CN112708658A - 一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子鉴定领域，特别是涉及一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用。本发明利用所述引物组进行多重PCR同时检测9种耐药基因时，9组引物对之间无交叉反应，特异性好、灵敏度高，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、特异性好、重复性好和线性范围广的优点，在耐药基因的检测应用方面有较大的前景；且在PCR扩增后，不需要对PCR产物进行处理，可直接与微球杂交，节省了时间，简化了工艺。

Description

一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用
技术领域
本发明涉及分子鉴定领域，特别是涉及一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用。
背景技术
qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB分别属于喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类和四环素类耐药基因，这四类药物无论是在医用还是兽用都是主要的抗菌药物，在长期的使用中产生了大量的多重耐药菌(multidrugresistance，MDR)。
耐药基因可通过质粒、整合子、转座子等移动元件在不同细菌间传播，也可以在动物、人和环境之间传播。细菌耐药性的检测与监测有助于了解耐药菌和耐药基因的流行和分布、制定合理的抗菌药物使用计划。然而，目前临床实验室多采用药敏试验检测耐药菌的表型和常规PCR检测基因型，但其检测周期长时效性差、检测通量低、影响因素多，不能满足目前检测样本量大、灵敏度高和及时反馈的要求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用。本发明提供的液态芯片引物组能够同时检测qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB 9种耐药基因，而且具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、特异性好、重复性好和线性范围广的优点，在耐药基因的检测应用方面会有较大的前景。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组，所述引物组的上游引物的结构均为F1-F2-F3，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取时的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检耐药基因的特异基因序列互补，F2包括间臂；所述间臂包括多聚dT、寡聚四聚乙二醇或(CH2)n，其中n≥3；
所述引物组的下游引物中包括与待检耐药基因的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素；
所述多重耐药基因包括qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB；
检测耐药基因qnrS的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.1所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.2所示；
检测耐药基因aac(6’)-Ib-cr的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.3所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.4所示；
检测耐药基因gyrA的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.5所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.6所示；
检测耐药基因sul-1的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.7所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.8所示；
检测耐药基因sul-2的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.9所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.10所示；
检测耐药基因sul-3的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.11所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.12所示；
检测耐药基因aadA1的引物中上游引物中的F3序列如SEQ ID No.13所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.14所示；
检测耐药基因Aph(3’)-Ⅱ-a的引物中上游引物中的F3序列如SEQ ID No.15所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.16所示；
检测耐药基因tetB的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.17所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.18所示。
优选的，检测耐药基因qnrS的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.19所示；
检测耐药基因aac(6’)-Ib-cr的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.20所示；
