CN104254620A

CN104254620A - 核酸的扩增方法及扩增核酸的检测方法

Info

Publication number: CN104254620A
Application number: CN201380022347.XA
Authority: CN
Inventors: 高桥孝治; 宫本重彦; 直原启明; 佐野创太郎; 友野润
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-04-26
Also published as: JP6219816B2; CN104254620B; EP2843058A4; JPWO2013162026A1; US20150203905A1; JP2018038406A; EP2843058A1; US9783844B2; EP2843058B1; WO2013162026A1

Abstract

本发明提供一种用于进行有效的杂交的核酸的扩增/检测方法及用于这些方法的检测器/试剂盒。在对靶核酸进行扩增时，以两末端具有单链区的双链核酸的形式进行扩增、检测。另外，提供一种使用了这些靶核酸的检测设备/试剂盒。

Description

核酸的扩增方法及扩增核酸的检测方法

技术领域

本发明涉及一种核酸的扩增方法及利用该方法进行了扩增的核酸的检测方法。

背景技术

在分子生物学的研究领域、基因检测等临床应用领域中，对靶核酸序列进行特异性地扩增的方法成为非常重要的技术。作为对利用核酸扩增法得到的扩增产物特异性地进行检测的方法之一有将含有靶序列的核酸片段固定于固相来进行检测的方法。在该方法中，可通过特异性地将靶核酸捕捉于固相，利用清洗等容易地将非特异性的核酸序列除去，提高检测特异性。

此时，作为将靶核酸捕捉于固相的方法，可以举出：利用可形成特异性结合的抗原-抗体的组合、或者配体-受体的组合的方法。例如，在非专利文献1中公开了使用下述引物并进行了扩增的PCR产物的检测法，所述引物是对一个引物的末端进行生物素修饰且对另一个引物进行了荧光物质修饰而成。在该方法中，使PCR产物与由链霉亲和素-琼脂糖构成的固相接触，形成链霉亲和素-生物素复合物，由此使其与固相结合，对所述荧光测定，从而可检测目标扩增产物。

但是，可用于标识的抗原/抗体或配体/受体的组合有限制，因此，实质上难以同时对多个靶核酸进行检测。另外，荧光标识核酸也具有成本昂贵这样的问题。

作为将靶核酸捕捉于固相的另一方法有将由具有与靶核酸互补的序列的寡核苷酸构成的探针固定在固相上，基于靶核酸与探针的杂交，将靶核酸间接地固定于固相的方法。在该方法中，对由形成杂交而引起的信号强度进行检测。这样的核酸分析法可通过改变探针序列一次性对多个靶序列进行分析。

但是，为了使进行了固定的探针与靶核酸在固相上进行杂交，通常需要利用热处理使通过PCR法进行了扩增的双链核酸改性为单链的工序，但不仅加热处理复杂，还存在由再退火引起的杂交效率的降低的问题。另外，单链DNA也存在易于发生球状化，检测灵敏度差这样的问题。在专利文献1中，公开一种在不进行加热处理而通过核酸酶处理来对单链核酸进行扩增的方法，但其也存在操作复杂、发生单链球状化的问题。

在核酸的检测方法中，也有作为操作性优异、迅速、简便的靶核酸的检测方法，即专利文献2中记载的基于色谱的方法。该方法为在单一基因检测装置上基于毛细管作用使含有任意所提取的基因或其片段的液体试样转移而连续地进行如下工序的基因检测方法：从细胞、病毒或细菌中提取基因的工序；对任意提取的基因进行片段化工序；以及检测工序。可判断是否存在目标基因，进而对其种类进行鉴定。其中，在专利文献2中也利用NASBA法对单链核酸进行扩增。单链核酸在使用上的问题如上所述。

为了解决上述的问题，在专利文献3及专利文献4中，在引物区的5’侧具有对基于DNA聚合酶的核酸合成进行抑制非天然型核酸标签、发夹结构或假结结构，由此在PCR反应后在双链核酸的一方任然残留单链区。仅使用特殊的引物来进行PCR反应在下述的方面优异，即，可制作在双链DNA中一条链的末端具有可杂交的单链区的扩增产物。但是，检测中需要荧光标识及利用表面等离波子共振差成像的检测，因此需要昂贵的专用装置，在迅速性、简便性方面存在问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平5-252998号公报

专利文献2：日本特开2006-201062号公报

专利文献3:国际公开第2006/095550号册

专利文献4：日本特开2009-296948号公报

非专利文献

非专利文献1：Analytical biochemistry,193,231-235,(1991)

发明内容

发明要解决的问题

在临床的基因诊断及检测中，由于需要大型且昂贵的检测装置，并需要检测时间，因此，大多要求患者的检测费用及多次的到医院看病而产生的麻烦及负担。因此，从需要在保持检测的准确性的同时减轻患者及检测者的负担这样的理由考虑，需要简便、迅速、特异性高的方法，且成本低且不需要特殊的装置的方法。本发明为鉴于所述问题而完成的，其目的在于解决下述问题：提供一种充分利用杂交法的高特异性，且减少PCR产物的检测工序中所需要的时间和工序，并且不需要特殊的设备，以目视简便且高精度地进行检测的核酸检测方法、及核酸检测设备或试剂盒。进而，目前需要对每个靶核酸制作昂贵的标识标签，在工序和成本方面有改善的余地。

用于解决问题的方法

本发明人等为了解决上述问题进行了潜心研究，结果独自地发现，通过使用引物组，其具有与各自的引物主体部的5’末端连结的在核酸扩增反应中未进行双链化的标签区，以两末端分别具有单链区的双链核酸的形式对靶核酸进行扩增，使该扩增片段与固相结合来对其进行检测，所述固相具有能够与所述单链区的一条链进行杂交的寡核苷酸探针，由此可在不需要特殊的装置的情况下，简便且高精度地对所述DNA扩增片段进行检测，从而完成了本发明。

即，本发明涉及一种核酸的扩增方法，其使用5’末端侧连接有不会通过核酸扩增反应而双链化的标签区的引物来进行核酸扩增反应，从而得到在两末端具有单链区的核酸。

优选标签区经由间隔区与引物连接。

优选间隔区含有核酸衍生物。

优选核酸衍生物为选自L型核酸、3-脱氧-2-羟基-dN、修饰碱基核酸、损伤碱基核酸、磷酸结合部位修饰核酸、RNA、2’-OMe-N及它们的衍生物中的至少1种以上。

优选L型核酸选自L型DNA、L型RNA及它们的衍生物中的至少1种以上。

优选3-脱氧-2-羟基-dN通过2’-5’结合与引物连接。

优选修饰碱基核酸含有发色团或生物素。

优选发色团选自芘、亚乙烯基、吡咯并、苝、荧光素、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA、DABCYL、花青苷及它们的衍生物中的至少1种以上。

优选损伤碱基核酸选自脱碱基核苷酸、5-羟甲基-dN及它们的衍生物中的至少1种以上。

优选修饰磷酸结合部位核酸含有硫代磷酸酯或其衍生物。

优选核酸衍生物通过5’-5’结合与引物连接，且通过3’-3’结合与标签区连接。

优选间隔区含有非核酸衍生物。

优选非核酸衍生物具有D-苏氨醇骨架。

优选在D-苏氨醇骨架上导入有选自偶氮苯、生物素、EDTA及发色团中的至少1种以上。

优选非核酸衍生物选自碳链(C_n)、聚乙二醇链((CH₂CH₂O)_n)、含有二硫醚的链(C_nSSC_n)及二硫醇亚磷酰胺中的至少1种以上。

优选间隔区为多种及/或多个。

另外，本发明涉及一种核酸的检测方法，其中，对上述的核酸的扩增方法中所得到的两末端具有单链区的核酸进行检测。

优选包括将含有与一个单链区互补的序列的第一寡核苷酸探针固定于固相的工序及使所述第一寡核苷酸探针与两末端具有单链区的核酸进行杂交的工序。

优选进一步包括使含有与另一个单链区互补的序列的第二寡核苷酸探针与标记物质结合的工序及使所述第二寡核苷酸探针与两末端具有单链区的核酸进行杂交的工序。

优选还包括目视辨别核酸的工序。

优选标记物质为着色载体。

优选在核酸检测设备上对两末端具有单链区的核酸进行检测。

优选核酸检测设备为阵列检测器或色谱检测器。

发明效果

根据本发明，由于标签区不会通过核酸扩增反应而双链化，因此可以得到两末端具有单链区且利用杂交进行高效率检测的核酸。

进而，根据本发明，可以利用核酸扩增产物的单链区使核酸扩增产物特异性地与固相结合，进而可以利用另一条单链区与标识化合物形成复合物，在不使用特殊装置的情况下，可简便、迅速地目视判定核酸扩增产物。进而，与全长单链的检测相比，通过对结构上稳定的双链核酸进行检测，可提高检测灵敏度。另外，通过准备多种为了与固相结合的扩增产物的单链区、以及与其互补的固相上的寡核苷酸探针的组合，也可以同时辨别试样中存在的2种以上的靶核酸。进而，可通过廉价的联合引物对所有的靶核酸附加同一单链区。可利用其同一单链区，使用同一标签标识及设备来进行检测。该情况下，不需要对每个靶核酸制作成昂贵的标签标识，可大幅地改善工序和成本。

附图说明

图1是本发明的PCR用引物的示意图；

图2是本发明的PCR用第一引物的示意图；

图3是本发明的PCR用第二引物的示意图；

图4是本发明中部分双链核酸合成法的示意图；

图5是本发明中部分双链核酸合成法的另一实施方式的示意图；

图6是示出本发明的核酸色谱设备的一个例子的简图；

图7是本发明中的PCR产物检测原理的示意图；

图8是示出本发明的微阵列(DNA晶片)的一个例子的简图；

图9是示出本发明的珠载体的一个例子的简图；

图10是参考例的改性PAGE的结果的一个例子；

图11是利用实施例1的核酸色谱条对PCR扩增产物进行检测的结果的一个例子；

图12是利用实施例13的色谱条对PCR扩增产物进行检测的结果；

图13是实施例14中使用的靶1的示意图；

图14是实施例14中使用的靶2的示意图。

具体实施方式

本发明涉及一种核酸的扩增方法，其使用5’末端连接有不会通过核酸扩增反应而双链化的标签区的引物来进行核酸增幅反应，从而得到在两末端具有单链区的核酸。作为核酸，例如可以举出：DNA、RNA。核酸扩增产物的两末端的单链区优选含有天然的核苷酸。进而，本发明涉及一种核酸的检测方法，其包括对所述的核酸的扩增方法中所得到的两末端具有单链区的核酸进行检测的工序。

在两末端具有单链区的核酸可通过对模板试样DNA使用特定的引物组来进行核酸扩增反应而得到。在两末端具有单链区的核酸优选为双链DNA扩增片段且在两末端具有单链区。

试样DNA没有特别限定，只要可以用作核酸扩增反应的模板即可。具体而言，可以使用血液、体液、组织、口腔内粘膜、毛发、指甲、培养细胞、动物、植物、微生物等源自所有生物试样的DNA。另外，上述试样DNA可以为基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、及叶绿体DNA等。另外，也可以使用以RNA为模板进行逆转录反应后得到的cDNA。这些DNA只要根据进行了扩增的DNA片段适时进行选择即可。另外，试样DNA不需要进行了精制的DNA，在核酸扩增反应中可以直接应用含有试样DNA的细胞及组织而不用进行精制处理。

在两末端具有单链区的双链DNA扩增片段优选为在核酸扩增反应中使用2个以上具有未双链化的标签区的引物并利用核酸扩增法而得到的产物。此时，双链DNA扩增片段的两末端的单链区为来自用于核酸扩增反应的引物中不会通过核酸扩增反应而双链化的标签区的区。

图1示出核酸扩增用引物。该引物由引物主体区1及在上述引物主体部的5’侧且不会通过核酸扩增反应而双链化的标签区2构成。另外，在引物主体区与标签区之间，可以具有间隔区作为聚合酶反应抑制区3。

