CN108179177A

CN108179177A - 一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN108179177A
Application number: CN201711485219.5A
Authority: CN
Inventors: 张睿; 李博安; 詹尔昌; 郭永斌
Original assignee: Bo Di Tai (xiamen) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Bo Di Tai (xiamen) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-06-19

Abstract

本发明涉及一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域。本发明将针对突变型基因所设计的反向引物和其相对应野生型基因所设计的反向引物分别相邻地固定于固相介质表面。本发明将等温重组酶聚合酶扩增技术(RPA)与固相微阵列相结合，可同时在硝酸纤维膜上进行多个基因单点突变的筛查，也可置于96孔平底微盘进行自动高通量筛选基因突变。采用本发明进行核酸突变检测，整个反应可以在30分钟内完成，无需加热循环仪，操作简易，检测效率高，可直接基于固相介质上的呈色反应判读检测结果。

Description

一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法。

背景技术

目前在基因突变检测领域，有几种方法可以用来检测基因的点突变，这些方法的敏感性、反应时间、以及费用各不相同。传统突变检测方法为杂交和DNA测序，而这些方法步骤复杂且消耗时间。多聚酶链式反应(PCR)技术的出现为该领域的发展提供了新的线索。目前的突变检测方法几乎无一例外的是基于PCR技术，包括基于PCR的测序、高分辨熔解分析(HRMA)、探针扩增阻滞突变系统(ARMS)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)。在这些方法中，DNA测序，又称为Sanger测序或双脱氧测序，被认为是金标准，缘于该方法沿着每个核苷酸检测DNA序列因此能够鉴定出检测基因片段中的所有可能突变，包括碱基置换、插入或者缺失。然而该方法敏感性低，仅为20％，且耗费劳力和时间。该测序法的一个替代方法如焦磷酸测序，其敏感性已被证明可达5％-10％。在非测序方法中，ARMS、HRMA、PCR-RFLP，还有等位基因特异性实时定量PCR，都是基于实时定量PCR技术。这些技术在过去几年中已被Sanger测序法作为参考研究印证，证实了在基因突变检测中的有效性可可行性。

HRMA，通常基于实时定量PCR，是通过在熔解的DNA双链中插入染料的方法检测其变化，以确定突变。该方法快速敏感但已被报道有20％的假阳性。所以，该方法需要测序验证，且不能显示确实的突变方式。等位基因特异性实时定量PCR以及ARMS仅能检测靶基因有限的突变位点，使得这些方法在临床实践中不怎么切实可行。最近，更敏感的方法已被应用于KRAS的检测。其中一种方法是PCR钳分析技术，另一种方法是co-amplification atlower denaturation temperature低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)。PCR钳分析利用突变特异性杂交探针以及其它野生型互补多肽核酸探针，以抑制正常序列的扩增，能够检测小于1％的等位基因。COLD-PCR是另外一种选择性扩增系统，能够从混合DNA序列中富集微量等位基因。该方法是基于与野生型比较突变同源双链有着较低的熔解温度。因此，在COLD-PCR，变性温度设定在80℃，而在常规PCR变形温度将近94℃。作为一个敏感的DNA富集方法，COLD-PCR通常跟随着HRMA和焦磷酸测序。突变分离聚合酶链反应(MS-PCR)是一种新的基于PCR的检测方法，可以在核酸序列中鉴别已知的等位基因突变。该方法的基本原则是，使用带有突变位置离3‘端不同距离的等位基因引物，以等位基因依赖的方式，将突变引入PCR引物在扩增DNA的结合区。在接下来的循环中，由于错误引物不稳定的延伸，突变可以防止扩增产物的形成。MS-PCR过程中形成的产物对于它们各自的等位基因是特异的，并且能被凝胶电泳直接鉴别。