检测耐药基因gyrA的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.21；
检测耐药基因sul-1的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.22所示；
检测耐药基因sul-2的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.23所示；
检测耐药基因sul-3的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.24所示；
检测耐药基因aadA1的引物中上游引物中的F1序列如SEQ ID No.25所示；
检测耐药基因Aph(3’)-Ⅱ-a的引物中上游引物中的F1序列如SEQ ID No.26所示；
检测耐药基因tetB的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.27所示。
优选的，当所述间臂为(CH2)n时，n为10～18。
本发明提供了上述方案所述液态芯片引物组在制备同时检测9种耐药基因的试剂盒中的应用，所述耐药基因包括qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB。
本发明提供了一种同时检测9种耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述液态芯片引物组和2×PROMEGA Go Taq Green Master Mix。
本发明提供了一种同时检测多种耐药基因的方法，包括以下步骤：
将待测样品DNA模板与权利要求1～3任一项所述液态芯片引物组混合后进行PCR扩增，得到扩增产物；
将扩增产物与偶联核苷酸片段的微球杂交后，读取荧光中位数MFI值；
当样品的MFI值与空白对照的MFI值的比值≥3时，结果判为阳性；当所述比值＜2时，结果判为阴性；当所述比值在[2,3)区间内时，结果判为可疑。
优选的，所述偶联核苷酸片段的微球所连接的序列如SEQ ID NO:1～9所示。
优选的，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，包括qnrS-F 0.8μL、qnrS-R 0.8μL、aac(6’)-Ib-cr-F 1.2μL、aac(6’)-Ib-cr-R 1.2μL、gyrA-F 0.8μL、gyrA-R 0.8μL、sul-1-F0.8μL、sul-1-R 0.8μL、sul-2-F 1.8μL、sul-2-R 1.8μL、sul-3-F 1.8μL、sul-3-R 1.8μL、aadA1-F 0.8μL、aadA1-R 0.8μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-F 0.6μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-R 0.6μL、tetB-F1.2μL和tetB-R 1.2μL，2×PCR Mix 25μL、模板0.5～2μL和余量的ddH2O。
优选的，所述qnrS-F、qnrS-R、aac(6’)-Ib-cr-F、aac(6’)-Ib-cr-R、gyrA-F、gyrA-R、sul-1-F、sul-1-R、sul-2-F、sul-2-R、sul-3-F、sul-3-R、aadA1-F、aadA1-R、Aph(3’)-Ⅱ-a-F、Aph(3’)-Ⅱ-a-R、tetB-F和tetB-R的工作浓度均为10μmol·L-1。
优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
有益效果：
本发明提供了一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组，所述引物组的上游引物的结构均为F1-F2-F3，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取时的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检耐药基因的特异基因序列互补，F2包括间臂；所述间臂包括多聚dT、寡聚四聚乙二醇或(CH2)n，其中n≥3；所述引物组的下游引物中包括与待检耐药基因的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素；所述多重耐药基因包括qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB。利用所述引物组进行多重PCR同时检测9种耐药基因时，9组引物对之间无交叉反应，特异性好、灵敏度高，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、特异性好、重复性好和线性范围广的优点，在耐药基因的检测应用方面有较大的前景；且在PCR扩增后，不需要对PCR产物进行处理，可直接与微球杂交，节省了时间，简化了工艺。
附图说明
图1为实施例1中9对引物对各特异耐药基因扩增的PCR电泳图；
图2从左至右为实施例3中aac(6’)-Ib-cr、gyrA、Aph(3’)-Ⅱ-a引物对各特异耐药基因灵敏性检测PCR电泳结果图；
图3从左至右为实施例3中qnrS、sul-3、sul-2引物对各特异耐药基因灵敏性检测PCR电泳结果图；
图4从左至右为实施例3中tetB、sul-1、aadA1引物对各特异耐药基因灵敏性检测PCR电泳结果图；
图5为实施例3中9对引物对各特异耐药基因灵敏性检测结果图。
具体实施方式
如无特殊要求，本发明所用试剂均为本领域技术人员常规购买所得。
本发明提供了一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组，所述引物组的上游引物的结构均为F1-F2-F3，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取时的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检耐药基因的特异基因序列互补，F2包括间臂；所述间臂包括多聚dT、寡聚四聚乙二醇或(CH2)n，其中n≥3；所述引物组的下游引物中包括与待检耐药基因的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素；所述多重耐药基因包括qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB；
