CN104928356A - 基于pcr引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因snp快速、灵敏检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP快速、灵敏检测方法。针对于乳腺癌易感基因的单核苷酸多态性(SNP),本发明人设计了一种基于引物3’末端双脱氧修饰的新型检测方法,既保留了引物延伸法灵活、便捷、可操作性强的特点,又从根本上解决了假阳性的产生,为乳腺癌易感基因以及其它与疾病相关基因的SNP检测提供了一种快速、经济而又准确、灵敏的方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学、遗传学和核酸分子检测领域;更具体地,本发明涉及基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP快速、灵敏检测方法。
背景技术
乳腺癌作为女性癌症的第一大杀手,近些年在世界范围内已备受关注。据估计,仅2007年,全球就有130万乳腺癌新发患者,有超过46万的患者死于该病。就中国而言,根据2003~2007年全国32个肿瘤登记点的资料分析报告以及2008年世界卫生组织(WHO)国际癌症研究中心发布的数据显示:近年来乳腺癌的发病率高居中国女性恶性肿瘤的首位,并以3%以上的速度逐年递增;保守估计全国每年有4万多妇女死于此病,死亡率已居第6位。
已证实,乳腺癌的发生与遗传易感性、女性内分泌失调、哺乳过程中病毒的感染等几大因素密切相关。这其中,遗传易感性(遗传背景)扮演了重要角色。因为据流行病学研究显示,乳腺癌患者的一级亲属患此病的风险要显著高于普通人群,且年龄越小,风险越大。因而该病具有明显的家族遗传倾向。而这种遗传倾向主要是由于基因突变造成的。这其中,单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)系主要组成部分。
目前为止,研究已发现一系列与乳腺癌发生密切相关的乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility genes),如BRCA1、BRCA2、TP53、CHEK2、MAP3K1、TOX3、RAD50、ATM等。这其中,BRCA1与BRCA2是最重要的2个易感基因。其突变,尤其是外显子的SNPs与遗传性乳腺癌及早发性乳腺癌的高度相关性已被证实。
由于这些基因中广泛存在的SNPs与乳腺癌的发生具有密切联系,再加上SNP已成为继限制性片段长度多态性(RFLP)和微卫星标记(SSR)之后的第三代遗传标记,因此近年来SNP检测技术领域的发展也十分迅速,已涌现出许多不同的SNP检测方法(技术),包括:
(1)直接测序法。通常采取的做法是对可能含有SNP的目标片段的PCR扩增产物进行测序。由于这种方法最直接、可靠,因此也被认为是确认突变结果的“金标准”方法。但其不可避免的缺点是通量低、耗时长;近年发展起来的高通量测序技术(如焦磷酸测序)虽然具有高效、快速、可深度测序的优势,也被诸多研究机构广泛采用,但其配套仪器、试剂的花费非常昂贵。
(2)限制性片段长度多态性(RFLP)。这是一种较早的SNP检测方法。其依据的原理是每种限制性内切酶都具有严格、专一的酶切识别位点。如果基因某位点处的碱基发生了改变而导致该处的若干个碱基恰好成为了某种限制性内切酶的切割识别位点,那么经该酶作用并经电泳分离后,会检测到2个不同的DNA片段;反之若该位点处碱基没有发生改变,则不会被此限制酶识别和作用,因此经电泳分离后,仍是原始的一个片段,不会产生两个片段。这种方法原理简便、操作易行且结果可靠,也被人们认为是一种检测SNP的标准方法。但其明显的缺陷是,一种酶往往只能针对性地检测一个或几个SNP位点,而且目前发现的限制性内切酶的种类是有限的,并非每一个SNP都有对应的一种酶可以作用,限制了该方法的应用。
(3)蛋白阻断实验(PTT)。这种方法主要是通过对基因表达产物——蛋白质片段大小的分析来检测SNP的。由于这种方法只适用于检测SNP中,小片段的增添、缺失等可造成翻译提前终止的移码突变,因此常作为其他SNP检测方法的一种辅助性验证手段,目前已不单独用于SNP检测。
(4)基于DNA分子化学结构分析的方法。主要有单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)等。
(5)高分辨率熔解曲线分析。这是一种基于实时荧光定量PCR(real timequantitative-PCR)的分析方法。虽然检测准确度也令人满意,但实验当中为获得高分辨率的熔解曲线,多数要用到饱和荧光染料,因而提高了实验的成本,一定程度上限制了该方法的应用。
(6)引物延伸法。这种方法主要是一种基于PCR反应的检测方法。其主要原理是针对涉及某SNP位点的两个等位基因分别设计两条不同的特异性辨别引物,使之3’末端恰好位于SNP处,再在其上游(或下游)设计一条共用引物,这样一条共用引物与两条等位基因特异性引物分别进行PCR反应,只有SNP位点与特异性引物的3’末端互补配对时,引物才能顺利延伸,扩增得到片段。跟据PCR反应后的情况可以推测两个等位基因的SNP位点处的突变情况。这种方法具备了常规PCR反应简便易行,应用广泛、无需昂贵的仪器设备等优点。但值得一提的是,这种方法常会不可避免地产生假阳性结果,因此一定程度上影响了该方法的准确度。此外,还有ddNTP单碱基延伸结合质谱检测法,也属于引物延伸法的范畴。
以上是一些常用的早期SNP检测方法。目前发展起来的新方法还有:SNP基因芯片技术,在一块很小的芯片上就可排列多达数十万个SNP特异性标记探针,可对大量DNA样品同时检测;变性高效液相色谱法(DHPLC)、引物延伸结合飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)、动态等位基因特异性杂交(DASH)等。它们与传统方法相比,在检测通量、准确度上有了很大的提高,但与此同时,由于都用到了某些最新的仪器、技术,因此检测成本也相对较高,尤其是当检测样品规模较少时,这一点更加突出。故短时间内还无法实现广泛的应用。
