KR20180132603A - 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트 - Google Patents

클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명의 과제는, 위음성이나 위양성과 같은 오판정이 발생할 확률이 낮고, 감도 및 특이성이 우수한, 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명은, 「서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머로 이루어지는 제 1 프라이머쌍을 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 그 프라이머 세트를 사용하는 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트」에 관한 것이다.

Description

클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트
본 발명은, 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)(이하, CT 로 약기하는 경우가 있다.) 를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법, 그 방법을 실시하기 위한 시약 키트에 관한 것이다.
오늘날, 성풍속의 다양화나 젊은이를 중심으로 하는 성행동 양식의 변화에 수반하여, 클라미디아 감염증의 증가가 현저하다.
클라미디아 감염증의 원인균은, 클라미디아 트라코마티스이고, 인간의 눈이나 요도, 자궁경관이나 인두에 감염하여, 여러 가지 염증을 일으킨다. 또, 클라미디아 트라코마티스에는, 인간에 감염할 수 있는 15 종류 정도의 혈청형 (A-K, Ba, L1-L3 등) 이 알려져 있다. 그 때문에, 복수 혈청형의 클라미디아 트라코마티스를 검출할 필요가 있다.
현재, 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법으로는, 핵산 증폭 반응을 이용한, 클라미디아 트라코마티스에 특이적인 잠재 플라스미드 (Cryptic plasmid) 를 검출하는 방법이 주류로 되어 있다 (특허문헌 1, 비특허문헌 1).
또, 클라미디아 트라코마티스의 임상 시료는, 소변, 인두, 자궁경관으로부터 채취하는 것이 추천되고 있다. 그러나, 소변, 인두, 자궁경관 유래의 시료에는, 인간 게놈 DNA 가 포함되어 있고, 이 인간 게놈 DNA 는, 목적의 핵산 증폭 반응을 저해해 버리는 것을 알고 있다. 그 때문에, 인간 게놈 DNA 존재하여도, 특이적으로 클라미디아 트라코마티스를 증폭시킬 필요가 있다.
일본 특허 제5811086호
Moller, J. K., et al., Journal of Clinical Microbiology, 2008, 46, p.3892-3895
그러나, 특허문헌 1 및 비특허문헌 1 에 있어서 개시된 검출 방법에서는, 인간 게놈 DNA 등의 협잡 DNA 존재하에서 핵산 증폭 반응을 실시하면, 비특이적인 핵산이 다수 증폭되어 버린다. 그 결과, 소변, 인두, 자궁경관 유래의 시료를 사용한 클라미디아 트라코마티스의 검출을 실시하면, 위양성이 발생해 버리는 경우가 있었다.
또, 비특허문헌 1 에 있어서 개시된 검출 방법에서는, 클라미디아 트라코마티스의 복수의 혈청형을 검출할 수 없으므로, 위음성이 발생해 버리는 경우도 있었다.
요컨대, 핵산 증폭 반응을 이용한, 종래의 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법에서는, 위음성이나 위양성과 같은 오판정이 발생해 버린다는 문제를 가지고 있었다.
본 발명은, 상기한 바와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 위음성이나 위양성과 같은 오판정이 발생할 확률이 낮고, 감도 및 특이성이 우수한 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트의 제공을 과제로 한다.
본 발명은, 상기 과제를 해결할 목적으로 이루어진 것으로, 이하의 구성으로 이루어진다.
(1) 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 1 프라이머쌍을 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트.
(2) 상기 (1) 의 프라이머 세트를 사용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시하고, 얻어진 핵산 증폭 산물을 검출하는 것을 특징으로 하는, 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
(3) 상기 (1) 의 프라이머 세트를 포함하여 이루어지는, 클라미디아 트라코마티스 검출용 시약 키트.
본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 의하면, 인간 게놈 DNA 등의 협잡 DNA 존재하여도, 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 있다. 또, 인간에 감염할 수 있는 클라미디아 트라코마티스의 복수의 혈청형을 검출할 수도 있다.
또한, 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트를 사용하는 본 발명의 방법은, 종래법에서 발생하는 위음성이나 위양성과 같은 오판정을 경감하고, 클라미디아 트라코마티스를 고감도로 특이적으로 정밀하게 검출할 수 있다.
도 1 은 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2 에서 얻어진, 인간 게놈 DNA 함유 시료에 대해, 각종 프라이머쌍을 사용하여 얻어진 PCR 증폭 산물을 캐필러리 전기 영동에 의해 분리, 검출한 영동도이다.
도 2 는 실시예 3 및 비교예 3 에서 얻어진, 클라미디아 트라코마티스 DNA 및 인간 게놈 DNA 함유 시료에 대해, 각종 프라이머쌍을 사용하여 얻어진 PCR 증폭 산물을 캐필러리 전기 영동에 의해 분리, 검출한 영동도이다.
도 3 은 실시예 5 및 비교예 4 에서 얻어진, 인간 게놈 DNA 함유 시료에 대해, 각종 프라이머쌍을 사용하여 얻어진 멀티플렉스 PCR 증폭 산물을 캐필러리 전기 영동에 의해 분리, 검출한 영동도이다.
도 4 는 실시예 6 및 비교예 5 에서 얻어진, 클라미디아 트라코마티스 DNA 및 인간 게놈 DNA 함유 시료에 대해, 각종 프라이머쌍을 사용하여 얻어진 멀티플렉스 PCR 증폭 산물을 캐필러리 전기 영동에 의해 분리, 검출한 영동도이다.
도 5 는 실시예 6 및 비교예 5 에서 얻어진, 영동도에 있어서의 클라미디아 트라코마티스 잠재 플라스미드에 대응하는 밴드의 형광 강도 (농도) 로부터 산출한, 클라미디아 트라코마티스 잠재 플라스미드의 핵산 농도를 나타내는 도면이다.
＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트
본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 (이하, 본 발명의 프라이머 세트라고 약기하는 경우가 있다.) 는, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 1 프라이머쌍 (이하, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍으로 약기하는 경우가 있다.) 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머는, 클라미디아 트라코마티스의 잠재 플라스미드 pLGV440 (이하, 잠재 플라스미드라고 약기하는 경우가 있다.) 에 어닐링하는 것이다. 이들 프라이머의 조합으로 이루어지는 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍과, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 (서열 번호 1, GenBankID : HE603230.1, 염기 번호 1 ∼ 7492) 을 사용하여 핵산 증폭 반응 (PCR 등) 에 부여하면, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 중, 서열 번호 2 로 나타내는 염기 서열을 가지는 염기 번호 4770 ∼ 4917 의 영역 (148 염기쌍) 이 증폭된다.
본 발명의 프라이머 세트는, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍에 더하여, 추가로 클라미디아 트라코마티스의 게놈 DNA (이하, CT 게놈 DNA 라고 약기하는 경우가 있다.) 와 어닐링하는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 2 프라이머쌍 (이하, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍이라고 약기하는 경우가 있다.) 을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍은, CT 게놈 DNA 와 어닐링하는 것이면 어떤 것이어도 된다. 또한, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열은, GenBankID : HE601796.2 에 개시되어 있다.
또, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍은, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍과는 상이한 염기 서열이다.
본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍은, 자체 공지된 방법에 따라 설계되면 된다.
예를 들어, 프라이머 설계를 위해서 일반적으로 이용되고 있는 프라이머 디자인용 소프트 (예를 들어, Primer3) 등) 를 사용하여 프라이머를 설계하면 된다.
그 때, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍에 있어서의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기수는, 각각 통상 프라이머 배열로서의 특이성을 유지하기 위해서 필요한 염기수라고 생각되고 있는 10 ∼ 50 염기이고, 10 ∼ 35 염기가 바람직하고, 15 ∼ 35 염기가 보다 바람직하며, 18 ∼ 30 염기가 특히 바람직하다.
본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 구체예로는, 서열 번호 7 ∼ 9 중 어느 것으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍으로서, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머, 및 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응 (PCR 등) 에 부여하면, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 중, 염기 번호 782264 ∼ 782436 의 영역 (서열 번호 3 : 173 염기쌍) 이 증폭된다.
또, 서열 번호 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머, 및 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응 (PCR 등) 에 부여하면, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 중, 염기 번호 782264 ∼ 782436 의 영역 (서열 번호 3 : 173 염기쌍) 이 증폭된다.
또한, 서열 번호 9 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머, 및 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응 (PCR 등) 에 부여하면, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 중, 염기 번호 782264 ∼ 782437 의 영역 (서열 번호 4 : 174 염기쌍) 이 증폭된다.
그 중에서도, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍으로는, 서열 번호 7 또는 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하고, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.
잠재 플라스미드를 대상으로 하는 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍에, CT 게놈 DNA 를 대상으로 하는 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 첨가한 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 경우, 최근 보고되고 있는 잠재 플라스미드가 결손한 클라미디아 트라코마티스 변이주 (An, Q., et al., Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30, p.2814-2821) 여도, 그 핵산을 증폭, 검출할 수 있다.
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 구성하는 프라이머 (이하, 본 발명에 관련된 프라이머라고 약기하는 경우가 있다.) 를 얻는 방법으로는, 특별히 한정은 되지 않지만, 자체 공지된 화학 합성법에 의해 조제하는 방법, 벡터 등을 사용하는 유전자 조작법에 의해 얻는 방법을 들 수 있다. 그 중에서도, 용이·대량 또한 염가로 일정 품질의 프라이머를 얻는 것이 가능한 점에서, 화학 합성법이 바람직하다.
예를 들어, DNA 신시사이저를 이용하여, 통상적인 포스포라미디트법으로 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 음이온 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하면, 목적으로 하는 본 발명에 관련된 프라이머를 얻을 수 있다.
또한, 프라이머의 합성을 실시하는 위탁 업자로부터 구입해도 된다.
본 발명에 관련된 프라이머 중 적어도 1 개는, 표지 물질로 표지된 것이어도 된다.
표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 프라이머를 사용하는 경우로서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍만을 사용하는 경우에는, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
또, 표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 프라이머를 사용하는 경우로서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍과 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 2 개의 프라이머쌍을 사용하는 경우에는, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명에 관련된 프라이머를 표지 물질로 표지하기 위해서 사용되는 표지 물질로는, 형광 물질, 방사성 동위체나 효소, 발광 물질 등 공지된 표지 물질을 예시할 수 있고, 형광 물질이 바람직하다.
상기 형광 물질로는, 예를 들어 TAMRATM (시그마 알드리치 주식회사 제조), Alexa555, Alexa647 (서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조), Cyanine Dye 계의 Cy3, Cy5 (GE 헬스 케어 주식회사 제조), 플루오레세인 등을 들 수 있고, TAMRATM (시그마 알드리치 주식회사 제조) 이 바람직하다.
상기 방사성 동위체로는, 예를 들어 32P, 33P, 35S 등을 들 수 있다.
상기 효소로는, 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 등을 들 수 있다.
상기 발광 물질로는, 예를 들어 Acridinium Ester 를 포함하는 화학 발광 시약 등을 들 수 있다.
또한, 표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 프라이머는, 직접 표지 물질이 프라이머에 결합하고 있어도 되고, 링커를 개재하여 결합하고 있어도 된다. 그 링커로는, 이 분야에서 통상 사용되는 것이면 되고, 1 ∼ 3 염기의 핵산이어도 된다.
본 발명에 관련된 프라이머를 표지 물질로 표지하는 방법으로는, 이 분야에서 통상 실시되고 있는 올리고뉴클레오티드의 표지 방법을 들 수 있고, 표지 물질마다 적절한 방법을 선택하면 된다.
