CN101921831A - Brca基因突变的快速检测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRCA基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRCA1基因的第2外显子或BRCA1基因的第20外显子或BRCA2基因的第11外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRCA1基因的第2外显子具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列；所述BRCA1基因的第20外显子具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列；BRCA2基因的第21外显子具有SEQ ID No：3的连续核苷酸序列。本发明的试剂盒采用饱和探针和高分辨率溶解曲线分析技术，完成对样品基因型的判断，从而为肿瘤包括家族性乳腺癌和卵巢癌的选择用药和遗传易感性提供指导。

Description

BRCA基因突变的快速检测

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种肿瘤用药选择和遗传易感性相关的BRCA基因突变的快速检测。

背景技术

人类乳腺癌易感基因(BRCA1/2)首先在乳腺癌家族中发现的，为具有遗传倾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因。BRCA1定位于人类17号染色体q21.以常染色体显性遗传方式遗传.并有很高的外显率，BRCA1长约100kb.含24个外显子。其基因产物是1863个氨基酸所构成的磷酸化蛋白质。BRCA2定位于13号染色体q12.全基因组DNA长约70kb.其中编码区含有10987bp.且富含AT f约64％1，其基因序列与BRCA1无明显关系。BRCA2由27个外显子组成.其中第11个外显子长约4932bpmRNA长约10.2kb.编码的BRCA2蛋白含3418个氨基酸。BRCAI/2基因结构与功能的异常与乳腺癌及卵巢癌的发生密切相关，其作为一种抑癌基因，不仅能抑制细胞生长，还参与细胞周期调控，基因转录调节，DNA损伤修复以及凋亡等多种重要细胞活动，在维持基因组稳定性中起重要作用。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，可分为散发性和遗传性两类，其中遗传性乳癌约占乳癌发病率的5％～10％。乳癌易感基因-1(BRCA-1)是近年来发现的一种重要的肿瘤抑制基因。它的丢失或突变在家族性乳腺癌发生中起一定作用，该类基因编码的蛋白在细胞转录调节和DNA修复中起着多种特殊的作用。可诱导凋亡并抑制雌激素依赖型转录通路，该通路与乳腺上皮细胞增生有关，基因突变削弱了这些功能，而增加乳腺癌发病的危险度。BRCA1基因的突变使其患乳腺癌的危险性比一般人群高8～10倍。在遗传性乳腺癌家族中，BRCA1基因的突变率达40％～50％。而在遗传性乳腺癌并卵巢癌家族中，BRCA1基因的突变几乎为100％。又有相关文献报道70％非BRCA1基因突变所致的遗传性乳腺癌是由BRCA2基因突变引起的。对BRCA基因进行检测，寻找其致病突变位点，可帮助筛选出高危人群，有助于风险评估和早期诊断；同时也可为未来的高危人群基因筛查和基因诊断提供基本突变谱资料。

正是由于BRCA1/2基因的突变对家族性乳腺癌、卵巢癌的发生有一定的联系，所以检测BRCA1/2的突变基因对诊断和及早治疗癌症有很大的临床意义。本发明主要是利用HRM技术来进行BRCA1/2突变基因的检测，HRM技术是近年来国内外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接对PCR产物进行溶解分析，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。对于在血浆和血清中DNA含量很低的情况下，使用该方法仍可以用该方法进行BRCA1/2基因突变的检测，突破了微量无法检测或检测效率低的障碍。

本试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA突变，协助临床医生实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。

目前普遍应用的BRCA基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序：该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方 法难适用于临床检测。

临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便、设备要求低的BRCA基因突变检测技术，来改变现状，以满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便、和有效避免污染的检测BRCA基因突变的试剂盒，解决了现有技术中进行BRCA基因突变检测程序繁琐、费用昂贵或、费时、精确度低和污染等问题。

本发明提供的技术方案是：

一种检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRCA基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRCA1基因的第2外显子或BRCA1基因的第20外显子或BRCA2基因的第11外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRCA1基因的第2外显子具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列；所述BRCA1基因的第20外显子具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列；BRCA2基因的第21外显子具有SEQ ID No：3的连续核苷酸序列。