检测耐药基因qnrS的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.1所示：TAGAGTTCCGTGCGTGTGA，下游引物中R序列如SEQ ID NO.2所示：GTTCGTTCCTATCCAGCGATT；
检测耐药基因aac(6’)-Ib-cr的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.3所示：TACAGCATCGTGACCAACA，下游引物中R序列如SEQ ID NO.4所示：CCAATCGGCTCTCCATTCAG；
检测耐药基因gyrA的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.5所示：GCTGCCAGATGTCCGAGAT，下游引物中R序列如SEQ ID NO.6所示：AAGTTACCCTGACCGTCTACC；
检测耐药基因sul-1的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.7所示：GACGGTGTTCGGCATTCTG，下游引物中R序列如SEQ ID NO.8所示：GGTTGGAAGCTGTCGATTGAA；
检测耐药基因sul-2的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.9所示：TCCAGACACTGCGTTCTATCC，下游引物中R序列如SEQ ID NO.10所示：AAGGCGGTTGCGTTTGATAC；
检测耐药基因sul-3的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.11所示：GTTGAAGATGGAGCAGATGTGA，下游引物中R序列如SEQ ID NO.12所示：TGACTTTGCCAAGCCTGAATAA；
检测耐药基因aadA1的引物中上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.13所示：CATCATTCCGTGGCGTTATCC，下游引物中R序列如SEQ ID NO.14所示：GCGAGTTCCATAGCGTTAAGG；
检测耐药基因Aph(3’)-Ⅱ-a的引物中上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.15所示：TGGAGAGGCTATTCGGCTATG，下游引物中R序列如SEQ ID NO.16所示：GCAAGGTGAGATGACAGGAGA；
检测耐药基因tetB的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID NO.17所示：CCAGTGCTGTTGTTGTCATTAA，下游引物中R序列如SEQ ID NO.18所示：AAAGGGACTATGCGGTGAAATC。
在本发明中，当所述间臂为(CH2)n时，n优选为10～18，更优选为12。在本发明实施例中，所述间臂为(CH2)12(用spacer12表示)，但是不能仅将其认定为本发明的保护范围。
在本发明中，检测耐药基因qnrS的引物中，上游引物中的F1序列优选如SEQ IDNO.19所示：TACTTCTTTACTACAATTTACAAC；
检测耐药基因aac(6’)-Ib-cr的引物中，上游引物中的F1序列优选如SEQ IDNO.20所示：TACTTAAACATACAAACTTACTCA；
检测耐药基因gyrA的引物中，上游引物中的F1序列优选如SEQ ID NO.21：ATATACTTTACACTTTCAACAAAC；
检测耐药基因sul-1的引物中，上游引物中的F1序列优选如SEQ ID NO.22所示：CAATTTACATTTCACTTTCTTATC；
检测耐药基因sul-2的引物中，上游引物中的F1序列优选如SEQ ID NO.23所示：TAACTTACACTTAACTATCATCTT；
检测耐药基因sul-3的引物中，上游引物中的F1序列优选如SEQ ID NO.24所示：ATACTTTACAAACAAATAACACAC；
检测耐药基因aadA1的引物中上游引物中的F1序列优选如SEQ ID NO.25所示：TTAATACAATTCTCTCTTTCTCTA；
检测耐药基因Aph(3’)-Ⅱ-a的引物中上游引物中的F1序列优选如SEQ ID NO.26所示：TTTACAACTACTAAACACACATTT；
检测耐药基因tetB的引物中，上游引物中的F1序列优选如SEQ ID NO.27所示：AACTTTCTCTCTCTATTCTTATTT。
本发明所述引物组包含的引物碱基数为18～22个，引物的熔解温度Tm值为51℃～57℃，引物GC％为40％～60％，引物扩增的目标片段长度为185bp～277bp；合成或标记的引物均可采用HPLC纯化。本发明提供的9组引物对之间无交叉反应，可以在同一反应体系中同时检测qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB 9种耐药基因，且特异性好、灵敏度高；同时本发明提供的液态芯片引物组具有高通量、高速度、低成本、重复性好和线性范围广的优点，在耐药基因的检测应用方面会有较大的前景。
本发明对所述引物对的合成方法并没有特殊限定，优选由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明提供了上述液态芯片引物组在制备同时检测9种耐药基因的试剂盒中的应用，所述耐药基因包括qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB。
本发明提供了一种同时检测9种耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包括包括上述液态芯片引物组和2×PROMEGA Go Taq Green Master Mix。
