CN102424833A - 多基因突变位点的实时pcr基因检测芯片及其检测方法 - Google Patents

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艾洪新
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Abstract

本发明公开了一种多基因突变位点的实时 PCR 基因检测芯片及其检测方法,所述基因检测芯片包括多孔 PCR 板,所述多孔 PCR 板的孔内设置有 PCR 反应体系,所述 PCR 反应体系包括用于特异性扩增目标基因靶向序列的若干个引物对、荧光探针、 PCR 缓冲液、 dNTPs GoldTaq 酶,所述引物对含有目标基因外显子中至少 15 个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列;所述荧光探针在 PCR 扩增时荧光探针的荧光分子发射荧光信号。该方法对于较大基因的突变检出率达到 98% 以上。

Description

多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片及其检测方法
技术领域
本发明属于多基因突变位点的实时检测技术领域,具体涉及一种多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片及其检测方法。
背景技术
DNA突变(mutation)是遗传物质中任何可检测的能遗传的改变,但不包括遗传重组。突变是可以传递给子细胞,甚至延续给后代,从而导致产生了突变细胞或个体。对于一个多细胞生物来说,如果突变仅发生在体细胞中,那么这种突变是不会传递给后代的。这种类型的突变称为体细胞突变。但若突变发生在的生殖细胞中,那么这种突变就能通过配子传递给下一代,在后代个体的体细胞和生殖细胞中产生同样的突变,这种突变就叫做种系突变。由于遗传物质一般是DNA,突变会影响到DNA的化学或物理的构成,它的复制,表型功能或者一个或多个碱基对序列会发生改变,例如增加、减少或置换碱基,颠倒顺序或转移到新的位置上。发生在基因水平的突变称为基因突变,它涉及到基因的一个或多个序列的改变。包括一对或多对碱基对的替换,增加或缺失。由于DNA碱基对的改变引起的基因突变称为点突变。每一个人或动物个体都携带有其独特的突变谱,包括长短不一的增加或缺失(indel)、DNA片断包括基因重复数(CNV)和点突变(SNP)。
突变的种类包括:
(1)碱基替换突变
①同义突变:由于密码子具有兼并性,因此,单个碱基置换后使mRNA上改变后的密码子与改变前所编码的氨基酸一样,肽链中出现同一氨基酸。
②错义突变:DNA分子中的核苷酸置换后改变了mRNA上的遗传密码,从而导致合成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代,称为错义突变。错义突变的结果是产生异常蛋白质。
③无义突变:当单个碱基置换导致出现终止密码子(UAG、UAA、UGA)时,多肽链将提前终止合成,所产生的蛋白质大都失去活性或丧失正常功能,这种突变称为无义突变。
④终止密码突变:当DNA分子中一个终止密码发生突变,成为编码氨基酸的密码子时,多肽链的合成将继续进行,肽链延长直到遇到下一个终止密码子时才停止,因而形成了延长的异常肽链,这种突变称为终止密码突变。
(2)移码突变
基因内部DNA的碱基序列中,丢失或插入1个或几个碱基对,从而使碱基对的排列顺序发生改变引起突变。
基因片段上碱基数单个增添或减少一定会导致生物性状的改变。若碱基对数以3的倍数增添或减少,则合成的蛋白质上氨基酸种类排列顺序变化较小。
基因片段上可能某一位点上添(减)1个碱基对,然后在以后某一位点上又减(添)4个碱基对,使其添减之差为3或3的倍数,则合成的蛋白质氨基酸种类在这两个位点之间变化,其他部位变化不明显。
(3)抑制突变:RNA上的反密码子通过碱基互补配对能识别mRNA上的密码子,从而将mRNA上的核苷酸序列转变为多肽链上的序列。如果控制mRNA上的基因所在的DNA分子上某一对脱氧核苷酸发生改变,产生了基因突变,但这种突变刚好被tRNA的基因突变所纠正,结果是突变基因的最终产物并未发生改变。由于tRNA基因的突变,在翻译过程中抑制了mRNA上的突变基因的表达,故称为抑制突变。
(4)重组突变:基因所在的DNA分子断裂后,不同的DNA分子在断裂处可能发生交换重组,极性相同的不同单链重新连接起来,产生新组合的DNA分子的脱氧核苷酸序列,不同于原来的DNA分子序列,从而可以导致各种各样的突变。
检测突变的技术方法:
1、核酸分子杂交技术,用于检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。常用有以下方法。
(1)限制性内切酶分析法。此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变,其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变,借此可作出分析。