优选的，所述连续核苷酸序列为SEQ ID No：4～21序列之一的正向核苷酸序列或反向核苷酸序列。

优选的，所述引物为SEQ ID No：4～21序列之一的正向引物或反向引物。

优选的，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TqqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液     终浓度1～10×；

dNTPs         0.1～0.5mM；

引物序列      终浓度为0.1～0.5μM；

模板DNA       0.1～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶  0.01～0.10U/μL；

MgCl₂         终浓度为1～3mM；

荧光染料      1～3×。

优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液    终浓度1～5×；

dNTPs        0.2～0.3mM；

引物序列     终浓度为0.2～0.3M；

模板DNA      0.5～1.0ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.03～0.06U/μL；

MgCl₂        终浓度为2～3mM；

荧光染料     1～2×。

优选的，所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

本发明的另一目的在于提供一种检测BRCA基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取包括含有BRCA基因的第二外显子BRCA2或第三外显子BRCA3中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；

(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRCA基因进 行PCR扩增；

(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRCA基因进行突变位点检测。

优选的，所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变组织中提取，进行PCR反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，40～50个循环。

优选的，所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶解曲线法的条件为：92～97℃变性1min；40℃复性1min；然后初始溶解温度60℃开始程序升温溶解至95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30～50次每秒。

本发明的又一目的在于提供一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的BRCA基因突变检测方面的应用，本试剂盒选用各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。

本发明的BRCA基因序列如SEQ No.22，突变发生在BRCA1外显子2、BRCA1外显子20、BRCA2外显子11上，所述的突变具体体现在：

BRCA基因	突变类型	突变位点核苷酸
			BRCA1	拼接点突变	IVS17-1G＞T  IVS21+1G＞C  IVS11t3A＞G  300T＞G
BRCA1	移码突变	185delAG  1100delAT  5640delA  1675delA  3347delAG  2594delC  3828delT  2804delAA  2953del3tC
			BRCA1	插入/缺失	5382insC  1135insA  3171insC  3768insA  ex13ins6kb
BRCA2	移码突变	6174delT  995delG  3604delTT  6601delA  1538del4  6503delTT  8765delAG  3398del5  5802delAATT
			BRCA2	插入/缺失	9326insA  5579insA  2816insA

所述的试剂盒，包括PCR引物、阴性对照DNA、PCR反应体系和反应条件。所述的PCR引物，用化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端10-50个序列的模板，以及与之配对的反向序列。

所述的PCR引物优选为下表所示的引物对：

最为优选的，下表所示的引物对：

所述的阴性对照DNA，用常规方法从正常人组织中提取获得DNA。

所述的正常人组织，包括外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。所述的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、MgCl₂、Taq酶、DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括三羟甲基氨基甲烷盐(Tris·Cl)，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，酸碱度(pH值)8.0-9.0(20℃)。所述的PCR缓冲液，其特征在于，包括10x缓冲液，终浓度15mM的氯化镁，终pH 8.7。所述的dNTP混合液，包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液。所述的荧光染料，包括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYTO 9染料。所述的MgCl2，包括10-30mM MgCl2。所述的MgCl2，包括25mMMgCl₂。

所述的Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP，延伸速率2-4kb/min at72℃，存储缓冲液10-40mM Tris·cl，50-200mM氯化钾(KCL)，0-5.0mM二硫苏糖醇(DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA)，0-2.0％(V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40，0-2.0％(V/V)吐温20(Tween 20)，30-70％(v/v)甘油(glycerol)， 稳定剂(stabilizer)：pH 7.0-10.0(20℃)。所述的存储缓冲液，包括终浓度为20mM Tris·cl、100mM KCL、1mM DTT、0.1mM EDTA、0.5％(V/V)Nonidet P-40、0.5％(V/V)Tween 20、50％glycerol(v/v)。稳定剂的终pH值为9.0。

所述的DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的DNA。包括DNA和RNA。所述的患者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。

所述的患者组织，包括外周血、体液、腔道的脱落物、粪便、病变组织、肿瘤组织，以及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。