由此可见,作为“金标准”的测序法虽然直接、准确,但耗时、耗力;其它传统方法虽然简便易行,但或多或少都具有应用范围窄、准确度较低等不同的弊端;近年发展起来的一些新方法,由于依托了最新的仪器设备,因此往往具有高通量、高准确度的优点,但成本昂贵、原理复杂也是限制其广泛应用的一个主要原因。综合考虑,目前被各个实验室广泛采用的仍以经过改进的传统方法为主。这其中,最有价值、应用最灵活的还属PCR引物延伸法。
但是如上所述,早期的等位基因特异性PCR方法虽然简便易行,只需设计3条引物,两个常规的PCR反应即可达到SNP检测与分型两个目的,但假阳性的产生却严重限制了这种方法的准确度。因此这种原始方法现在已不常用,取而代之的是基于该理论的一系列改进方法,如人为掺入错配碱基,加大区分度;增加外围引物进行巢式PCR,提高准确度等。但是值得注意的是,假阳性的产生是由这种方法的原理决定的,因此这些诸多的改进,都不能100%避免假阳性的产生。故而,一种简便易行、可操作性强,而又具有相当准确度、高效经济的通过PCR反应检测SNP的方法对于核酸分子诊断、遗传学分析等领域是迫切需要的。
发明内容
本发明的目的在于提供基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP快速、灵敏检测方法。
在本发明的第一方面,提供一种乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测方法,所述方法包括:
(1)针对一个单核苷酸多态性位点,以正向引物和反向引物为引物对,以同时含有高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合体系进行PCR扩增;所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物,以其3’末端碱基起算第1-6位的任意1个或多个碱基对应待测位点,但与野生型序列相应区段上碱基序列完全匹配;且,所述的辨别性引物的3’末端核苷酸经过2’,3’-双脱氧修饰,其长度为20~40mer;
所述的引物对中,辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配,其长度为20~40mer;
(2)分析PCR扩增产物,若获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测位点存在突变,基因型为突变型;若未获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测位点不存在突变,基因型为野生型。
在本发明的另一方面,提供一种乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测方法,所述方法包括:
(1)针对一个单核苷酸多态性位点,以正向引物和反向引物为引物对,以同时含有高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合体系进行PCR扩增;所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物,以其3’末端碱基起算第1-6位的任意1个或多个碱基对应待测位点,但与突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配;且,所述的辨别性引物的3’末端核苷酸经过2’,3’-双脱氧修饰,其长度为20~40mer;
所述的引物对中,辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配,其长度为20~40mer;
(2)分析PCR扩增产物,若获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测突变位点不存在突变,基因型为野生型;若未获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测突变位点存在突变,基因型为突变型。
在一个优选例中,所述的突变包括:点突变、插入突变、缺失突变。
在另一优选例中,所述的方法用于快速检测乳腺癌易感基因某单核苷酸多态性位点的基因型,其中包括单个或数个碱基的置换、增添或缺失。当检测的单核苷酸多态性位点包含数个碱基的置换、增添或缺失时,这数个碱基在设计引物时当作一个碱基对待。
在另一优选例中,所述的2’,3’-双脱氧修饰包括:2’,3’-ddC、2’,3’-ddA、2’,3’-ddT或2’,3’-ddG。
在另一优选例中,步骤(2)或(2’)中,通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。
在另一优选例中,步骤(1)中,PCR目的扩增产物为包含所述单核苷酸多态性位点的约200~500bp大小的DNA片段。
在另一优选例中,所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶;所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶;
较佳地,所述的高保真DNA聚合酶包括:HS DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。
较佳地,所述的非高保真DNA聚合酶包括:Taq DNA聚合酶。
较佳地,所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶按照酶活性单位的比例是(0.05-0.6):1;较佳地为(0.1-0.5):1。
在另一优选例中,所述的乳腺癌易感基因单核苷酸多态性位点包括:BRCA1基因的185delAG,300T>G,1081delG,4153delA,4184delTCAA,5382insC;或BRCA2基因的999del5,6174delT,9254del5。