另外，双链DNA扩增片段优选为使用第一引物组以及第二引物组并利用核酸扩增法而得到的产物，所述第一引物组含有具有能够与靶核酸模板进行杂交的序列、以及不能够与该模板进行杂交的共有序列的引物，所述第二引物组含有具有可与上述共有序列的互补序列进行杂交的序列、以及在核酸扩增反应中未双链化的标签区的引物。图2示出构成PCR用第一引物组的引物。PCR用第一引物(联合引物)的特征在于包含能够与靶核酸模板进行杂交的引物主体区4、以及在上述引物主体区的5’侧与第二引物共有的序列构成的共有区5。图3示出构成PCR用第二引物组的引物。第二引物的特征在于包含具有与上述第一引物共有的序列的引物主体区6、以及在主体区6的5’侧不会通过核酸扩增反应而双链化的标签区7。在第二引物主体区和标签区之间可以具有间隔区作为聚合酶反应抑制区8。

所谓引物主体区，是指具有能够作为在核酸扩增反应中的引物而发挥作用的碱基序列的寡核苷酸区。具体而言，为靶核酸的靶碱基序列中可与5’末端侧或3’末端侧进行杂交的序列，通常为与靶碱基序列的5’末端侧或3’末端侧的碱基序列互补的碱基序列。这些引物主体区若可与靶核酸特异性地结合，则可以具有碱基缺损、插入及错配部位。引物主体区的长度优选为8碱基以上，更优选为12碱基以上，进一步优选为15碱基以上。另外，引物的链长没有特别限定，但从其合成的成本等观点考虑，通常优选为50碱基以下或者40碱基以下。

引物的标签区优选含有天然的核苷酸。所谓天然的核苷酸为由天然的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的碱基、脱氧核糖、核糖的糖部及磷酸基构成的核苷酸，各部分为未接受人工修饰的核苷酸。天然的核苷酸可以为D型核苷酸，也可以为L型核苷酸。所谓D型核苷酸，是指由D型的脱氧核糖或者核糖构成的核苷酸。另外，所谓L型核苷酸，是指由L型的脱氧核糖或者核糖构成的核苷酸。标签区含有天然的核苷酸，由此达到合成廉价且容易这样的效果。另外，引物的标签区中天然核苷酸的比例优选为5％以上，更优选为20％以上，进一步优选为50％以上，更进一步优选为70％以上，最优选为90％以上。标签区的长度没有特别限定，为了与互补链核酸进行杂交，只要具有充分的长度即可。通常为5碱基～60碱基，优选为6碱基～40碱基。

引物的标签区的核酸的方向优选沿与引物主体区同一方向进行排列。通过引物的标签区的核酸方向沿与引物主体区同一方向排列，起到合成廉价且容易这样的效果。例如，在偶氮苯这样的非天然的化合物进入标签区与引物主体区之间的情况下，即使标签区和引物主体区未直接连接也优选沿同一方向排列。在此，所谓核酸为同一方向是指相邻的核苷酸彼此不是核苷酸中糖的3’位或5’位，而是5’位和3’位之间形成的磷酸二酯结合。例如，在标签区中，在核苷酸彼此通过磷酸二酯键在糖的5’位和3’位之间进行结合的情况下，在主体区中，也指核苷酸彼此在糖的5’位和3’位之间形成磷酸二酯键。

就间隔区而言，含有通过聚合酶来对伸长反应进行抑制的间隔区，可以抑制在核酸的扩增反应的过程中对聚合酶引起的伸长反应进行抑制从而保持标签区为单链结构。间隔区的结构只要能够对聚合酶引起的伸长反应进行抑制就没有特别限定，但优选含有核酸衍生物或非核酸衍生物。

核酸衍生物只要可对聚合酶引起的伸长反应进行抑制且将保持标签区为单链结构就没有特别限定。作为核酸衍生物，可以举出：5’-5’结合及3’-3’结合这样的倒位序列结构的核酸、如牢固的发夹结构及假结结构这样的具有对聚合酶的作用进行抑制的立体结构的核酸、L型核酸、3-脱氧-2-羟基-dN、修饰碱基核酸、损伤碱基核酸、磷酸结合部位修饰核酸、RNA、2’-OMe-N、BNA(LNA)及它们的衍生物。

如化学式(1)所示，所谓5’-5’结合或者3’-3’结合为构成DNA的脱氧核糖的5’位与相邻的脱氧核糖的5’位之间夹着磷酸基而进行结合的结构、或者3’位与相邻的脱氧核糖的3’位之间夹着磷酸基而进行结合的结构。与通常所谓的5’位与3’位的结合的方向相反，因此称为倒位序列结构。作为具体的例子，可以举出具有2次倒位结构的结构，使得引物主体区的5’区与间隔区进行5’-5’结合而连结、且上述标签区的3’末端与间隔区进行3’-3’结合而连结。另外，倒位结构的次数只要至少包括1次即可，没有特别限定，但优选包括偶数次。若具有偶数次的倒位结构，则与通常的引物相同标签区的末端为5’位，因此，可以对从标签区开始进行的非特异性伸长反应进行抑制，且在检测时有效。另外，间隔区优选设为5～60碱基而不是如化学式(1)所示的1个碱基，由此还可以兼具间隔区以及标签两者的作用。

[化学式1]

“发夹结构”及“假结结构”是指与同一分子内的其它的单链区发生对合而形成的稳定的环结构。

如化学式(2)或者化学式(3)所示，L型核酸为构成核酸的糖即脱氧核糖或者核糖，而所谓天然型的D型核酸是指具有光学异构体的结构的L型DNA、L型RNA及它们的衍生物。L型核酸无法被通常所使用的DNA聚合酶识别，因此不能发挥伸长反应的作用。L型DNA形成左旋的双螺旋结构，因此，仅在L型核酸彼此形成杂交而不会与天然存在的D型核酸形成杂交。

[化学式2]

[化学式3]

如化学式(4)所示的3-脱氧-2-羟基-dA，3-脱氧-2-羟基-dN在2’位及相邻的脱氧核糖5’位之间通过2’-5结合发生结合而在脱氧核糖的3’位不具有羟基。因此，无法被DNA聚合酶识别，因此不发挥伸长反应的模板作用。在本发明中，优选3-脱氧-2-羟基-dN通过2’-5’结合与引物发生连结。

[化学式4]

修饰碱基核酸为DNA的碱基部位具有生物素(生物素)及发色团等修饰的核酸。作为发色团，可以举出：芘、亚乙烯基、吡咯并、苝、荧光素、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA、DABCYL(ダブシル)、花青苷等，但不限定于这些。作为修饰碱基核酸的例子，可以举出：化学式(5)所示的氨基C6-dA、化学式(6)所示的2-硫代-dT、化学式(7)所示的4-硫代-dT、化学式(8)所示的生物素-dT、化学式(9)所示的羧基-dT、化学式(10)所示的芘-dU、化学式(11)所示的苝-dU、化学式(12)所示的吡咯并-dC、化学式(13)所示的亚乙烯基-dA、化学式(14)所示的FITC-dT、化学式(15)所示的TAMRA-dT、化学式(16)所示的丹磺酰-dT、BHQ-1-dT、Cy3-dT、Cy5-dT等，但不限定于这些。这些碱基部的修饰成为立体的阻碍，从而无法被DNA聚合酶识别，因此不发挥伸长反应的模板作用。

[化学式5]

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

[化学式11]

[化学式12]

[化学式13]

[化学式14]

[化学式15]

[化学式16]

损伤碱基核酸为脱碱基核苷酸(AP位点：脱嘌呤碱基、脱嘧啶碱基)、化学式(17)所示的无碱基间隔基(dSpacer)、化学式(18)所示的一个碱基(Abasic)及5-羟甲基-dN等具有脱碱基或进行了修饰的碱基的核酸。这些无法被通常使用的DNA聚合酶识别，因此不发挥伸长反应的模板起作用。

[化学式17]

[化学式18]

如化学式(19)所示的硫代磷酸酯(S寡)，磷酸结合部位修饰核酸为以其它的原子或分子对核酸的一部分磷酸基进行取代而成的核酸，无法被DNA聚合酶识别，因此不发挥伸长反应的模板作用。

[化学式19]

如化学式(20)所示，构成核酸的糖由核糖构成，RNA无法被通常所使用的DNA聚合酶识别，因此不发挥伸长反应的模板作用。

[化学式20]

如化学式(21)所示的2’-OMe-G，构成核酸的糖部被修饰，2’-OMe-N无法被DNA聚合酶识别，因此不发挥伸长反应的模板的作用。

[化学式21]

进而，作为对聚合酶引起的伸长反应进行抑制的非核酸衍生物，可以举出：D-苏氨醇(threoninol)骨架、PC间隔区(spacer)、碳链(C_n)等脂肪链、聚乙二醇链(peg链)(CH₂CH₂O)_n、含二硫醚的链(C_nSSC_n)、PNA及这些物质的衍生物，但只要可对聚合酶引起的伸长反应进行抑制且保持该区为单链结构就没有特别限定。这些非核酸分子具有与核酸不同的结构，因此无法被DNA聚合酶识别，不发挥伸长反应的模板作用。

如化学式(22)所示，D-苏氨醇(threoninol)(苏氨醇)骨架具有利用苏氨醇将核酸彼此结合的结构，可在苏氨醇的氨基中插入各种分子。只要可通过氨基而结合的物质就没有特别限定，例如除芘、亚乙烯基、吡咯并、苝、荧光素、FITC、TET、HEX、JOE、Cy3、Cy5、DABCYL(ダブシル)、花青苷、BHQ等发色团、生物素(Biotin)、EDTA以外，可以插入化学式(23)所示的偶氮苯。

[化学式22]

[化学式23]

如C_n所示，脂肪链表示碳链连接而成的结构及其衍生物。在此，n数没有特别限定，优选为1～45，更优选为2～18。例如可以举出：化学式(24)所示的C3连接物及C6连接物、化学式(25)所示的C12连接物。另外，作为衍生物，也可以举出化学式(26)所示的PC间隔区(PCspacer)这样的结构。

[化学式24]

[化学式25]

[化学式26]

聚乙二醇链表示(CH₂CH₂O)_n所示的聚乙二醇连接而成的结构及其衍生物。在此，n数没有特别限定，但优选为1～21，更优选为1～9。例如可以举出：化学式(27)所示的间隔区9(Spacer9)(二缩三乙二醇间隔区)及化学式(28)所示的间隔区18(Spacer18)(五缩六乙二醇间隔区)。

[化学式27]

[化学式28]

含二硫的链表示具有C_nSSC_n所示的二硫键的结构。在此，n数没有特别限定，但优选为1～20，更优选为1～12。例如可以举出化学式(29)所示的碳原子数为3的物质。另外，只要具有二硫键就可以在两侧获得脂肪链及聚乙二醇链等结构。另外，作为含二硫的链，也可以举出如化学式(30)所示的二硫醇亚磷酰胺(ジチオールフォスフォロアミダイト)等。

[化学式29]

[化学式30]

所谓PNA是指在主链保持肽结构且具有与DNA及RNA相似结构的分子，并且N-(2-氨基乙基)甘氨酸以酰胺键结合而成的物质成为主链。而且，相当于核酸碱基的嘌呤环及嘧啶环通过亚甲基以及羰基与主链结合。

如化学式(31)所示，所谓BNA(LNA)表示通过对DNA或RNA的糖部结构进行交联修饰而人工合成的核酸。

[化学式31]

在标签区仅由天然的核苷酸构成且标签区的核酸的方向与引物主体区为相同方向的情况下，通常在标签区与引物区之间需要对聚合酶反应进行抑制的间隔区。另一方面，在标签区含有L型核酸、PNA、BNA等且不会成为通过DNA聚合酶引起的反应的模板从而在核酸扩增反应后也不会双链化的情况下，也可省略对聚合酶反应进行抑制的间隔区。另外，本发明的引物可以单独具有下述结构或物质，也可以组合具有多个下述结构及物质：倒位结构、发夹结构、假结结构等稳定的环结构；L型核酸、3-脱氧-2-羟基-dN、修饰碱基核酸、损伤碱基核酸、磷酸结合部位修饰核酸、RNA、2’-OMe-N、BNA(LNA)等核酸衍生物及碳链、聚乙二醇链、含二硫的链、PNA等非核酸衍生物等。