所述的PCR反应条件：

所述的PCR反应条件：

所述的反应条件：

本发明的检测方法使用本发明的试剂盒和DNA模板在本发明所述的反应条件在荧光定量PCR仪上进行序列扩增、运行溶解曲线，进行数据分析，得到分型的图谱。所述的荧光定量PCR仪，包括LightCycler 480(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、ABI7500(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、ABI7900(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、Qiagen Rotor-Gene 6000(德国Qiagen公司，杜塞尔多夫，德国)、Idaho LightScanner (美国Idaho公司，爱达荷州，美国)。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照，加入MIX，进行PCR反应，配套的基因分型软件即可自动区分野生型与突变型。采用的阴性对照样品可以包括BRCA1和BRCA2阴性对照样品。

本发明的试剂盒可以提供与肿瘤用药选择和诊断相关的KRAS基因突变的快速检测，所述的肿瘤，包括结包括家族性乳腺癌、卵巢癌、肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴细胞癌。较为优选的，所述的肿瘤包括家族性乳腺癌、卵巢癌。

检测BRCA基因突变的用于PCR反应的试剂盒，适用于BRCA1第二外显子和第二十外显子及BRCA2第十五外显子突变的检测。本发明检测BRCA基因突变时，所述引物用于扩增BRCA基因靶向序列，包括以下引物对：(1)第一引物序列含有BRCA1-185的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有BRCA1-185的至少15个连续的核苷酸；(2)第一引物序列含有BRCA1-5382的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有BRCA1-5382的至少15个连续的核苷酸；(3)第一引物序列含有BRCA2-6174的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有BRCA2-6174的至少15个连续的核苷酸。

优选的，本发明的检测BRCA基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本

(2)用上述的试剂盒和引物，以步骤(1)提取的核酸、阴性对照为模板，进行实时定量PCR检测

(3)分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，与阴性对照参比，判断样本DNA中KRAS基因的各位点是否突变。

在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲液(buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl₂、Taq酶。

在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15～25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。

引物设计遵循原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般在15～30碱基之间。④G+C含量在40％～60％之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。

引物设计的软件：Primer 5(加拿大Premier公司，加拿大，不列颠哥伦比亚省温哥华市)，Beacon Designer 7；本发明所用引物由上海英潍捷基公司合成。

引物合成通常使用亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引物。

一种检测BRCA基因突变的试剂盒、方法及在家族遗传性乳腺癌诊断中的应用。所述的肿瘤，包括家族性乳腺癌、卵巢癌。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

由于采用上述技术方案，本发明的检测BRCA基因突变的试剂盒、引物及方法，采用饱和探针荧光定量PCR基础上运行新型突变研究技术——高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis，HRM)，参照阴性和阳性对照，即可完成对样品基因型的判断。本发明试剂盒灵敏度非常高，可以使用在各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。这采用现有技术中的检测方法是不可能实现的。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；

图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图；

图3为本发明实施例阴性对照DNA的电泳图；

图4为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；

图5为本发明实施例不同活性酶进行PCR扩增的电泳图；

图6为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的溶解曲线图；

图7为本发明实施例不同MgCl₂终浓度进行PCR-HRM的溶解曲线图和得到的PCR产物电泳图；

图8为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；

图9为本发明实施例试剂盒灵敏度的检测图；

图10为本发明应用例家族遗传性乳腺癌患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；

图11本发明应用例正常人血液标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；

图12为本发明应用例家族遗传性乳腺癌患者血浆标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线比较图；

图13为本发明应用例家族遗传性乳腺癌患者口腔黏膜细胞DNA进行扩增后检测的溶解曲线比较图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1引物的设计、合成和验证

本实施例采用Primer 5设计引物，首先优化设计引物片段的大小，得到不同片段大小引物PCR扩增的电泳图，结果如图1和下表所示。图1a为5-9bp的引物PCR扩增的电泳图，图1b为13-16bp的引物PCR扩增的电泳图，图1c为18-24bp的引物PCR扩增的电泳图，图1d为25-29bp的引物PCR扩增的电泳图，图1e为30-37bp的引物PCR扩增的电泳图，图1f为39-45bp的引物PCR扩增的电泳图。由下表或图1可知，最佳引物为18-24bp大小的引物。

引物大小(bp)	5-9	13-16	18-24	25-29	30-37	39-45
							特异性	特异性很差	特异性差	特异性好	特异性较好	特异性差	特异性很差

本实施例中的引物由上海英潍捷基公司合成，本实施例通过PAGE实验进行验证。用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对合成的引物进行鉴定，包括以下步骤：