在另一优选例中,用于检测BRCA1基因185delAG的辨别性引物是选自SEQ ID NO:1-5任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:6-12任一所示的反向引物(较佳地,以SEQ ID NO:125作为正向引物);或
用于检测BRCA1基因300T>G的辨别性引物是选自SEQ ID NO:13-19任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:20-24任一所示的反向引物(较佳地,以SEQ ID NO:126作为正向引物);或
用于检测BRCA1基因1081delG的辨别性引物是选自SEQ ID NO:25-28任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:29-34任一所示的反向引物(较佳地,以SEQ ID NO:127作为正向引物);或
用于检测BRCA1基因4153delA的辨别性引物是选自SEQ ID NO:35-40任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:41-45任一所示的反向引物(较佳地,以SEQ ID NO:128作为正向引物);或
用于检测BRCA1基因4184delTCAA的辨别性引物是选自SEQ ID NO:46-54任一所示的正向引物(较佳地,以SEQ ID NO:129作为反向引物);或选自SEQ ID NO:55-61任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA1基因5382insC的辨别性引物是选自SEQ ID NO:62-63任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:64-68任一所示的反向引物。
在另一优选例中,用于检测BRCA2基因999del5的辨别性引物是选自SEQID NO:69-78任一所示的正向引物(较佳地,以SEQ ID NO:136作为反向引物);或选自SEQ ID NO:79-84任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA2基因6174delT的辨别性引物是选自SEQ ID NO:85-90任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:91-96任一所示的反向引物(较佳地,以SEQ ID NO:137作为正向引物);或
用于检测BRCA2基因9254del5的辨别性引物是选自SEQ ID NO:97-106任一所示的正向引物(较佳地,以SEQ ID NO:138作为反向引物);或选自SEQID NO:107-115任一所示的反向引物。
在另一优选例中,一种用于乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测的试剂盒,所述的试剂盒中包括:
用于检测BRCA1基因185delAG的辨别性引物,选自SEQ ID NO:1-5任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:6-12任一所示的反向引物(较佳地,还包括SEQ ID NO:125作为正向引物);
用于检测BRCA1基因300T>G的辨别性引物,选自SEQ ID NO:13-19任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:20-24任一所示的反向引物(较佳地,还包括SEQ ID NO:126作为正向引物);
用于检测BRCA1基因1081delG的辨别性引物,选自SEQ ID NO:25-28任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:29-34任一所示的反向引物(较佳地,还包括SEQ ID NO:127作为正向引物);
用于检测BRCA1基因4153delA的辨别性引物,选自SEQ ID NO:35-40任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:41-45任一所示的反向引物(较佳地,还包括SEQ ID NO:128作为正向引物);
用于检测BRCA1基因4184delTCAA的辨别性引物,选自SEQ ID NO:46-54任一所示的正向引物(较佳地,还包括SEQ ID NO:129作为反向引物);或选自SEQ ID NO:55-61任一所示的反向引物;和
用于检测BRCA1基因5382insC的辨别性引物,选自SEQ ID NO:62-63任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:64-68任一所示的反向引物。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:
用于检测BRCA2基因999del5的辨别性引物,选自SEQ ID NO:69-78任一所示的正向引物(较佳地,以SEQ ID NO:136作为反向引物);或选自SEQ IDNO:79-84任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA2基因6174delT的辨别性引物,选自SEQ ID NO:85-90任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:91-96任一所示的反向引物(较佳地,还包括SEQ ID NO:137作为正向引物);或
用于检测BRCA2基因9254del5的辨别性引物,选自SEQ ID NO:97-106任一所示的正向引物(较佳地,还包括SEQ ID NO:138作为正向引物);或选自SEQ ID NO:107-115任一所示的反向引物。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:
高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶或它们的混合酶;较佳地,混合酶中,高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶按照酶活性单位的比例是(0.05-0.6):1;较佳地为(0.1-0.5):1。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、基于PCR引物3’末端双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法原理图(以正向引物作为3’-2’,3’-双脱氧修饰引物为例)。
图2、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法对BRCA1基因热点碱基突变的检测琼脂糖凝胶电泳结果图。
图3、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法对BRCA2基因热点碱基突变的检测琼脂糖凝胶电泳结果图。
图4、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法的灵敏度分析实验琼脂糖凝胶电泳结果图。
图5、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法的特异性分析实验琼脂糖凝胶电泳结果图。
注:以上图中,“WT”表示野生型(wild type);“MT”表示突变型(mutanttype);“NC”表示阴性对照(negative control);“M”为DL2000DNA Marker(大连TakaRa公司)。
具体实施方式
针对于乳腺癌易感基因的单核苷酸多态性(SNP),本发明人设计了一种基于引物3’末端双脱氧修饰的新型检测方法,从而既保留了引物延伸法灵活、便捷、可操作性强的特点,又从根本上解决了假阳性的产生,为乳腺癌易感基因以及其它与疾病相关基因的SNP检测提供了一种快速、经济而又准确、灵敏的方法。
在本发明中,对于突变位点的命名按照本领域公知的命名方式,例如185delAG表示BRCA1基因mRNA序列第185位(位于外显子2)缺失A和G;又例如300T>G表示BRCA1基因mRNA序列第300位(位于外显子5)由野生型的T突变为G;又例如5382insC表示BRCA1基因mRNA序列第5382位与5383位(位于外显子20)之间插入一个C;又例如999del5表示BRCA2基因mRNA序列第998位(位于外显子9)起缺失5个碱基。其它突变位点的命名以此类推。
本发明人通过针对不同的乳腺癌易感基因SNP(热点突变)设计不同的引物,并对每对引物中的一条引物的3’末端核苷酸进行2’,3’-双脱氧修饰从而造成“封闭”效果,再结合反应体系中高保真DNA聚合酶的3’,5’-核酸外切酶活性,从而达到有效检测(区分)各乳腺癌易感基因SNP的目的。本发明的方法只需针对待检测的SNP位点设计一对引物,通过一个常规PCR反应,外加凝胶电泳(琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶)分离,即可达到检测SNP基因型的目的。经验证,本发明的方法操作简单,无需昂贵、复杂的仪器、试剂,且灵敏度高、重现性好。适用于乳腺癌易感基因SNP的检测以及其它相关基因SNP的检测。
本发明通过PCR反应检测SNP的原理为:通过设计一条3’末端核苷酸经2’,3’-双脱氧修饰的引物,使其自3’末端起的1-6个碱基完全覆盖待测的SNP位点(最好是3’末端恰好位于SNP处),且引物序列和基因型为野生型的等位基因序列完全互补配对。这样再加上另外一条下游(或上游)引物,与待测DNA样品一同进行PCR反应,当待测DNA样品SNP位点处的基因型为野生型时,由于3’末端核苷酸是经过2’,3’-双脱氧修饰的,因此下一个dNTP原料由于无法与该3’末端核苷酸正常形成3’,5’-磷酸二酯键,因而无法添加上去,即该条引物被“封闭”,无法顺利进行延伸,因此最终结果是无法扩增出包含SNP位点的目的片段。凝胶电泳分离后的结果为无目的扩增条带;而当待测的DNA样品基因型为突变型时,由于在SNP位点处,碱基序列发生了改变(置换、增添或缺失),导致该双脱氧修饰引物的3’末端与此模板无法互补配对,即形成了错配,这样在PCR反应体系中高保真DNA聚合酶3’,5’-核酸外切酶活性的作用下,该3’末端包括双脱氧修饰的核苷酸在内的错配的几个核苷酸就会被逐个切除下来,直至引物剩余的若干寡核苷酸可以和模板序列完全互补配对为止。由此,经过切除后形成的新的3’末端便是正常的核苷酸,解除了2’,3’-双脱氧修饰的“封闭”作用,因此在Taq DNA聚合酶的作用下可以顺利延伸,最终与另一条引物一起,经过PCR反应可以扩增得到一条覆盖SNP位点的大小约200bp~500bp的目的片段。经凝胶电泳分离后,可得到一条清晰的条带,与之前描述的基因型为野生型的DNA样品PCR反应后的凝胶电泳分离结果形成了鲜明对比。由此而达到检测待测DNA样品SNP的目的(如图1)。
本发明所述的PCR反应,其体系中具体包括:PCR反应缓冲液(由高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶各自对应的反应缓冲液组成)、dNTP、待测DNA样品、上/下游引物、Taq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、灭菌去离子水。一种情况下,当SNP位点碱基与双脱氧修饰引物的3’末端的相应碱基序列相同时,则该引物为上游引物(辨别性引物),普通引物为下游引物;当与之互补时,则该双脱氧修饰引物为下游引物(辨别性引物),普通引物为上游引物。而对于Taq DNA聚合酶,主要利用的是其DNA聚合活性(引物延伸活性);对于高保真DNA聚合酶,则主要利用的是其3’,5’-核酸外切酶活性(校对功能)。反应所用到的PCR仪为常规PCR仪。