(2)等位基因特异寡核苷酸探针杂交法。根据已知基因突变位点的核苷酸序列,人工合成两种寡核苷酸探针:一是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸;二是相应于正常基因碱基序的寡核苷酸,用它们分别与受检DNA进行分子杂交。从而检测受检者基因是否发生突变,以及是否有新的突变类型。
2、聚合酶链反应(PCR)
PCR技术采用特异的引物,能特异地扩增出目的DNA片段。由于在基因顺序中突变区两侧的碱基序列和正常基因仍然相同。因此。根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物,经PCR反应将目的基因片断扩增出来,即可进一步分析判断致病基因的存在与否,并了解其变异的形式。
相同长度的单链DNA基因碱基序列不同,甚至单个碱基不同,都可能形成不同的空间构象,从而在电泳时泳动速率不同。PCR产物变性后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,正常基因和变异基因的迁移位置不同,借此可分析确定致病基因的存在,这就是PCR/单链构象多态性分析。
3.基因芯片
生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。最初的生物芯片技术主要目标是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析,所以又称为DNA芯片或基因芯片技术。由于目前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域,出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等,所以改称生物芯片技术更符合发展趋势。
4.基因测序
分离出有关基因,测定出碱基排列顺序,找出其变异所在,这是最为确切的基因诊断方法。对于在染色体上的一个较大的基因来说,突变的种类既有删除突变、又有重复突变、还有很多的点突变。对于很大的基因来说测序是很困难的、用基因芯片技术需要用到昂贵的仪器、而且操作繁琐不适用于大规模推广、探针方法不适于检测删除和重复突变,PCR方法无法检测点突变。
发明内容
本发明目的在于提供一种多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片及其检测方法,解决了现有技术中不能对大基因的多个基因突变位点、较大基因的外显子删除、重复和点突变的检测等问题。
为了解决现有技术中的这些问题,本发明提供的技术方案是:
一种多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述基因检测芯片包括多孔PCR板,所述多孔PCR板的孔内设置有PCR反应体系,所述PCR反应体系包括用于特异性扩增目标基因靶向序列的若干个引物对、荧光探针,所述引物对含有目标基因外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列;所述荧光探针在PCR扩增时荧光探针的荧光分子发射荧光信号。
优选的,所述目标基因选自肌营养不良蛋白基因(dystrophin)、腓骨肌萎缩症PMP22、MPZ、SIMPLE基因。
优选的,所述引物为SEQ ID No:37~208序列之一的正向引物或反向引物;所述荧光探针具有SEQ ID No:209~294之一的连续核苷酸序列。
优选的,所述PCR反应体系还包括PCR缓冲液、dNTPs、Gold Taq酶,所述PCR反应体系终浓度组成为:
PCR缓冲液               终浓度1~5×;
dNTPs                   0.01~1.5mM;
引物                    终浓度为0.01~2μM;
Gold Taq DNA聚合酶      0.01~1.0U/μL;
MgCl2                   终浓度为2~3mM;
荧光探针                1~3×。
优选的,所述PCR反应体系终浓度组成为:
PCR缓冲液               终浓度1~5×;
dNTPs                   0.1~0.5mM;
引物                    终浓度为0.1~0.5μM;
Gold Taq DNA聚合酶      0.01~1.0U/μL;
MgCl2                   终浓度为2~3mM;
荧光探针                1~2×。
优选的,所述荧光探针选自Taqman探针;所述PCR缓冲液包括Tris.cl,氯化钾,硫酸铵,氯化镁;-20℃下pH值在8.0-9.0间。
优选的,所述多孔PCR板为96孔PCR板或384孔PCR板;PCR板的孔内设置不同的引物和荧光探针。
本发明还提供了一种实时检测目标基因外显子多位点突变的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