使用加有7M尿素的16％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃，2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，约2-3小时后，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色。结果如图2所示。

实施例2阴性或阳性对照DNA的制作

阴性对照DNA的提取：

采样：

1、抽取正常人或已知突变的人外周血2.5ml于枸橼酸纳(1∶9)抗凝管。

2、抗凝管中的血2000rpm离心5分钟，分离出血细胞，PBS洗两次。

3、DNA提取。用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA在-20℃保存。

定量：使用Nano 1000定量仪，测定DNA浓度，

合格指标：1，符合OD值A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0要求之间，再将DNA定量稀释到10ng/ul

电泳鉴定：提取的DNA用1.0％的琼脂糖凝胶120V电泳25min，电泳条带比较单一，比较纯，电泳结果如图3；对其进行测序鉴定：将提取的DNA进行PCR扩增后送Invtrogen公司测序，测序结果图如图4。上述鉴定结果表明，按上述方法所获得的DNA样品符合阴性对照的要求。

实施例3肿瘤组织DNA的提取

样本采集：

取新鲜组织块50～100mg以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在0.5cm以下，放入装有1.5ml体积RNAlater的冻存管中，充分混匀。(30分钟内完成)室温下放置1-2小时，4℃冰箱过夜，第二天转至-20℃长期保存。

DNA提取；

使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。

DNA纯化：(若提取的DNA，OD值A260/A230：2.0-2.2；A260/A280：1.8-2.0，没有在标准范围内，则需要此步骤)

加入等体积的氯仿-异戊醇(25∶1)，向下翻转离心管5min以充分混匀，13000rpm 离心10min小心吸出上清液至另一1.5ml离心管；加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇匀，沉淀DNA13000rpm离心3min，轻轻倒去上清液，加入70％乙醇洗一次，13000rpm，离心3min，去上清液，倒置5-10min(倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸管吹打使DNA充分溶解。

实施例4血液中血细胞DNA的提取

抽取病人外周血1-2ml于枸橼酸纳(1∶9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管，吸取部分血液至离心管2000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。弃血浆，留下血细胞并用PBS洗两次。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤：血浆用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。

实施例5石蜡切片组织DNA的提取

刮削5-10μm厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2-3层)。用二甲苯脱蜡后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit(德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作说明提取DNA，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20℃保存。

实施例6：PCR-HRM条件优化实验

1)热启动Taq酶选择

用不同厂家的酶进行实验，选择活性比较高的酶，结果如下表和图5，，图5中1、2、3、4分别为HotStarTaq酶、FastStartTaq酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G快速热启动DNA聚合酶的酶活性检测结果图，根据该图最终确定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活性最高。

酶的类  型	HotStarTaq酶  ①	FastStartTaq酶  ②	Taq CE DNA  Polymerase③	KAPA2G快速热启  动DNA聚合酶④
					厂家	德国Qiagen公   司	Roche公司	上海超世生物科   技有限公司	KAPABiosystem
活性	活性好	活性好	活性较好	活性较差

2)荧光染料的选择

用不同厂家的染料进行实验，选择结合效果好的染料；实验结果如图6所示，图6中1、2、3、4、5分别为Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo荧光染料的实验结果，据图可知最佳染料为Eva Green和LC Green。

荧光染料种  类	Eva Green①	LC Green②	SYBRGreen③	DAPI④	Flamingo⑤
						厂家	Biotium公   司	idaho公司	ABI公司	Roche公   司	ABI公司
结合效果	结合效果好	结合效果好	结合效果不好，  且会抑制PCR  反应	结合效  果不好	结合效果不  好

3)PCR条件的优化

在退火温度、Mgcl₂浓度两方面PCR条件进行优化调整，结果如表：

60℃时，MgCl₂浓度为2.0mM，2.5mM的实验图如图7所示，图7可以看出，选择退火温度为60℃，MgCl₂终浓度为2.5mM时为最佳的条件。

4)HRM条件优化

HRM条件的优化：溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面调整

最佳HRM条件的确定：

温度	时间
		95℃	1min
40℃	1min
		65℃	1s
95℃	每秒检测荧光40次

5)DNA来源样本

分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中进行检测模板DNA，检测结果如下表和图8所示：

模板DNA来源	外周血	口腔拭子	组织	石蜡切片
					检测效果	可以检测	可以检测	可以检测	可以检测

图8A～D分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片的检测结果，由图可知，外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。