正是由于SNP的检测与区分是以引物的延伸/不延伸作为判断依据的,而引物的延伸与否,又严格取决于3’末端是否被2’,3’-双脱氧修饰的核苷酸所“封闭”,亦即3’末端序列是否与相应的模板序列完全互补配对,因此这种延伸或者不延伸是绝对的,著名的测序方法——Sanger双脱氧终止法也正是利用了当3’末端为2’,3’-双脱氧修饰核苷酸时,引物便无法正常延伸这一原理的。这样,与传统的SNP检测方法——等位基因特异性引物延伸法相比,该发明从理论上避免了假阳性的产生。很大程度上提高了检测的准确度、重现性。
作为本发明的一种优选方式,本发明的方法的操作步骤如下:
第一步,确定要研究的基因与SNP位点,并明确SNP位点突变前后的序列,即具体的突变情况。
第二步,根据SNP位点突变前的序列,也就是原野生型等位基因序列设计两条引物,并使其中一条引物自3’末端起的几个碱基(不超过6个)完全覆盖SNP位点,最好是3’末端恰好位于SNP位点处。另一条引物在其下游(或上游),使这一对引物扩增的目的片段大小为200bp~500bp。对于突变类型为数个碱基的置换、增添或缺失时,这数个碱基在设计引物时当作一个碱基对待。
第三步,引物合成。并对覆盖SNP位点的那条引物的3’末端核苷酸进行2’,3’-双脱氧修饰,但最好是进行2’,3’-ddC的修饰。因为目前只有3’-2’,3’-ddC的修饰技术已经成熟,可通过许多生物试剂公司来合成(修饰),如TakaRa、Invitrogen、Qiagen、上海生工等。其余三种双脱氧核苷酸修饰技术目前还不很成熟,没有现成的商业化渠道可供选择。因此需要操作者(实验室)自己进行合成(修饰)。合成(修饰)方法大致为:首先按前两步所述设计好两条引物并进行常规合成,对于欲进行修饰的那条引物,只合成除3’末端双脱氧核苷酸的剩余部分。例如,合成了两条引物,长度分别为25nt与28nt,并准备对28nt的那条引物的3’末端腺嘌呤脱氧核苷酸进行双脱氧修饰,则合成时只合成该条引物从5’末端起的27个寡核苷酸。合成之后,以这27个寡聚核苷酸为引物,设计引物时依据的DNA为模板,2’,3’-ddA为原料进行PCR反应,由于在Taq DNA聚合酶作用下,该条引物会顺利延伸,这样便在其3’末端添加上了一个2’,3’-ddA,正由于当3’末端为2’,3’-双脱氧核苷酸时引物是无法再继续延伸的,因此加上去一个2’,3’-ddA后,PCR反应即终止。之后再通过凝胶电泳将该条引物从PCR反应体系中分离纯化出来,即得到了最终需要的28nt的2’,3’-双脱氧修饰引物。此方法类似于Sanger双脱氧终止测序法的原理。
第四步,PCR反应。按照前述内容配制PCR反应体系(20uL或50uL均可),其中Taq DNA聚合酶用量建议为0.5U-1U,高保真DNA聚合酶(以TaKaRaHS DNA Polymerase为例)用量为0.1U-0.5U(20uL体系)。其余试剂或原料均按常规PCR反应体系添加。PCR反应程序为常规反应程序,退火温度可根据设计的引物情况自行摸索、设定。或根据所用的Taq DNA聚合酶反应所需的环境条件自行优化反应体系与反应条件。反应在常规PCR仪中进行即可。
第四步,琼脂糖凝胶电泳(或聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离。
第五步,根据电泳分离后的结果,即可判断待测DNA样品的SNP基因型:若分离后无条带,则待测DNA样品(等位基因)的基因型为野生型;若分离后有一条大小为200bp~500bp的条带,则待测DNA样品(等位基因)的基因型为突变型,即该基因待研究的SNP位点处序列发生了突变。
本发明所述的方法适用于检测突变类型为少数(1~8个)核苷酸的置换、增添或缺失的SNP位点,尤其适用于不超过5个核苷酸的置换、增添或缺失的SNP检测。对于检测大片段的增添、缺失、重排等,不适合用本方法。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义,文中所涉及的专业术语、缩略语及科学用语等与本领域操作人员所熟知的含义相同。
应该强调的是,以下所述的实施例以及所用到的仪器、试剂、材料等仅是作为示范,旨在进一步阐述本发明方法的实用性与可操作性。实际操作中所用到的仪器、试剂、材料以及反应条件等,并不局限于文中所述。具体操作时,可根据实验室的条件、需要、目的以及制造商的要求与建议自行选择仪器、试剂、材料等,自行设计、安排实验。只要实施方案与以下所述内容类似或均等即可。
标准基因组DNA样品及临床待测DNA样品
以下实施例中所用到的标准基因组DNA样品均使用TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit(大连TaKaRa公司)提取自人肺癌A549细胞株。
试剂及仪器
以下实施例中所用到的(10×)PCR反应缓冲液、(5×)PCR高保真酶反应缓冲液、氯化镁、dNTP、高保真DNA聚合酶(HS DNA Polymerase)、Taq DNA聚合酶等试剂均购自大连TaKaRa公司;PCR反应所需引物均由上海铂尚生物技术有限公司合成并纯化;所用PCR仪为美国Mastercycler96孔PCR仪。
基因序列信息
以BRCA1、BRCA2为例,以下实施例中,设计引物所参考的BRCA1与BRCA2的基因全长(参考)序列均下载自美国国立生物技术信息中心(NCBI),其Genbank登录号分别为:BRCA1(MIM113705)、BRCA2(MIM600185)。
实施例1、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法对BRCA1基因热点碱基突变的检测
以下PCR检测方法中,所用的WT、MT模板序列为SEQ ID NO:116~124的序列。
(1)引物设计
本例以BRCA1基因热点突变外显子2上的185delAG突变、外显子5上的300T>G突变、外显子11上的1081delG突变、4153delA突变以及4184delTCAA突变为例来分析本发明所述的方法(300T>G、1081delG、4153delA与4184delTCAA,以及后面实施例中所涉及的待检测SNP位点的名称均是沿用公知文献中对该突变位点的习惯命名)。