引物也可以利用寡核苷酸的标识中通常所使用的各种分子标识。作为这样的分子，可以举出：酶、磁性粒子、荧光色素、放射性同位素等。可以单独使用上述物质，也可以组合使用多个。

制造设计的引物的方法没有特别限定，可以利用公知的方法制造。具体而言，可以通过使用DNA合成装置或利用委托合成服务而容易地得到设计的引物。

核酸扩增法只要为使用上述的引物而得到在两末端具有单链区的核酸的方法就没有特别限定。例如可以举出PCR。另外也可以使用LAMP法、ICAN法等等温扩增法。

在使用PCR作为核酸扩增法，对标签区和引物通过间隔区进行连结的情况下，作为用于PCR的反向引物和正向引物的组合，可以在两个的引物中使用不同的间隔区，也可以在一个引物中使用间隔区，在另一个引物中对引物的5’末端进行生物素等修饰而不导入间隔区。

PCR条件没有特别限定，在以上述的试样DNA为模板使用上述引物组进行PCR时，只要为可对所期望的试样DNA区域进行扩增的条件即可。用于PCR的聚合酶没有特别限定，但优选为耐热性DNA聚合酶，更优选为实质上不具有3’→5’核酸外切酶活性的耐热性DNA聚合酶。作为这样的耐热性DNA聚合酶，可以举出：Ex-Taq(Takara bio公司制)、KOD Plus(东洋纺公司制)、Phusion、PrimeSTAR、KOD FX、Tks Gflex等，但不限定于此。另外，温度、时间、缓冲液组成等PCR的反应条件也没有特别限定，只要根据选择的DNA聚合酶、引物的序列、目标序列部分的长度等适宜设定即可。利用核酸扩增反应所进行扩增的DNA的长度优选为20碱基以上，更优选为40碱基以上。若低于20碱基，则难以设计具有充分的特异性的引物，从而存在非特异的扩增增加的倾向。

通过使用上述引物组利用常规方法进行PCR，可以得到在靶核酸序列的两末端附加了单链区的扩增产物。作为扩增反应的一个例子在图4中示出使用了包含引物主体区和标签区的引物时的扩增反应的示意图。正向引物10具有引物主体区11及在引物主体区11的5’末端侧的标签区12，所述引物主体区11包含与靶核酸序列9的5’末端侧的部分序列相同的序列。反向引物13具有引物主体区14和在引物主体区14的5’末端侧的标签区15，所述引物主体区14包含与靶核酸序列的3’末端侧的部分序列互补的序列。与两个引物结合的标签区的序列优选分别具有不同的序列。若使用上述引物组进行PCR，则附加于两引物的标签区实质上不参与PCR反应，因此得到在两末端具有单链区的DNA扩增产物16。如图4所示，所谓两末端具有单链区的DNA扩增片段是指：具有与靶DNA区相同的双链DNA部、以及在双链DNA的两侧的各自的5’末端具有单链区作为标签部的DNA扩增产物。即，若对上述DNA扩增片段更详细地进行说明，则表示在两末端具有由未经修饰的核酸构成的单链区的双链DNA扩增片段，且两末端的单链区具有与各自连接的DNA链相同方向的序列。

作为扩增反应的一个例子，图5示出使用下述引物来进行扩增反应的示意图：包含引物主体区及共有序列区的引物；以及包含共有序列及标签区引物，来作为联合引物组。通过使用第一及第二引物组利用常规方法进行PCR，可以得到在靶核酸序列的两末端附加了单链区的扩增产物。

正向第一引物18具有引物主体区19及在引物主体区19的5’末端侧的共有序列区20，所述引物主体区19包含与靶核酸序列17的5’末端侧的部分序列相同的序列。反向第一引物21具有引物主体区22及在引物主体区22的5’末端侧的共有序列区23，所述引物主体区22包含与靶核酸序列的3’末端侧的部分序列互补的序列。附加于两引物的共有区的序列优选分别具有不同的序列。若利用上述第一引物组进行PCR反应，则可得到具有共有区的双链DNA扩增产物24。

进而，DNA扩增产物24的两端的共有序列区的正向第二引物25具有引物主体区26及在引物主体区26的5’末端侧的标签区27，所述引物主体区26包含与具有上述共有区的双链DNA扩增产物24的5’末端侧的部分序列共有的序列。反向第二引物28具有引物主体区29及在引物主体区29的5’末端侧的标签区30，所述引物主体区29包含与具有上述共有区的双链DNA扩增产物24的3’末端侧的部分序列即共有序列互补的序列。与两引物结合的标签区的序列优选分别具有不同的序列。若使用上述引物组进行PCR，则两引物中所附加的标签区实质上不参与PCR反应，因此，可得到在两末端具有单链区的DNA扩增产物31。如图5所示，在本实施方式中，连续地进行使用了第一引物的PCR反应及使用了第二引物的PCR反应，但就其顺序而言，可以同时加入第一引物和第二引物，或者可以稍后加入第二引物。

如图5的31所示，所谓在两末端具有单链区的DNA扩增片段，是指在与靶DNA区相同的双链DNA部及其两侧的各自的5’末端具有单链区作为标签部的DNA扩增产物。

通过使用第一及第二引物组，即使变更靶核酸，通过将共有序列设为相同的序列，第二引物可使用相同的引物，从而可制备除出相同的单链标签序列。若对上述DNA扩增片段更详细地进行说明，则表示在两末端具有由未修饰的核酸构成的单链区的双链DNA扩增片段，且两末端的单链区具有与各自连接的DNA链相同方向的序列。

利用使用上述引物所得到的扩增产物的单链区形成杂交复合物。所谓杂交是指含有核酸的分子互补地形成复合物，除DNA/DNA以外，可含有DNA/RNA、DNA/PNA、L-DNA/L-DNA等。在本发明的核酸检测方法中，核酸具有单链区，因此，在核酸扩增工序后可以直接用于杂交反应而不进行热处理等单链化处理等。

可以使固定在捕捉用载体(固相)的第一寡核苷酸探针与两末端具有含有天然核苷酸的单链区标签的双链DNA扩增片段的一条链的单链区进行杂交。进而，优选包含使双链DNA扩增片段的另一条链的单链区与标识物质直接或间接地结合而成的第二寡核苷酸探针进行杂交的工序。将由双链DNA扩增片段、第一寡核苷酸探针、及第二寡核苷酸探针构成的三者形成的复合物称为三明治层状杂交。需要说明的是，三者杂交的顺序没有特别限定。

第一寡核苷酸探针的长度只要可与双链DNA扩增片段的单链区进行杂交就没有特别限定，但优选为5～60碱基长，更优选为10～40碱基长。

第二寡核苷酸探针的长度只要可与双链DNA扩增片段的单链区进行杂交就没有特别限定，但优选为5～60碱基长，更优选为10～40碱基长。

与第二寡核苷酸探针结合的标识物质只要为实现对双链DNA扩增片段进行检测的物质就没有特别限定，但优选着色载体即可实现对双链DNA扩增片段进行目视检测的物质。作为这样的着色载体，可以举出：着色粒子及酶、色素结合载体等。其中，优选使用着色粒子。

作为着色粒子，可以举出：由金、银、铜、铂等金属构成的胶体粒子、以颜料或染料等对胶乳进行着色而成的着色胶乳、将色素分子固定于二氧化硅(二氧化硅)粒子内部而成的二氧化硅纳米粒子等。其中，优选使用金胶体粒子、着色为蓝色或红色等的由水分散型高分子聚合物构成的着色胶乳粒子。通过使用上述着色粒子，可以成为更容易进行DNA扩增片段的目视判定的物质。特别是在同时对多项目进行检测时，通个对每个项目使用不同颜色的着色粒子，从而易于同时目视判定多个项目。

在使用着色粒子的情况下，其粒径没有特别限定，但优选对三明治层状杂交复合物的形成及将含有靶序列的扩增产物捕捉在固相中的不良影响较小且在检测时发色好的物质。着色粒子的粒径选自小于后述色谱用介质的孔径的粒径。具体而言，通常使用500nm以下，其中，优选设为0.1nm～100nm，更优选设为1nm～50nm。所谓用作着色载体的酶，为对发色或者发光的基质的反应进行催化的蛋白质。例如可以举出：过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶等，但只要可通过肉眼进行检测就不限定于此。

双链DNA扩增片段的末端的单链区与第一或第二寡核苷酸探针进行杂交的条件只要为发生杂交的条件就没有特别限定，但优选使其在室温下于10mM磷酸缓冲液中进行反应。此时，通过放入氯化钠等盐使杂交的效率上升。

通过对捕捉用载体(固相)上在可识别的位置所形成的三明治层状杂交复合物中所含的标识物质进行检测，可以判定有无靶核酸。检测优选通过目视进行辨别。另外，检测优选在可见光下进行。所谓可见光，特别是指波长为380～800nm的光。根据本发明的检测法，核酸扩增反应的扩增产物可直接用于杂交反应而不用进行热改性等单链化处理。另外，可通过目视简便、迅速地辨别有无靶核酸而不需要特殊的装置。

利用上述的三明治层状杂交复合物的形成进行核酸检测方法优选在核酸检测设备上进行。另外，作为核酸检测设备，没有特别限定，但优选担载有捕捉用寡核苷酸探针的设备，所述捕捉用寡核苷酸探针具有在双链DNA扩增片段的末端具有的与单链标签区的至少一部分互补的序列。例如可以举出：色谱、阵列、珠等，但并不限定于此。

图6的核酸色谱设备为使用粘结剂等在基材的部件36上对下述垫进行贴合而成：样品垫32(用于添加DNA扩增产物的载体)、结合垫33(配置有着色载体结合寡核苷酸的载体)、保持有捕捉用寡核苷酸的载体34(色谱用介质)及吸收垫35。在载体34上设有涂布有捕捉用寡核苷酸的测试线37及对照线38。在将着色载体结合寡核苷酸混入展开溶液的情况下，可以没有结合垫33。

在色谱中，优选利用包括下述工序(a)～(c)的方法对双链DNA扩增片段进行检测：(a)在核酸检测设备上的与固定有第一寡核苷酸探针的区域不同的区域，对DNA扩增片段进行配置的工序；(b)使用溶剂使DNA扩增片段沿固定有第一寡核苷酸探针的区域的方向在设备上进行扩散的工序；及(c)在固定有第一寡核苷酸探针的区域中，使第一寡核苷酸探针与DNA扩增片段进行杂交的工序。

例如，在图6的核酸色谱设备的情况下，在工序(a)中，向样品垫32对DNA扩增片段进行配置。在工序(b)中使DNA扩增片段沿箭头方向进行扩散。在工序(c)中，在测试线37中，利用与固定了的第一寡核苷酸探针进行的杂交来捕捉DNA扩增片段。

在工序(c)之前，优选还包括使DNA扩增片段与结合有标识物质的第二寡核苷酸探针进行杂交的工序。例如，在图6的核酸色谱设备的情况下，在结合垫33中，使DNA扩增片段与第二寡核苷酸探针进行杂交。

另外，在色谱中，优选(d)分别在与核酸检测设备上的固定有第一寡核苷酸探针的区分别不同的区域对DNA扩增片段、及结合有标识物质的第二寡核苷酸探针分别进行配置；(e)使用溶剂使DNA扩增片段沿配置有结合了标识物质的第二寡核苷酸探针的区域的方向进行扩散；(f)在配置有结合了标识物质的第二寡核苷酸探针的区中，使DNA扩增片段与结合有标识物质的第二寡核苷酸探针进行杂交；(g)使工序(f)中杂交而成的复合物沿配置有第一寡核苷酸探针的方向在展开介质上进行扩散；(h)在固定有上述第一寡核苷酸探针的区域中，使上述第一寡核苷酸探针与上述复合物进行杂交。