实施例6灵敏度实验

用实施例1～5获得的材料和优化的条件，确定检测的灵敏度。实验中，同时放入阴性对照样本、1％突变样本、5％突变样本、10％突变样本、15％突变样本。本试剂盒与其它检测方法灵敏度比较如图9和下表所示：

如图9所示，经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1％。其他检测方法对照文献Mutation Research 635(2007)105-117的检测方法灵敏度数据，如下表所示，本试剂盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1％。

检测方法	检测灵敏度
		RFLP	3-6
SOMA	3

APEX	3-6
		DHPLC	3-12
TTGE	50
		Direct sequencing	50
HRM	1

应用例1：家族遗传乳腺癌患者石蜡切片组织BRCA突变检测

家族遗传乳腺癌患者的石蜡切片30例，提取DNA作为模板。

使用仪器：LlightCycler^TM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、刮削5-10μm厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2-3层)。

2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit(德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作说明提取DNA。

引物序列：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl2)	2.0
MgCl2	0.4
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH2O	13.9

PCR和HRM反应条件：

用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图10所示的家族遗传性乳腺癌患者的检测结果。结果在家族遗传性乳腺癌病人中检出BRCA1第2外显子突变的有12例(检出率大约为66.7％)，BRCA1第20外显子突变的有2例(检出率大约为10％)，BRCA2第11外显子突变的有2例(检出率大约为10％)如图10A～C所示，为BRCA1-185、BRCA1-5382和BRCA2-6174的突变检测图。符合国内外研究报道的家族遗传乳腺癌中BRCA基因突变的几率。

应用例2家族遗传性乳腺癌血细胞DNA检测BRCA突变

抽取病人(共20例)外周血1-2ml于枸橼酸钠(1∶9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管，破碎红细胞后吸取部分血液至离心管2000rpm离心5分钟，分离细胞。提取血细胞中的DNA作为模板。

使用仪器：

LlightCycler^TM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、将抗凝血2000转离心5分钟，取血细胞。

2、用Qiagen Blood Mini kit(德国QIAGEN公司生产)提取血浆中的DNA。按照试剂盒的操作说明提取。

引物序列：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl2)	2.0
MgCl2	0.4
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH20	13.9

PCR和HRM反应条件：

用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图11A～C为正常人BRCA1-185、BRCA1-5382和BRCA2-6174的突变检测图，图12A～C为家族遗传性乳腺癌患者BRCA1-185、BRCA1-5382和BRCA2-6174的突变检测图的检测结果。从图中可知，在家族遗传性乳腺癌病人中检出BRCA1第2外显子突变的有8例(检出率大约为40％)，BRCA1第20外显子突变的有1例(检出率大约为5％)BRCA2第11外显子突变的有4例(检出率大约为20％)。在正常人中未检出BRCA突变。符合国内外研究报道的家族遗传乳腺癌中BRCA基因突变的几率。

应用例3口腔粘膜细胞DNA筛查BRCA基因突变

口腔拭子涂擦口腔粘膜后，用PBS洗脱细胞，2000rpm离心5分钟收取口腔粘膜细胞。用试剂盒提取DNA作为模板。

使用仪器：

LlightCycler^TM 480荧光定量PCR仪器分析

DNA模板提取：

1、将口腔粘膜细胞洗脱液2000转离心5分钟，取沉淀细胞。

2、用TIANamp Swab DNA Kit试剂盒(TIANGEN公司生产)提取口腔粘膜细胞DNA。按照试剂盒的操作说明提取。

引物序列：

PCR反应体系：

反应体系组分	加入的体积(μL)
		10×PCR Buffer(含MgCl2)	2.0
MgCl2	0.4
		dNTP	0.5
Eva-green	1.0
		10μm Primers	1.0
Template	1.0
		Taq酶	0.2
ddH2O	13.9

PCR和HRM反应条件：

用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图13A～C为家族遗传性乳腺癌患者BRCA1-185、BRCA1-5382和BRCA2-6174的突变检测图的检测结果。。从图中可知，在家族遗传性乳腺癌病人中检出BRCA1第2外显子突变的有8例(检出率大约为40％)，BRCA1第20外显子突变的有2例(检出率大约为10％)BRCA2第11外显子突变的有5例(检出率大约为25％)。符合国内外研究报道的家族遗传乳腺癌中BRCA基因突变的几率。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州工业园区为真生物医药科技有限公司