本发明所述引物组或所述试剂盒中的引物组针对qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB9种耐药基因设计得到，能够特异性的鉴定9种耐药基因，且9组引物对之间无交叉反应，特异性好、灵敏度高。
本发明提供了一种同时检测多种耐药基因的方法，包括以下步骤：将待测样品DNA模板与上述方案所述液态芯片引物组混合后进行PCR扩增，得到扩增产物；
将扩增产物与偶联核苷酸片段的微球杂交后，读取荧光中位数MFI值；
当样品的MFI值与空白对照的MFI值的比值≥3时，结果判为阳性；当所述比值＜2时，结果判为阴性；当所述比值在[2,3)区间内时，结果判为可疑。
本发明将待测样品DNA模板与上述方案所述液态芯片引物组混合后进行PCR扩增，得到扩增产物。在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，优选包括qnrS-F 0.8μL、qnrS-R 0.8μL、aac(6’)-Ib-cr-F 1.2μL、aac(6’)-Ib-cr-R 1.2μL、gyrA-F 0.8μL、gyrA-R0.8μL、sul-1-F 0.8μL、sul-1-R 0.8μL、sul-2-F 1.8μL、sul-2-R 1.8μL、sul-3-F 1.8μL、sul-3-R 1.8μL、aadA1-F 0.8μL、aadA1-R 0.8μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-F 0.6μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-R0.6μL、tetB-F 1.2μL和tetB-R1.2μL，2×PCR Mix 25μL、模板0.5～2μL和余量的ddH2O；所述qnrS-F、qnrS-R、aac(6’)-Ib-cr-F、aac(6’)-Ib-cr-R、gyrA-F、gyrA-R、sul-1-F、sul-1-R、sul-2-F、sul-2-R、sul-3-F、sul-3-R、aadA1-F、aadA1-R、Aph(3’)-Ⅱ-a-F、Aph(3’)-Ⅱ-a-R、tetB-F和tetB-R的工作浓度均优选为10μmol·L-1；所述模板更优选为0.1μL；所述PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
检测多重耐药基因的引物筛选，选择GenBank中qnrS NG_050543.1、aac(6’)-Ib-cr NG_052123.1、gyrA MF741921.1、sul-1 NG_048082.1、sul-2 NG_048106.1、sul-3 NG_048120.1、aadA1 NG_047324.1、Aph(3’)-Ⅱ-a NG_047417.1和tetB NG_048170.1作为参考序列，进行序列同源性比较，选择其保守区域，通过primerplexP2273多重引物软件设计候选引物，并经过大量的反应条件优选，对比试验和验证试验获得多重耐药基因检测的液态芯片引物组；所述引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；所述引物组的上游引物的结构均为F1-F2-F3，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取时的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检耐药基因的特异基因序列互补，F2为(CH2)12间臂；所述引物组的下游引物中包括与待检耐药基因的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素。引物序列及扩增片段长度见表1。
表1引物序列及扩增片段长度
Figure BDA0002918181490000091
注：表1中小写字母表示所述F1序列，Spacer12表示(CH2)12间臂，Spacer12连接的大写字母表示所述F3序列，Biotin表示生物素，连接有Biotin的大写字母表示R序列。
按各自的摩尔数计算，用双蒸水溶解成100μM贮存液备用。采用上述9对引物，以提取的9种耐药基因(qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB)的DNA或反转录的cDNA为模板分别进行PCR扩增，经2％的琼脂凝胶电泳，其结果见图1，其中泳道M为Takara Biomedical Technology(Beijing)生产的DL2000 DNA marker；泳道1～9分别对应qnrS、sul-3、sul-2、tetB、sul-1、aadA1、aac(6’)-Ib-cr、gyrA和Aph(3’)-Ⅱ-a的核酸样本。从图1可以看出，各对引物均能扩增出清晰的目的性条带，目的性条带大小为185bp～277bp。
实施例2
特异性实验
样品DNA提取
(1)水煮法提取：取经过增菌(大肠杆菌)培养的培养基1mL在12000rpm离心5min，沉淀用500μL无菌生理盐水洗1次后用100μL无菌超纯水重悬，煮沸10min，冰浴10min，12000rpm离心5min取上清。
(2)细菌基因组DNA小量试剂盒提取。
本发明选择GenBank中选择qnrS NG_050543.1、aac(6’)-Ib-cr NG_052123.1、gyrA MF741921.1、sul-1 NG_048082.1、sul-2 NG_048106.1、sul-3 NG_048120.1、aadA1NG_047324.1、Aph(3’)-Ⅱ-a NG_047417.1和tetB NG_048170.1作为参考序列，重新设计引物扩增大于上述扩增目标片段的基因序列，序列长度在500bp～1000bp，连接入pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中。挑取阳性克隆增菌后提取质粒，通过DNA测序以鉴定插入了目标序列。然后通过测定质粒浓度进行阳性核酸拷贝数的换算，以制备标准品，其浓度至少大于108拷贝/μL。标准品可用于敏感性测定，也可作为阳性对照。