例如，在图6的核酸色谱设备的情况下，在工序(d)中，将DNA扩增片段配置于样品垫32，将第二寡核苷酸探针配置于结合垫33。在工序(e)中，使DNA扩增片段由样品垫32沿箭头方向进行扩散。在工序(f)中，在结合垫33中，使DNA扩增片段与第二寡核苷酸探针进行杂交。在工序(g)中，使DNA扩增片段与结合有标识物质的第二寡核苷酸探针进行杂交而成复合物沿箭头方向扩散。在工序(h)中，在测试线37，使第一寡核苷酸探针与复合物进行杂交。

将具有与上述DNA扩增片段的一条链的标签区互补的序列的寡核苷酸探针作为捕捉用的第一寡核苷酸探针而固定于膜上的测试线上。捕捉用的第一寡核苷酸探针可以直接与膜结合，也可以通过官能团进行结合，还可以经由任意物质与膜结合。作为其中介的物质可以举出肽、蛋白质、核酸等，但没有限定。在中介物质为抗生物素蛋白的情况下，需要对捕捉用寡核苷酸进行生物素修饰。

在膜上的对照线固定有着色载体捕捉用的寡核苷酸探针。对照线用的寡核苷酸探针具有与结合有标识物质的第二寡核苷酸探针互补的序列，若溶液展开，则一定会捕捉标识物质。关于对照线用的寡核苷酸探针，也与上述相同，可以直接与膜结合，也可以通过官能团结合，还可以通过任意物质与膜结合。其中介物质可以举出肽、蛋白质、核酸等，但没有限定。在中介物质为抗生物素蛋白的情况下，需要对捕捉用寡核苷酸进行生物素修饰。

可利用测试线中的呈色以目视辨别试样中的目标核酸的存在。另一方面，可利用对照线中的呈色以目视辨别可进行正常的展开及呈色反应。在此，所谓目视是指以肉眼观察并判断颜色。另外，辨别优选在可见光下进行。所谓可见光，特别是指波长为380～800nm的光。

作为色谱用介质，可以举出包含定性滤纸、定量滤纸、分液滤纸、玻璃纤维滤纸、二氧化硅纤维滤纸、复合纤维滤的滤纸等。另外，也可以使用由硝基纤维素等纤维素构成的滤纸、及聚醚砜膜等合成树脂的膜、硅胶、琼脂糖、葡聚糖、明胶等多孔凝胶。另外，也可适当使用尼龙膜。在实际的使用时，该色谱介质的形态及大小没有特别限制，只要在操作及反应结果的观察中适当即可。

为了提高这些载体的亲水性及化合物的结合性，也可实施各种修饰。为了更简便地进行操作，优选在表面形成有反应部位的色谱介质的背面设置由塑料等构成的支承体。

如图6所示，作为设备内的展开方向可以为水平方向，也可以为垂直方向，没有特别限定。作为展开溶剂，可以使用核酸扩增反应中的溶剂，因此，可以将核酸扩增反应后的反应液直接滴加到图6中的样品垫32中。或也可以在扩增反应后的反应液中另行添加展开溶液添加到样品垫。作为展开溶剂，只要为液体就没有特别限定，可使用磷酸缓冲液及Tris缓冲液等优良缓冲液。另外，可以将盐、表面活性剂、蛋白质或者核酸溶解在溶剂中。

在图7中，作为本发明的实施方式的一个例子，以色谱载体上的三明治层状杂交复合物的形成为例进行说明。直接将核酸扩增工序中所得到的DNA扩增片段16用于之后的复合物形成工序而不对其进行热处理等单链化处理等。可通过含有能够与上述DNA片段的一条链的标签区12特异性地结合的核酸序列39及着色载体40的寡核苷酸探针与DNA扩增片段16之间进行杂交从而形成第一复合物41。复合物41可以在应用于展开介质前，例如，在PCR的反应容器中形成；也可以将DNA扩增片段应用在载体上，在通过毛细管现象而发生的移动过程中，使DNA扩增片段通过对上述标识分子结合寡核苷酸进行了涂布并干燥的载体而形成。

在展开介质上，复合物41与在由多孔膜等构成的色谱用介质42上可识别的位置上预先结合了的捕捉用寡核苷酸探针43接触。上述捕捉用的寡核苷酸43具有与上述DNA扩增片段的另一条链的标签序列15互补的序列，可通过复合物41与捕捉用寡核苷酸进行杂交而形成三明治层状杂交复合物。

形成三明治层状杂交复合物的顺序没有特别限定。优选在DNA扩增片段与结合有标识物质的第二寡核苷酸探针形成复合物41后，形成与捕捉用的第一寡核苷酸探针的复合物，但也可以在展开介质上利用捕捉用的第一寡核苷酸探针对DNA扩增片段进行浓缩后，对结合有标识物质的第二寡核苷酸进行展开，从而形成三明治层状杂交复合物。

作为其它的核酸检测设备的形态，可以举出阵列。作为阵列，可以举出如图8所示的微阵列(DNA晶片)。在微阵列44上的固定有捕捉用寡核苷酸的孔内，可以通过三明治层状杂交而形成三者的复合物。

另外，可以举出如图9所示的珠形态。可以在保持有捕捉用寡核苷酸的珠载体45上，基于利用三明治层状杂交而形成三者的复合物。

上述核酸检测方法及核酸检测设备可以用于包含对通过核酸扩增法得到的核酸(例如PCR产物)进行检测事项的所有领域的技术。具体而言，例如可以用于分子生物学的研究领域、病原体的检测、变应原等食品中的混入物的检测、食品的品质管理(假冒标示食品、转基因食品等的检测)、家畜管理、基因突变(单碱基多型(以下也称为“SNP”)、插入、缺失)的检测、染色体缺失变异的检测、癌等疾病检测等。因此，本发明也包括含有本发明的核酸检测方法作为一个工序的病原体引起的感染症的检测方法、食品中的混合物(例如变应原)的检测方法、食品的品质管理、家畜的管理方法及碱基多型的检测方法等。

在此，作为本发明的利用的一个实施方式，对本发明的病原体的检测方法、及变应原的检测方法详细地进行说明。

病原体的检测方法只要包括使用本发明的核酸检测方法对病原体具有的特异性基因进行检测的工序即可。上述病原体没有特别限定，具体而言，例如可以举出：病原性细菌、病原性病毒、食物中毒细菌、医院内感染的细菌及病毒等。更具体而言，例如可以例示：C型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、胞疹病毒(Herpesviridae)、人免疫缺陷病毒(HIV)等病毒、O157等大肠杆菌、结核菌、伤寒沙门菌、伤寒沙门氏杆菌(Salmonella enterica serovar Typhi)或副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、或者支原体等微生物。

对病原体的检测方法进行更具体的说明，例如通过上述核酸检测方法对由需要检测有无病原体的对象的试样进行制备的DNA试样中是否含有上述病原体具有的特异性基因进行判定。另外，也可以直接将需要检测有无病原体的对象的试样直接用作核酸扩增法的模板而不制备DNA试样。例如，在检测作为病原体的大肠杆菌等细菌的情况下，可以将细菌菌落的悬浮液用作模板。其结果，在对病原体具有的特异性基因进行检测的情况下，判定该试样中含有病原体。由此，可以不需要特殊的装置简便且高精度地判定试样中是否含有病原体。即，本发明的病原体的检测方法可以用于微生物感染症的诊断。

变应原的检测方法只要包括使用本发明的核酸检测方法对编码变应原的基因进行检测的工序即可。上述变应原没有特别限定，具体而言，例如可以举出食品中所含的变应原。更具体而言，可以举出蛋清变应原、乳变应原、小麦变应原、荞麦变应原及花生变应原等。对变应原的检测方法进行更具体的说明，例如使用上述核酸检测方法对由食品制备的DNA试样中是否含有编码蛋、乳、小麦、荞麦、花生等的变应原的基因进行判定。其结果，在对上述基因进行检测的情况下，判定该食品中包括含有变应原的原料。

由此，可以不需要特殊的装置简便且高精度地判定食品等试样中是否包括含有变应原的原料。需要说明的是，变应原的来源并不限定于上述例示的物质，例如，取谷类为例，包括水稻、玉米、小米、黍、稗子、荞麦及豆类的全部。DNA对热稳定，即使在加工食品中也进行可检测出微量，因此，利用上述变应原的检测方法所得到的数据除利用于食品的表示或用作食品的过敏信息以外，还可以用于检测加工助剂及贮存供下季供应等食品添加物的极微量的残留、或者有无生产线间的相互污染等生产者无意图混入的物质。

此外，本发明的核酸的检测方法可以用于包括人的哺乳动物的亲子鉴定、家畜血统的确定、农产品的品种确定、SNP检测、基因的变异引起的疾病(癌等)的检测等。具体而言，例如对于家畜而言，可以利用于血统注册、个体识别、亲子判定、病原基因的载体个体的除去等目的。需要说明的是，本发明并不限定于以上给出的各结构，可在请求保护的范围所示的范围中进行各种变更，本发明的技术范围中也包括对不同的实施方式中分别公开的技术方案进行适宜组合而得到的实施方式。

实施例

下面，利用实施例对本发明进一步进行详细的说明。但是，本发明的技术范围并不限定于这些实施例。

参考例

各种间隔区的伸长反应抑制效果的确认

(1)各种引物的合成

在本参考例中，设计了正向引物F及反向引物R，使得使用pUC19(Takarabio公司制)作为模板，通过PCR扩增而扩增约330碱基对。

进而，设计了带标签的引物Ta-S1-F～Ta-S31-F：在引物F的5’末端侧导入了标签序列(Ta)及任意的31种间隔区(Sx)。

作为不含间隔区的正向引物，设计了在5’末端侧仅附加标签序列(Ta)的引物Ta-F、对5’末端侧进行了生物素修饰的引物mTa-F、对3’末端侧进行了FITC修饰的引物Ta-Fm。将进行了设计的正向引物示于表1。

[表1]

表1的S1～S31的间隔区的结构分别对应于上述化学式(1)～(31)。这些带标签的引物的合成利用TSUKUBA OLIGO SERVICE株式会社的委托合成系统、或者EUROGENTEC公司的委托合成系统而购入。

正向引物F：5’-^Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号1)

反向引物R：5’-^Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号2)

标签序列Ta：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列号3)

引物Ta-Sx-F：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG SxGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号4)

引物Ta-F：

5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAGGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号5)

引物mTa-F：5’-生物素-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAGGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号6)

引物Ta-Fm：

5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAGGGAAACAGCTATGACCATGA)-FITC-3’(序列号7)

(2)使用了各种引物组的PCR反应

使用上述工序(1)中制成的引物进行了PCR反应。将20pmol的正向引物Ta-S1-F～Ta-S31-F、Ta-F、mTa-F、Ta-Fm的任一种、20pmol的反向引物R、以及10pg的pUC19放入0.2ml的PCR用管中，根据ExTaq PCR试剂盒(Takarabio公司制)的说明书制备了100μl的PCR反应液。然后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司制)，在95℃下进行热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环35次，扩增作为目标的约330bp的核酸。

(3)琼脂糖凝胶电泳

使用1×TAE缓冲剂(Nippongene公司制)和琼脂糖(和光纯药公司制)制作2％琼脂糖凝胶。将凝胶放入电泳槽，用1×TAE缓冲剂充满电泳槽后，将上述工序(2)中所得到的PCR反应液5μl和加样缓冲剂1μl混合，应用于凝胶的孔。施加100V的电压进行泳动30分钟后，将凝胶浸渍于溴化乙锭溶液(NacalaiTesque公司制)中，进行染色15分钟。染色后，使用UV照射撮影装置，照射254nm的UV，进行双链DNA的扩增产物的确认。

其结果，可分别确认到一条扩增产物。但，在使用了对3’末端进行了修饰且不含间隔区的正向引物Ta-Fm的反应中无法确认到扩增产物。

(4)改性聚丙烯酰胺凝胶电泳(改性PAGE)