由此可见目前，基于多聚酶链式反应(PCR)的方法为突变检测的主流方法，但是这些方法耗费时间且价格昂贵。一个可能的替代是等温核酸扩增技术，该方法在整个反应过程中使用单一温度，运用不同的机制如某些多聚酶的链替代活性或者加入在自然修复过程中使用的蛋白。等温核酸扩增技术中的例子是环介导的扩增(LAMP)、螺旋酶依赖的扩增(HAD)、链替代扩增(SDA)以及滚环扩增(RCA)，这些方法最近已有叙述并且已证明了其应用价值。另一个有希望的方法是重组酶多聚酶反应(RPA)，该方法使用一种噬菌体重组酶以引导短寡核苷酸引物到同源靶序列上。与一种链置换多聚酶以及一种单链DNA结合蛋白结合使用，扩增少于10个拷贝的基因组DNA可以在少于30分钟内完成。并且，反应的运行仅需要持续37–39℃低温，以及仅需2个引物的PCR养系统，后者提供了多重检测的可能性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种快速检测核酸突变的试剂盒，解决了现有技术中存在的核酸突变检测繁琐，难以满足需求的问题。

本发明的另一个目的还在于提供一种利用上述试剂盒快速检测核酸突变的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种快速检测核酸突变的试剂盒，所述试剂盒包括针对突变型基因和野生型基因的引物组、重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白和固相介质，所述引物组包括正向引物和反向引物，针对突变型基因和野生型基因的反向引物固定在固相介质上，形成微阵列芯片。

上述的试剂盒可用来同时检测多个基因单点突变，其方法是将针对突变基因所设计的反向引物和其相对应的野生型基因所设计的反向引物分别相邻地固定于固相介质表面；通过等温重组酶多聚酶扩增(RPA)技术可以在10-20分钟完成核酸扩增反应，不必用加热循环仪，可直接由已固定的反向野生型与突变型引物，以及通用的生物素(Biotin)修饰的正向引物进行核酸扩增反应；反应结束后加入与乳胶耦合的链霉亲和素或辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)及呈色剂进行呈色反应；比较颜色深浅判断是否有单点突变或通过观察预先设计的呈色位置的信号分子进行基因型鉴定；本发明使用的固相介质可为但不限于塑料或硝酸纤维膜，可同时进行多个基因单点突变的检测。本发明的微阵列可置于硝酸纤维膜上进行基因突变筛查，也可置于96孔平底微盘进行高通量基因突变的筛查。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的优选实施方式，所述正向引物修饰有生物素，反向引物修饰有特异标记物或60～80个胸腺嘧啶核苷酸。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的优选实施方式，所述特异标记物为地高辛(Dig)或FAM荧光。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的优选实施方式，所述重组酶为T4uvsX/uvsY，所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4gp32。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括ddH₂O、缓冲溶液和呈色剂。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的优选实施方式，所述缓冲溶液含有下述浓度的组分:Tris-HCl缓冲液50mM、乙酸钾100mM、乙酸镁14mM、二硫苏糖醇2mM、dNTPs 200μM、ATP 3mM、磷酸肌酸50mM、肌酸激酶100ng/μL和Carbowax20M 5wt％；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的优选实施方式，所述呈色剂包括显色乳胶或酶催化呈色剂。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的优选实施方式，所述固相介质为硝酸纤维膜或96孔平底微盘。

本发明还提供了上述的快速检测核酸突变的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1)针对突变型基因和其相对应的野生型基因分别设计专一性引物；

(2)提取样本核酸DNA；

(3)将反向引物固化在固相介质上，形成微阵列芯片；

(4)配置反应体系：混合样本核酸、被生物素修饰的正向通用引物、重组酶、DNA聚合酶、DNA结合蛋白、缓冲溶液和ddH₂O；

(5)震荡混匀步骤(4)制得的反应体系后，转移至(3)所述的具有固化反向引物的固相介质上，于37～42℃恒温反应10～20分钟，进行RPA扩增；

(6)结果呈色与判读：通过观察呈色反应结果，对步骤(5)所得的RPA扩增产物进行基因型鉴定。

上述技术方案是一个鉴定基因突变的方法，包括但不限于点突变，其方法是将突变基因所设计的反向引物和其相对应的野生型基因所设计的反向引物分别相邻地固定于固相介质表面，其特征在于上述引物被修饰了特异的标志物(Dig、FAM)或60～80个胸腺嘧啶核苷酸(poly-thymidine)，这种特异的标志物可以固化在固相介质(如塑料、玻璃、硝酸纤维膜)上；接着加入通用的正向引物，其特征在于通用的正向引物被修饰加入生物素(Biotin)。经过等温重组酶多聚酶扩增后，扩增产物就被标记了生物素(Biotin)。该生物素和与乳胶耦合的链霉亲和素或辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)相结合。经过洗脱未结合的物质，沉积的显色乳胶可以被肉眼或者被光学设备读出；或者，沉积在固相基质上的HRP催化呈色剂(TMB)进行显色反应。