본 발명에 관련된 프라이머를 형광 물질로 표지하는 방법으로는, 예를 들어 플루오레세인 표지한 뉴클레오티드를 자체 공지된 방법에 따라, 프라이머에 혼입시키는 방법을 들 수 있다.
또, 링커 아암을 갖는 뉴클레오티드를 배열의 올리고뉴클레오티드 중으로 치환하는 방법 (Nucleic Acids Res., 1986년, 제14권, p.6115) 으로도 뉴클레오티드를 형광 물질로 표지할 수 있다. 예를 들어, 5 위치에 링커 아암을 갖는 우리딘을 일본 공개특허공보 소60-500717호에 개시된 합성법에 의해 디옥시우리딘으로부터 화학 합성하고, 그 디옥시우리딘을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이어서 그 올리고뉴클레오티드 사슬에 형광 물질을 도입하는 방법이 있다 (일본 공개특허공보 소60-500717호).
본 발명에 관련된 프라이머를 방사성 동위체로 표지하는 방법으로는, 예를 들어 프라이머를 합성할 때에, 방사성 동위체로 표지된 뉴클레오티드를 혼입시키는 것에 의해, 프라이머를 표지하는 방법이나, 프라이머를 합성한 후, 방사성 동위체로 표지하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 일반적으로 사용되는 랜덤 프라이머법, 닉 트랜슬레이션, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제에 의한 5' 말단 표지법, 터미널 디옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제를 사용한 3' 말단 표지법 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 프라이머를 효소로 표지하는 방법으로는, 예를 들어 알칼리 포스파타아제, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 등의 효소 분자를, 표지하는 프라이머에 직접 공유 결합시키는 등의 직접 표지법을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 프라이머를 발광 물질로 표지하는 방법으로는, 자체 공지된 방법에 따라, 뉴클레오티드를 발광 표지하는 방법을 들 수 있다.
또, 비오틴-아비딘 반응을 이용한 검출 시스템에 따라, 상기 표지 물질을 본 발명에 관련된 프라이머에 결합시켜도 된다.
그 때에는, E. P. Diamandis, T. K. Christopoulos, Clinical Chemistry 1991, 37, p.p.625-636 에 기재된 수법에 따라 실시하면 된다.
＜2＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출 방법
본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출 방법 (이하, 본 발명의 CT 검출 방법이라고 약기하는 경우가 있다.) 은, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 1 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시하고, 얻어진 핵산 증폭 산물을 검출함으로써 이루어진다.
본 발명의 CT 검출 방법에 사용되는 시료로는, 예를 들어 소변, 요도 스왑 현탁액, 질 스왑 현탁액, 자궁경관 스왑 현탁액, 양치액, 구강 스왑 현탁액, 인두 스왑 현탁액 등의 각종 임상 시료나 배양균체 등을 들 수 있다. 이들 시료는, 본 발명의 CT 검출 전에, 미리 시료 중에 존재하는 균의 농축, 분리나, 균체로부터의 DNA 의 추출, 정제 등의 조작을 전처리로서 실시해도 된다. 그 방법으로는, 효소, 계면 활성제, 알칼리, 열에 의한 처리 등이 있다.
상기 시료로부터 DNA 를 추출 및 정제하려면, 자체 공지된 방법에 따라 실시하면 되고, 구체적으로는 클라미디아의 세포벽을 파괴한 후, DNA 의 추출 및 정제를 실시하면 된다.
상기 시료 중의 클라미디아의 세포벽을 파괴하는 방법으로는, SDS 등의 계면 활성제나, 구아니딘티오시아네이트 (GTC) 등의 단백 변성제로 균체를 처리하여 클라미디아의 막구조를 파괴하는 방법, 또는 유리 비즈 등에 의해 물리적으로 파쇄하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 DNA 의 추출 및 정제는, 클라미디아의 세포벽을 파괴한 후, 페놀 및 클로로포름을 사용하여 추출 및 정제하는 방법, 에탄올, 이소프로판올 등을 사용하여 추출 및 정제하는 방법 등에 의해 이루어지면 된다.
또, DNA 의 추출 및 정제는, 시판되는 키트 [예를 들어, Genomic-tip (주식회사 퀴아젠 제조)] 를 사용하여 실시해도 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에는, 추가로 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용해도 된다. 구체적으로는, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 1 프라이머쌍과, 서열 번호 7 ∼ 9 중 어느 것으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시하고, 얻어진 핵산 증폭 산물을 검출함으로써 이루어진다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우의 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍과 제 2 프라이머쌍의 조합으로는, 이하에 나타내는 표 1 의 (1) 또는 (2) 가 바람직하고, (1) 이 보다 바람직하다.
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본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 본 발명에 관련된 프라이머 중 적어도 1 개는 표지 물질로 표지된 것을 사용해도 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 프라이머를 사용하는 경우로서, CT 검출용 프라이머로서 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍만을 사용하는 경우에는, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 프라이머를 사용하는 경우로서, CT 검출용 프라이머로서 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍과 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 2 개의 프라이머쌍을 사용하는 경우에는, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
또, 임균은, 클라미디아 트라코마티스와 동시에 감염하는 경우가 많지만, 치료약이 클라미디아 트라코마티스의 경우와는 상이하다. 그 때문에, 클라미디아 트라코마티스와 임균을 동시에 검출하는 것은 임상적 의의가 높다. 그래서, 클라미디아 트라코마티스와 임균을 동시에 검출하는 경우에는, 본 발명의 프라이머 세트와 임균을 검출하는 프라이머쌍을 사용하여 핵산 증폭 반응을 실시하고, 클라미디아 트라코마티스 유래의 핵산 증폭 산물과 임균 유래의 핵산 증폭 산물을 검출하면 된다.
또한, 내부 컨트롤로서 적당한 균을 선택하고, 당해 균 유래의 핵산, 및 당해 균을 검출하기 위한 프라이머쌍을 첨가하고, 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 핵산 증폭 반응을 실시하고, 클라미디아 트라코마티스 유래의 핵산 증폭 산물과 당해 균 유래의 핵산 증폭 산물을 검출함으로써, 핵산 증폭 반응을 올바르게 실시할 수 있었는지 여부를 확인해도 된다.
또한, 내부 컨트롤로서 선택하는 균은, 예를 들어 클라미디아 트라코마티스만을 검출하는 경우, 클라미디아 트라코마티스 이외의 균이고, 클라미디아 트라코마티스 및 임균을 검출하는 경우, 클라미디아 트라코마티스 및 임균 이외의 균이다.
또한, 본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 임균 검출용 프라이머쌍 및 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍을 구성하는 프라이머는, 각각 표지 물질로 표지된 것을 사용해도 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 표지 물질로 표지된 임균 검출용 프라이머쌍을 사용하는 경우에는, 임균 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 표지 물질로 표지된 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍을 사용하는 경우에는, 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서, 표지 물질로 표지된 임균 검출용 프라이머쌍 및 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍을 사용하는 경우에는, 임균 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방 및 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에 사용하는 프라이머, 프라이머쌍, 프라이머 세트, 표지 물질 및 표지 물질로 표지하는 방법의 상세한 것에 대하여는, ＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 있어서 기재한 바와 같다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서의 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 실시하는 핵산 증폭 반응 (이하, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응이라고 약기하는 경우가 있다.) 은, 특별히 제한되지 않고, 자체 공지된 방법에 따라 실시하면 된다. 구체적으로는, 예를 들어 PCR (Polymerase Chain Reaction) 법, TMA (Transcription-mediated amplfication) 법, SDA (Strand Displacement Amplification) 법 등을 들 수 있고, PCR 법이 바람직하다.
또, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 있어서의 타겟은 통상 DNA 이지만, 타겟이 RNA 여도 역전사에 의해 상보적 DNA (cDNA) 를 합성하여, 타겟으로 할 수 있다. 그 방법으로는, 예를 들어 TRC (Transcription-Reverse Transcription Concerted Reaction) 법 등을 들 수 있다.
본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 있어서 사용되는, TaqDNA 폴리메라아제 [예를 들어, KOD Exo(-)(토요보 주식회사 제조)] 등의 핵산 합성 효소나, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dGTTP) 등의 핵산 합성 기질은, 통상 이 분야에서 사용되는 것이면 된다.
또한, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 있어서의 반응액 중에, Tris-HCl, K2HPO4 등의 완충액, MgCl2, KCl, (NH4)2SO4 등의 염, 폴리에틸렌글리콜, Triton (다우 케미컬 컴퍼니 주식회사 제조), Nonidet (쉘 케미컬 주식회사 제조), CHAPS (주식회사 도진도 화학 제조) 등의 계면 활성제, 프로클린 300 (시그마 알드리치 주식회사) 등의 방부제, BSA (소 혈청 알부민) 등의 폴리펩티드가 포함되어 있어도 된다. 또, 상기 성분에 추가하여, 핵산 증폭 반응이 저해되지 않는 한 다른 임의의 성분이 포함되어 있어도 된다.
본 발명의 CT 검출 방법에 있어서의, 증폭 산물을 검출하는 방법은, 통상 이 분야에서 실시되고 있는 자체 공지된 방법에 기초하여 이루어지면 된다. 구체적으로는, 예를 들어 (a) 전기 영동에 의해 검출하는 방법, (b) 리얼 타임법에 의해 검출하는 방법 등을 들 수 있고, (a) 전기 영동에 의해 검출하는 방법이 바람직하다.
이하에, 각각의 방법에 대해 설명한다.
(a) 전기 영동에 의해 검출하는 방법
전기 영동에 의해 검출하는 방법이란, 본 발명에 관련된 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 증폭 산물을, 전기 영동에 의해 분리하고, 검출하는 수법이고, 구체적인 방법으로는, (a-1) 표지 프라이머법, (a-2) 인터칼레이터법 및 (a-3) 표지 프로브법을 들 수 있다.
(a-1) 표지 프라이머법
표지 프라이머법이란, 『본 발명에 관련된 프라이머 중 적어도 일방을 표지 물질로 표지한 표지 프라이머를 포함하는 프라이머쌍을 이용하고, 피검 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한다. 이어서, 얻어진 증폭 산물을 전기 영동에 의해 분리하고, 그 증폭 산물 중의 표지를 검출한다. 그 결과, 그 증폭 산물의 표지가 본 발명에 관련된 프라이머쌍으로 증폭되는 산물의 염기 로그로 검출할 수 있었던 경우에, 「그 피검 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다』 는 방법이다.
또한, 본 명세서에 있어서 「표지를 검출한다」란, 표지 물질의 성질에 기초하여 표지 물질을 직접 또는 간접적으로 측정하는 것을 의미한다.
표지 프라이머법에 있어서의, 프라이머, 프라이머쌍, 표지 물질 및 표지 물질로 표지하는 방법의 상세한 것에 대하여는, ＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 기재한 바와 같다.
표지 프라이머법에 있어서의 전기 영동으로는, 물질의 하전 강도에 의존하여 상이한 속도로 이동 또는 상이한 거리를 이동하는 방법에 근거하는 것이면 되고, 구체적으로는 예를 들어 캐필러리 전기 영동, 아가로오스 겔 전기 영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (슬라브 전기 영동), 전분 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 들 수 있고, 아가로오스 겔 전기 영동, 캐필러리 전기 영동이 바람직하고, 캐필러리 전기 영동이 보다 바람직하다.
또한, 상기 캐필러리 전기 영동을 실시하는 경우에는, WO2007/027495, WO2011/118496, WO2008/075520 등에 기재된 자체 공지된 방법에 따라 실시하면 된다.