根据9种耐药基因的引物序列与Luminex TM公司现有MagPlex-Tag荧光微球及其所偶联的核苷酸序列进行比对，挑选如下9种荧光MagPlex-Tag微球，编号为：15、19、27、43、51、54、65、87、98。
选取qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB的阳性质粒及其对应引物，配置成多重PCR反应体系：2×PROMEGA Go Taq GreenMaster Mix 25μL；各引物工作浓度为10μM，取qnrS-F 0.8μL、qnrS-R 0.8μL、aac(6’)-Ib-cr-F 1.2μL、aac(6’)-Ib-cr-R 1.2μL、gyrA-F 0.8μL、gyrA-R 0.8μL、sul-1-F 0.8μL、sul-1-R 0.8μL、sul-2-F 1.8μL、sul-2-R 1.8μL、sul-3-F 1.8μL、sul-3-R 1.8μL、aadA1-F 0.8μL、aadA1-R 0.8μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-F 0.6μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-R 0.6μL、tetB-F 1.2μL和tetB-R 1.2μL，模板1μL；补水至50μL；反应条件为95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，循环35次；72℃10min。各基因阳性质粒按下表2设计加样1μL。
表2 9种耐药基因特异性试验设计对照表
Figure BDA0002918181490000111
取5μL扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球(125个/μL)和链霉素-亲和素藻红蛋白(SAPE)(10μg/mL)混合，在30℃孵育杂交20min(所述1×杂交缓冲液为0.1M Tris-ClpH8.0，0.2M NaCl和0.08％TritonX-100)。
在Luminex TM 200仪器上读取荧光中位数MFI值，根据读数进行结果判定；具体的，所述结果判定为：当样品的MFI值与空白样品的MFI值的比值≥3时结果判为阳性，如果其比值＜2时判为阴性，如果2≤比值＜3时结果判为可疑，试验结果见表3。
表3 9种耐药基因特异性试验结果
Figure BDA0002918181490000112
Figure BDA0002918181490000121
由表3和图2可知，本发明提供的9组引物对，可分别对qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB九种耐药基因有特异性扩增和阳性检出，引物和荧光微球均不存在非特异性的交叉反应。
实施例3
灵敏度试验
选取qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB的阳性质粒及其对应引物，配置成多重PCR反应体系：2×PROMEGA Go Taq GreenMaster Mix 25μL；各引物工作浓度为10μM，取qnrS-F 0.8μL、qnrS-R 0.8μL、aac(6’)-Ib-cr-F 1.2μL、aac(6’)-Ib-cr-R 1.2μL、gyrA-F 0.8μL、gyrA-R 0.8μL、sul-1-F 0.8μL、sul-1-R 0.8μL、sul-2-F 1.8μL、sul-2-R 1.8μL、sul-3-F 1.8μL、sul-3-R 1.8μL、aadA1-F 0.8μL、aadA1-R 0.8μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-F 0.6μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-R 0.6μL、tetB-F 1.2μL和tetB-R 1.2μL，模板1μL；补水至50μL；反应条件为95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，循环35次；72℃10min。各基因阳性质粒按下表4设计加样1μL。
表4 9种耐药基因灵敏度试验设计对照表
Figure BDA0002918181490000122
Figure BDA0002918181490000131
取5μL扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球(125个/μL)和链霉素-亲和素藻红蛋白(SAPE)(10μg/mL)混合，在30℃孵育杂交20min(所述1×杂交缓冲液为0.1M Tris-ClpH8.0，0.2M NaCl和0.08％TritonX-100)。
在Luminex TM 200仪器上读取荧光中位数MFI值，根据读数进行结果判定；具体的，所述结果判定为：当样品的MFI值与空白样品的MFI值的比值≥3时结果判为阳性，如果其比值＜2时判为阴性，如果2≤比值＜3时结果判为可疑。试验结果见表5和图2～5，其中图2从左到右依次为aac(6’)-Ib-cr、gyrA、Aph(3’)-Ⅱ-a，图3从左到右依次为qnrS、sul-3、sul-2，图4从左到右依次为tetB、sul-1、aadA1，图2～4对应的检测浓度从左至右为1010copies/μL至103copies/μL依次递减。
表5 9种耐药基因灵敏度试验结果
Figure BDA0002918181490000132
由表5和图2～5可知，本发明提供的9组引物对，对qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB九种耐药基因的检测不仅可以相对定量，而且灵敏度高，灵敏度结果中扩增单一阳性质粒时最低检测量分别为qnrS 102copies/μL、sul-3 103copies/μL、sul-2 102copies/μL、tetB 103copies/μL、sul-1 103copies/μL、aadA1 103copies/μL、aac(6’)-Ib-cr 103copies/μL、gyrA 103copies/μL、Aph(3’)-Ⅱ-a104copies/μL。
实施例4
临床样品试验