首先根据BRCA1的基因全长序列选取5对(实际为9条)序列片段,分别为185delAG野生型(WT)序列、185delAG突变型(MT)序列、300T>G野生型序列、300T>G突变型序列、1081delG野生型序列、1081delG突变型序列、4153delA野生型序列、4153delA突变型序列、4184delTCAA野生型序列(与4153delA野生型序列相同)、4184delTCAA突变型序列(SEQ ID NO:116~124)。使其分别覆盖这5个SNP位点,且野生型与突变型序列相比,只在相应SNP位点处有1~4个碱基的差异。然后再根据选取的5对序列片段,分别设计5对检测引物(如表1),用于扩增一段长度分别为252bp、222bp、392bp、231bp和340bp的包含待检测SNP位点的DNA片段。其中检测185delAG、300T>G、1081delG、4153delA的上游引物(以下简称FP)为普通引物;下游引物(以下简称RP)为3’末端2’,3’-ddC双脱氧修饰引物,且3’末端的2’,3’-ddC恰位于待测位点处,或待测位点碱基向上游数不超过5个碱基的范围内,且与相应碱基互补;检测4184delTCAA的上游引物为3’末端2’,3’-ddC双脱氧修饰引物,且3’末端的2’,3’-ddC恰位于待测位点处,与相应碱基相同,下游引物为普通引物。
表1
(*表中的WT、MT模板序列只显示与正向或反向(封闭)引物相对应的部分)
(2)PCR反应体系
下列各体系中,除非另外说明,高保真酶是HS DNA聚合酶(大连TaKaRa);(5×)PCR反应混合缓冲液是由(5×)PCR反应缓冲液与(5×)PCR高保真酶反应缓冲液按体积比1:1混合而成;其中(5×)PCR反应缓冲液是由原(10×)PCR反应缓冲液以灭菌去离子水稀释而成。
以上体系为针对突变185delAG、300T>G、1081delG、4153delA与4184delTCAA的反应体系。且该体系须分别各配制2个反应体系,所加的模板DNA分别为包含待检测SNP突变位点的基因型为野生型(WT)的质粒与基因型为突变型(MT)的质粒。其中高保真酶的加入量可根据各个待测突变位点的反应情况及引物设计的不同而在0.1U-0.4U(1μL-4μL)的范围内具体调整。
(3)反应循环条件
按上述反应体系和反应条件在普通PCR仪上进行反应,然后对反应物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定(所用凝胶浓度为1.2%,上样量均为5μL),分子量标记物为购自大连TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(下同)。电泳结果如图2所示。从电泳图中可看到5个突变型(MT)序列模板均有扩增后目的条带,而其野生型(WT)序列模板则均无目的条带(其中4184delTCAA突变的突变型模板扩增后有明显的非特异性条带,但这并不对检测结果的判定造成影响。检测结果判定的唯一标准是特异性目的条带的有无)。
实施例2、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法对BRCA2基因热点碱基突变的检测
以下PCR检测方法中,所用的WT、MT模板序列为SEQ ID NO:130~135的序列。
(1)引物设计
本例以BRCA2基因热点突变外显子9上的999del5、外显子11上的6174delT以及外显子23上的9254del5为例来分析本发明所述的方法。首先根据BRCA2的基因全长序列选取3对序列片段,分别为999del5野生型序列、999del5突变型序列、6174delT野生型序列、6174delT突变型序列、9254del5野生型序列以及9254del5突变型序列(SEQ ID NO:130~135)。使其分别覆盖这3个SNP位点,且野生型与突变型序列相比,只在相应SNP位点处有1~5个碱基的差异。然后根据选取的3对序列片段,分别设计3对检测引物,用于扩增一段长度分别为244bp、232bp和251bp的包含待检测SNP位点的DNA片段(如表2)。其中检测6174delT的上游引物(以下简称FP)为普通引物,下游引物(以下简称RP)为3’末端2’,3’-ddC双脱氧修饰引物,且3’末端的2’,3’-ddC恰位于待测位点碱基向上游数不超过5个碱基的范围内,且与相应碱基互补;检测999del5与9254del5的上游引物为3’末端2’,3’-ddC双脱氧修饰引物,且3’末端的2’,3’-ddC恰位于待测位点处,且与相应碱基相同,下游引物为普通引物。
表2
(*表中的WT、MT模板序列只显示与正向或反向(封闭)引物相对应的部分)
(2)PCR反应体系
以上体系为针对突变999del5、6174delT与9254del5的反应体系。且该体系须分别各配制2个反应体系,所加的模板DNA分别为包含待检测SNP突变位点的基因型为野生型(WT)的质粒与基因型为突变型(MT)的质粒。其中高保真酶的加入量可根据各个待测突变位点的反应情况及引物设计的不同而在0.1U-0.4U(1μL-4μL)的范围内具体调整。
(3)反应循环条件
按上述反应体系和反应条件在普通PCR仪上进行反应,然后对反应物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定(所用凝胶浓度为1.2%,上样量均为5μL)。电泳结果如图3所示。从电泳图中可看到3个突变型(MT)序列模板均有扩增后目的条带,而其野生型(WT)序列模板则均无目的条带。
实施例3、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法的灵敏度分析
以对突变6174delT的检测为例,使用与实施例2中完全相同的包含突变位点6174delT的野生型(WT)序列模板(SEQ ID NO:132)和突变型(MT)序列模板(SEQ ID NO:133),将这两个DNA序列片段分别连接到18-T Vector(大连TaKaRa公司),之后把重组质粒转化入DH5α感受态细胞中,挑取单菌落扩大培养,经菌液PCR筛选出阳性克隆后,送至上海铂尚生物技术有限公司测序,最终挑选出序列完全正确的重组质粒。用限制性内切酶SacI(大连TaKaRa公司)分别对这两种重组质粒进行单酶切,并对酶切后得到的线性质粒进行纯化,之后用超微量紫外分光光度计分别测定其OD值,并换算为拷贝/ml。用1×TE以10倍作为梯度标准对两种线性质粒进行逐步稀释,最终制备成108~101拷贝/μL的系列标准品,作为PCR反应的模板。之后按以下体系进行PCR反应(①为野生型反应体系,②为突变型反应体系)