표지 프라이머법에 대해, (a-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우 및 (a-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우로 나누어, 이하에 구체적으로 설명한다.
(a-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우
예를 들어, 먼저 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍에 있어서의 프라이머 중 적어도 일방을 표지 물질로 표지한다. 이어서, 이 표지 물질로 표지된 프라이머를 포함하는 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 이용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한다. 이어서, 얻어진 증폭 산물을 전기 영동에 의해 분리하고, 그 증폭 산물 중의 표지를 검출한다.
그 결과, 그 증폭 산물의 표지가 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍으로 증폭되는 산물의 염기 로그로 검출할 수 있었던 경우에, 「그 피검 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
(a-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우
예를 들어, 먼저 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍에 있어서의 프라이머 중 적어도 일방 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍에 있어서의 프라이머 중 적어도 일방을 표지 물질로 표지한다. 이어서, 이들 표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 표지 물질로 표지된 프라이머를 포함하는 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 이용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한다. 이어서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 증폭 산물 (제 1 증폭 산물) 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 증폭 산물 (제 2 증폭 산물) 각각을 전기 영동에 의해 분리하고, 그 제 1 증폭 산물 및 그 제 2 증폭 산물 중의 표지를 검출한다.
그 결과, 그 제 1 증폭 산물의 표지가 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍으로 증폭되는 산물의 염기 로그로 검출할 수 있었던 경우, 또는 그 제 2 증폭 산물의 표지가 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍으로 증폭되는 산물의 염기 로그로 검출할 수 있었던 경우 중 적어도 어느 일방인 경우, 「그 피검 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
또한, 상기 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 구체예로는, 서열 번호 7 ∼ 9 중 어느 것으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것을 들 수 있고, 서열 번호 7 또는 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하고, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.
또, 임균이나 내부 컨트롤로서 선택한 균 등의 균류를 동시에 검출하는 경우에는, 클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위한 본 발명에 관련된 프라이머쌍에 추가하여, 표지 물질로 표지된 임균이나 내부 컨트롤로서 선택한 균 등의 균류를 검출하기 위한 프라이머쌍을 사용하여 상기와 동일하게 핵산 증폭 반응을 실시하고, 검출 방법을 실시하면 된다.
(a-2) 인터칼레이터법
인터칼레이터법이란, 『본 발명에 관련된 프라이머쌍을 이용하고, 피검 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시하고, 얻어진 증폭 산물을 전기 영동에 의해 분리한다. 이어서, 그 증폭 산물을 인터칼레이터로 염색하고, 그 인터칼레이터 유래의 형광을 검출한다. 그 결과, 그 인터칼레이터 유래의 형광을 검출할 수 있었던 경우에, 「그 피검 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다』는 방법이다.
인터칼레이터법에 있어서의 프라이머쌍의 상세한 것에 대하여는, ＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 기재한 바와 같다.
인터칼레이터법에 있어서의 전기 영동으로는, (a-1) 표지 프라이머법과 동일한 것을 들 수 있고, 바람직한 것도 동일하다.
또, 인터칼레이터법에 있어서의 인터칼레이터로는, 통상 이 분야에서 이용되고 있는 인터칼레이터이면 어떤 것이어도 된다. 그 구체예는, 하기 (1) ∼ (5) 의 인터칼레이터 그리고 하기 (6) 및 (7) 의 인터칼레이터 유사 물질을 들 수 있다.
즉, (1) 에티듐 화합물 [예를 들어, 에티듐브로마이드, 에티듐 호모다이머 1 (EthD-1), 에티듐 호모다이머 2 (EthD-2), 브롬화에티듐모노아지드 (EMA), 디하이드로에티듐 등],
(2) 아크리딘 색소 (예를 들어, 아크리딘 오렌지 등),
(3) 요오드 화합물 (요오드화프로피듐, 요오드화헥시듐 등), 시아닌 다이머계 색소 [예를 들어, POPO-1, BOBO-1, YOYO-1, TOTO-1, JOJO-1, POPO-3, LOLO-1, BOBO-3, YOYO-3, TOTO-3 (모두 서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 등],
(4) 시아닌 모노머계 색소 [예를 들어, PO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1, JO-PRO-1, PO-PRO-3, LO-PRO-1, BO-PRO-3, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5 (모두 서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 등],
(5) SYTOX 계 색소 [예를 들어, SYTOX Green, SYTOX Blue, SYTOX Orange (모두 서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 등], SYBR 계 색소 [예를 들어, SYBR Gold, SYBR Green I, SYBR Green II (모두 서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조)], GelRed 계 색소 [예를 들어, GelRed (와코 준야쿠 공업 주식회사 제조) 등],
(6) DNA 이중나선의 마이너 그루브에 결합하는 것 [예를 들어, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)(서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 등],
(7) 아데닌-티민 (A-T) 배열에 특이적으로 결합하는 것 [예를 들어, 펜타하이드레이트(비스-벤즈이미드)(Hoechst 33258)(서모 피셔 사이언티픽), 트리하이드로클로라이드 (Hoechst 33342)(서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조), 비스벤즈이미드 색소 (Hoechst 34580)(서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 등] 을 들 수 있다.
(a-3) 표지 프로브법
표지 프로브법이란, 『본 발명에 관련된 프라이머쌍을 이용하고, 피검 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시하고, 얻어진 증폭 산물을 전기 영동에 의해 분리한다. 이어서, 그 증폭 산물을 열처리에 부여하는 것에 의해, 1 개 사슬로 한다. 이어서, 표지 물질로 표지된, 그 증폭 산물의 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브를 하이브리다이즈시킴으로써, 하이브리드체를 얻고, 그 하이브리드체 중의 표지를 검출한다. 그 결과, 그 하이브리드체 중의 표지를 검출할 수 있었던 경우에, 「그 피검 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다』는 방법이다.
표지 프로브법에 있어서의, 프라이머쌍 및 표지 물질, 표지 물질로 표지하는 방법의 상세한 것에 대하여는, ＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 기재한 바와 같다.
표지 프로브법에 있어서의 전기 영동으로는, (a-1) 표지 프라이머법과 동일한 것을 들 수 있고, 바람직한 것도 동일하다.
(b) 리얼 타임법에 의해 검출하는 방법
리얼 타임법에 의해 검출하는 방법이란, 본 발명에 관련된 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 의해 얻어지는 증폭 산물을, 리얼 타임으로 검출하는 방법이고, 구체적인 방법으로는, (b-1) TaqManTM 프로브법 및 (b-2) 인터칼레이터법을 들 수 있다.
(b-1) TaqManTM 프로브법
TaqManTM 프로브법이란, 『본 발명에 관련된 프라이머쌍 및 형광 표지 프로브를 이용하고, 피검 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 리얼 타임 PCR) 을 실시하고, 그 프로브 유래의 형광을 검출할 수 있었던 경우에, 「그 피검 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다』는 방법이다.
TaqManTM 프로브법에 있어서의 프라이머쌍의 상세한 것에 대하여는, ＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 기재한 바와 같다.
TaqManTM 프로브법에 있어서의 형광 표지 프로브란, 본 발명에 관련된 프라이머쌍을 이용하고, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한 경우에 증폭되는 영역에 하이브리다이즈하도록 설계되고, 또한 그 5' 말단을 예를 들어, 형광 색소 (리포터 형광 색소) 로, 3' 말단을 예를 들어, ?처 색소로 표지한 것이다.
TaqManTM 프로브법에 대해, (b-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우 및 (b-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우로 나누어, 보다 구체적으로 설명한다.
(b-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우
예를 들어, 먼저 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 및 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍으로 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한 경우에 증폭되는 영역에 하이브리다이즈하도록 설계된 프로브의 5' 말단이 리포터 형광 색소로 표지되고, 3' 말단이 ?처 색소로 표지된 표지 프로브 (제 1 표지 프로브) 를 사용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한다.
그 결과, 그 제 1 표지 프로브로부터 유리된 리포터 형광 색소 유래의 형광이 검출된 경우, 「그 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
(b-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우
예를 들어, 먼저 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 및 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍으로 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한 경우에 증폭되는 영역에 하이브리다이즈하도록 설계된 프로브의 5' 말단이 리포터 형광 색소로 표지되고, 3' 말단이 ?처 색소로 표지된 표지 프로브 (제 1 표지 프로브), 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍, 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍으로 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한 경우에 증폭되는 영역에 하이브리다이즈하도록 설계된 프로브의 5' 말단이 리포터 형광 색소로 표지되고, 3' 말단이 ?처 색소로 표지된 표지 프로브 (제 2 표지 프로브) 를 사용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시한다.
그 결과, 그 제 1 표지 프로브로부터 유리된 리포터 형광 색소 유래의 형광 또는 그 제 1 표지 프로브로부터 유리된 리포터 형광 색소 유래의 형광 중 적어도 일방이 검출된 경우, 「그 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
상기 방법에 있어서의, 제 1 표지 프로브의 리포터와 제 2 표지 프로브의 리포터는 각각 상이한 형광 파장을 가지고 있어도 된다.
또한, 제 1 표지 프로브와 제 2 표지 프로브의 염기 서열은 서로 상이한 것이다.
또한, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 구체예로는, 서열 번호 7 ∼ 9 중 어느 것으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것을 들 수 있고, 서열 번호 7 또는 8 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 바람직하고, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.
상기 (b-1-1) 및 (b-1-2) 에 있어서의 TaqManTM 프로브법에 있어서는, 추가로 본 발명에 관련된 프라이머쌍 이외에, 임균이나 내부 컨트롤로서 선택한 균 등의 균류를 검출하기 위한 프라이머쌍을 첨가하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응을 실시해도 된다. 이들 균류는, 마찬가지로 TaqManTM 프로브법을 사용하여 검출해도 되고, 자체 공지된 방법에 의해 검출해도 된다.
(b-2) 인터칼레이터법
인터칼레이터법이란, 『본 발명에 관련된 프라이머쌍 및 인터칼레이터를 이용하고, 피검 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 리얼 타임 PCR) 을 실시한다. 이어서, 얻어진 증폭 산물의 증폭량과 상관하여 인터칼레이션하는 인터칼레이터 유래의 형광을 검출한다. 그 결과, 그 인터칼레이터 유래의 형광을 검출할 수 있었던 경우에, 「그 피검 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다』는 방법이다.
인터칼레이터법에 있어서의 프라이머쌍의 상세한 것에 대하여는, ＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 기재한 바와 같다.
인터칼레이터법에 있어서의 인터칼레이터로는, (a-2) 인터칼레이터법과 동일한 것을 들 수 있다.
본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출 방법의 바람직한 구체예를, 증폭 산물을 검출하는 방법으로서, (a'-1) 표지 프라이머법, (b'-1) TaqManTM 프로브법을 사용하는 경우로 나누어 이하에 설명한다.
(a'-1) 표지 프라이머법
표지 프라이머법을 사용하는 경우의 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출 방법의 구체예를, (a'-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우, (a'-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우로 나누어, 이하에 설명한다.
(a'-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우
먼저, 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 시료 중에서, 자체 공지된 방법에 따라, 정제 DNA 를 얻는다.
한편, 예를 들어 DNA 신시사이저를 이용하고, 포스포라미디트법으로, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (즉, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 을 합성한다. 이어서, 자체 공지된 방법에 의해, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 중 적어도 일방을 표지 물질 (예를 들어, 형광 물질) 로 표지한다.
