CN202482330U

CN202482330U - 四种腹泻病病原菌纳米可视化基因芯片

Info

Publication number: CN202482330U
Application number: CN2011203498519U
Authority: CN
Inventors: 张晓龙; 张玲; 慈颖; 马爱敏; 房健慧; 马晓光
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2021-09-16

Abstract

本实用新型涉及一种四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片，其系由聚苯乙烯材料制成之三孔芯片，并形成数组模式，芯片上取霍乱弧菌、痢疾杆菌、出血性大肠杆菌O157、空肠弯曲菌的DNA为探针。

Description

四种腹泻病病原菌纳米可视化基因芯片

技术领域

本实用新型提供了一四种腹泻病病原菌的纳米可视化基因芯片，使具有良好的特异性及重复性，在裸眼观察条件下，检测限可达100fM。

背景技术

DNA芯片的基本原理是在固相支持物上固定核酸并通过杂交过程来检测样品。此基本原理实际来自于20世纪70年代出现的Southern blot和Northern blot技术。80年代中期，国际上几个研究小组同时开发了杂交测序的技术。基本原理是在固相支持物上固定成百上千个8碱基长度的寡核苷酸片段，然后与待测序的DNA片段进行杂交。由于不同的寡核苷酸的碱基序列是相互覆盖的，通过计算机来分析杂交信号，便可以拼接出未知DNA的序列。Fodor等人1991年2月在Science杂志上发表论文，他们利用固相化学合成，光敏保护基团及光刻掩膜技术，在固相支持底物上高密度合成了多肽和寡核苷酸，并用合成的多肽在固相支持物上与抗体进行了亲和反应。随后，1991年9月Science杂志发表了一篇评论，介绍了Fodor等人在1.28cm2的面积上原位光合成65,000个点的工作，第一次提出了DNA芯片(DNA chip)的概念。到1995年，Schena等人在Science杂志上发表论文，将45个拟南芥基因固定在一张玻片上，并行检测拟南芥植株不同组织及不同处理后45个基因表达的变化。此报导第一次将高精度机械手点样技术，荧光标记技术，双信道荧光扫描技术及数据分析软件结合在一起，可以说是DNA芯片技术在基因表达分析中第一次真正意义上的应用。随后，用于基因表达分析的DNA芯片技术发展迅速，在玻片上点样的密度越来越大。部分已经完成基因组测序的微生物的全基因组DNA芯片已经制备出来并应用于各项研究中：如酿酒酵母、结合杆菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的全基因组DNA芯片。随着人类基因组计划的完成和功能基因组学研究的进展，制作出人类全基因组DNA芯片将只是一个时间上的问题。

现在用生物芯片技术分析的物种包括人、酵母、小鼠、大鼠、黑猩猩、大猩猩、果蝇、线虫、玉米、水稻、棉花、细菌和病毒等。目前有超过3000篇的论文与芯片分析有关。这些论文从不同的角度表明了微数组技术的多样性、不同研究单位的研究侧重点以及此技术领域商业化产品的多样性。

实用新型内容

本实用新型的主要目的在于提供一种四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片。

本实用新型的技术内容为：四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片，其是由聚苯乙烯材料制成之三孔芯片，并形成数组模式，芯片上取霍乱弧菌、痢疾杆菌、出血性大肠杆菌O157、空肠弯曲菌之DNA 为探针。

微孔板芯片每孔芯片的探针排列皆为4×4的矩阵。

下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步描述。

附图说明

图1为本实用新型的实施例图。

【主要组件符号说明】

1……芯片 2……微孔

具体实施方式

为了更充分理解本实用新型的技术内容，下面结合具体实施例对本实用新型的技术方案进一步介绍和说明。

本实用新型四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片，系由聚苯乙烯材料制成之三孔芯片，并形成数组模式，芯片上取霍乱弧菌、痢疾杆菌、出血性大肠杆菌O157、空肠弯曲菌之DNA为探针。而微孔板芯片每孔芯片的探针排列皆为4×4的矩阵，

本实用新型四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片，基因芯片技术平台一般包括5个部分：芯片的基质材料、把DNA固着到芯片上的装置、核酸杂交控制系统、读取杂交信号的光学扫描系统以及读取和分析数据的计算机软件工具，由于不同的文献对探针(probe)和靶标(target)有不同的定义，这里我们的定义是固定在基质载体上的DNA被称为探针，而来自生物样品的核酸被称为靶标。

参考目前已发表的相关文献，我们从NCBI上下载所需微生物的GenBank文件，利用软件primer premier5在保守序列上设计相关病毒的特异性引物及探针。在引物的设计过程中，尽可能使不同引物对之间的退火温度趋于一致(4对引物退火温度均在49-54℃之间)，以利于后期的多重PCR过程。设计的引物和探针序列见表1.