(1)设计并选取包括含有目标基因外显子中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物和荧光探针对分别置于多孔PCR板的不同孔内形成基因检测芯片;
(2)提取模板DNA,将模板DNA加入基因检测芯片多孔PCR板的每个孔内对模板DNA中目标基因进行PCR扩增;
(3)根据qPCR检测对扩增后的目标基因的基因突变位点。
优选的,所述方法中模板DNA的浓度在50~100ng/μL。
优选的,所述方法中进行PCR反应的条件为92~97℃预变性4~15min;92~97℃变性10~30s,56~60℃退火10~30s,70~75℃延伸15~30s,扩增35~50个循环。
本发明将集中探针技术、多重PCR技术及定量PCR技术于一个微孔板上检测较大基因的删除、重复和点突变。本发明把检测突变点的多对精心设计的引物、荧光探针、PCR缓冲液、dNTPs和Gold Taq酶以优化的配比混均后,点到25-30μl混合液到普通96-孔PCR板或1-5μl混合液到384-孔PCR板上,批量置于冷冻干燥仪上过夜干燥,密封避光4度保存,从而制成基因探针芯片产品。使用时,加入1-5μl的DNA溶液,震动混均后,放在qPCR仪上即可进行分析。所得芯片稳定性很好,操作简单,快速,室温保存三个月荧光信号还保留90%以上。
每个孔可针对不同的突变或SNP,它们有可能是同一个基因的也有可能是不同基因的。由于本发明采用的基因检测芯片上每块板上的所有探针及引物都进行优化,优化后所有孔的qPCR反应条件是一样的,故可同时对多个基因进行筛查。由于采用荧光实时定量PCR仪,所以本发明可同时对单位点突变、外显子丢失重复进行检测。
所述的PCR引物,用化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端10-50个序列的模板,以及与之配对的反向序列。所述的PCR引物为SEQ ID No:37~208序列之一的正向引物或反向引物形成的引物对;所述荧光探针具有SEQ ID No:209~294之一的连续核苷酸序列。
所述的DNA模板,用常规方法从患者组织中提取获得的DNA。所述的患者组织,包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、粪便、病变组织、肿瘤组织,以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。
优选的,本发明的检测目标基因突变的方法,包括以下步骤:
(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本
(2)用上述的基因检测芯片和多个引物,以步骤(1)提取的核酸、阴性对照为模板,进行实时定量PCR检测。
在本发明中,术语“引物”是指一种寡核苷酸,可以是天然的也可以是合成,它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点,在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物,即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下,在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途,但在一般在15~25个核苷酸之间,较短的引物分子通常需要较低的温度,从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列,但必须充分互补,已与模板杂交并引发DNA合成。
引物设计遵循以下原则:①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
引物设计的软件有Primer Premier 5,Beacon Designer 7。
本发明所用引物通过亚磷酰胺三酯法合成,亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。具体方法如下:1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5′-羟基的保护基团DMT,获得游离的5′-羟基。2、合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3′端被活化,5′-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。最后通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC,PAGE等手段纯化引物。
相对于现有技术中的方案,本发明的优点是:
经试验证实,本发明检测方法对于较大基因的突变检出率达到98%以上。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
图1为本发明实施例进行模板DNA的量优化时扩增的电泳图;
图2为本发明实施例18个外显子扩增的电泳图;
图3是对96个平行样品的重复性实验结果;