표지 물질로 표지된 프라이머를 포함하는 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 증폭용 프라이머로서 이용하고, 시료로부터 얻어진 정제 DNA 에 대해, 하기와 같이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 을 실시한다.
즉, 각 0.1 ∼ 2 μM 의 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 1.0 ∼ 4.0 mM 의 염 (예를 들어, MgCl2), 80 ∼ 150 ㎍/mL 의 폴리펩티드 (예를 들어, BSA), 0.8 ∼ 1.5 ％ 의 계면 활성제 (예를 들어, 폴리에틸렌글리콜), 0.1 ∼ 0.5 ％ 의 방부제 (예를 들어, 프로클린 300), 각각 0.2 ∼ 0.3 mM 의 핵산 합성 기질 (예를 들어, dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 10 ∼ 80 단위/ml 의 핵산 합성 효소 (예를 들어, Taq DNA 폴리메라아제) 를 함유하는 PH 7 ∼ 9 의 10 mM 의 완충액 (예를 들어, Tris-HCl 완충액) 을 조정하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액으로 한다. 이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액 20 ∼ 30 μL 에, 정제 DNA 를 1 ∼ 100 ng 첨가하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 얻는다.
이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 이용하고, 서멀 사이클러 등의 핵산 증폭 장치를 사용하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 을 실시한다.
즉, 93 ℃ ∼ 98 ℃, 1 ∼ 10 분 가열한 후, (1) 93 ℃ ∼ 98 ℃, 10 ∼ 30 초 → (2) 50 ℃ ∼ 70 ℃, 10 ∼ 30 초 → (3) 68 ∼ 72 ℃, 30 초 ∼ 5 분을 1 사이클로 하여 30 ∼ 45 사이클 실시한다.
이어서, 얻어진 핵산 증폭 산물에 대해, 전기 영동 (예를 들어, 캐필러리 전기 영동) 을 실시한 후, 그 증폭 산물 중의 표지를 검출한다.
그 결과, 얻어진 핵산 증폭 산물 중의 표지가 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍으로 증폭되는 산물의 염기 로그 (148 염기쌍) 로 검출할 수 있었던 경우, 「그 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
또한, 2100 바이오애널라이저 (애질런트 테크놀로지 주식회사 제조) 등의 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치를 사용하여 캐필러리 전기 영동을 실시한 경우, 얻어지는 데이터는, 가로축이 전기 영동 시간, 세로축이 형광 강도로 나타내어진다. 가로축의 전기 영동 시간은, 분자량 마커의 전기 영동 시간으로부터 DNA 등의 사이즈로 환산할 수 있다. 그 때문에, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 의해 얻어지는 핵산 증폭 산물의 길이 (염기 로그) 를 미리 산출해 두고, 「얻어진 핵산 증폭 산물이 산출된 핵산 증폭 산물에 해당하는지 여부」를 확인해도 된다.
즉, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 중 적어도 일방이 형광 물질로 표지된 것을 사용하고, 상기와 마찬가지로 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 을 실시한다.
한편, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 으로 증폭되는 핵산 증폭 산물의 길이 (염기 로그) 를 산출해 둔다.
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 경우, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 중, 서열 번호 2 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 148 염기쌍의 핵산이 증폭된다고 예측된다.
이어서, 얻어진 핵산 증폭 산물을, 예를 들어 2100 바이오애널라이저 (애질런트 테크놀로지 주식회사 제조) 등의 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치를 사용하여, 캐필러리 전기 영동에 부여한다. 그리고, 캐필러리 전기 영동에 의해 얻어진 샘플의 데이터를, 기기의 소프트로 겔 이미지로 환산한다.
그 결과, 얻어진 핵산 증폭 산물의 길이 (염기 로그) 가, 148 염기쌍의 핵산 증폭 산물과 동일한 경우, 「그 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
(a'-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우
먼저, 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 시료 중에서, 자체 공지된 방법에 따라, 정제 DNA 를 얻는다.
한편, 예를 들어, DNA 신시사이저를 이용하고, 포스포라미디트법으로, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (즉, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (예를 들어, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 을 합성한다. 이어서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 중 적어도 일방 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 중 적어도 일방을 표지 물질 (예를 들어, 형광 물질) 로 표지한다.
표지 물질로 표지된 프라이머를 포함하는, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 증폭용 프라이머로서 이용하고, 시료로부터 얻어진 정제 DNA 에 대해, 하기와 같이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 멀티플렉스 PCR) 을 실시한다.
즉, 각 0.1 ∼ 2 μM 의 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 각 0.1 ∼ 2 μM 의 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 1.0 ∼ 4.0 mM 의 염 (예를 들어, MgCl2), 80 ∼ 150 ㎍/mL 의 폴리펩티드 (예를 들어, BSA), 0.8 ∼ 1.5 ％ 의 계면 활성제 (예를 들어, 폴리에틸렌글리콜), 0.1 ∼ 0.5 ％ 의 방부제 (예를 들어, 프로클린 300), 각각 0.2 ∼ 0.3 mM 의 핵산 합성 기질 (예를 들어, dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 10 ∼ 80 단위/ml 의 핵산 합성 효소 (예를 들어, Taq DNA 폴리메라아제) 를 함유하는 PH 7 ∼ 9 의 10 mM 의 완충액 (예를 들어, Tris-HCl 완충액) 을 조정하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액으로 한다. 이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액 20 ∼ 30 μL 에, 클라미디아 트라코마티스의 정제 DNA 시료를 1 ∼ 100 ng 첨가하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 얻는다.
이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 이용하고, 서멀 사이클러 등의 핵산 증폭 장치를 사용하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 멀티플렉스 PCR) 을 실시한다.
즉, 93 ℃ ∼ 98 ℃, 1 ∼ 10 분 가열한 후, (1) 93 ℃ ∼ 98 ℃, 10 ∼ 30 초 → (2) 50 ℃ ∼ 70 ℃, 10 ∼ 30 초 → (3) 68 ∼ 72 ℃, 30 초 ∼ 5 분을 1 사이클로 하여 30 ∼ 45 사이클 실시한다.
이어서, 얻어진 핵산 증폭 산물 각각에 대해, 전기 영동 (예를 들어, 캐필러리 전기 영동) 을 실시한 후, 그 증폭 산물 중의 표지를 검출한다.
그 결과, 얻어진 핵산 증폭 산물 중의 표지가 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍으로 증폭되는 산물의 염기 로그 (148 염기) 로 검출할 수 있었던 경우, 또는 얻어진 핵산 증폭 산물 중의 표지가 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍으로 증폭되는 산물의 염기 로그 (173 염기) 로 검출할 수 있었던 경우 중 적어도 어느 일방인 경우, 「그 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
또한, 2100 바이오애널라이저 (애질런트 테크놀로지 주식회사 제조) 등의 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치를 사용하여 캐필러리 전기 영동을 실시한 경우, 얻어지는 데이터는, 가로축이 전기 영동 시간, 세로축이 형광 강도로 나타내어진다. 가로축의 전기 영동 시간은, 분자량 마커의 전기 영동 시간으로부터 DNA 등의 사이즈로 환산할 수 있다. 그 때문에, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 의해 얻어지는 핵산 증폭 산물의 길이 (염기 로그) 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응에 의해 얻어지는 핵산 증폭 산물의 길이 (염기 로그) 를 미리 산출해 두고, 「얻어진 핵산 증폭 산물이 산출된 핵산 증폭 산물에 해당하는지 여부」를 확인해도 된다.
즉, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 중 적어도 일방 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 중 적어도 일방이 형광 물질로 표지된 것을 사용하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 멀티플렉스 PCR) 을 실시한다.
한편, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 으로 증폭되는 핵산 증폭 산물의 길이 (염기 로그) 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (예를 들어, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 으로 증폭되는 핵산 증폭 산물의 길이 (염기 로그) 를 산출해 둔다.
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 경우, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 중, 서열 번호 2 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 148 염기쌍의 핵산이 증폭된다고 예측된다.
한편, 상기 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용한 경우, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 중, 서열 번호 3 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 173 염기쌍의 핵산이 증폭된다고 예측된다.
이어서, 얻어진 핵산 증폭 산물을, 예를 들어 2100 바이오애널라이저 (애질런트 테크놀로지 주식회사 제조) 등의 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치를 사용하여, 캐필러리 전기 영동에 부여한다. 그리고, 캐필러리 전기 영동에 의해 얻어진 샘플의 데이터를, 기기의 소프트로 겔 이미지로 환산한다.
그 결과, 얻어진 핵산 증폭 산물이, 148 염기쌍의 핵산 증폭 산물, 또는 173 염기쌍의 핵산 증폭 산물 중 적어도 어느 일방과 동일한 경우, 「그 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
(b'-1) TaqManTM 프로브법
TaqManTM 프로브법을 사용하는 경우의 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출 방법의 구체예를 (b'-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우, (b'-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우로 나누어, 이하에 설명한다.
(b'-1-1) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하는 경우
먼저, 자체 공지된 방법에 따라, 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 시료 중에서 정제 DNA 시료를 얻는다.
한편, 예를 들어 DNA 신시사이저를 이용하고, 포스포라미디트법으로, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (즉, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 을 합성한다.
또, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 으로 증폭되는 염기 서열로부터, 프로브로서 이용하기 위한 배열을 설계하고, 이 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리포터 형광 색소인 FAM 을, 3' 말단에 ?처 색소인 TAMRA 를 자체 공지된 방법에 의해 결합시켜, 형광 표지 프로브 (제 1 표지 프로브) 를 얻는다.
상기에서 합성한 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 증폭용 프라이머로서 이용하고, 예를 들어 하기와 같이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 리얼 타임 PCR) 을 실시한다.
즉, 각 0.1 ∼ 2 μM 의 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 0.1 ∼ 1 μM 의 제 1 표지 프로브, 1.0 ∼ 4.0 mM 의 염 (예를 들어, MgCl2), 50 ∼ 100 mM 의 염 (예를 들어, KCl), 300 ∼ 600 ㎍/mL 의 폴리펩티드 (예를 들어, BSA), 0.05 ∼ 2 ％ 의 계면 활성제 (예를 들어, 콜산나트륨), 각각 0.1 ∼ 0.3 mM 의 핵산 합성 기질 (예를 들어, dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 ∼ 80 단위/mL 의 핵산 합성 효소 (예를 들어, Taq DNA 폴리메라아제) 를 함유하는 pH 8 ∼ 9 의 10 mM 의 완충액 (예를 들어, Tris-HCl 완충액) 을 조제하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액으로 한다. 이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액 20 ∼ 25 μL 에 클라미디아 트라코마티스의 정제 DNA 시료 1 ∼ 100 ng 을 첨가하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 얻는다.
이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 이용하고, 서멀 사이클러 등을 사용하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 리얼 타임 PCR) 을 실시한다.
즉, 93 ℃ ∼ 98 ℃, 5 ∼ 15 분 가열한 후, (1) 93 ℃ ∼ 98 ℃, 10 ∼ 30 초 → (2) 50 ∼ 70 ℃, 30 ∼ 90 초를 1 사이클로 하여 30 ∼ 55 사이클 실시하고, 1 사이클마다 리포터 형광 색소 유래의 형광 강도량을 측정한다.
이 경우, 리포터 형광 색소 유래의 형광이 측정된 경우에, 클라미디아 트라코마티스 양성으로 판정된다.
또한, 자체 공지된 방법에 의해 검량선을 작성함으로써, 시료 중의 클라미디아 트라코마티스의 수를 계산할 수도 있다.