取上述工序(2)中所得到的PCR反应液各7μl于PCR管中，与TBE-尿素样品缓冲液(invitrogen公司制)7μl混合。将其混合液在70℃下进行热处理3分钟。将6％TBE-尿素凝胶(invitrogen公司制)设置在电泳槽中，将TBE缓冲剂(1.08％(w/v)Tris、0.55％(w/v)硼酸、0.037％(w/v)EDTA·2Na(2H₂O))放入泳动槽中。将进行了热处理的扩增产物应用于各孔。

在180V的条件下，进行电泳60分钟后，将凝胶浸渍于溴化乙锭溶液(Nacalai Tesque公司制)中，进行染色15分钟。染色后，使用UV照射撮影装置，照射254nm的UV，对进行了改性而成为单链的扩增产物进行确认。对使用(i)引物Ta-F、(ii)引物Ta-S1-F、(iii)引物Ta-S20-F、(iv)引物Ta-S23-F作为正向引物时的PCR扩增产物进行泳动的结果作为代表例示于图10。

在使用改性PAGE对PCR扩增产物进行电泳的情况下，可在使用不含间隔区的正向引物而得到的PCR扩增产物中确认到一条带。可在使用含有间隔区的正向引物所得到的PCR扩增产物中确认到二条带。

在琼脂糖凝胶电泳和改性PAGE的两者的结果中，就确认到一条带的PCR扩增产物而言，可得到直到末端为止完全为双链的扩增产物。就在琼脂糖凝胶电泳的结果中确认到一条带且在改性PAGE的结果中确认到二条带的PCR产物而言，可确认：不同长度的单链DNA汇合形成双链，间隔区对聚合酶引起的伸长反应进行了抑制，从而得到在末端具有单链标签的双链的扩增产物。

对使用了具有各间隔区的正向引物进行PCR的结果示于表1。

实施例1

使用了附加各种间隔区的引物组的色谱检测

(1)使用了各种引物组的PCR反应

将Tm-S1-R用作反向引物，除此以外，与参考例的工序(1)同样地进行了PCR反应，得到了作为目标的330bp的扩增产物。

标签序列Tm：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列号8)

引物Tm-S1-R：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA S1CTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号9)

(2)金胶体结合寡核苷酸探针的制作

对金胶体(40nm、9.0×10¹⁰(粒子数/ml)、British BioCell International公司制)和含硫醇基的寡核苷酸探针(序列号5、标签Ta序列号3的互补链)进行混合，在50℃下培养16小时。以6000rpm离心分离15分钟，除去上清，添加含有0.05M氯化钠的5mM磷酸(pH7)缓冲剂并进行了混合，然后，再次在50℃下培养40小时。

培养后，进行离心(6000rpm、15分钟)，除去上清，添加5mM磷酸缓冲剂(pH7)。再次进行该缓冲剂置换。将制备的金胶体溶液添加到玻璃纤维制垫上使得其变得均匀，然后，以真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

寡核苷酸探针1：

5’-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-SH-3’(序列号10)

(3)寡核苷酸探针在固相中的固定化

对具有与序列号8互补的序列(序列号11)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针与链霉亲和素进行了混合。在硝基纤维素膜上(商品名：Hi-Flow 180、Millipore公司制)使用涂布器将混合液涂布于一条线上，在40℃下风干30分钟。

寡核苷酸探针2：

5’-Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列号11)

(4)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在底板构成的基材上对下述垫进行贴合从而制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了各种带标签的引物组：基于上述制成的由硝基纤维素膜构成的色谱介质、结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫。

(5)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(1)中制成的PCR产物进行改性，而分别立刻应用于工序(4)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。基于色谱的检测所需的时间为较短时间5～15分钟。

将结果示于表1。在表1中，将在工序(1)中添加了的pUC19作为被分析物进行PCR反应的情况下，在测试条上检测到了靶核酸特异性的着色线，且在添加水作为负对照的情况下，无法确认到检测线着色的引物记载为“○”。将使用(i)引物Ta-F、(ii)引物Ta-S1-F、(iii)引物Ta-S20-F、(iv)引物Ta-S23-F作为正向引物时PCR扩增产物的色谱样测试条的检测结果作为代表例示于图11。

实施例2

使用了各种附加间隔区的引物组的阵列检测

(1)寡核苷酸探针在固相中的固定化

对具有与序列号8互补的序列(序列号11)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针与链霉亲和素进行了混合。将混合液1μl点在硝基纤维素膜(商品名：Hi-Flow 180、Millipore公司制)上，在40℃下风干30分钟。将该探针固定化膜用作PCR扩增产物的检测用阵列，所述PCR扩增使用了各种带标签的引物组。

(2)利用点印迹法的PCR产物的检测

不对实施例1的工序(1)中制成的PCR产物进行改性，分别立刻应用于工序(1)中制成的阵列上，进而，滴加实施例1的工序(2)中制成的金胶体溶液并静置15～20分钟，进行基于阵列的检测。基于使用了阵列的点印迹法的检测所需的时间为较短时间15～20分钟。

将结果示于表1。在表1中，将在添加pUC19作为被分析物的情况下，在阵列上检测到靶核酸特异性的着色点，且在添加水作为负对照的情况下，无法确认到检测点着色的引物记载为“○”。

实施例3

使用了各种PCR试剂盒的实验

作为EX Taq以外的PCR试剂盒，使用KOD plus、Phusion、PrimeSTAR、KOD FX、Tks Gflex，进行了与参考例及实施例1～2同样的实验，结果确认到与使用EX Taq PCR的情况下同样的结果。

实施例4

(1)带L-DNA标签的引物的合成

在本实施例中，对正向引物(F)及反向引物(R)进行了设计，使得使用pUC19(Takara bio公司制)作为模板，通过PCR扩增来得到约330碱基对。进而，设计了附带L-DNA标签的引物T1-F及T2-R：在各自的5’末端侧导入由非天然型(L型)DNA链构成的标签序列T1及T2。带L-DNA标签的引物的合成使用0.2μM规模的柱基于通常的亚磷酰胺法利用DNA自动合成机(H-8-SE：Gene World)进行合成。

示出本研究中制成的引物组。

标签序列T1：5’-^Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)-3’(序列号12)

标签序列T2：5’-^Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)-3’(序列号13)

引物T1-F：

5’-^Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)-^Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号14)

引物T2-R：

5’-^Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)-^Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号15)

(2)使用了带L-DNA标签的引物组的PCR反应

使用上述工序(1)中实施并制成的引物组进行了PCR反应。将引物T1-F和引物T2-R各15pmol、10ng的pUC19放入0.2ml的PCR用管，按照ExTaqPCR设备(Takara bio公司制)的说明书，制备100μl的PCR反应液。然后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环35次，得到目标序列约330bp。另外，不添加pUC19而进行同样的反应，作为负对照。

(3)胶乳结合L型寡核苷酸探针的制备

在添加了必要量的水溶性碳二亚胺的MES缓冲液中，对含羧基聚苯乙烯胶乳(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)与含氨基的L型寡核苷酸探针(序列号16、序列号12的互补链)进行了混合，含羧基聚苯乙烯胶乳与含氨基的L型寡核苷酸探针结合后，用单乙醇胺进行自行粘着(blocking)。对上述反应液进行离心分离后，除去上清，对所得到的沉淀进行水洗。清洗后，再悬浮于含有表面活性剂的HEPES缓冲液，添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，然后，利用真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

核苷酸探针3：5’-^Ld(TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC)-NH₂-3’(序列号16)

(4)L型寡核苷酸探针在固相中的固定化

用去离子水对利用水溶性碳二亚胺处理过的羧基修饰尼龙膜(日本Pall公司制、6mm×60mm)进行清洗。在距进行了活化的膜的一端30mm处使用涂布器将具有与序列号13互补的序列(序列号17)的含氨基L型寡核苷酸探针涂布在一条线上，风干15分钟。然后，用Tris缓冲液处理膜，进行自行粘着(blocking)后，对膜进行水洗、干燥。

核苷酸探针4：5’-^Ld(CACTGGGCATACGGTAGCAT)-NH₂-3’(序列号17)

(5)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了带L型DNA标签的引物组：按照上述制成的由尼龙膜构成的色谱介质、结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫，。

(6)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(2)中制成的PCR产物进行改性，而立刻应用于工序(5)中制成的测试条上的试样添加部位，进行基于色谱的检测。将工序(2)中添加了的pUC19作为被分析物的情况下，在测试线上检测到靶核酸特异性的着色线。另一方面，在添加水作为负对照的情况下，无法确认到检测线。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例5

(1)带发夹标签的引物的合成

与参考例的工序(1)同样地使用pUC19(Takara bio公司制)作为模板，设计了正向引物(F)及反向引物(R)，使得利用PCR扩增得到约330碱基对。合成了带标签的引物T3-H-F及T4-H-R：在其5’末端侧导入了具有发夹结构的聚合酶反应抑制区(H)、以及标签序列T3及T4。

示出本研究中制成的引物组。

聚合酶反应抑制序列H：

5’-^Dd(AGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTCGCCT)-3’(序列号18)

标签序列T3：5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-3’(序列号19)

标签序列T4：5’-^Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAAT)-3’(序列号20)

引物T3-H-F：

5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTCGCCTGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号21)

引物T4-H-R：

5’-^Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTCGCCTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号22)

(2)使用了带发夹标签的引物组的PCR反应

使用上述工序(1)中实施制成的引物组进行了PCR反应。将引物F和引物R各15pmol、10ng的pUC19放入0.2ml的PCR用管，按照ExTaq PCR设备(Takara bio公司制)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。然后，将管固安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环35次，得到了作为目标的约330bp。另外，不添加pUC19进行同样的反应，作为负对照。

(3)胶乳结合寡核苷酸探针的制作

在添加了必要量的水溶性碳二亚胺的MES缓冲液中，对含羧基聚苯乙烯胶乳(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)与含氨基寡核苷酸探针(序列号23、序列号19的互补链)进行了混合，含羧基聚苯乙烯胶乳与含氨基寡核苷酸探针结合后，用单乙醇胺进行自行粘着(blocking)。对上述反应液进行离心分离后，除去上清，对所得到的沉淀进行水洗。清洗后，再悬浮于含有表面活性剂的HEPES缓冲液，并添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，然后，以真空干燥机使其干燥，作为为结合垫。

寡核苷酸探针5：5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-NH₂-3’(序列号23)

(4)寡核苷酸探针在固相中的固定化

用去离子水对利用水溶性碳二亚胺处理过的羧基修饰尼龙膜(日本Pall公司制、6mm×60mm)进行清洗。在距进行了活化的膜的一端30mm处使用涂布器将具有与序列号20互补的序列(序列号24)的含氨基L型寡核苷酸探针涂布在一条线上，风干15分钟。然后，用Tris缓冲液处理膜，进行自行粘着(blocking)，对面膜进行水洗、干燥。

寡核苷酸探针6：5’-^Dd(ATTGAGCAAGTGTACAGAGCA)-NH₂-3’(序列号24)

(5)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了带发夹标签的引物组：基于上述制成的由尼龙膜构成的色谱介质、结合垫、为试样添加部的通用性的样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫。

(6)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(2)中制成的PCR产物进行改性，立刻应用于工序(5)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。将在工序(2)中添加了的pUC19作为被分析物的情况下，在测试线上检测到靶核酸特异性的着色线。另一方面，在添加水作为负对照的情况下，无法确认到检测线。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例6

(1)人工核酸(偶氮苯)插入引物的合成

设计了正向引物(F)及反向引物(R)，使得将与参考例的工序(1)同样地使用pUC19(Takara bio公司制)作为模板，从而通过PCR扩增得到约330碱基。合成了带标签的引物T5-X-F及T6-X-R：各自的5’末端侧导入了含有人工核酸偶氮苯的聚合酶反应抑制区(X)、及标签序列T5及T6。这2种偶氮苯插入引物在TSUKUBA OLIGO SERVICE株式会社进行委托合成而购入。示出本研究中制成的引物组。

标签序列T5：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列号25)

标签序列T6：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列号26)

引物T5-X-F：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号27)

引物T6-X-R：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号28)