选取qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB的阳性质粒及其对应引物，配置成多重PCR反应体系：2×PROMEGA Go Taq GreenMaster Mix 25μL；各引物工作浓度为10μM，取qnrS-F 0.8μL、qnrS-R 0.8μL、aac(6’)-Ib-cr-F 1.2μL、aac(6’)-Ib-cr-R 1.2μL、gyrA-F 0.8μL、gyrA-R 0.8μL、sul-1-F 0.8μL、sul-1-R 0.8μL、sul-2-F 1.8μL、sul-2-R 1.8μL、sul-3-F 1.8μL、sul-3-R 1.8μL、aadA1-F 0.8μL、aadA1-R 0.8μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-F 0.6μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-R 0.6μL、tetB-F 1.2μL和tetB-R 1.2μL，模板1μL；补水至50μL；反应条件为95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，循环35次；72℃10min。水煮法提取临床样本细菌中的基因组：取经过增菌培养的培养基1mL在12,000rpm离心5min，沉淀用500μL无菌生理盐水洗1次后用100μL无菌超纯水重悬，煮沸10min，冰浴10min，12,000rpm离心5min取上清。分别取临床样本1-19号1μL模板待检。
取5μL扩增产物与1×Tm杂交液稀释的混合微球(125个/μL)和链霉素-亲和素藻红蛋白(SAPE)(10μg/mL)混合，在30℃孵育杂交20min(所述1×杂交缓冲液为0.1M Tris-ClpH8.0，0.2M NaCl和0.08％TritonX-100)。
在Luminex TM 200仪器上读取荧光中位数MFI值，根据读数进行结果判定；具体的，所述结果判定为：当样品的MFI值与空白样品的MFI值的比值≥3时结果判为阳性，如果其比值＜2时判为阴性，如果2≤比值＜3时结果判为可疑。临床样品液态芯片检测法试验结果见表6，临床样品PCR检测法试验结果见表7，液态芯片检测与常规PCR检测结果符合率见表8。
表6临床样品液态芯片检测法试验结果
微球编号 15 19 27 43 51 54 65 87 98
基因名称 qnrS sul-3 sul-2 tetB sul-1 aadA1 aac(6’)-Ib-cr gyrA Aph(3’)-Ⅱ-a
Sample1 277.5 294 2212 2290 2016.5 445 741 1694.5 375
Sample2 277.5 317 1256 841 1727.5 1291 277 2918 403.5
Sample3 1239.5 269 1145 413.5 1264.5 657 481 2593 222
Sample4 772 343 1601.5 858 2161 964 545.5 2694 918.5
Sample5 1262 220 1316 778.5 1833 1205 405.5 2838 365
Sample6 1360 177 1075 269 631 245 231.5 446 165.5
Sample7 114 419 1436 920 1429.5 1354.5 420.5 2866 374
Sample8 2047 384 1461 557 1689 1965.5 378.5 2610 216
Sample9 1693 394 1302 622 1281 1101 601 2615.5 305.5
Sample10 1088 260 975 862 1715 2898 365.5 2473.5 312.5
Sample11 668 231 1264 621.5 2389 989.5 251.5 2293 372.5
Sample12 1051.5 317.5 1522.5 862.5 1799.5 1216.5 465.5 2340 299
Sample13 1338.5 181 1243 819 1347.5 822 335 2492 318.5
Sample14 1534.5 370 1116 715.5 1040 1186.5 554 2256.5 444
Sample15 1254 252.5 1346 686 1734 925 477 2206 328
Sample16 1184.5 200 571 312 706.5 294 156.5 457 215.5
Sample17 204.5 277 1248.5 867.5 1497 1177 412 1573.5 228.5
Sample18 1224.5 175 635.5 275 1001.5 270 147.5 413 198
Sample19 158 180.5 739.5 423 670 551 194 895 200
表7临床样品PCR检测法试验结果
Figure BDA0002918181490000151
Figure BDA0002918181490000161
表8液态芯片检测与常规PCR检测结果符合率
基因 qnrS sul-3 sul-2 tetB sul-1 aadA1 aac(6’)-Ib-cr gyrA Aph(3’)-Ⅱ-a
Kappa 0.79 0.63 0.43 0.46 0.69 0.48 0.83 0.61 0.77
本发明检测结果与常规PCR检测结果经符合率计算，sul-2、tetB和aadA1的Kappa值在0.41～0.60内，具有中等的一致性(moderate)，qnrS、sul-3、sul-1、Aph(3’)-Ⅱ-a和gyrA的Kappa值在0.61～0.80内，具有高度的一致性(substantial)，aac(6’)-Ib-cr的Kappa值在0.81～1内，几乎完全一致。
综上所述，利用所述引物组进行多重PCR同时检测9种耐药基因时，9组引物对之间无交叉反应，特异性好、灵敏度高，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、特异性好、重复性好和线性范围广的优点，在耐药基因的检测应用方面有较大的前景；且在PCR扩增后，不需要对PCR产物进行处理，可直接与微球杂交，节省了时间，简化了工艺。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组及其应用