(b'-1-2) 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용하는 경우
먼저, 자체 공지된 방법에 따라, 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 시료 중에서 정제 DNA 시료를 얻는다.
별도로, 예를 들어 DNA 신시사이저를 이용하고, 포스포라미디트법으로, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (즉, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (예를 들어, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 을 합성한다.
이어서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 으로 증폭되는 염기 서열로부터, 프로브로서 이용하기 위한 배열을 설계하고, 이 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 또한, 이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리포터 형광 색소인 FAM 을, 3' 말단에 ?처 색소인 TAMRA 를 자체 공지된 방법에 의해 결합시켜, 형광 표지 프로브 (제 1 표지 프로브) 를 얻는다.
또, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (예를 들어, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머) 을 사용한 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, PCR) 으로 증폭되는 염기 서열로부터, 프로브로서 이용하기 위한 배열을 설계하고, 이 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 또한, 이 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 리포터 형광 색소인 HEX 를, 3' 말단에 ?처 색소인 TAMRA 를 자체 공지된 방법에 의해 결합시켜, 형광 표지 프로브 (제 2 표지 프로브) 를 얻는다.
상기에서 합성한 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 증폭용 프라이머로서 이용하고, 예를 들어 하기와 같이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 리얼 타임 PCR) 을 실시한다.
즉, 각 0.1 ∼ 2 μM 의 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 각 0.1 ∼ 2 μM 의 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 구성하는 프라이머, 0.1 ∼ 1 μM 의 제 1 표지 프로브, 0.1 ∼ 1 μM 의 제 2 표지 프로브, 1.0 ∼ 4.0 mM 의 염 (예를 들어, MgCl2), 50 ∼ 100 mM 의 염 (예를 들어, KCl), 300 ∼ 600 ㎍/mL 의 폴리펩티드 (예를 들어, BSA), 0.05 ∼ 2 ％ 의 계면 활성제 (예를 들어, 콜산나트륨), 각각 0.1 ∼ 0.3 mM 의 핵산 합성 기질 (예를 들어, dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 ∼ 80 단위/mL 의 핵산 합성 효소 (예를 들어, Taq DNA 폴리메라아제) 를 함유하는 pH 8 ∼ 9 의 10 mM 의 완충액 (예를 들어, Tris-HCl 완충액) 을 조제하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액으로 한다. 이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 반응액 20 ∼ 25 μL 에 클라미디아 트라코마티스의 정제 DNA 시료 1 ∼ 100 ng 을 첨가하여, 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 얻는다.
이 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응용 시료를 사용하고, 서멀 사이클러 등을 사용하여 본 발명에 관련된 핵산 증폭 반응 (예를 들어, 리얼 타임 PCR) 을 실시한다.
즉, 93 ℃ ∼ 98 ℃, 5 ∼ 15 분 가열한 후, (1) 93 ℃ ∼ 98 ℃, 10 ∼ 30 초 → (2) 50 ∼ 70 ℃, 30 ∼ 90 초를 1 사이클로 하여 30 ∼ 55 사이클 실시하고, 1 사이클마다 리포터 형광 색소 유래의 형광 강도량을 측정한다.
그 결과, 제 1 표지 프로브 유래의 형광, 또는 제 2 표지 프로브 유래의 형광 중 적어도 어느 일방이 검출된 경우, 「그 시료는, 클라미디아 트라코마티스 양성이다.」라고 판정한다.
또한, 자체 공지된 방법으로 검량선을 작성함으로써, 시료 중의 클라미디아 트라코마티스의 수를 계산할 수도 있다.
＜3＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 시약 키트
본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 시약 키트 (이하, 본 발명의 시약 키트라고 약기하는 경우가 있다.) 는, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 1 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 시약 키트에는, 추가로 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용해도 된다. 구체적으로는, 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 1 프라이머쌍과, 서열 번호 7 ∼ 9 중 어느 것으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 포함하여 이루어지는 것을 들 수 있다.
본 발명의 시약 키트에 있어서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 제 2 프라이머쌍을 포함시키는 경우에는, 이하에 나타내는 표 2 의 (1) 또는 (2) 가 바람직하고, (1) 이 보다 바람직하다.
Figure pct00002
본 발명의 시약 키트에 있어서, 본 발명에 관련된 프라이머 중 적어도 1 개는 표지 물질로 표지된 것이어도 된다.
예를 들어, 본 발명의 시약 키트에 있어서, 표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 프라이머를 포함시키는 경우로서, CT 검출용 프라이머로서 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍만을 포함시키는 경우에는, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
예를 들어, 본 발명의 시약 키트에 있어서, 표지 물질로 표지된 본 발명에 관련된 프라이머를 포함시키는 경우로서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍과 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 2 개의 프라이머쌍을 포함시키는 경우에는, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명의 시약 키트에 포함되는, 프라이머, 프라이머쌍, 프라이머 세트, 표지 물질 및 프라이머를 표지 물질로 표지하는 방법의 상세한 것에 대하여는, ＜1＞ 본 발명의 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트에 있어서 기재한 바와 같다.
본 발명의 시약 키트에 있어서, 클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위한 본 발명에 관련된 프라이머쌍에 추가하여, 임균을 검출하기 위한 프라이머쌍이나 내부 컨트롤로서 선택한 균 또는 당해 균 유래의 핵산, 및 당해 균을 검출하기 위한 프라이머쌍을 포함시켜도 된다.
또한, 본 발명의 시약 키트에 있어서, 임균 검출용 프라이머쌍 및 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍을 구성하는 프라이머는, 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
예를 들어, 본 발명의 시약 키트에 있어서, 표지 물질로 표지된 임균 검출용 프라이머쌍을 포함시키는 경우에는, 임균 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
예를 들어, 본 발명의 시약 키트에 있어서, 표지 물질로 표지된 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍을 포함시키는 경우에는, 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
예를 들어, 본 발명의 시약 키트에 있어서, 표지 물질로 표지된 임균 검출용 프라이머쌍 및 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍을 포함시키는 경우에는, 임균 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방 및 내부 컨트롤 검출용 프라이머쌍의 포워드 프라이머와 리버스 프라이머 중 적어도 일방이 각각 표지 물질로 표지되어 있으면 된다.
본 발명의 시약 키트 중에 있어서, 통상 이 분야에서 사용되는 시약류, 예를 들어 완충액, 안정화제, 방부제 등으로서, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하지 않고, PCR 등의 핵산 증폭 반응이나 하이브리다이제이션 반응을 저해하지 않는 것을 포함시킬 수 있다. 또, 그 농도도, 통상 이 분야에서 사용되는 농도 범위에서 적절히 선택하면 된다.
완충액의 구체예를 들면, 예를 들어 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굳 완충액 등, 통상적인 PCR 등의 핵산 증폭 반응이나 하이브리다이제이션 반응을 실시하는 경우에 이용되고 있는 완충액은 모두 들 수 있고, 그 pH 도 특별히 한정되지 않지만, 통상 5 ∼ 9 의 범위가 바람직하다.
또, 필요에 따라 핵산 합성 효소 (예를 들어, Taq DNA 폴리메라아제 등), 핵산 합성 기질 (예를 들어, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 등), 인터칼레이터 (예를 들어, 에티듐브로마이드, SYBRTM Green I 등), 표지 물질 (예를 들어, FAM, TAMRA 등), 형광 표지 프로브, 전기 영동용 시약 (예를 들어, 겔), DNA 마커 등을 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 시약 키트에는, 본 발명의 클라미디아 트라코마티스를 검출하는 방법, 클라미디아 트라코마티스의 유무를 판단하기 위한 설명서 등을 포함시켜 두어도 된다. 당해 「설명서」란, 당해 방법에 있어서의 특징, 원리, 조작 순서, 판정 순서 등이 문장 또는 도표 등에 의해 실질적으로 기재되어 있는 당해 키트의 취급 설명서, 첨부 문장, 혹은 팜플렛 등을 의미한다.
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되지 않는다.
실시예
실시예에서 사용되는 세균은, 모두 임상 분리주이고, 배양 후, 콜로니의 형상이나 종래의 각종 생화학적 시험 등에 의해 균종이 이미 감별되어 있는 것이다.
실시예 1 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 클라미디아 트라코마티스의 검출
(1) 프라이머쌍 (본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍)
하기 표 3 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (CT1P1F-2) 와 리버스 프라이머 (CT1P1R-9) 를 사용하였다. 또한, 포워드 프라이머 (CT1P1F-2) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
Figure pct00003
(2) 타겟 배열
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (CT1P1F-2 및 CT1P1R-9) 은, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE603230.1) 중, 염기 번호 4770 ∼ 4917 의 영역 (서열 번호 2 : 148 염기쌍) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
(3) 클라미디아 DNA 의 조제
하기 표 4 에 나타내는 각 클라미디아 (클라미디아속 : Chlamydia trachomatis, 클라미도필라속 : Chlamydophila caviae, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila pecorum) 를 자체 공지된 방법에 따라 배양한 후, 자체 공지된 핵산 정제법을 사용하여 정제 게놈 DNA 를 취득하였다. 각각의 얻어진 정제 DNA 의 카피수는 SYBRTM Premix Ex TaqTM II (다카라 바이오 주식회사 제조) 를 이용하고, 리얼 타임 PCR 장치 [StepOnePlusTM (서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조)] 로 산출하였다. 그 정제 DNA 는 TE 완충액 (pH 8.0)(주식회사 닛폰 진 제조) 을 이용하고, 105 copy/μL 로 조제하여, 클라미디아 DNA 로 하였다.
또한, 사용한 세균주는, 모두 오카야마 대학 대학원 의치약학 종합 연구과 쿠몬 히로미 교수의 연구실로부터 공여된 것이다.
Figure pct00004
(4) PCR
상기 (1) 의 각 0.8 μM 의 프라이머 (CT1P1F-2 및 CT1P1R-9), 1.2 mM 의 MgCl2, 100 ㎍/mL 의 BSA, 1 ％ 의 폴리에틸렌글리콜, 0.2 ％ 의 프로클린 300 (시그마 알드리치 주식회사 제조), 각각 0.25 mM 의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (토요보 주식회사 제조) 그리고 60 단위/mL 의 KOD Exo(-)(토요보 주식회사 제조) 를 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (PH 8.0) 을 조제하고, 이것을 PCR 용 반응액으로 하였다.
상기 (3) 에서 조제한 각 클라미디아 DNA 1 μL 를, 얻어진 PCR 용 반응액 25 μL 에 현탁하고, 이것을 PCR 용 시료로 하였다.
이 PCR 용 시료를 96 well plate (서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 에 넣고, StepOnePlusTM (서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 을 사용하여, PCR 을 실시하였다. 반응은 95 ℃ 에서 2 분 가열한 후, (1) 97 ℃ 에서 10 초 → (2) 65.5 ℃ 에서 20 초 → (3) 71.5 ℃ 에서 30 초를 1 사이클로 하여 40 사이클을 실시하였다.
그 후, 얻어진 핵산 증폭 산물을, 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치 2100 바이오애널라이저 (애질런트 테크놀로지 주식회사 제조) 를 사용하여, 기기에 첨부된 프로토콜에 따라 캐필러리 전기 영동함으로써, 얻어진 핵산 증폭 산물의 분리·검출을 실시하였다.
(5) 결과
캐필러리 전기 영동의 결과를, 하기 표 5 에 정리하였다. 표 5 에 있어서, 결과가 양성이란, 타겟의 148 염기쌍의 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타낸다. 결과가 음성이란, 타겟의 핵산 증폭 산물이 검출되지 않은 것을 나타낸다.