反应循环条件:
按上述反应体系和反应条件在普通PCR仪上进行反应,然后对反应物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定(所用凝胶浓度为1.2%,上样量均为5μL)。电泳结果如图4所示。从电泳图中可以明显看出,当反应体系(20μL)中模板含量分别为1×108拷贝~1×103拷贝时,突变型(MT)序列模板均有目的条带,且目的条带亮度随体系中所加的模板浓度的降低而减弱,而相应野生型(WT)序列模板则均无目的条带。由此可见,仅凭借琼脂糖凝胶电泳分离、通过肉眼判断的条件下,本发明所述方法的检测(区分)范围已达1×108~1×103(拷贝),因而具有相当的灵敏度和检测限。
实施例4、基于PCR引物3’末端核苷酸双脱氧修饰的乳腺癌易感基因SNP检测方法的特异性分析
仍以对突变6174delT的检测为例,使用与实施例3中相同的6174delT野生型、突变型线性重组质粒(SEQ ID NO:132~133)共同作为PCR反应模板,反应体系(20μL)中加入的模板量固定为0.345ng(1×108拷贝)、其中突变型(MT)序列模板所占的比例分别按100%、50%、10%、1%、0.1%、0%依次递减,此外其余反应体系组分及反应条件等均与实施例3中描述的相同。
经PCR反应之后,对反应物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定(所用凝胶浓度为1.2%,上样量均为5μL)。电泳结果如图5所示。从电泳图中可以明显看出,当反应体系(20μL)中突变型(MT)模板量占总模板量的比例分别为100%、50%、10%、1%、0.1%时,均有目的条带,且目的条带亮度随体系中突变型模板比例的降低而减弱。当突变型模板质粒所占比例为0%,即所加模板均为野生型重组质粒时,则无目的条带。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)针对一个单核苷酸多态性位点,以正向引物和反向引物为引物对,以同时含有高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合体系进行PCR扩增;
所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物,以其3’末端碱基起算第1-6位的任意1个或多个碱基对应待测位点,但与野生型序列相应区段上碱基序列完全匹配;且,所述的辨别性引物的3’末端核苷酸经过2’,3’-双脱氧修饰,其长度为20~40mer;
所述的引物对中,辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配,其长度为20~40mer;
(2)分析PCR扩增产物,若获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测位点存在突变,基因型为突变型;若未获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测位点不存在突变,基因型为野生型。
2.一种乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)针对一个单核苷酸多态性位点,以正向引物和反向引物为引物对,以同时含有高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合体系进行PCR扩增;
所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物,以其3’末端碱基起算第1-6位的任意1个或多个碱基对应待测位点,但与突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配;且,所述的辨别性引物的3’末端核苷酸经过2’,3’-双脱氧修饰,其长度为20~40mer;
所述的引物对中,辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配,其长度为20~40mer;
(2)分析PCR扩增产物,若获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测突变位点不存在突变,基因型为野生型;若未获得目的扩增产物,则表明待测基因的待测突变位点存在突变,基因型为突变型。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,PCR目的扩增产物为包含所述单核苷酸多态性位点的约200~500bp大小的DNA片段。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶;所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的乳腺癌易感基因单核苷酸多态性位点包括:BRCA1基因的185delAG,300T>G,1081delG,4153delA,4184delTCAA,5382insC;或