对于多个点突变位点的检测，针对不同突变位点的等温重组酶聚合酶扩增反应也可分别在不同的试管中进行。在反应结束后，将扩增的核酸产物以及辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)(或与乳胶耦合的链霉亲和素)加入固相微阵列上，等温40℃条件下进行重组反应。最后通过观察预先设计的呈色位置的信号分子进行基因型鉴定。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的检测方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，将修饰有特异标记物或60～80个胸腺嘧啶核苷酸的反向引物溶于固化液中，通过自动点片机置于固相介质上。

作为本发明所述的快速检测核酸突变的试剂盒的检测方法的优选实施方式，检测结果呈现方式包括圆点阵列或线型阵列。

不同的斑点形态代表不同的突变状态。靶基因的基因型可以根据呈现在试纸条上的斑点形态而鉴定。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明将RPA恒温基因技术与固相微阵列相结合，省去荧光检测或加热循环仪器等复杂设备，整个反应可以在30分钟内完成，其检测结果用肉眼即可观测并判读，操作简易，检测效率高，适用于即时快速诊断，可推广至基层医疗单位。此外，本发明运用的96孔平底微盘进行自动高通量筛选基因突变，可以在同一反应平台同时对大量样本进行鉴定，极大地降低了成本。

附图说明

图1为实施例2的硝酸纤维膜微阵列示意图；图中，硝酸纤维膜微阵列包含反应区；其中反应区包含试纸品管点、突变型点、野生型点及质控点。有效反应可鉴定出野生型纯合基因型(Homozygous)反应、突变型杂合基因型(Heterozygous)及突变型纯合基因型(Homozygous)反应；无效反应为无试纸品管点及质控点。

图2为实施例2的硝酸纤维膜微阵列结果图；分别包括BRCA1 185野生型以及185delAG突变型、BRCA1 5382野生型以及5382insC突变型、BRCA2 6174野生型以及6174delT突变型。

图3为实施例3的96孔平底微盘微阵列结果图；分别包括BRCA1 185野生型以及185delAG突变型、BRCA1 5382野生型以及5382insC突变型、BRCA26174野生型以及6174delT突变型。其中，M表示:Marker(品管点),P表示:Positive Internal Control(阳性内质控),N表示:Negative control(阴性内质控)。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例所述快速检测核酸突变的试剂盒为：

所述试剂盒包括针对突变型基因和野生型基因的引物组、T4uvsX/uvsY重组酶、Bsu DNA聚合酶、T4gp32DNA结合蛋白、固相介质、ddH₂O、缓冲溶液和呈色剂，所述引物组包括正向引物和反向引物，针对突变型基因和野生型基因的反向引物固定在固相介质上，形成微阵列芯片。正向引物修饰有生物素，反向引物修饰有特异标记物(地高辛或FAM荧光)或60～80个胸腺嘧啶核苷酸。

所述缓冲溶液含有下述浓度的组分:Tris-HCl缓冲液50mM、乙酸钾100mM、乙酸镁14mM、二硫苏糖醇2mM、dNTPs 200μM、ATP 3mM、磷酸肌酸50mM、肌酸激酶100ng/μL和Carbowax20M 5wt％；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9；所述呈色剂包括显色乳胶或酶催化呈色剂；所述固相介质为硝酸纤维膜或96孔平底微盘。

实施例2

结合等温重组酶聚合酶扩增与硝酸纤维膜微阵列，进行多重鉴定BRCA1、BRCA2基因突变。

1.引物设计与合成

根据NCBI基因数据库的BRCA1、BRCA2基因突变序列，参考TwistDxinstructionmanual和Primer-BLAST引物设计原则，设计引物。引物长度约为30-35nt，由于目前没有针对RPA的引物设计软件，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物，从中筛选出灵敏度高且特异性好的引物用于本发明(表1)。按照表1所示的引物序列，进行序列合成。正向引物(forward primer)的5’端，修饰加入Biotin生物素；反向引物(reverse primer)的5’端，加入特异的标志物(Dig、FAM)。