Figure pct00005
표 5 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 이용하고, 클라미디아 트라코마티스의 각각의 주 (株) 에서 유래하는 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 을 실시한 경우만, 타겟의 핵산 증폭 산물이 확인되고, 이들 시료는 클라미디아 트라코마티스 양성이라고 판정할 수 있었다.
한편, 클라미디아 트라코마티스 이외의 균에서 유래하는 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 을 실시한 경우에는, 해당하는 타겟의 핵산 증폭 산물은 확인되지 않고, 이들 시료는, 클라미디아 트라코마티스 음성이라고 판정할 수 있었다.
이상의 점으로부터, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하여, 핵산 증폭 반응을 실시함으로써, 클라미디아 트라코마티스를 특이적으로 검출 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 2, 비교예 1 및 2 각종 프라이머쌍을 사용한 PCR 에 대한 인간 게놈 DNA 의 영향
(1) 프라이머쌍
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (실시예 2)
실시예 1 과 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
· 특허문헌 1 의 프라이머쌍 (비교예 1)
특허문헌 1 (일본 특허 제5811086호) 에 개시되어 있는 프라이머쌍으로서, 하기 표 6 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (IshikFw) 와 리버스 프라이머 (IshikRv) 를 사용하였다.
또한, 리버스 프라이머 (IshikRv) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
·비특허문헌 1 의 프라이머쌍 (비교예 2)
비특허문헌 1 (Moller, J. K., et al., Journal of Clinical Microbiology, 2008, 46, p.3892-3895) 에 개시되어 있는 프라이머쌍으로서, 하기 표 6 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (MollarFw) 와 리버스 프라이머 (MollarRv) 를 사용하였다.
또한, 포워드 프라이머 (MollarFw) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
사용한 각 프라이머쌍을, 하기 표 6 에 정리하였다.
Figure pct00006
(2) 인간 게놈 DNA 의 조제
정상인 (클라미디아 트라코마티스 비감염자) 의 인간 전혈로부터 DNA 를, NucleoSpinTMBlood XL 키트 (매커레이 나겔 주식회사 제조) 로 정제하였다. 이어서, Etachinmate (주식회사 닛폰 진 제조) 로 농축하고, TE 완충액 (pH 8.0)(주식회사 닛폰 진 제조) 을 이용하여, 1 mg/mL 로 조제하고, 이것을 인간 게놈 DNA 로 하였다.
(3) PCR
프라이머쌍으로서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 특허문헌 1 의 프라이머쌍, 그리고 비특허문헌 1 의 프라이머쌍을 사용한 것 이외에는, 실시예 1 (4) 와 동일한 방법에 의해, 이하의 PCR 용 반응액을 각각 조제하였다.
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 포함하는 PCR 용 반응액
·특허문헌 1 의 프라이머쌍을 포함하는 PCR 용 반응액
·비특허문헌 1 의 프라이머쌍을 포함하는 PCR 용 반응액
상기 (2) 에서 조제한 인간 게놈 DNA 1 μL 를, 3 종의 PCR 용 반응액 25 μL 에 각각 현탁 첨가하고, 이것을 PCR 용 시료로 하였다.
이 PCR 용 시료를 이용하고, 실시예 1 (4) 와 동일한 방법에 의해 PCR 을 실시하고, 이어서 캐필러리 전기 영동함으로써, 핵산 증폭 산물의 분리, 검출을 실시하였다.
(4) 결과
캐필러리 전기 영동의 결과를, 도 1 에 나타낸다. 도 1 의 각 레인에 있어서 사용한 프라이머쌍을 하기 표 7 에 나타낸다.
또, 도 1 에 있어서, 밴드는, 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타낸다. 또한, PCR 용 시료는, 클라미디아 트라코마티스 DNA 를 포함하지 않기 때문에, 핵산 증폭 산물을 나타내는 밴드가 검출된 경우, 그 밴드는 비특이적으로 핵산이 증폭되어 있는 것 (비특이적 핵산 증폭 산물이 얻어진 것) 을 나타낸다.
Figure pct00007
도 1 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하여 PCR 을 실시한 경우 (레인 3 : 실시예 2), 인간 게놈 DNA 존재하여도, 핵산 증폭 산물의 증폭을 나타내는 밴드는 검출되지 않았다. 즉, 비특이적으로 핵산이 증폭되어 있지 않은 것을 알 수 있었다.
한편, 특허문헌 1 에 개시된 프라이머쌍을 사용하여 PCR 을 실시한 경우 (레인 2 : 비교예 1), 및 비특허문헌 1 에 개시된 프라이머쌍을 사용하여 PCR 을 실시한 경우 (레인 1 : 비교예 2), 인간 게놈 DNA 존재하에 있어서, 핵산 증폭 산물을 나타내는 밴드가 다수 검출되었다. 즉, 비특이적으로 핵산이 증폭되어 있는 것을 알 수 있었다.
특히, 150 염기쌍 부근의 밴드 (레인 2 : 비교예 1) 는, 특허문헌 1 에 개시된 프라이머쌍의 잠재 플라스미드의 타겟 배열인 145 염기쌍에 매우 가깝기 때문에, 위양성이 될 가능성이 매우 높은 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하면 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 있으므로, 위양성이 될 가능성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다.
한편, 특허문헌 1 에 개시된 프라이머쌍, 및 비특허문헌 1 에 개시된 프라이머쌍을 사용하면 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 없기 때문에, 위양성이 될 가능성이 높은 것을 알 수 있었다.
실시예 3 및 비교예 3 인간 게놈 DNA 존재하에 있어서의 클라미디아 트라코마티스의 검출
(1) 프라이머쌍
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (실시예 3)
실시예 1 과 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·비특허문헌 1 의 프라이머쌍 (비교예 3)
비교예 2 와 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
사용한 각 프라이머쌍을, 하기 표 8 에 정리하였다.
Figure pct00008
(2) 타겟 배열
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 (실시예 3) 은, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE603230.1) 중, 염기 번호 4770 ∼ 4917 의 영역 (148 염기쌍 : 서열 번호 2) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
비특허문헌 1 의 프라이머쌍 (비교예 3) 은, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE603230.1) 중, 염기 번호 4770 ∼ 4886 의 영역 (117 염기쌍 : 서열 번호 20) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
(3) 클라미디아 DNA 의 조제
실시예 1 (3) 에서 조제한, 각 C. trachomatis 주 (A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L1, L2, L3) 로부터 정제한 클라미디아 DNA 를 사용하였다.
(4) 인간 게놈 DNA 의 조제
실시예 2 (2) 에서 조제한 인간 게놈 DNA 를 사용하였다.
(5) PCR
프라이머쌍으로서, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 그리고 비특허문헌 1 의 프라이머쌍을 사용한 것 이외에는, 실시예 1 (4) 와 동일한 방법에 의해, 이하의 PCR 용 반응액을 각각 조제하였다.
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 포함하는 PCR 용 반응액
·비특허문헌 1 의 프라이머쌍을 포함하는 PCR 용 반응액
상기 (3) 및 (4) 에서 조제한 각 클라미디아 DNA 1 μL 및 인간 게놈 DNA 1 μL 를, 2 종의 PCR 용 반응액 25 μL 에 각각 현탁 첨가하여, PCR 용 시료를 조제하였다.
이들 각종 PCR 용 시료를 이용하고, 실시예 1 (4) 와 동일한 방법에 의해, PCR, 캐필러리 전기 영동을 함으로써, 핵산 증폭 산물의 분리, 검출을 실시하였다.
(6) 결과
캐필러리 전기 영동의 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 의 각 레인과 증폭에 사용한 프라이머쌍 및 클라미디아 DNA 의 관계를 하기 표 9 에 나타낸다.
또, 도 2 에 있어서, 밴드는 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타낸다.
또한, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용한 경우 (실시예 3) 는, 타겟 배열이 148 염기쌍이므로, 148 염기쌍 부근에서 밴드가 검출되면, 타겟인 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있었다고 할 수 있다.
또, 비특허문헌 1 의 프라이머쌍 (비교예 3) 을 사용한 경우에는, 타겟 배열이 117 염기쌍이므로, 117 염기쌍 부근에서 밴드가 검출되면, 타겟인 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있었다고 할 수 있다.
Figure pct00009
도 2 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하여 PCR 을 실시한 경우 (레인 1 ∼ 15 : 실시예 3), 모든 혈청형의 클라미디아 트라코마티스에서 148 염기쌍 부근에서 밴드가 검출되어, 클라미디아 트라코마티스의 복수 혈청형을 검출할 수 있었다. 또한, 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 밴드, 즉 148 염기쌍 부근 이외의 밴드는 검출되지 않았다.
한편, 비특허문헌 1 의 프라이머쌍을 사용하여 PCR 을 실시한 경우 (레인 16 ∼ 30 : 비교예 3), 혈청형 D (레인 20) 및 혈청형 H (레인 24) 에 대해서는, 117 염기쌍 부근에서 연하게 밴드가 보였지만, 이들 이외에 대해서는 밴드가 보이지 않아, 모든 혈청형을 검출할 수는 없었다. 또, 150 ∼ 1000 염기쌍 사이에, 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 밴드가 다수 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍을 사용하면, 모든 혈청형을 검출할 수 있고, 위음성이 될 가능성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다. 또, 위양성의 원인이 되는 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 있는 것도 알 수 있었다.
한편, 비특허문헌 1 의 프라이머쌍을 사용하면, 클라미디아 트라코마티스의 모든 혈청형을 검출할 수는 없는 것을 알 수 있었다. 또한, 위양성의 원인이 되는 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 없는 것도 알 수 있었다.
실시예 4 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 사용한 클라미디아 트라코마티스의 검출
(1) 프라이머쌍
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍
실시예 1 과 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍
하기 표 10 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (CT2F-4) 와 리버스 프라이머 (CT2_8) 를 사용하였다.
또한, 리버스 프라이머 (CT2_8) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
리버스 프라이머 (CT2_8) 는, WO93/00447 의 SeqID92 에 개시되어 있는 것이다.
·임균 검출용 프라이머쌍
하기 표 10 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (NG21F) 와 리버스 프라이머 (NG24R) 를 사용하였다.
또한, 리버스 프라이머 (NG24R) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
포워드 프라이머 (NG21F) 는, WO96/12824 의 SeqID12 에 개시되어 있는 배열의 5' 말단을 5 염기 삭제, 3' 말단에 2 염기 부가한 것이다. 리버스 프라이머 (NG24R) 는, WO93/00447 의 SeqID108 에 개시되어 있는 것이다.
임균 검출용 프라이머쌍은, 이 프라이머쌍이 존재하고 있어도, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있는지 여부를 검증하기 위해서 사용하였다.
사용한 각 프라이머쌍을, 하기 표 10 에 정리하였다.
Figure pct00010
(2) 타겟 배열
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍은, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE603230.1) 중, 염기 번호 4770 ∼ 4917 의 영역 (148 염기쌍 : 서열 번호 2) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍은, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE601796.2) 중, 염기 번호 782264 ∼ 782436 의 영역 (173 염기쌍 : 서열 번호 3) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
(3) 클라미디아 DNA 의 조제
실시예 1 (3) 에서 조제한, 각 클라미디아주로부터 정제한 클라미디아 DNA 를 사용하였다.