BRCA2基因的999del5,6174delT,9254del5。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,用于检测BRCA1基因185delAG的辨别性引物是选自SEQ ID NO:1-5任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:6-12任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA1基因300T>G的辨别性引物是选自SEQ ID NO:13-19任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:20-24任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA1基因1081delG的辨别性引物是选自SEQ ID NO:25-28任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:29-34任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA1基因4153delA的辨别性引物是选自SEQ ID NO:35-40任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:41-45任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA1基因4184delTCAA的辨别性引物是选自SEQ ID NO:46-54任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:55-61任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA1基因5382insC的辨别性引物是选自SEQ ID NO:62-63任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:64-68任一所示的反向引物。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,用于检测BRCA2基因999del5的辨别性引物是选自SEQ ID NO:69-78任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:79-84任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA2基因6174delT的辨别性引物是选自SEQ ID NO:85-90任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:91-96任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA2基因9254del5的辨别性引物是选自SEQ ID NO:97-106任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:107-115任一所示的反向引物。
8.一种用于乳腺癌易感基因单核苷酸多态性检测的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包括:
用于检测BRCA1基因185delAG的辨别性引物,选自SEQ ID NO:1-5任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:6-12任一所示的反向引物;
用于检测BRCA1基因300T>G的辨别性引物,选自SEQ ID NO:13-19任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:20-24任一所示的反向引物;
用于检测BRCA1基因1081delG的辨别性引物,选自SEQ ID NO:25-28任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:29-34任一所示的反向引物;
用于检测BRCA1基因4153delA的辨别性引物,选自SEQ ID NO:35-40任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:41-45任一所示的反向引物;
用于检测BRCA1基因4184delTCAA的辨别性引物,选自SEQ ID NO:46-54任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:55-61任一所示的反向引物;和
用于检测BRCA1基因5382insC的辨别性引物,选自SEQ ID NO:62-63任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:64-68任一所示的反向引物。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括:
用于检测BRCA2基因999del5的辨别性引物,选自SEQ ID NO:69-78任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:79-84任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA2基因6174delT的辨别性引物,选自SEQ ID NO:85-90任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:91-96任一所示的反向引物;或
用于检测BRCA2基因9254del5的辨别性引物,选自SEQ ID NO:97-106任一所示的正向引物;或选自SEQ ID NO:107-115任一所示的反向引物。
10.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括:
高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶或它们的混合酶;较佳地,混合酶中,高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶按照酶活性单位的比例是(0.05-0.6):1;较佳地为(0.1-0.5):1。
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