<120>BRCA基因突变的快速检测

<130>

<160>22

<170>PATENTIN VERSION 3.5

<210>1

<211>383

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

<400>1

atggatttat ctgctcttcg cgttgaagaa gtacaaaatg tcattaatgc tatgcagaaa    60

atcttagagt gtcccatctg gtaagtcagc acaagagtgt attaatttgg gattcctatg    120

attatctcct atgcaaatga acagaattga ccttacatac tagggaagaa aagacatgtc    180

tagtaagatt aggctattgt aattgctgat tttcttaact gaagaacttt aaaaatatag    240

aaaatgattc cttgttctcc atccactctg cctctcccac tcctctcctt ttcaacacaa    300

atcctgtggt ccgggaaaga cagggactct gtcttgattg gttctgcact ggggcaggaa    360

tctagtttag attaactggc att                                            383

<210>2

<211>387

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

<400>2

actcctgacc tcaagtgatc tgcctgcctc agtctcccaa agtgctagga ttacaggggt    60

gagccactgc gcctggcctg aatgccttaa atatgacgtg tctgctccac ttccattgaa    120

ggaagcttct ctttctctta tcctgatggg ttgtgtttgg tttctttcag catgattttg    180

aagtcagagg agatgtggtc aatggaagaa accaccaagg tccaaagcga gcaagagaat    240

cccaggacag aaaggtaaag ctccctccct caagttgaca aaaatctcac cccaccactc    300

tgtattccac tcccctttgc agagatgggc cgcttcattt tgtaagactt attacataca    360

tacacagtgc tagatacttt cacacag                                        387

<210>3

<211>300

<212>DNA

<213>智人(HOMO SAPIENS)

<400>3

aaattttaca acataaccaa aatatgtctg gattggagaa agtttctaaa atatcacctt    60

gtgatgttag tttggaaact tcagatatat gtaaatgtag tatagggaag cttcataagt    120

cagtctcatc tgcaaatact tgtgggattt ttagcacagc aagtggaaaa tctgtccagg    180

tatcagatgc ttcattacaa aacgcaagac aagtgttttc tgaaatagaa gatagtacca    240

agcaagtctt ttccaaagta ttgtttaaaa gtaacgaaca ttcagaccag ctcacaagag    300

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>4

gtgcagctgt gggttgatt                                                  19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>5

aaccagccct gtcgtctct                                          19

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>6

gattcctcac tgattgctct tag                                      23

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>7

gggcaccacc acactatg                                            18

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>8

tggatttatc tgctcttcgc                                          20

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>9

tagtatgtaa ggtcaattct gttc                                     24

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>10

cgagtgatga ttgggagatt c                                        21

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>11

tgtcaccaca ttacatactt acc                                23

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>12

ttgtgaagat ctgtgacttt gg                                 22

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>13

aggaggatga gcctgacc                                     18

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>14

gatgtggtca atggaagaaa c                                 21

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>15

gagtggaata cagagtggtg                                   20

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>16

ggtaaccatt tatttgttct ctc                               23

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>17

atcataagga agttgtgttg g                                 21

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>18

taaagctgga aagggacga                                                19

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>19

ttccaataaa ttctcagatc cagg                                          24

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>20

ttgtgggatt tttagcacag c                                             21

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>21

cttgcgtttt gtaatgaagc  a                                            21

<210>22

<211>4028

<212>

<213>智人(HOMO SAPIENS)