(4) 멀티플렉스 PCR
각 0.8 μM 의 프라이머 (CT1P1F-2 및 CT1P1R-9), 각 0.4 μM 의 프라이머 (CT2F-4 및 CT2_8), 각 0.15 μM 의 프라이머 (NG21F 및 NG24R), 1.2 mM 의 MgCl2, 100 ㎍/mL 의 BSA, 1 ％ 의 폴리에틸렌글리콜, 0.2 ％ 의 프로클린 300 (시그마 알드리치 주식회사 제조), 각각 0.25 mM 의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (토요보 주식회사 제조) 그리고 60 단위/mL 의 KOD Exo(-)(토요보 주식회사 제조) 를 함유하는 10 mM Tris-HCl 완충액 (PH 8.0) 을 조제하고, 이것을 멀티플렉스 PCR 용 반응액으로 하였다.
상기 (3) 에서 조제한 각 클라미디아 DNA 1 μL 를, 멀티플렉스 PCR 용 반응액 25 μL 에 현탁 첨가하고, 이것을 멀티플렉스 PCR 용 시료로 하였다.
이 멀티플렉스 PCR 용 시료를 96 well plate (서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조) 에 넣고, 서멀 사이클러 [StepOnePlusTM (서모 피셔 사이언티픽 주식회사 제조)] 를 사용하여, 멀티플렉스 PCR 을 실시하였다.
반응은 95 ℃ 에서 2 분 가열한 후, (1) 97 ℃ 에서 10 초 → (2) 65.5 ℃ 에서 20 초 → (3) 71.5 ℃ 에서 30 초를 1 사이클로 하여 40 사이클을 실시하였다.
그 후, 얻어진 핵산 증폭 산물을, 전자동 마이크로칩형 캐필러리 전기 영동 장치 2100 바이오애널라이저 (애질런트 테크놀로지 주식회사 제조) 를 사용하여, 기기에 첨부된 프로토콜에 따라 캐필러리 전기 영동을 함으로써, 얻어진 핵산 증폭 산물의 분리·검출을 실시하였다.
(5) 결과
캐필러리 전기 영동의 결과를, 하기 표 11 에 정리하였다. 표 11 에 있어서 결과가 양성이란, 타겟인 148 염기쌍의 핵산 증폭 산물, 또는 타겟인 173 염기쌍의 핵산 증폭 산물 중 적어도 어느 일방이 검출된 것을 나타낸다. 결과가 음성이란, 타겟인, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 중 목적의 핵산 증폭 산물, 및 CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 중 목적의 핵산 증폭 산물이 검출되지 않았던 것을 나타낸다.
Figure pct00011
표 11 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하고, 클라미디아 트라코마티스의 각각의 주에서 유래하는 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 을 실시한 경우만, 타겟의 핵산 증폭 산물이 확인되고, 이들 시료는 클라미디아 트라코마티스 양성이라고 판정할 수 있었다.
한편, 클라미디아 트라코마티스 이외의 균에서 유래하는 DNA 시료를 주형으로 하고, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 동일하게 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우에는, 해당하는 타겟의 핵산 증폭 산물은 확인되지 않고, 이들 시료는, 클라미디아 트라코마티스 음성이라고 판정할 수 있었다.
또, 임균 검출용 프라이머쌍이 존재하고 있어도, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 클라미디아 트라코마티스를 특이적으로 검출할 수 있었다.
이상으로부터, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 클라미디아 트라코마티스를 특이적으로 검출 가능한 것을 알 수 있었다.
실시예 5 및 비교예 4 각종 프라이머쌍을 사용한 PCR 에 대한 인간 게놈 DNA 의 영향
(1) 프라이머쌍
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍
실시예 1 과 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a)
실시예 4 와 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b)
하기 표 12 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (CT2F-5) 와 리버스 프라이머 (CT2_8) 를 사용하였다.
또한, 리버스 프라이머 (CT2_8) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
·본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (c)
하기 표 12 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (CT2F-6) 와 리버스 프라이머 (CT2_8) 를 사용하였다.
또한, 리버스 프라이머 (CT2_8) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
·특허문헌 1 의 프라이머쌍
비교예 1 과 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·CT 게놈 DNA 를 대상으로 하는 공지 프라이머쌍
하기 표 12 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 (CT2_7) 와 리버스 프라이머 (CT2_8) 를 사용하였다.
또한, 리버스 프라이머 (CT2_8) 는, 그 배열의 5' 말단을 형광 물질 TAMRA 로 표지한 것을 사용하였다.
CT 게놈 DNA 를 대상으로 하는 공지 프라이머쌍을 구성하는 포워드 프라이머 (CT2_7) 는, US5573907 의 SeqID2 에 기재되어 있다. 리버스 프라이머 (CT2_8) 는, WO93/00447 의 SeqID92 에 기재되어 있다.
·임균 검출용 프라이머쌍
실시예 4 와 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
사용한 각 프라이머쌍을, 하기 표 12 에 정리하였다.
Figure pct00012
(2) 인간 게놈 DNA 의 조제
실시예 2 (2) 에서 조제한 인간 게놈 DNA 를 사용하였다.
(3) 멀티플렉스 PCR
프라이머쌍으로서, 상기 (1) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 4 (4) 와 동일한 방법에 의해, 이하의 멀티플렉스 PCR 용 반응액을 각각 조제하였다.
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a), 임균 검출용 프라이머쌍을 포함하는 멀티플렉스 PCR 용 반응액
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b), 임균 검출용 프라이머쌍을 포함하는 멀티플렉스 PCR 용 반응액
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (c), 임균 검출용 프라이머쌍을 포함하는 멀티플렉스 PCR 용 반응액
·특허문헌 1 의 프라이머쌍, CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍, 임균 검출용 프라이머쌍을 포함하는 멀티플렉스 PCR 용 반응액
상기 (2) 에서 조제한 인간 게놈 DNA 1 μL 를, 4 종의 멀티플렉스 PCR 용 반응액 25 μL 에 각각에 현탁 첨가하고, 이것을 멀티플렉스 PCR 용 시료로 하였다.
이 멀티플렉스 PCR 용 시료를 이용하고, 실시예 4 (4) 와 동일한 방법에 의해, 멀티플렉스 PCR, 캐필러리 전기 영동을 함으로써, 핵산 증폭 산물의 분리, 검출을 실시하였다.
(4) 결과
캐필러리 전기 영동의 결과를, 도 3 에 나타낸다. 도 3 의 각 레인에 있어서 사용한 프라이머쌍을, 하기 표 13 에 나타낸다.
또, 도 3 에 있어서, 밴드는, 핵산 증폭 산물이 검출된 것을 나타낸다. 또한, 멀티플렉스 PCR 용 시료는, 클라미디아 트라코마티스 DNA 를 포함하지 않기 때문에, 핵산 증폭 산물을 나타내는 밴드가 검출된 경우, 그 밴드는 비특이적으로 핵산이 증폭되어 있는 것 (비특이적 핵산 증폭 산물이 얻어진 것) 을 나타낸다.
Figure pct00013
도 3 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 특허문헌 1 의 프라이머쌍 및 CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 4 : 비교예 4), 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 형광 강도가 높은 (진한) 밴드가 다수 검출되었다.
특히, 140 ∼ 200 염기쌍 사이의 핵산 증폭 산물 (밴드) 은, 형광 강도가 높고, 잠재 플라스미드의 타겟 배열인 145 염기쌍 및 CT 게놈 DNA 의 타겟 배열인 164 염기쌍에 가깝기 때문에, 위양성이 될 가능성이 높은 것을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 1 : 실시예 5-1), 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 2 : 실시예 5-2), 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (c) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여, 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 3 : 실시예 5-3) 는, 인간 게놈 DNA 존재하여도, 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 밴드는 적고, 밴드의 형광 강도도 낮은 (연한) 것이었다.
또, 잠재 플라스미드의 타겟 배열인 148 염기쌍 및 CT 게놈 DNA 의 타겟 배열인 173 염기쌍, 174 염기쌍 부근에는 밴드가 보이지 않기 때문에, 위양성이 될 가능성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하면, 비특이적인 핵산의 증폭이 억제되어, 위양성이 될 가능성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다.
한편, 특허문헌 1 의 프라이머쌍 및 CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하면, 비특이적인 핵산의 증폭은 억제되지 않아, 위양성이 될 가능성이 높은 것을 알 수 있었다.
실시예 6 및 비교예 5 인간 게놈 DNA 존재하에 있어서의 클라미디아 트라코마티스의 검출
(1) 프라이머쌍
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍
실시예 1 과 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a)
실시예 4 와 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b)
실시예 5 와 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·특허문헌 1 의 프라이머쌍
비교예 1 과 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍
비교예 4 와 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
·임균 검출용 프라이머쌍
실시예 4 와 동일한 프라이머쌍을 사용하였다.
사용한 각 프라이머쌍을, 하기 표 14 에 정리하였다.
Figure pct00014
(2) 타겟 배열
본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍은, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE603230.1) 중, 염기 번호 4770 ∼ 4917 의 영역 (148 염기쌍 : 서열 번호 2) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a) 는, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE601796.2) 중, 염기 번호 782264 ∼ 782436 의 영역 (173 염기쌍 : 서열 번호 3) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b) 는, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE601796.2) 중, 염기 번호 782264 ∼ 782436 의 영역 (173 염기쌍 : 서열 번호 3) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
특허문헌 1 의 프라이머쌍은, 잠재 플라스미드의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE603230.1) 중, 염기 번호 4771 ∼ 4915 의 영역 (145 염기쌍 : 서열 번호 19) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍은, CT 게놈 DNA 의 전체 염기 서열 (GenBankID : HE601796.2) 중, 염기 번호 782264 ∼ 782427 의 영역 (164 염기쌍 : 서열 번호 20) 으로 이루어지는 염기 서열을 타겟 배열로 한다.
(3) 클라미디아 DNA 의 조제
실시예 1 (3) 에서 조제한, C. trachomatis 주 (D) 로부터 정제한 클라미디아 DNA 를 사용하였다.
(4) 인간 게놈 DNA 의 조제
실시예 2 (2) 에서 조제한 인간 게놈 DNA 를 사용하였다.
(5) 멀티플렉스 PCR
프라이머쌍으로서, 상기 (1) 을 선택한 것 이외에는, 실시예 4 (4) 와 동일한 방법에 의해, 이하의 멀티플렉스 PCR 용 반응액을 각각 조제하였다.
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a), 임균 검출용 프라이머쌍을 포함하는 멀티플렉스 PCR 용 반응액
·본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍, 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b), 임균 검출용 프라이머쌍을 포함하는 멀티플렉스 PCR 용 반응액
·특허문헌 1 의 프라이머쌍, CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍, 임균 검출용 프라이머쌍을 포함하는 멀티플렉스 PCR 용 반응액
상기에서 조제한 클라미디아 DNA 1 μL 및 인간 게놈 DNA 1 μL 를, 3 종의 멀티플렉스 PCR 용 반응액 25 μL 각각에 현탁 첨가하고, 이것을 멀티플렉스 PCR 용 시료로 하였다.
이 멀티플렉스 PCR 용 시료를 이용하고, 실시예 4 (4) 와 동일한 방법에 의해, 멀티플렉스 PCR, 캐필러리 전기 영동을 함으로써, 핵산 증폭 산물의 분리, 검출을 실시하였다.
또한 얻어진 잠재 플라스미드의 타겟 배열의 밴드의 형광 강도 (농도) 로부터, 증폭된 잠재 플라스미드의 핵산 농도를 산출하였다.
(6) 결과
캐필러리 전기 영동의 결과를 도 4 및 도 5 에 나타낸다. 도 4 및 도 5 의 각 레인에 있어서 사용한 프라이머쌍을 하기 표 15 에 나타낸다.