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagagttccg tgcgtgtga 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcgttcct atccagcgat t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacagcatcg tgaccaaca 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaatcggct ctccattcag 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgccagat gtccgagat 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagttaccct gaccgtctac c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacggtgttc ggcattctg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggttggaagc tgtcgattga a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccagacact gcgttctatc c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaggcggttg cgtttgatac 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttgaagatg gagcagatgt ga 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgactttgcc aagcctgaat aa 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catcattccg tggcgttatc c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgagttcca tagcgttaag g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggagaggct attcggctat g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaaggtgag atgacaggag a 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccagtgctgt tgttgtcatt aa 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaagggacta tgcggtgaaa tc 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tacttcttta ctacaattta caac 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tacttaaaca tacaaactta ctca 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atatacttta cactttcaac aaac 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caatttacat ttcactttct tatc 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
taacttacac ttaactatca tctt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atactttaca aacaaataac acac 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttaatacaat tctctctttc tcta 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttacaacta ctaaacacac attt 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aactttctct ctctattctt attt 24

Claims (10)

1.一种多重耐药基因检测的液态芯片引物组，其特征在于，所述引物组的上游引物的结构均为F1-F2-F3，其中F1的序列与用于液态芯片结果读取时的配伍微球所连接的序列反向互补，F3的序列与待检耐药基因的特异基因序列互补，F2包括间臂；所述间臂包括多聚dT、寡聚四聚乙二醇或(CH2)n，其中n≥3；
所述引物组的下游引物中包括与待检耐药基因的特异基因序列互补的R序列，并在5′端标记生物素；
所述多重耐药基因包括qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB；
检测耐药基因qnrS的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.1所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.2所示；
检测耐药基因aac(6’)-Ib-cr的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.3所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.4所示；