表1

2.核酸萃取

使用DNeasy Blood&Tissue kit(QIAGEN)，进行细胞DNA的萃取，经150μL无菌水冲提。

以Nanodrop ND-1000spectrophotometer(ThermoScientific,Wilmington,USA)分光亮度计OD260测量DNA的浓度与质量，萃取后的DNA保存于-20℃。

3.呈色乳胶耦合链霉亲和素试剂的制备

将链霉亲和素(Streptavidin)蛋白溶于MES(1mg/mL)，使最终浓度为50μg/mL。与5mL乳胶(Latex)溶液混合，并使其混合均匀。至于室温隔夜反应。离心(12,000rpm,30min)除去上清液。以10mL PBS重新混匀Latex，离心(12,000rpm,30min)，除去上清液(重复此步骤3次)。将Latex保存于10mL Storage Buffer(2.5％BSA)，并置于4℃备用。

4.实施方法

根据本发明实施例方法，第一步包括从含有要鉴定的突变基因的靶样品(包括但不限于细胞、血液、组织、微生物)中提取核酸(DNA)。对于每个突变位点检测，5μL的DNA样品加入反应溶液，其包含125μL的缓冲溶液(50mMTris-HCl缓冲液pH值为7.9、100mM乙酸钾、14mM乙酸镁、2mM二硫苏糖醇、200μM dNTPs、3mM ATP、50mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶、5％Carbowax20M)和单链DNA结合蛋白gp32，重组酶uvs X和uvs Y、DNA聚合酶,ddH₂O以及1μL正向通用引物(10μM)。将上述总体积150μL的反应溶液加入反应槽中，同时插入在预先设计的位置上固定有野生型和突变型反向引物的硝酸纤维膜。反应槽放置于加热器在40℃加热20分钟以扩增特异性基因片段，同时进行核酸杂交。

在第二步中，PRA反应产物(分别标记有生物素Biotin的突变以及野生型基因)被杂交在硝酸纤维膜上预先设计的位置，这些产物将被加入的与显色乳胶耦合的链霉亲和素捕捉。最终结果可以由特定位置上显色乳胶呈色结果来判读。具体地，将扩增与核酸杂交完毕的硝酸纤维膜插入含有150μL呈色乳胶耦合链霉亲和素试剂的呈色槽，经过3分钟孵育。拔出硝酸纤维膜以另外150μL反应缓冲液洗脱未结合物质，如果特定位置有胶乳沉积则视为阳性，而微量或者无胶乳沉积则视为阴性。不同的斑点形态代表不同的突变状态。因此，靶基因的基因型可以根据呈现在试纸条上的斑点形态而鉴定(如图2所示)。

本发明具有高效，步骤更为容易，鉴定时间短，鉴定费用低的特点。

实施例3

一种结合等温重组酶聚合酶扩增与96孔平底微盘微阵列，用以多重鉴定BRCA1、BRCA2基因突变。

1.引物设计与合成

根据NCBI基因数据库的BRCA1、BRCA2基因突变序列，参考TwistDxinstructionmanual和Primer-BLAST引物设计原则，设计引物。引物长度约为30-35nt，由于目前没有针对RPA的引物设计软件，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物，从中筛选出灵敏度高且特异性好的引物用于本发明(表2)。按照表2所示的引物序列，进行序列合成。正向通用引物(forward primer)的5’端，修饰加入Biotin生物素；反向引物(reverse primer)的5’端，加入60个胸腺嘧啶核苷酸(poly-thymidine)。

表2

2.核酸萃取

以Nanodrop ND-1000 spectrophotometer(ThermoScientific,Wilmington,USA)分光亮度计OD260测量DNA的浓度与质量，萃取后的DNA保存于-20℃。