需要说明的是，引物中所插入的偶氮苯如化学式(23)所示。

(2)使用了偶氮苯插入引物组的PCR反应

使用上述工序(1)中实施制成的引物组进行了PCR反应。将引物T5-X-F和引物T6-X-R各15pmol、10ng的pUC19放入0.2ml的PCR用管，按照ExTaqPCR设备(Takara bio公司制)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。然后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环35次，对目标基因约330bp进行扩增。另外，不添加pUC19而进行同样的反应，作为负对照。

(3)胶乳结合寡核苷酸探针的制备

在添加了必要量的水溶性碳二亚胺的MES缓冲液中，对含羧基聚苯乙烯胶乳(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)与含氨基寡核苷酸探针(序列号29、序列号25的互补链)进行了混合，含羧基聚苯乙烯胶乳与含氨基寡核苷酸探针结合后，用单乙醇胺进行自行粘着(blocking)。对上述反应液进行离心分离后，除去上清，对所得到的沉淀进行水洗。清洗后，再悬浮于含有表面活性剂的HEPES缓冲液，添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，然后，以真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

寡核苷酸探针7：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH₂-3’(序列号29)

(4)寡核苷酸探针在固相中的固定化

用去离子水对利用水溶性碳二亚胺处理后的羧基修饰尼龙膜(日本Pall公司制、6mm×60mm)进行清洗。在距活化的膜的一端30mm处使用涂布器将具有与序列号26互补的序列(序列号30)的含氨基D型寡核苷酸探针涂布在一条线上，风干15分钟。然后，用Tris缓冲液处理膜，进行自行粘着(blocking)后，对膜进行水洗、干燥。

寡核苷酸探针8：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-NH₂-3’(序列号30)

(5)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了偶氮苯插入引物组：按照上述制成的由尼龙膜构成的色谱介质、结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫。

(6)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(2)中制成的PCR产物进行改性，立刻应用于工序(5)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。将工序(2)中添加了的pUC19作为被分析物的情况下，在测试线上检测到靶核酸特异性的着色线。另一方面，在添加水作为负对照的情况下，无法确认到检测线。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例7

(1)金胶体结合寡核苷酸探针的制作

对金胶体(40nm、9.0×10¹⁰(粒子数/ml)、British BioCell International公司制)与含硫醇基寡核苷酸探针(序列号31、序列号25的互补链)进行混合，在50℃下培养16小时。以6000rpm离心分离15分钟，除去上清，添加0.05M氯化钠、5mM磷酸缓冲剂(pH 7)并进行混合后，再次在50℃下培养40小时。

培养后，进行离心(6000rpm、15分钟)，除去上清，添加5mM磷酸缓冲剂(pH7)。再次进行该缓冲剂置换。

将制备的金胶体溶液添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，然后，以真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

寡核苷酸探针7：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-SH-3’(序列号31)

(2)寡核苷酸探针在固相中的固定化

对具有与序列号26互补的序列(序列号31)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针与链霉亲和素进行混合。在硝基纤维素膜(商品名：Hi-Flow 180、Millipore公司制)上使用涂布器将混合液涂布在一条线上，在40℃下风干30分钟。

寡核苷酸探针10：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列号32)

(3)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了偶氮苯插入引物组：基于上述制成的由硝基纤维素膜构成的色谱介质、结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫。

(4)利用测试条的PCR产物的检测

不对实施例6的工序(2)中制成的PCR产物进行改性，立刻应用于工序(3)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。将实施例6的工序(2)中添加了的pUC19作为被分析物的情况下，在测试线上检测到靶核酸特异性的着色线。另一方面，在添加水作为负对照的情况下，无法确认到检测线。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例8

(1)寡核苷酸探针在固相中的固定化

在UltraBind亲和膜(日本Pall公司制)上使用涂布器将具有与序列号26互补的序列(序列号33)的寡核苷酸探针涂布在一条线上，在80℃下风干1小时。

寡核苷酸探针11：5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-3’(序列号33)

(2)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了偶氮苯插入引物组：基于上述制成的由UltraBind亲和膜构成的色谱介质、结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫。

(3)利用测试条的PCR产物的检测

不对实施例6的工序(2)中制成的PCR产物进行改性，立刻应用于工序(2)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。将实施例6的工序(2)中添加了的pUC19作为被分析物的情况下，在测试线上检测到靶核酸特异性的着色线。另一方面，在添加水作为负对照的情况下，无法确认到检测线。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例9

(1)人工核酸(偶氮苯)插入引物的合成

分别设计了正向引物(F1)和反向引物(R1)、正向引物(F2)和反向引物(R2)及正向引物(F3)和反向引物(R3)3组引物，使得使用pUC19(Takara bio公司制)、EcoRI甲基化酶基因及BamHI甲基化酶基因这3种基因作为靶核酸的模板，通过PCR扩增分别得到约330碱基对、约200碱基对、以及约100碱基。合成了带标签的引物T7-X-F1和T8-X-R1、T9-X-F2和T10-X-R2、以及T11-X-F3和T12-X-R3：在各自引物的5’末端侧引入了含有人工核酸偶氮苯的聚合酶反应抑制区(X)、及标签序列T7和标签序列T8、标签序列T9和标签序列T10及标签序列T11和标签序列T12。这6种偶氮苯插入引物在TSUKUBA OLIGOSERVICE株式会社进行委托合成而购入。

下面示出本研究中制成的3组引物组。

标签序列T7：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列号34)

标签序列T8：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列号35)

引物T7-X-F1：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号36)

引物T8-X-R1：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号37)

标签序列T9：5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)-3’(序列号38)

标签序列T10：5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3’(序列号39)

引物T9-X-F2：5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT XAGCATTATGAATTATATGGT)-3’(序列号40)

引物T10-X-R2：5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA XTTGTTTACATTTATAGCATC)-3’(序列号41)

标签序列T11：5’-^Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)-3’(序列号42)

标签序列T12：5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3’(序列号43)

引物T11-X-F3：5’-^Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA XTGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3’(序列号44)

引物T12-X-R3：5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG XAGTATGATGAGGGTGTAACA)-3’(序列号45)

(2)使用了3组偶氮苯插入引物组的PCR反应

使用上述工序(1)中实施制成的3组引物组进行了PCR反应。将引物T7-X-F1、引物T8-X-R1、引物T9-X-F2、引物T10-X-R2、引物T11-X-F3及引物T12-X-R3各15pmol、各模板10ng放入0.2ml的PCR用管，按照ExTaqPCR设备(Takara bio公司制)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。反应液准备下面的5种。

(i)添加pUC19(Takara bio公司制)作为模板，

(ii)添加EcoRI甲基化酶基因作为模板，

(iii)添加BamHI甲基化酶基因作为模板，

(iv)pUC19(Takara bio公司制)、EcoRI甲基化酶基因及BamHI甲基化酶基因3种均被添加作为模板，以及，

(v)无模板。

制备这些反应液后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、AppliedBiosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环30次，分别得到具有如下目标序列的DNA片段。扩增了(i)约330bp、(ii)约200bp、(iii)约100bp及(iv)约330bp、约200bp、约100bp这3种、(v)无扩增DNA片段(作为负对照)。

(3)胶乳结合寡核苷酸探针的制作

在添加了必要量的水溶性碳二亚胺的MES缓冲液中，分别对下述组合进行混合：含羧基聚苯乙烯胶乳(蓝色)(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)及含氨基寡核苷酸探针12(序列号46、序列号34的互补链)、含羧基聚苯乙烯胶乳(橙色)(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)及含氨基寡核苷酸探针13(序列号47、序列号38的互补链)、以及含羧基聚苯乙烯胶乳(绿色)(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)及含氨基寡核苷酸探针14(序列号48、序列号42的互补链)，上述各组合结合后，用单乙醇胺进行自行粘着(blocking)。对上述反应液进行离心分离后，除去上清，对所得到沉淀进行水洗。清洗后，再悬浮于含有表面活性剂的HEPES缓冲液来制备寡核苷酸探针12结合胶乳(蓝色)、寡核苷酸探针13结合胶乳(橙色)、寡核苷酸探针14结合胶乳(绿色)。

将这3种胶乳添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，然后，以真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

寡核苷酸探针12：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH₂-3’(序列号46)

寡核苷酸探针13：

5’-^Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-NH₂-3’(序列号47)

寡核苷酸探针14：5’-^Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)-NH₂-3’(序列号48)

(4)3种寡核苷酸探针在固相中的固定化

对下述探针分别与链霉亲和素进行了混合：具有与序列号35互补的序列(序列号49)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针15、具有与序列号39互补的序列(序列号50)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针16及具有与序列号43互补的序列(序列号51)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针17。在硝基纤维素膜(商品名：Hi-Flow 135、Millipore公司制)上，在从上游侧依次互相分离的位置上，使用涂布器将这些混合液分别涂布在三条线上，在40℃下风干30分钟。制作三条检测线。

寡核苷酸探针15：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列号49)

寡核苷酸探针16：

5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-生物素-3’(序列号50)

寡核苷酸探针17：5’-^Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-生物素-3’(序列号51)

(5)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了偶氮苯插入引物组：上述制成的由硝基纤维素膜构成的色谱介质、工序(3)中制成的结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫。

(6)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(2)中制成的(i)～(v)的PCR产物分别进行改性，分别立刻应用于工序(5)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。其结果示于以下。

(i)：仅第一条检测线着色为蓝色。

(ii)：仅第二条检测线着色为橙色。

(iii)：仅第三条检测线着色为绿色。

(iv)：分别第一条检测线着色为蓝色，第二条检测线着色为橙色，第三条检测线着色为绿色。

(v)：任一检测线均无法确认到着色。

由该结果，可特异性地对各自的靶基因进行检测，3种同时检测也均可确认。

另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例10

(1)联合引物的合成

设计了正向引物(Fj1)和反向引物(Rj1)、正向引物(Fj2)和反向引物(Rj2)及正向引物(Fj3)和反向引物(Rj3)这3组引物，使得使用pUC19(Takara bio公司制)、EcoRI甲基化酶基因及BamHI甲基化酶基因这3种基因作为靶核酸的模板，通过PCR扩增分别得到约330碱基对、约200碱基对及约100碱基对。合成了共有序列附加引物KF1-Fj1和KR1-Rj1、KF2-Fj2和KR2-Rj2及KF3-Fj3和KR3-Rj3：在各自引物的5’末端侧引入了共有序列KF1和KR1、共有序列KF2和KR2、以及共有序列KF3和KR3。这6种共有序列附加引物(联合引物)在TSUKUBA OLIGO SERVICE株式会社进行委托合成而购入。

下面示出本研究中制成的3组引物组。

共有序列KF1：5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列号52)

共有序列KR1：5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列号53)

引物KF1-Fj1：5’-^Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTTGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号54)

引物KR1-Rj1：5’-^Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGGTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号55)

共有序列KF2：5’-^Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)-3’(序列号56)

共有序列KR2：5’-^Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)-3’(序列号57)

引物KF2-Fj2：5’-^Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTTAGCATTATGAATTATATGGT)-3’(序列号58)

引物KR2-Rj2：5’-^Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGATTGTTTACATTTATAGCATC)-3’(序列号59)

共有序列KF3：5’-^Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)-3’(序列号60)

共有序列KR3：5’-^Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)-3’(序列号61)

引物KF3-Fj3：5’-^Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACCTGGTTTTAAAACTCTGATAC)-3’(序列号62)

引物KR3-Rj3：5’-^Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGCAGTATGATGAGGGTGTAACA)-3’(序列号63)

(2)人工核酸(偶氮苯)插入引物的合成

设计了3组具有与各自的联合引物相同的共有序列的引物，使得其能够与工序(1)中制备的联合引物组所扩增的3种PCR扩增片段结合。合成了带标签的引物T16-X-KF1和T17-X-KR1、T18-X-KF2和T19-X-KR2、以及T20-X-KF3和T21-X-KR3：在各自的引物的5’末端侧导入了含有人工核酸偶氮苯的聚合酶反应抑制区(X)、以及标签序列T16和T17、标签序列T18和T19或标签序列T20和T21。这6种偶氮苯插入引物在TSUKUBA OLIGOSERVICE株式会社进行委托合成而购入。