探针设计完毕后使用NCBI BLAST中的nr数据库进行特异性的检验，并使用Primer premier5检测是否有Hairpin或者dimer形成。在本项目设计的4对引物中，经primerlist软件分析self-dimer，cross-dimer在不同引物之间虽有少数形成，但均在可接受范围内，不会对PCR扩增过程产生明显不利的影响。

此外，我们还利用Clustal四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片及其检测方法软件对4种病原菌探针进行了多重序列比对，结果显示探针序列一致性很差，这表明4种探针具有很好的特异性，结果如下：

在下游引物的5’端进行了生物素修饰，以使PCR扩增产物生物素化。另外，为了便于探针固定及保证探针杂交效率，我们在探针的5’端添加了20个poly(T)。poly(T)作为间隔臂可使探针分子在固相表面充分伸展以利于探针的杂交反应。同时，我们人工合成了待扩增区域的基因片段，并转入相应的质粒载体以作为建立方法学的模拟标准样品。

对PCR引物有效性及特异性验证中，核酸的提取采用质粒提取试剂盒，操作过程参见试剂盒说明书。合成引物以TE缓冲液稀释为50μM贮存液，为验证PCR引物组合进行多重PCR的有效性及特异性，将4对不同引物等体积混合，分别针对不同范本做PCR扩增以验证PCR引物的特异性；取引物的混合物，针对不同模板组合做多重PCR扩增以验证PCR引物的有效性。PCR扩增体系组成如下：

10×PCR buffer 3μL

Primer mi四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片及其检测方法

dNTP mi四种腹泻病病源菌纳米可视化基因芯片及其检测方法

扩增条件为：95℃，2min；95℃，30second，55℃，30second，72℃，30second，5cycles；95℃，30second，47℃，30second，72℃，30second，20cycles；72℃，2min；4℃，10min。

取扩增产物2-3μL进行琼脂糖凝胶(2％)电泳检测，单一范本扩增如果有单一条带，即证明PCR引物特异性好，多重模板扩增如果目标带均出现，即证明PCR引物可以有效进行多重PCR扩增。

Lane1：DL2000，Lane2-5：霍乱弧菌(869bp)，痢疾杆菌(619bp)，空肠弯曲菌(630bp)，大肠杆菌O157:H7(400bp)多重范本扩增电泳图Lane1：DL2000，Lane2：从上至下依次为霍乱弧菌(869bp)，痢疾杆菌(619bp)，空肠弯曲菌(630bp)，大肠杆菌O157:H7(400bp)。

点样前的探针准备，系合成好的探针先溶解在双蒸水中，终浓度为40μM。

1、配制寡聚核苷酸水溶液稀释至30μM；

2、吸取7μL上述核酸溶液与等量2×基因芯片点样液混匀后即可用于基因芯片点样；

3、待DNA样品的点样板使用完毕可置于-20℃保存。

在芯片的基片表面要求，系使探针分子在芯片表面固定后，应具备均一性：1)不同批次制备的探针应具有一致的响应信号；2)探针分子应具有一致的最适合反应的空间取向；3)探针分子固定后应具有一致的生物活性。如上要求对基因芯片的基片表面化学要求很高，表面处理的优劣决定了探针分子在其上的性能，从而最终对检测分析方法的性能产生直接的影响。一个理想的芯片表面应该是尺寸精确、平滑、平整、均一、耐受性强、荧光惰性、反应效率高和可结合的。

基片的制作材料，系固定DNA探针的基质载体，包括尼龙膜、纤维素膜、玻片、金属片、硅片、陶瓷片、各种有机高分子制作的固相基质等。

将制备好的探针溶液分别吸取14μL，按默认模式分别加入探针制备仪点样板相应的位置，按探针制备仪使用说明进行相关操作，将探针溶液点置在三孔板芯片内形成数组模式。每种探针设置2次重复，反应后若有一个点未出现，则需重新进行。