检测耐药基因gyrA的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.5所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.6所示；
检测耐药基因sul-1的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.7所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.8所示；
检测耐药基因sul-2的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.9所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.10所示；
检测耐药基因sul-3的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.11所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.12所示；
检测耐药基因aadA1的引物中上游引物中的F3序列如SEQ ID No.13所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.14所示；
检测耐药基因Aph(3’)-Ⅱ-a的引物中上游引物中的F3序列如SEQ ID No.15所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.16所示；
检测耐药基因tetB的引物中，上游引物中的F3序列如SEQ ID No.17所示，下游引物中R序列如SEQ ID No.18所示。
2.根据权利要求1所述的液态芯片引物组，其特征在于，检测耐药基因qnrS的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.19所示；
检测耐药基因aac(6’)-Ib-cr的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.20所示；
检测耐药基因gyrA的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.21；
检测耐药基因sul-1的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.22所示；
检测耐药基因sul-2的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.23所示；
检测耐药基因sul-3的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.24所示；
检测耐药基因aadA1的引物中上游引物中的F1序列如SEQ ID No.25所示；
检测耐药基因Aph(3’)-Ⅱ-a的引物中上游引物中的F1序列如SEQ ID No.26所示；
检测耐药基因tetB的引物中，上游引物中的F1序列如SEQ ID No.27所示。
3.根据权利要求1所述液态芯片引物组，其特征在于，当所述间臂为(CH2)n时，n为10～18。
4.权利要求1～3任一项所述液态芯片引物组在制备同时检测9种耐药基因的试剂盒中的应用，其特征在于，所述耐药基因包括qnrS、aac(6’)-Ib-cr、gyrA、sul-1、sul-2、sul-3、aadA1、Aph(3’)-Ⅱ-a和tetB。
5.一种同时检测9种耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述液态芯片引物组和2×PROMEGA Go Taq GreenMasterMix。
6.一种同时检测多种耐药基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品DNA模板与权利要求1～3任一项所述液态芯片引物组混合后进行PCR扩增，得到扩增产物；
将扩增产物与偶联核苷酸片段的微球杂交后，读取荧光中位数MFI值；
当样品的MFI值与空白对照的MFI值的比值≥3时，结果判为阳性；当所述比值＜2时，结果判为阴性；当所述比值在[2,3)区间内时，结果判为可疑。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述偶联核苷酸片段的微球所连接的序列如SEQ ID NO:1～9所示。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系以50μL计，包括qnrS-F 0.8μL、qnrS-R 0.8μL、aac(6’)-Ib-cr-F 1.2μL、aac(6’)-Ib-cr-R 1.2μL、gyrA-F0.8μL、gyrA-R 0.8μL、sul-1-F 0.8μL、sul-1-R 0.8μL、sul-2-F 1.8μL、sul-2-R 1.8μL、sul-3-F 1.8μL、sul-3-R 1.8μL、aadA1-F 0.8μL、aadA1-R 0.8μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-F 0.6μL、Aph(3’)-Ⅱ-a-R 0.6μL、tetB-F 1.2μL和tetB-R 1.2μL，2×PCR Mix 25μL、模板0.5～2μL和余量的ddH2O。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述qnrS-F、qnrS-R、aac(6’)-Ib-cr-F、aac(6’)-Ib-cr-R、gyrA-F、gyrA-R、sul-1-F、sul-1-R、sul-2-F、sul-2-R、sul-3-F、sul-3-R、aadA1-F、aadA1-R、Aph(3’)-Ⅱ-a-F、Aph(3’)-Ⅱ-a-R、tetB-F和tetB-R的工作浓度均为10μmol·L-1。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
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