또, 도 4 에 있어서, 밴드는 핵산이 증폭된 것을 나타낸다.
또한, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용한 경우 (실시예 6-1) 그리고, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용한 경우 (실시예 6-2) 는 타겟 배열이 148 염기쌍 및 173 염기쌍이므로, 148 염기쌍, 또는 173 염기쌍 부근의 어느 일방에 밴드가 검출된 경우, 타겟인 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있었다고 할 수 있다.
특허문헌 1 의 프라이머쌍 및 CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트 사용한 경우 (비교예 5) 는, 타겟 배열이 145 염기쌍 및 164 염기쌍이므로, 145 염기쌍 부근, 또는 164 염기쌍 부근의 어느 일방에 밴드가 검출된 경우, 타겟인 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있었다고 할 수 있다.
또, 도 5 는, 도 4 에 있어서의 잠재 플라스미드의 타겟 배열의 밴드의 형광 강도 (농도) 로부터, 핵산 농도를 산출하고, 그래프화한 것이다.
Figure pct00015
도 4 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 특허문헌 1 의 프라이머쌍 및 CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 1 : 비교예 5), 145 염기쌍 및 164 염기쌍 부근에서 밴드가 검출되어 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있었지만, 130 ∼ 400 염기쌍 부근에, 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 형광 강도가 높은 (진한) 밴드가 다수 확인되었다.
특히, 130 ∼ 200 염기쌍 사이의 핵산 증폭 산물 (밴드) 은, 형광 강도가 높고, 잠재 플라스미드의 타겟 배열인 145 염기쌍 및 CT 게놈 DNA 의 타겟 배열인 164 염기쌍에 가깝기 때문에, 위양성이 될 가능성이 매우 높은 것을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 2 : 실시예 6-1), 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 3 : 실시예 6-2), 148 염기쌍 및 173 염기쌍 부근에서 밴드가 검출되어, 클라미디아 트라코마티스를 검출할 수 있었다.
또, 비특이적인 핵산의 증폭을 나타내는 밴드는 적고, 그 밴드의 형광 강도는 낮은 (연한) 것이었다.
또, 도 5 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 2 : 실시예 6-1), 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (b) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 3 : 실시예 6-2), 그 중에서도 특히 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍 (a) 를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우에는, 특허문헌 1 의 프라이머쌍 및 CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 멀티플렉스 PCR 을 실시한 경우 (레인 1 : 비교예 5) 와 비교해, 잠재 플라스미드의 타겟 배열의 핵산 농도가 높은 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터, 본 발명에 관련된 제 1 프라이머쌍 및 본 발명에 관련된 제 2 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하면, 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 있으므로 위양성이 될 가능성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다. 또, 클라미디아 트라코마티스를 고감도로 검출할 수 있는 점에서, 위음성이 될 가능성도 매우 낮은 것을 알 수 있었다.
한편, 특허문헌 1 의 프라이머쌍 및 CT 게놈 DNA 대상의 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 세트를 사용하면, 비특이적인 핵산의 증폭을 억제할 수 없기 때문에, 위양성이 될 가능성이 높은 것을 알 수 있었다. 또, 클라미디아 트라코마티스를 고감도로 검출할 수 없는 점에서, 위음성이 될 가능성도 매우 높은 것도 알 수 있었다.
산업상 이용가능성
본 발명의 프라이머 세트를 사용한 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법에 의하면, 인간 게놈 DNA 가 혼재할 가능성이 높은, 소변, 인두, 자궁경관 유래의 시료를 사용한 경우여도, 진단상의 오판정을 경감하는 것이 가능해져, 종래법과 비교해 클라미디아 트라코마티스를 고감도로 특이적으로 정밀하게 검출할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Wako Pure Chemical Industries, Ltd. <120> Primer Set for Detecting Chlamydia trachomatis <130> 2046PCT <150> JP2016-069163 <151> 2016-03-30 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7492 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 1 tttgcaactc ttggtggtag actttgcaac tcttggtggt agactttgca atcttggtgg 60 tagactttgc aactcttggt ggtagacttg gtcataatgg acttttgtta aaaaatttct 120 taaaatctta gagctccgat tttgaatagc tttggttaag aaaatgggct cgatggcttt 180 ccataaaagt agattgttct taacttttgg ggacgcgtcg gaaatttggt tatctacttt 240 atctcatcta actagaaaaa attatgcgtc tgggattaac tttcttgttt ctttagagat 300 tctggattta tcggaaacct tgataaaggc tatttctctt gaccacagcg aatctttgtt 360 taaaatcaag tctctagatg tttttaatgg aaaagtcgtt tcagaggcct ctaaacaggc 420 tagagcggca tgctacatat ctttcacaaa gtttttgtat agattgacca agggatatat 480 taaacccgct attccattga aagattttgg aaacactaca ttttttaaaa tccgagacaa 540 aatcaaaaca gaatcgattt ctaagcagga atggacagtt ttttttgaag cgctccggat 600 agtgaattat agagactatt taatcggtaa 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tggaatatct ttaacagtct 4860 ccaataattc atcaaccaat gcttctatta caattggttt ggatgcggaa aaagcttacc 4920 agcttattct agaaaagttg ggaaatcaaa ttcttgatgg aattgctgat actattgttg 4980 atagtacagt ccaagatatt ttagacaaaa tcacaacaga cccttctcta ggtttgttga 5040 aagcttttaa caactttcca atcactaata aaattcaatg caacgggtta ttcactccca 5100 gtaacattga aactttatta ggaggaactg aaataggaaa attcacagtc acacccaaaa 5160 gctctgggag catgttctta gtctcagcag atattattgc atcaagaatg gaaggcggcg 5220 ttgttctagc tttggtacga gaaggtgatt ctaagccctg cgcgattagt tatggatact 5280 catcaggcgt tcctaattta tgtagtctaa gaaccagcat tactaataca ggattgactc 5340 caacaacgta ttcattacgt gtaggcggtt tagaaagcgg tgtggtatgg gttaatgccc 5400 tttctaatgg caatgatatt ttaggaataa caaatacttc taatgtatct tttttggaag 5460 taatacctca aacaaacgct taaacaattt ttattggatt tttcttatag gttttatatt 5520 tagagaaaac agttcgaatt acggggtttg ttatgcaaaa taaaagaaaa gtgagggacg 5580 attttattaa aattgttaaa gatgtgaaaa aagatttccc cgaattagac ctaaaaatac 5640 gagtaaacaa ggaaaaagta actttcttaa attctccctt agaactctac cataaaagtg 5700 tctcactaat tctaggactg cttcaacaaa tagaaaactc tttaggatta ttcccagact 5760 ctcctgttct tgaaaaatta gaggataaca gtttaaagct aaaaaaggct ttgattatgc 5820 ttatcttgtc tagaaaagac atgttttcca aggctgaata gacaacttac tctaacgttg 5880 gagttgattt gcacacctta gttttttgct cttttaaggg aggaactgga aaaacaacac 5940 tttctctaaa cgtgggatgc aacttggccc aatttttagg gaaaaaagtg ttacttgctg 6000 acctagaccc gcaatccaat ttatcttctg gattgggggc tagtgtcaga aataaccaaa 6060 aaggcttgca cgacatagta tacaaatcaa acgatttaaa atcaatcatt tgcgaaacaa 6120 aaaaagatag tgtggaccta attcctgcat catttttatc cgaacagttt agagaattgg 6180 atattcatag aggacctagt aacaacttaa agttatttct gaatgagtac tgcgctcctt 6240 tttatgacat ctgcataata gacactccac ctagcctagg agggttaacg aaagaagctt 6300 ttgttgcagg agacaaatta attgcttgtt taactccaga acctttttct attctagggt 6360 tacaaaagat acgtgaattc ttaagttcgg tcggaaaacc tgaagaagaa cacattcttg 6420 gaatagcttt gtctttttgg gatgatcgta actcgactaa ccaaatgtat atagacatta 6480 tcgagtctat ttacaaaaac aagctttttt caacaaaaat 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oligonucleotide primer <400> 5 ccgctcaagg accagcaaat aatc 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 6 aagctttttc cgcatccaaa cca 23 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 7 ccagaaaaag atagcgagca caaagagag 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 8 ccagaaaaag atagcgagca caaagaga 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 9 gccagaaaaa gatagcgagc acaaagag 28 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 10 cacagaattc cgtcgatcat aagg 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 11 cgctcaagga ccagcaaata 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 12 gctttttccg catccaaac 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 13 ccgctcaagg accagcaa 18 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 14 agaagcattg gttgatgaat ta 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 15 attgtgttga aacaccgccc gg 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 16 ttcggctcct tattcggttt gacc 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 17 gatagcgagc acaaagagag ctaa 24 <210> 18 <211> 117 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 18 ccgctcaagg accagcaaat aatccttggg acaaaatcaa cacctgtcgc agccaaaatg 60 acagcttctg atggaatatc tttaacagtc tccaataatt catcaaccaa tgcttct 117 <210> 19 <211> 145 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 19 cgctcaagga ccagcaaata atccttggga caaaatcaac acctgtcgca gccaaaatga 60 cagcttctga tggaatatct ttaacagtct ccaataattc atcaaccaat gcttctatta 120 caattggttt ggatgcggaa aaagc 145 <210> 20 <211> 164 <212> DNA <213> Chlamydia trachomatis <400> 20 cacagaattc cgtcgatcat aaggcttggt tcagcaggat tccccacagg cagagcttgc 60 aaggaggaag cagaactcaa agcggcaaat actaacaccg atttcaagag ttttttcatt 120 cttacctcta aattgtataa ttagctctct ttgtgctcgc tatc 164

Claims (11)

  1. 서열 번호 5 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 6 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 1 프라이머쌍을 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    추가로, 서열 번호 7 ∼ 9 중 어느 것으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 제 2 프라이머쌍을 포함하는, 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트.
  3. 제 2 항에 있어서,
    제 2 프라이머쌍이, 서열 번호 7 로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머와 서열 번호 10 으로 나타내는 염기 서열로 이루어지는 리버스 프라이머의 조합으로 이루어지는 것인, 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 1 개의 프라이머가 표지 물질로 표지된 것인, 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트.
  5. 제 4 항에 있어서,
    표지 물질이 형광 물질, 방사성 동위체, 효소, 발광 물질에서 선택되는 것인, 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 프라이머 세트를 이용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시하고, 얻어진 핵산 증폭 산물을 검출하는 것을 특징으로 하는, 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    하기 공정을 함유하는 것을 특징으로 하는, 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법
    (1) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 프라이머 세트를 이용하고, 시료 중의 핵산을 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시한다,
    (2) (1) 의 핵산 증폭 반응에서 얻어진 핵산 증폭 산물에 대해 전기 영동을 실시하고, 그 결과에 기초하여 클라미디아 트라코마티스의 유무를 판정한다.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    핵산 증폭 반응이 PCR 인, 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    전기 영동이 캐필러리 전기 영동인, 클라미디아 트라코마티스의 검출 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 프라이머 세트를 포함하여 이루어지는, 클라미디아 트라코마티스 검출용 시약 키트.
  11. 제 10 항에 있어서,
    적어도 1 개의 프라이머가 표지 물질로 표지된 것인 프라이머 세트를 포함하여 이루어지는, 클라미디아 트라코마티스 검출용 시약 키트.
KR1020187019029A 2016-03-30 2017-03-27 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트 KR102259445B1 (ko)

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