图4是对10到1010拷贝的灵敏度实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解,这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1肌营养不良蛋白基因(dystrophin)的突变检测
1、引物的合成和排布
本实施例采用96孔板的基因突变检测芯片设计,其引物探针是通过primer 3 plus在线软件进行设计(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi),并在UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)验证其特异性。
引物在96孔板上的排布情况如表1:
表1  96孔板上引物排布设计
Figure BDA0000082947040000081
Figure BDA0000082947040000091
Figure BDA0000082947040000101
Figure BDA0000082947040000121
Figure BDA0000082947040000131
第1~2孔的引物用来做多重PCR的,用于扩增18个外显子,第3~88孔是用来检测突变的;第89~96作为阴性对照使用。
2、阴性对照DNA的制作:
1)抽取正常人外周血2.5ml于枸橼酸钠(1∶9)抗凝管中。
2)抗凝管中的血8000rpm离心5分钟,分离血浆和细胞。
3)血浆小心移入另一无菌管子,注意不要吸到白细胞,-20度保存(1周),
4)DNA提取:将抗凝血8000rpm离心5min,吸出上层的血浆,用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取,提取步骤参见试剂盒的说明书进行,其他涉及产品同样处理,提取的DNA-20℃保存。
5)定量:使用Nano 1000定量仪,测定DNA浓度。合格指标:1,符合OD值A260/A230:2.0-2.2;A260/A280:1.8-2.0要求之间,再将DNA定量稀释到10ng/ul。
6)电泳鉴定:提取的DNA用1.0%的琼脂糖凝胶120V电泳25min,电泳条带比较单一,比较纯;测序鉴定:将提取的DNA进行PCR扩增后送英潍捷基测序。鉴定结果表明,按上述方法所获得的DNA样品符合阴性对照的要求。
3、组织DNA的提取:采用康为世纪的血液基因组DNA提取试剂盒。
抽取病人外周血1-2ml于枸橼酸纳(1∶9)或EDTA抗凝管中,不用肝素抗凝管,吸取部分血液至离心管8000rpm离心5分钟,分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管子,注意不要吸到白细胞,-20度保存(1周),管身标示病人名字和编号,注明日期即可。
然后进行DNA提取,可以按照如下步骤:血浆采用康为世纪的血液基因组DNA提取试剂盒进行血液的提取,提取步骤参见试剂盒的说明书进行,其他涉及产品同样处理,提取的DNA-20℃保存,获得样本基因组。
4、qPCR条件优化
4.1模板DNA的最佳用量
在dystrophin基因多态PCR反应体系中,加入基因组DNA的量分别为10ng,20ng,30ng,50ng,100ng,150ng然后在PTC 220型PCR扩增仪上进行扩增,从图1中可以看出,当加入基因组DNA的量为10ng时,电泳条带非常弱,说明扩增出的产物浓度比较低,随着加入的模板DNA量的增加,PCR产物量逐渐增大,当基因组DNA的量大于100ng时,电泳条带的亮度无明显增加,说明当基因组DNA的量为100ng时,以完全满足扩增条件。为了保证有较好的扩增效果,并且使基因组DNA的量不浪费,最后确定所需要模板DNA的最佳量为100ng。
4.2 对于前两个孔多重PCR实验结果
外显子缺失筛查引物18对,分2组扩增,每组9对引物(孔1:外显子1、3、43、50、13、6、47、60、52,孔2:外显子45、48、19、17、51、8、4、12、44),扩增结果如图2所示。
4.3 96孔板上其余探针的重复性和灵敏度检测
图3是对96个平行样品的重复性实验结果;图4是对10到1010拷贝的灵敏度实验结果。
采用的PCR反应体系如下:
PCR反应条件见下表:
根据以往的关于肌营养不良症的研究成果确定检测的外显子个数(如肌营养不良症是由于肌营养不良蛋白(dystrophin)突变引起的包括删除突变、重复突变和点突变。这种有79个外显子,以往的检测方法主要是检测18个外显子的删除突变),本实施例能够检测79个外显子的删除突变、重复突变和点突变。
本实施例使用公认可靠的Taqman探针,针对96孔板上每一个孔代表一个不同突变检测的反应,则就可以检测(除了阳性对照和阴性对照孔)至少90个突变。如果每一个孔有两个以上的探针就可以检测180个以上的突变,解决了肌营养不良蛋白突变多不容易检测的难题。并且这一个板只检测一个基因组样品,消除了不同基因组之间的污染。