<400>22

atggatttat ctgctcttcg cgttgaagaa gtacaaaatg tcattaatgc tatgcagaaa    60

atcttagagt gtcccatctg gtaagtcagc acaagagtgt attaatttgg gattcctatg    120

attatctcct atgcaaatga acagaattga ccttacatac tagggaagaa aagacatgtc    180

tagtaagatt aggctattgt aattgctgat tttcttaact gaagaacttt aaaaatatag    240

aaaatgattc cttgttctcc atccactctg cctctcccac tcctctcctt ttcaacacaa    300

atcctgtggt ccgggaaaga cagggactct gtcttgattg gttctgcact ggggcaggaa    360

tctagtttag attaactggc attttggctt ttcttccagc tctaaaacaa gctccatcac    420

ttgaaatggc aaaataaaat catggatgag gccgagggcg gtggcttatg cctgtaatcc    480

cagcactttg ggaggccaag gtggtaggat cacgaggtca ggagatcgag accatcctgg    540

ccaacatggt gaaaccccct ctccactaaa aatacaaaaa ttagctgggc gtagtggcat    600

gtgcctgtaa tcccagctac tcaggaggct gaggcaggag aatcacttga accaggaggc    660

agatgttgct gtgagccaat atggcaccac tgaactccag cgacagagct aaactccatc    720

tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacat ggatgatcgg tgtcgttgag aggataggta    780