下面示出本研究中制成的3组引物组。

标签序列T16：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列号64)

标签序列T17：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列号65)

引物T16-X-KF1：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XTGGGCTGACCTAGAGGTCTT)-3’(序列号66)

引物T17-X-KR1：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XATGAAATGCAGGCCATTCGG)-3’(序列号67)

标签序列T18：5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)-3’(序列号68)

标签序列T19：5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)-3’(序列号69)

引物T18-X-KF2：5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT XCCGGAACAGACACCAGGTTT)-3’(序列号70)

引物T19-X-KR2：5’-^Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA XGAAGCTGTACCGTCACATGA)-3’(序列号71)

标签序列T20：5’-^Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)-3’(序列号72)

标签序列T21：5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)-3’(序列号73)

引物T20-X-KF3：5’-^Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA XATACCGATGAGTGTGCTACC)-3’(序列号74)

引物T21-X-KR3：5’-^Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG XTGGCCTGTGTGACACTATGC)-3’(序列号75)

(3)使用了联合引物及偶氮苯插入引物的PCR反应

使用上述工序(1)及(2)中实施制成的6组引物组进行了PCR反应。将引物KF1-Fj1、引物KR1-Rj1、引物KF2-Fj2、引物KR2-Rj2、引物KF3-Fj3、引物KR3-Rj3、引物T16-X-KF1、引物T17-X-KR1、引物T18-X-KF2、引物T19-X-KR2、引物T20-X-KF3、引物T21-X-KR3各8pmol、各模板10ng放入0.2ml的PCR用管，按照ExTaq PCR设备(Takara bio公司制)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。

反应液准备下面的5种。

(i)添加pUC19(Takara bio公司制)作为模板，

(ii)添加EcoRI甲基化酶基因作为模板，

(iii)添加BamHI甲基化酶基因作为模板，

(iv)pUC19(Takara bio公司制)、EcoRI甲基化酶基因及BamHI甲基化酶基因3种均被添加作为模板，而且，

(v)无模板。

制备这些反应液后，将管固定于热循环仪(GeneAmp PCR System、AppliedBiosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环30次，如下得到分别具有目的序列的DNA片段。得到了(i)约360bp、(ii)约230bp、(iii)约130bp及(iv)约360bp、约230bp、约130bp的3种、(v)无扩增DNA片段(设为负对照)。

(4)胶乳结合寡核苷酸探针的制作

分别在添加了必要量的水溶性碳二亚胺的MES缓冲液中，对下述组合进行混合：将含羧基聚苯乙烯胶乳(蓝色)(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)及含氨基寡核苷酸探针18(序列号76、序列号64的互补链)、含羧基聚苯乙烯胶乳(橙色)(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)及含氨基寡核苷酸探针19(序列号77、序列号68的互补链)、以及含羧基聚苯乙烯胶乳(绿色)(固体成分10％(w/w)、Bangs公司制)及含氨基寡核苷酸探针20(序列号78、序列号72的互补链)，上述组合结合后，用单乙醇胺进行自行粘着(blocking)。对上述反应液进行离心分离后，除去上清，对所得到的沉淀进行水洗。清洗后，再悬浮于含有表面活性剂的HEPES缓冲液，制备寡核苷酸探针18结合胶乳(蓝色)、寡核苷酸探针19结合胶乳(橙色)、寡核苷酸探针20结合胶乳(绿色)。

将这3种胶乳添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，以真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

寡核苷酸探针18：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-NH₂-3’(序列号76)

寡核苷酸探针19：

5’-^Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-NH₂-3’(序列号77)

寡核苷酸探针20：5’-^Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)-NH₂-3’(序列号78)

(5)3种寡核苷酸探针在固相中的固定化

对下述探针分别与链霉亲和素进行了混合：具有与序列号65互补的序列(序列号79)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针21、具有与序列号69互补的序列(序列号80)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针22、以及具有与序列号73互补的序列(序列号81)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针23。在硝基纤维素膜(商品名：Hi-Flow 135、Millipore公司制)上，在从上游侧开始依次互相分离的位置上，使用涂布器将这些混合液分别涂布在三条线上，在40℃下风干30分钟。制作三条检测线。

寡核苷酸探针21：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列号79)

寡核苷酸探针22：

5’-^Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)-生物素-3’(序列号80)

寡核苷酸探针23：5’-^Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)-生物素-3’(序列号81)

(6)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了偶氮苯插入引物组：上述制成的由硝基纤维素膜构成的色谱介质、工序(4)中制成的结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫，。

(7)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(3)中制成的(i)～(v)的PCR产物分别进行改性，立刻应用于工序(6)中制成的测试条上的试样添加部位，进行利用色谱的检测。

其结果示于以下。

(i)：仅第一条检测线着色为蓝色。

(ii)：仅第二条检测线着色为橙色。

(iii)：仅第三条检测线着色为绿色。

(iv)：第一条检测线着色为蓝色，第二条检测线着色为橙色，第三条检测线着色为绿色。

(v)：任一检测线均无法确认到着色。

由该结果，可特异性地对各自的靶基因进行检测，也可对3种基因的检测进行确认。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例11

(1)人工核酸(偶氮苯)插入引物的合成

在本实施例中，使用引入了质粒pUC19的大肠杆菌(E.coli DH5α)作为目标。设计了正向引物(F)及反向引物(R)，使得在pUC19为模板时，通过PCR扩增得到约330碱基对。合成了的带标签的引物T25-X-F及T26-X-R：在各自引物的5’末端侧导入了含有为人工核酸的偶氮苯的聚合酶反应抑制区(X)、及标签序列T25及T26。这2种偶氮苯插入引物在TSUKUBA OLIGOSERVICE株式会社进行委托合成而购入。

示出本研究中制成的引物组。

标签序列T25：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列号82)

标签序列T26：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列号83)

引物F：5’-^Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号84)

引物R：5’-^Dd(TCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号85)

引物T25-X-F：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号86)

引物T26-X-R：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列号87)

(2)使用了偶氮苯插入引物组的PCR反应

取引入了质粒pUC19的大肠杆菌(E.coli DH5α)的菌落，混入1ml水中。使用上述工序(1)中制成的引物组进行了PCR反应。将引物F和引物R各5pmol、上述大肠杆菌的悬浮液1μl放入0.2ml的PCR用管，按照ExTaqPCR设备(Takara bio公司制)的说明书，制备了25μl的PCR反应液。然后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环30次，得到了作为目标的约330bp。另外，不添加悬浮液进行同样的反应，作为负对照。

(3)金胶体结合寡核苷酸探针的制作

对金胶体(10nm、5.7×10¹²(粒子数/ml)、British BioCell International公司制)与抗FITC抗体溶液(5mM磷酸缓冲剂、pH7)进行了混合，在室温下静置20分钟。添加含有1％BSA及0.1％PEG的溶液1/2量，以10000rpm离心分离25分钟，除去上清，添加含有1％BSA及0.1％PEG的溶液混合后，以10000rpm离心分离25分钟。离心后，除去上清，添加5mM磷酸缓冲剂(pH7)。再次进行该缓冲剂置换。

将3’末端FITC修饰寡核苷酸探针24(序列号88、序列号82的互补链)混入至制备的金胶体溶液中，添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，然后，以真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

寡核苷酸探针24：

5’-^Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-FITC-3’(序列号88)

(4)寡核苷酸探针在固相中的固定化

将具有与序列号83互补的序列(序列号89)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针25与链霉亲和素进行了混合。在硝基纤维素膜(商品名：Hi-Flow 180、Millipore公司制)上，使用涂布器将混合液涂布在一条线上，在40℃下风干30分钟。

寡核苷酸探针25：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列号89)

(5)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了偶氮苯插入引物组：根据上述而制成的由硝基纤维素膜构成的色谱介质、结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫，。

(6)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(2)中制成的PCR产物进行改性，立刻应用于工序(5)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。将工序(2)中添加了的大肠杆菌作为被分析物的情况下，在测试线上检测到靶核酸特异性的着色线。另一方面，在不添加大肠杆菌作为负对照的情况下，无法确认到检测线。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间10～15分钟。

实施例12

(1)SNP目标的合成

在本实施例中，准备2种50碱基对的合成DNA作为靶。这2个DNA为仅末端起第20位的单碱基不同的单碱基多型(SNP)。假定靶1为野生型(WT)、靶2为变异型(MT)，进行SNP检测试验。

下述仅示出靶1及靶2的双链DNA中一方的序列。下划线部分为不同的单碱基。

靶1(WT)：

CACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAG(序列号90)

靶2(MT)：

CACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAAGCTGCTCTGATGCCGCATAG(序列号91)

(2)人工核酸(偶氮苯)插入引物的合成

设计了正向引物(Fwt)、反向引物(Rwt)、及反向引物(Rmt)，使得在将上述工序(1)中合成的靶1或者靶2设为模板时，利用PCR扩增得到约50碱基对。合成了带标签的引物T27-X-Fwt、T28-X-Rwt、T29-X-Rmt：在各自的5’末端侧导入了含有人工核酸偶氮苯的聚合酶反应抑制区(X)、以及标签序列T27、T28、T29的。这3种偶氮苯插入引物在TSUKUBA OLIGO SERVICE株式会社进行委托合成而购入。

示出本研究中制成的引物组。

标签序列T27：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)-3’(序列号92)

标签序列T28：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’(序列号93)

标签序列T29：5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)-3’(序列号94)

引物Fwt：5’-^Dd(CACACCGCATATGGTGCACT)-3’(序列号95)

引物Rwt：5’-^Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAGA)-3’(序列号96)

引物Rmt：5’-^Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAGC)-3’(序列号97)

引物T27-X-Fwt：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XCACACCGCATATGGTGCACT)-3’(序列号98)

引物T28-X-Rwt：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAGA)-3’(序列号99)

引物T29-X-Rmt：5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT XTCTATGCGGCATCAGAGCAGC)-3’(序列号100)

(3)使用了偶氮苯插入引物组的PCR反应

使用含有上述工序(1)中制成的靶1或者靶2的试样溶液以及上述工序(2)中合成的3种引物进行了PCR反应。

将引物T27-X-Fwt、引物T28-X-Rwt及引物T29-X-Rmt各5pmol、各模板1fmol放入0.2ml的PCR管，按照ExTaq PCR试剂盒(Takara bio公司制)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。

用于反应液的模板准备下面的4种类。

(i)靶1(同型)作为模板，

(ii)靶1及靶2(异型)作为模板，

(iii)靶2(同型)作为模板，

(iv)无靶(添加水)

制备这些反应液后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、AppliedBiosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃10秒、55℃30秒、72℃10秒的循环30次，分别得到具有如下目标序列的DNA片段。扩增了(i)约50bp、(ii)约50bp、(iii)约50bp及(iv)无扩增DNA片段(作为负对照)。

(4)金胶体结合寡核苷酸探针的制作

将金胶体(40nm、9.0×10¹⁰(粒子数/ml)、British BioCell International公司制)与含硫醇基寡核苷酸探针26(序列号101、序列号92的互补链)进行了混合，在50℃下培养16小时。以6000rpm离心分离15分钟，除去上清，添加含有0.05M氯化钠的5mM磷酸缓冲剂(pH7)进行混合后，再次在50℃下培养40小时。进行培养后，进行离心(6000rpm、15分钟)，除去上清，添加5mM磷酸缓冲剂(pH7)。再次进行该缓冲剂置换。

将制备的金胶体溶液添加到玻璃纤维制垫上使得其均匀，然后，以真空干燥机使其干燥，设为结合垫。

寡核苷酸探针26：

5’-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-SH-3’(序列号101)

(5)2种寡核苷酸探针在固相中的固定化

分别对下述探针与链霉亲和素进行了混合：具有与序列号93互补的序列(序列号102)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针27、以及具有与序列号94互补的序列(序列号103)的3’末端生物素修饰寡核苷酸探针28。在硝基纤维素膜(商品名：Hi-Flow 135、Millipore公司制)上，在从上游侧开始依次互相分离的两处的位置上，使用涂布器将这些混合液涂布在两条线上，在40℃下风干30分钟，制作两条检测线。

