧光标记。在荧光显微镜下可以看到基因芯片连接有a1处有荧光。

如果待测溶液中不含有目标基因A，则无法完成目标基因A的扩增过程，在荧光显微镜下不可以看到基因芯片连接有a1处有荧光。

实施例2

1、一体化PCR基因芯片扩增检测管基因芯片制备：

根据目标基因A的序列，设计一对扩增目标基因A的特异性核酸引物a1及a2。

根据目标基因B的序列，设计一对扩增目标基因A的特异性核酸引物b1及b2。

根据目标基因C的序列，设计一对扩增目标基因A的特异性核酸引物c1及c2。

根据目标基因D的序列，设计一对扩增目标基因A的特异性核酸引物d1及d2。

以聚二甲基硅氧烷基片为管底制成PCR反应管：聚二甲基硅氧烷基片经清洗、等离子处理、化学修饰后在基片上得到活性基团。通过手工或点样仪将特异性核酸引物a1、b1、c1、d1按照一定的阵列固定到经化学处理的基片上，制备出基因芯片。

将该基因芯片作为PCR管底部制作成本发明。

2、将扩增目标基因A的特异性核酸引物a2连接上荧光标记，得a2-荧光标记，备用。

将扩增目标基因B的特异性核酸引物b2连接上荧光标记，得b2-荧光标记，备用。

将扩增目标基因C的特异性核酸引物c2连接上荧光标记，得c2-荧光标记，备用。

将扩增目标基因D的特异性核酸引物d2连接上荧光标记，得d2-荧光标记，备用。

PCR管内还有a2-荧光标记、b2-荧光标记、c2-荧光标记、d2-荧光标记以及用于扩增目标基因A、B、C、D的扩增体系（dNTP、Taq酶和缓冲液、BSA）。

所以本发明一体化PCR基因芯片扩增检测管包括：

以PCR基因芯片为底部的PCR管；PCR管底基因芯片，上面分别连接有扩增目标基因A、B、C、D的特异性核酸引物a1、b1、c1、d1；PCR管内的：带荧光标记的扩增目标基因A的特异性核酸引物a2、带荧光标记的扩增目标基因A的特异性核酸引物b2、带荧光标记的扩增目标基因A的特异性核酸引物c2、带荧光标记的扩增目标基因A的特异性核酸引物d2以及用于扩增目标基因的扩增体系（dNTP、Taq酶和缓冲液、BSA）。

如图1。

3、测定

在PCR管中加入待测样品溶液。盖好管盖，将扩增管置于PCR扩增仪上扩增，置于荧光显微镜下观察结果。

如果待测溶液中含有目标基因A，则目标基因A在PCR管内扩增（因为引物a1、a2及扩增体系齐全），并连接在PCR管底的基因芯片上，并带有荧光标记。在荧光显微镜下可以看到基因芯片连接有a1处有荧光。

如果待测溶液中不含有目标基因A，则无法完成目标基因A的扩增过程，在荧光显微镜下不可以看到基因芯片连接有a1处有荧光。

如果待测溶液中含有目标基因B，则目标基因B在PCR管内扩增（因为引物b1、b2及扩增体系齐全），并连接在PCR管底的基因芯片上，并带有荧光标记。在荧光显微镜下可以看到基因芯片连接有b1处有荧光。

如果待测溶液中不含有目标基因B，则无法完成目标基因B的扩增过程，在荧光显微镜下不可以看到基因芯片连接有b1处有荧光。

如果待测溶液中含有目标基因C，则目标基因C在PCR管内扩增（因为引物c1、c2及扩增体系齐全），并连接在PCR管底的基因芯片上，并带有荧光标记。在荧光显微镜下可以看到基因芯片连接有c1处有荧光。

如果待测溶液中不含有目标基因C，则无法完成目标基因C的扩增过程，在荧光显微镜下不可以看到基因芯片连接有c1处有荧光。

如果待测溶液中含有目标基因D，则目标基因D在PCR管内扩增（因为引物d1、d2及扩增体系齐全），并连接在PCR管底的基因芯片上，并带有荧光标记。在荧光显微镜下可以看到基因芯片连接有d1处有荧光。

如果待测溶液中不含有目标基因D，则无法完成目标基因D的扩增过程，在荧光显微镜下不可以看到基因芯片连接有d1处有荧光。

实施例3

本发明一体化PCR基因芯片扩增检测管，应用于检测转基因大豆。以检测抗草甘膦转基因大豆外源基因花椰菜花叶病毒的 CaMV35S 启动子、胭脂碱合成酶的 NOS 终止子以及 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因 CP4-epsps的检测为例。

1、基因芯片制备：

根据目标基因CaMV35s的序列，设计一对扩增目标基因CaMV35s的特异性核酸引物35s-F：5'-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3'及35s-R：5'-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3'。