tttggaagaa cctttgtttg aaactggctc tgtacataca atgaaattac atacttattt    840

acatacaatg aaatgcagag gttttttttt tatataggat ctctgtcgag aggctggagt    900

gcagtggtgc tatcacagct cactgcagcc tcaacctcgt caggctcaag caatcctccc    960

acctcagcct ccagagtagc agggacgata ggtgtgcacc accatgccca gctaattttt    1020

gtattttttt ttcttttttt gagatggagt cttgctctgt tgcccaggct ggagtgcagt    1080

ggcgcgatct cagctcactg caaactctgc ctcccgggtt catgccattc ttctgcctga    1140

gcctcctgaa tagctgggac tacaagcacc cactaccacg cccggctaat tttttgtatt    1200

tttttttctt ttttagtaga ggcgggattt caccgtgtta gccaggatag tcttgatctc    1260

ctgaccttgt gatccacccg cctgggcctc ccaaagtgct aggattacag gcataagcca    1320

ctgcgtccag ccattcttgt atttttctgt tgtagagata gggttttgct atgttggcca    1380

tgctggtctc aaactcctga cctcaagtga tctaccctcc cttggcctct caaggtgctg    1440

ggattacagg cctgagccat tgcacccagc catggtctaa aaatcttgat tgaaatacca    1500

ccttttcatt tccagacacc cctatttaaa attaccacac ccccagcaca cactttatct    1560

tctattcctg ctgcttctcc ataacactga ttactagctg acattctatg taatgtatcc    1620

attttttatc tctagtccca cagaatgtaa actccaggat gggatttttg ttttgtttac    1680

atacatctgt atgttcagta gttagaacgg tacttgggac ctagttgcca ctcaataaac    1740

atttgtcaaa taaataataa actaaactaa attagttctt taattttttt aaatatggtg    1800

atggttagta gtgagtaaca ttcaaaaaat aagttgaaaa gttgtaccat tgcctcttac    1860

ccacaataaa aaagggtaaa ttcttttctg ctttatgaaa gttgtttttc atatttgaag    1920

tcaagttaat cagattaagg aaaatgtatg ttgtgttttc agagcgatac aagatttata    1980

aataaccatc ctctcccttg cccttcaaca ttatagctaa acaaaaataa gaggaaaaca    2040

ggattcacaa tttatcaatt tattgaaaat cagagccaga gaagcaggaa atgacattgt    2100

aggaaaaaac tgcttttgaa aaagcacaaa acttactcat gacaatcagt gatcaggaaa    2160

atcctcaata gtgtggcatt tggatacatt tatgtttcat ttccatggga gagagtcata    2220

aaaataggat gttctttctc attctggcaa attaaaccat caattaaaaa ctcagataca    2280

taaaaattaa agatgtaaga atgaaaatgc taaattgtta ttttcaatca actattatgt    2340

tttctagctt ttcattgctt ttttctgttt cctgttaaga ttaatttctt tttttttttt    2400

tgctagggtt ataggtgtga gccattggtg cccagctact gcctgcctgg caattctgaa    2460

tgccttaaat tttttttttt tttttttttt tttttgagac agagtttcac tctgtcaccc    2520

aggctggagt gcagtggcat gatcgtggct cacagcaacc tctgcctcct ggattccagc    2580

aattctcatg cctcagcttc ccgagtagct gggactacag gtgcatgcca ccacgcccag    2640

ctaatttttg gtttttttgt ttgtttgttt gtttgttttg agacggagtc tcgctcagtt    2700

gcccaggctg gagtgcagtg gcgtgatctc cgctcactgc aagctccgcc tcccgggttc    2760

acgccattct cctgcctcag cctcccgagt agctgggact acaggcgcct gccactacac    2820

ccggctaatt tttttgtatt ttaagtagag acggggtttc accgtgttag ccaggatggt    2880

ctcgatctcc tgacctcgtg atccgcctgt ctcggcctcc caaagtcctg ggattacagg    2940

cgtgagccac cacacccggc ctaatttttt tttttttaat tttattttta attttttgag    3000

atgcgagatg gagtctcgct ctgttaccca ggctggagtg cagtggcacc atctcagctc    3060

actgcaacct ccacctcctg cattcaaaag attctcctgc ctcagcctcc caagtagctg    3120

ggattacagg tgcctgccac cacgcccaac taattttttg tatttttagt agagatgagg    3180

tttcaccatg ttggtcagac tggtgtcgaa ctcctgacct caagtgatct gcctgcctca    3240

gtctcccaaa gtgctaggat tacaggggtg agccactgcg cctggcctga atgccttaaa    3300

tatgacgtgt ctgctccact tccattgaag gaagcttctc tttctcttat cctgatgggt    3360

tgtgtttggt ttctttcagc atgattttga agtcagagga gatgtggtca atggaagaaa    3420

ccaccaaggt ccaaagcgag caagagaatc ccaggacaga aaggtaaagc tccctccctc    3480

aagttgacaa aaatctcacc ccaccactct gtattccact cccctttgca gagatgggcc    3540

gcttcatttt gtaagactta ttacatacat acacagtgct agatactttc acacaggttc    3600

ttttttcact cttccatccc aaccacataa ataagtattg tctctacttt atgaatgata    3660

aaactaagag atttagagag gctgtgtaat ttggattccc gtctcgggtt cagatcttag    3720

ctgataagtg gaagagctgg gactttaagc agatgagaat ctaaagactt tgctcttttc    3780

acttcactgg ggtgtctttc tctctctctc tcttgctctc tctctctctt tttttttttc    3840

ccaagacgga gtctcactcc attgcccagg ccagagtgca gtggtgcgat ctcagctcac    3900

tgaaaactca tcttgcccag gctggtcttg aacccctgac cttgtgatcc tcccgccttg    3960

gcctccccaa gtgctgggat aggcgtgagc caccgtgccc agccaataat agctaaaatt    4020

tatataat                                                    4028

Claims (10)

1.一种检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRCA基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRCA1基因的第2外显子或BRCA1基因的第20外显子或BRCA2基因的第11外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRCA1基因的第2外显子具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列；所述BRCA1基因的第20外显子具有SEQ ID No：2的连续核苷酸序列；BRCA2基因的第11外显子具有SEQ ID No：3的连续核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续核苷酸序列为SEQ ID No：4～21序列之一的正向核苷酸序列或反向核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物为SEQ ID No：4～21序列之一的正向引物或反向引物。

4.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液            终浓度1～10×；

dNTPs                0.1～0.5mM；

引物序列终浓度为     0.1～0.5μM；

模板DNA              0.1～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶         0.01～0.10U/μL；

MgCl₂                终浓度为1～3mM；

荧光染料             1～3×。

5.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液            终浓度1～5×；

dNTPs                0.2～0.3mM；

引物序列             终浓度为0.2～0.3M；

模板DNA              0.5～1.0ng/μL；

TaqDNA聚合酶         0.03～0.06U/μL；

MgCl₂                终浓度为2～3mM；

荧光染料             1～2×。

6.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、

PLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

7.一种检测BRCA基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取包括含有BRCA1基因的第二外显子BRCA或第二十外显子BRCA，BRCA2基因的第十一外显子BRCA中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；

(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRCA基因进行PCR扩增；

(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRCA基因进行突变位点检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片中提取，进行PCR反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，40～50个循环。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶解曲线法的条件为：92～97℃变性1min；40℃复性1min；然后初始溶解温度60℃开始程序升温溶解至95℃，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30～50次每秒。

10.一种PCR反应试剂盒在BRCA基因突变相关的肿瘤用药选择和遗传易感性方面的应用。

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