本实施例因为在一个96孔板上有96个反应,每一个反应有不同的探针,所以每一个反应都要经过优化,而且到最后96个孔都在同一个退火温度下退火,在同一个温度下延伸,并且延伸时间一致,因此需要做大量的优化工作。当每一个孔中有两个以上的探针时工作量就更大。
经过优化好的反应条件及优化后的引物和探针就可以批量生产,96孔板相应的孔上加上相应的缓冲液、引物、探针、Taq酶(24μl)后冷冻干燥,然后特制的96孔板盖将每一个孔密封,这就制成了成品基因探针芯片。4度保存三个月以上。既保持了酶的活性又对荧光没有影响。
这种芯片检验病人样品的时候,只需将病人血液中纯化的基因组DNA加入到96孔板上就可以在实时定量PCR仪上检测了,操作简单、快速、无污染。数据处理中,有荧光信号说明没有突变,没有荧光信号说明有突变,简单易懂。
实施例2快速高通量基因突变的检测
将这种芯片设计的思想与PCR系统整合,将来设计50个孔的1cm2大小的芯片,设计能够同时检测多个芯片的荧光实时定量PCR系统即开发出同时检测多种基因、多种形式突变的芯片-PCR系统,这将会极大的提高通量,并且芯片体积缩小所加的样1-5μl成本将大幅度降低。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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Claims (10)

1.一种多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述基因检测芯片包括多孔PCR板,所述多孔PCR板的孔内设置有PCR反应体系,所述PCR反应体系包括用于特异性扩增目标基因靶向序列的若干个引物对、荧光探针,所述引物对含有目标基因外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列;所述荧光探针在PCR扩增时荧光探针的荧光分子发射荧光信号。
2.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述目标基因选自肌营养不良蛋白基因(dystrophin)。
3.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述引物为SEQ ID No:37~208序列之一的正向引物或反向引物;所述荧光探针具有SEQ ID No:209~294之一的连续核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述PCR反应体系还包括PCR缓冲液、dNTPs、Gold Taq酶,所述PCR反应体系终浓度组成为:
PCR缓冲液 终浓度1~5 ×;dNTPs 0.01~1.5mM;引物 终浓度为0.01~2μM;Gold Taq DNA聚合酶    0.01~1.0U/μL;MgCl2    终浓度为2~3mM;荧光探针    1~3×。
5.根据权利要求4所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为:
PCR缓冲液 终浓度1~5 ×;dNTPs 0. 1~0.5mM;引物 终浓度为0.1~0.5μM;Gold Taq DNA聚合酶    0.01~1.0U/μL;MgCl2    终浓度为2~3mM;荧光探针    1~2×。
6.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述荧光探针选自Taqman探针;所述PCR缓冲液包括 Tris﹒cl,氯化钾,硫酸铵, 氯化镁; -20℃下pH值在8.0-9.0间。
7.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片,其特征在于所述多孔PCR板为96孔PCR板或384孔PCR板;每个PCR板的孔内设置不同的引物和荧光探针,且多孔PCR板每个孔的PCR反应条件相同。
8.一种实时检测目标基因外显子多位点突变的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
(1)设计并选取包括含有目标基因外显子中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物和荧光探针对分别置于多孔PCR板的不同孔内形成基因检测芯片;
(2)提取模板DNA,将模板DNA加入基因检测芯片多孔PCR板的每个孔内对模板DNA中目标基因进行PCR扩增;
(3)根据qPCR检测对扩增后的目标基因的基因突变位点。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于所述方法中模板DNA的浓度在50~100ng/μL。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于所述方法中进行PCR反应的条件为92~97℃预变性4~15min;92~97℃变性10~30s,56~60℃退火10~30s,70~75℃延伸15~30s,扩增35~50个循环。
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