根据目标基因NOS的序列，设计一对扩增目标基因NOS的特异性核酸引物NOS-F：5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3'及NOS-R：5'-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3'。

根据目标基因CP4-epspsS的序列，设计一对扩增目标基因CP4-epsps的特异性核酸引物CP4-F：5'-CTT CTG TGC TGT AGC CAC TGA TGC-3'及CP4-R：5'-CCA CAT TCC TTC GCA AGA CCC TTC C-3'。

根据作为对照的无关基因BT Cry1A的序列，设计一对扩增对照基因Cry1A的特异性核酸引物Cry1A-F：5'-CAATATCGGTATCAACAACCAGC-3'及Cry1A-R：5'-GGCACGTTGTTGTTCTGTGGTGG-3'。

以聚二甲基硅氧烷基片为管底制成PCR反应管：聚二甲基硅氧烷基片经清洗、等离子处理、化学修饰后在基片上得到活性基团。通过手工或点样仪将特异性核酸引物35s-F、NOS-F、CP4-F、Cry1A-F按照一定的阵列固定到经化学处理的基片上，制备出基因芯片。

将该基因芯片作为PCR管底部制作成本发明。

2、将扩增目标基因CaMV35s的特异性核酸引物35S-R连接上荧光标记，得35S-R -荧光标记，备用。

将扩增目标基因NOS的特异性核酸引物NOS-R连接上荧光标记，得NOS-R-荧光标记，备用。

将扩增目标基因Cp4-epsps的特异性核酸引物CP4-R连接上荧光标记，得CP4-R-荧光标记，备用。

将扩增对照基因Bt的特异性核酸引物Cry1A-R连接上荧光标记，得Cry1A-R-荧光标记，备用。

PCR管内还有35S-R -荧光标记、NOS-R-荧光标记、CP4-R-荧光标记、Cry1A-R-荧光标记以及用于扩增目标基因CaMV35S、NOS、CP4-epsps和对照基因Bt Cry1A的检测为例的扩增体系（dNTP、Taq酶和PCR buffer、BSA）。

3、测定

在PCR管中加入待测样品溶液。盖好管盖，将扩增管置于PCR扩增仪上扩增(PCR的反应条件为: 95℃，40s; 52℃，40s; 72℃，45s; 50cycle)，置于荧光显微镜下观察结果。

如果荧光检测显示35s-F和（或）NOS-F和（或）CP4-F点位处有荧光，空白对照检测点位处无荧光，则表明待测基因中含有抗草甘膦基因，表明该样品中检出抗草甘膦转基因大豆成分；（图2）

如果荧光检测显示35s-F、NOS-F、CP4-F点位处均无荧光，空白对照检测点位处无荧光，则表明待测基因中不含有抗草甘膦基因，表明该样品中未检出抗草甘膦转基因大豆成分；

如果荧光检测显示35s-F、NOS-F、CP4-F点位处均无荧光，空白对照检测点位处有荧光，则表明检测系统失效。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南昌大学

 

<120>  一体化PCR基因芯片扩增检测管

 

<130>  2014

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gatagtggga ttgtgcgtca                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gctcctacaa atgccatca                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gaatcctgtt gccggtcttg                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ttatcctagt ttgcgcgcta                                                 20

 

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cttctgtgct gtagccactg atgc                                            24

 

 

<210>  6

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ccacattcct tcgcaagacc cttcc                                           25

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

caatatcggt atcaacaacc agc                                             23

 

 

<210>  8

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

ggcacgttgt tgttctgtgg tgg                                             23

 

 

Claims (3)

1.一体化PCR基因芯片扩增检测管，包括：以PCR基因芯片为底部的PCR管；PCR基因芯片，上面分别阵列a1；PCR管内的：带荧光标记的a2、用于扩增目标基因的扩增体系；所述a1和a2为一对扩增目标基因的特异性核酸引物。

2.根据权利要求1所述的一体化PCR基因芯片扩增检测管，其特征在于：PCR基因芯片，上面分别阵列多种特异性核酸引物a1、b1、c1、d1、e1、f1…如此类推；PCR管内的：带荧光标记的多种特异性核酸引物a2、b2、c2、d2、e2、f2…如此类推、以及用于扩增目标基因的扩增体系；所述扩增体系包括dNTP、Taq酶和PCR buffer、BSA；所述PCR基因芯片，上面分别阵列的多种特异性核酸引物a1、b1、c1、d1、e1、f1…，分别对应的在PCR管内有扩增目标基因特异性核酸引物一对中的另一条a2、b2、c2、d2、e2、f2…。

3.利用权利要求1一体化PCR基因芯片扩增检测管检测目标基因的方法，包括：将待测样品溶液加入基因芯片PCR管中，置于基因扩增仪中扩增，置于荧光检测仪上读取结果。