探针固定模式A1，A4，D1，D4为阳性对照，A2，A3：霍乱弧菌；B1，B2：痢疾杆菌；C1，C2：大肠杆菌O157:H7肠毒素I型C3，C4：弯曲肠杆菌；D2，D3：大肠杆菌O157:H7肠毒素II型。

点好样的芯片37℃水合过夜，去离子水清洗2遍，将芯片放入硼酸盐溶液(1.0gNaBH4+300mLPBS+100mL无水乙醇)中孵育5min，去离子水清洗2遍，空气中干燥后，即得到检测用的芯片。

芯片上固定的探针是根据不同微生物的保守区域设计的，其位置在相应微生物进行PCR扩增的区域内。根据碱基互补配对原则，在适当条件下，生物素化的PCR产物与芯片上的探针可以互补结合形成稳定的双链，该复合物与链霉亲和素-纳米金复合物进一步结合，再利用银染试剂染色，结果可用肉眼直接判定或用扫描仪扫描后进行灰度值计算。

杂交反应的基本流程为：杂交-清洗-呈色剂(链霉亲和素-纳米金)-银染试剂增强显色-清洗。

将针对不同微生物的多重PCR产物吸取20μL与杂交缓冲液(台湾晶宇公司提供)混匀后，95热变性3min(可在PCR仪中进行)。然后，迅速冰浴1min。用移液器将杂交液注入三孔板微孔内，使杂交液覆盖芯片上的点阵，然后盖上芯片盖子，放入杂交仪内，在45℃条件下杂交2小时，并将震动开至最大以使样品与探针充分反应。

杂交反应结束后，取纳米金标记的链霉亲和素(购自Sigma公司)用PBST缓冲液(50mM PBS缓冲液，pH7.5，0.1％Tween)稀释25倍与三孔板芯片37℃孵育30min，用马来酸缓冲液(15mMNaCl，0.1％Tween，pH7.5)洗涤5次，每次1min。再用200μL银染试剂(等体积的硝酸银溶液和对苯二酚溶液)室温温育5-10 min，用蒸馏水洗涤，37℃干燥后，将微孔芯片盘移至生物芯片全自动扫描判读仪内进行结果读取或通过肉眼观察。

在芯片的特定位置按预先设定的模式均出现了清晰的杂交显色点，说明该检测芯片可以很好的实现4种病原微生物的检测，无交叉反应出现，具有很好的特异性。

芯片的重复性稳定对于检测反应结果的一致性至关重要，这里的重复性包括多次测定的重复性以及不同批次制备芯片对同一样品的重复性。为检验该芯片的重复性，我们取两个不同批次制备的检测芯片，以大肠杆菌O157:H7为例，对其进行了连续四次的测定。

连续四次测定结果并无显着差异，均可成功检测到大肠杆菌O157:H7，同时，不同批次制备的芯片其重现性良好，可见该芯片具有良好的重复性。

为测试芯片检测的灵敏性，我们以霍乱弧菌为例，将其PCR产物梯度稀释后(浓度范围从50fM-10000fM)与芯片进行杂交反应。结果表明，在裸眼观察条件下，100fM以上浓度均可清晰呈现。

为了测试制备芯片的货架期(保存期)，我们将制备的芯片在4℃密封保存1个月后再进行测试，以霍乱弧菌为例。

芯片在低温保存1个月后，仍能有效检出。虽然我们没有测试该芯片的最终保存期限，但1个月的保存期对于常规检测已经足够，而且，检测芯片的制备过程很容易进行。

该芯片具有良好的检测特异性及重复性，在裸眼观察条件下，检测限可达100fM。该检测芯片具有良好的保存稳定性，在4℃保存1 个月后，仍可有效检出靶标微生物。更为重要的是，该检测芯片检测结果可视化，更适合基层推广及现场检测应用。

Claims

1.一种四种腹泻病病原菌纳米可视化基因芯片，其特征在于：是由聚苯乙烯材料制成之三孔芯片，并形成数组模式，芯片上取霍乱弧菌、痢疾杆菌、出血性大肠杆菌O157、空肠弯曲菌之DNA为探针。

2.如权利要求1所述的四种腹泻病病原菌纳米可视化基因芯片，其特征在于：其中，芯片每孔的探针排列皆为4×4的矩阵。