3.96孔平底微盘制备

3.1将上述60个胸腺嘧啶核苷酸修饰的反向引物溶于固化液使反向引物浓度介于2.5～25μM，其中所述固化液为:2.5wt％BSA和中性红染色剂。

3.2将含有特定引物的溶液，以自动点片机(BioDot AD3200)，通过计算机点片程序搭配三维空间(X、Y、Z轴)的自动化机械手臂系统，藉由点渍针(Picoliterpin)，将含引物的溶液以物理接触方式点印于96孔平底塑料盘上的特定位置。将点好点96孔平底微盘放置于室温下2-6小时使其阴干。

3.3将上述96孔平底微盘置于紫外光(254nm)装置(Stratalinker 2400,Stratagene,CA,USA)下，以能量3mW/cm²强度照射10分钟，使引物固定于塑料固相基质上。

3.4再以封闭液在室温下反应1小时，所述封闭液为2.5 wt％BSA。

3.5封闭结束后，以清洗液(100mMTris-HCl(pH 7.5),150mMNaCl,and 1mL/LTween 20)震荡摇晃清洗10分钟。

3.5再以去离子水清洗2-4次。

3.6以氮气(nitrogen)吹干后置于室温保存。

4.固相核酸扩增与杂交反应

4.1按表3比例配置反应体系：

表3

样本核酸	5μL(2μg)
		通用正向引物	1μL(10μM)
缓冲溶液	25μL
		T4 uvsX/uvsY,120ng/ul	1μL
Bsu DNA聚合酶，30ng/ul	1μL
		T4 gp32,900ng/ul	1μL
ddH2O	补足至50μL

4.2震荡混匀步骤4.1制得的反应体系后,转移至步骤3所述具有固化反向引物的96孔平底微盘。样本于38～42℃恒温反应10～20分钟，进行RPA扩增与核酸杂交反应。

4.3反应完毕后于室温用PBST清洗两次，每次5分钟。

4.4将HRP-Streptavidin加入上述96孔平底微盘，40℃恒温反应5分钟；PBST清洗三次，加入TMB呈色剂，室温反应1分钟，进行酶催化呈色。

5.结果判读

采用肉眼判读或影像分析仪进行自动高通量数据采集等方法检测样品基因型(图3)。

综上所述，本发明的试剂盒将RPA恒温基因技术与固相微阵列相结合，省去荧光检测或加热循环仪器等复杂设备，整个反应可以在30分钟内完成，其检测结果用肉眼即可观测并判读，操作简易，检测效率高，适用于即时快速诊断，可推广至基层医疗单位。此外，本发明运用的96孔平底微盘进行自动高通量筛选基因突变，可以在同一反应平台同时对大量样本进行鉴定，极大地降低了成本。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 博迪泰（厦门）生物科技有限公司

<120> 一种快速检测核酸突变的试剂盒及检测方法

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<213> 人工合成序列

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Claims

1.一种快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对突变型基因和野生型基因的引物组、重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白和固相介质，所述引物组包括正向引物和反向引物，针对突变型基因和野生型基因的反向引物固定在固相介质上，形成微阵列芯片。

2.根据权利要求1所述的快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述正向引物修饰有生物素，反向引物修饰有特异标记物或60～80个胸腺嘧啶核苷酸。

3.根据权利要求2所述的快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述特异标记物为地高辛或FAM荧光。

4.根据权利要求1所述的快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述重组酶为T4uvsX/uvsY，所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4 gp32。

5.根据权利要求1所述的快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddH₂O、缓冲溶液和呈色剂。

6.根据权利要求5所述的快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液含有下述浓度的组分:Tris-HCl缓冲液50mM、乙酸钾100mM、乙酸镁14mM、二硫苏糖醇2mM、dNTPs200μM、ATP 3mM、磷酸肌酸50mM、肌酸激酶100ng/μL和Carbowax20M 5wt％；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9。

7.根据权利要求5所述的快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述呈色剂包括显色乳胶或酶催化呈色剂。

8.根据权利要求1所述的快速检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述固相介质为硝酸纤维膜或96孔平底微盘。

9.根据权利要求1～8任一项所述的快速检测核酸突变的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)提取样本核酸DNA；

(3)将反向引物固化在固相介质上，形成微阵列芯片；

(4)配置反应体系；

10.根据权利要求9所述的快速检测核酸突变的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将修饰有特异标记物或60～80个胸腺嘧啶核苷酸的反向引物溶于固化液中，通过自动点片机置于固相介质上。