寡核苷酸探针27：

5’-^Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)-生物素-3’(序列号102)

寡核苷酸探针28：

5’-^Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-生物素-3’(序列号103)

(6)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了间隔区(偶氮苯)插入引物组：工序(5)中制作的由硝基纤维素膜构成的色谱介质、工序(4)中制成的结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫，。

(7)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(3)中制成的(i)～(iv)的PCR产物进行改性，分别立刻应用于工序(6)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。

其结果示于以下。

(i)：仅第一条检测线着色。

(ii)：第一条线、第二条检测线两者均着色。

(iii)：仅第二条检测线着色。

(iv)：任一检测线均无法确认到着色。

由该结果，可特异性地检测各自的靶基因，进而也可同时判定，进行SNP的同型和异型的辨别。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间5～15分钟。

实施例13

(1)间隔区(5’-5’结合+3’-3’结合)插入引物的合成

在本实施例中，使用低筋面粉(日清制粉公司制)、荞麦粉(Obinata公司制)及花生(Le·Monde·Alico公司制)这3种作为试样。设计了正向引物(Fwtr)和反向引物(Rwtr)、正向引物(FFAG)和反向引物(RFAG)、以及正向引物(Fagg)和反向引物(Ragg)这3组引物：由各试样通过PCR扩增分别得到约141碱基对、约127碱基对、以及约95碱基对的DNA。合成了带标签的间隔区插入引物T7-X-Fwtr和T8-X-Rwtr、T9-X-FFAG和T10-X-RFAG、以及T11-X-Fagg和T12-X-Ragg：在各自引物的5’末端侧引入了含有5’-5’结合+dA+3’-3’结合的聚合酶反应抑制区(X)、以及标签序列T7和T8、标签序列T9和T10、以及标签序列T11和T12。这6种标签间隔区插入引物在TSUKUBA OLIGO SERVICE株式会社进行委托合成而购入。

下面示出本研究中制成的3组引物组。

引物T7-X-Fwtr：5’-Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XCATCACAATCAACTTATGGTGG)-3’(序列号104)

引物T8-X-Rwtr：5’-Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTTTGGGAGTTGAGACGGGTTA)-3’(序列号105)

引物T9-X-FFAG：5’-Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT XAACGCCATAACCAGCCCGATT)-3’(序列号106)

引物T10-X-RFAG：5’-Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA XCCTCCTGCCTCCCATTCTTC)-3’(序列号107)

引物T11-X-Fagg：5’-Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA XCGAAGGAAACCCCGCAATAAAT)-3’(序列号108)

引物T12-X-Ragg：5’-Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG XCGACGCTATTTACCTTGTTGAG)-3’(序列号109)

(2)各试样的基因组DNA的精制

由各试样(面粉、荞麦粉、粉碎的花生)2g分别精制基因组DNA。首先，在离心管(50mL容积)中量取试样，加入CTAB缓冲液15mL，使用均质器进行混合。加入CTAB缓冲液30mL，颠倒混合后，在55℃下加温30分钟。加温处理后，搅拌溶液，在微管(1.5mL容积)中量取成为均质的溶液600μL。

由该均质溶液以下面的方法进行核酸的提取。即，向该均质溶液加入500μL的苯酚/氯仿混合液(将1M Tris/盐酸(pH8.0)饱和苯酚以及氯仿/异戊醇以1:1(v/v)的比例混合而成的物质)，颠倒混合后，用涡旋混合器轻轻地进行悬浮。悬浮后，在室温条件下以7500×g的速度离心15分钟，将分离的水层(上层)移至新的微管。向水层再次加入500μL的氯仿/异戊醇混合液(对氯仿和异戊醇以24:1(v/v)的比例进行混合而成的物质)，颠倒混合后，用涡旋混合器轻轻地进行悬浮。在室温条件下，以7500×g的速度离心15分钟，将分离的水层(上层)移至新的微管。在分离的水层中加入等容量的异丙醇，颠倒混合后，在室温条件下，以7500×g的速度离心15分钟，以倾滤去除上清液。接着，沿着壁面静静地加入500μL的70％乙醇，然后，在室温条件下，以7500×g的速度离心1分钟。离心后，尽量以不接触沉淀的方式吸取乙醇。为了使残留在管中的核酸的沉淀干燥，使用吸引器进行2～3分钟的真空干燥处理。此时，注意避免完全干燥。加入50μL的TE缓冲液(10mM Tris/盐酸(pH8.0)、1mMEDTA(pH8.0))，充分混合，然后，在室温下静置15分钟。期间多次颠倒混合，促使沉淀完全溶解。将完全溶解而成的物质设为DNA试样原液。

需要说明的是，CTAB缓冲液以下面的方法制备。在烧杯中量取8mL的0.5mM EDTA(pH 8.0)、20mL的1M Tris/盐酸(pH8.0)、以及56mL的5M NaCl水溶液，进行混合后，加入水使其成为约150mL，一边搅拌一边加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)4g，完全溶解。进而，加入水，将总量设为200mL，用高压釜灭菌。

(3)使用了3组间隔区(5’-5’结合+3’-3’结合)插入引物组的PCR反应

使用上述工序(1)中实施制成的3组引物组进行了PCR反应。将引物T7-X-Fwtr、引物T8-X-Rwtr、引物T9-X-FFAG、引物T10-X-RFAG、引物T11-X-Fagg、以及引物T12-X-Ragg各15pmol、各DNA试样原液放入0.2ml的PCR用管，按照ExTaq PCR设备(Takara bio公司制)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。

准备下面的5种作为添加到反应液中的DNA试样原液。

(i)添加面粉的DNA试样原液作为模板

(ii)添加荞麦粉的DNA试样原液作为模板，

(iii)添加花生的DNA试样原液作为模板，

(iv)面粉、荞麦粉、花生3种的DNA试样原液均被添加作为模板，而且，

(v)无模板。

制备这些反应液后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、AppliedBiosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒的循环30次，得到分别具有如下目的序列的DNA片段。得到了(i)约141bp、(ii)约127bp、(iii)约95bp及(iv)约141bp、约127bp、约95bp这3种、(v)无扩增DNA片段(作为负对照)。

(4)金胶体结合寡核苷酸探针的制作

分别对金胶体(40nm、9.0×10¹⁰(粒子数/ml)、British BioCell International公司制)与下述探针进行了混合：含硫醇基寡核苷酸探针29(序列号110、序列号34的互补链)、含硫醇基寡核苷酸探针30(序列号111、序列号38的互补链)、以及含硫醇基寡核苷酸探针31(序列号112、序列号42的互补链)，在50℃下培养16小时。以6000rpm离心分离15分钟，除去上清，添加含有0.05M氯化钠的5mM磷酸缓冲剂(pH7)进行混合后，再次在50℃下培养40小时。培养后，进行离心(6000rpm、15分钟)，除去上清，添加5mM磷酸缓冲剂(pH7)。再次进行该缓冲剂置换。

将制备的金胶体溶液添加到玻璃纤维制垫，使得其均匀，以真空干燥机使其干燥，作为结合垫。

寡核苷酸探针29：

5’-Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)-SH-3’(序列号110)

寡核苷酸探针30：5’-Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)-SH-3’(序列号111)

寡核苷酸探针31：5’-Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)-SH-3’(序列号112)

(5)3种寡核苷酸探针在固相中的固定化

使用与实施例9的工序(4)同样的方法将寡核苷酸探针15、16、17各自涂布在1条线上，干燥固定于硝基纤维素膜上。

(6)核酸色谱样测试条的制作

如图6所示，在由底板构成的基材上贴合下述垫来制备PCR扩增产物的检测用测试条，所述PCR扩增使用了间隔区(5’-5’结合+3’-3’结合)插入引物组：工序(5)中制作的由硝基纤维素膜构成的色谱介质、工序(4)中制成的结合垫、试样添加部的通用性样品垫、用于对展开的试样及标识物质进行吸收的吸收垫，。

(7)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(3)中制成的(i)～(v)的PCR产物进行改性，分别立刻应用于工序(6)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。

将其结果示于以下(i)～(v)及图12。

(i)：仅第一条检测线着色。

(ii)：仅第二条检测线着色。

(iii)：仅第三条检测线着色。

(iv)：第一条检测线、第二条检测线及第三条检测线均着色。

(v)：任一检测线均无法确认到着色。

由该结果可确认到：可特异性地对各自的靶基因进行检测。也可同时确认3种试样的检测。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间5～15分钟。

实施例14

有无pUC19插入物的检测

(1)目标DNA(pUC19及含有插入物的pUC19)的准备

在本实施例中，准备2种质粒DNA作为靶。将靶的概要示于图13、图14。靶1使用质粒pUC19DNA(Takara bio公司制)、靶2使用在pUC19的多克隆位点插入基因A(1668bp)作为插入物而制成的质粒(pUC19/基因A)。

基因A序列(序列号113)

靶1：pUC19序列(序列号114)

靶2：pUC19序列/基因A(序列号115)

(2)C6连接物插入引物的合成

如图13、图14所示，在夹持pUC19序列上的多克隆位点的位置设计正向引物(F)及反向引物(R)，在插入物基因A序列上设计反向引物(R-in)。若使用正向引物F和反向引物R进行PCR反应，则在靶1的pUC19中可得到118碱基对的扩增产物，在含有插入物的靶2的pUC19/基因A中可得到1768碱基对的扩增产物。另外，若使用正向引物F和反向引物R-in进行PCR反应，则在靶2(插入插入物)产生101碱基长的扩增产物。合成了带标签的引物T27-X-F、T28-X-R、T29-X-R-in：在各自引物的5’末端侧导入了含有C6连接物的聚合酶反应抑制区(X)、以及与实施例12中记载的标签相同的标签序列T27、T28、T29。这3种C6连接物插入引物在TSUKUBA OLIGO SERVICE株式会社进行委托合成而购入。

示出本研究中制成的引物组。

引物F：5’-^Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号116)

引物R：5’-^Dd(TTTCCCAGTCACGACGTTGT)-3’(序列号117)

引物R-in：5’-^Dd(AGTGCGTGCTGGGCTCTTC)-3’(序列号118)

引物T27-X-F：5’-^Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列号119)

引物T28-X-R：5’-^Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTTTCCCAGTCACGACGTTGT)-3’(序列号120)

引物T29-X-R-in：5’-^Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT XAGTGCGTGCTGGGCTCTTC)-3’(序列号121)

(3)使用了C6连接物插入引物组的PCR反应

使用上述工序(1)中准备的靶1或者靶2溶液以及上述工序(2)中合成的3种的引物进行了PCR反应。将引物T27-X-F、引物T28-X-R及引物T29-X-R-in各5pmol、各模板1fmol放入0.2ml的PCR管，按照ExTaq PCR试剂盒(Takarabio公司制)的说明书，制备了100μl的PCR反应液。

用于反应液的模板准备下面的4种。

(i)靶1作为模板，

(ii)靶1及靶2作为模板，

(iii)靶2作为模板，

(iv)无靶(添加水)

制备这些反应液后，将管安装于热循环仪(GeneAmp PCR System、AppliedBiosystems公司制)，在95℃下热处理5分钟后，进行95℃10秒、55℃30秒、72℃5秒的循环30次。在该PCR反应条件中使伸长反应时间缩短为5秒的原因在于仅选择性地对扩增长度短的片段进行扩增。在该反应条件中，在具有插入物的靶2为模板的情况下，仅利用引物T27-X-F、引物T29-X-R-in产生101bp的扩增片段，而未利用引物T27-X-F、引物T28-X-R中产生1786bp的扩增。因此，得到分别具有如下目标序列的DNA片段。扩增(i)118bp、(ii)118bp、101bp、(iii)101bp及(iv)无扩增DNA片段(作为负对照)。

(4)核酸色谱样测试条的制作

以与实施例13的工序(4)～(6)同样的方法制作使用了间隔区插入引物组的PCR扩增产物的检测用测试条。

(5)利用测试条的PCR产物的检测

不对工序(3)中制成的(i)～(iv)的PCR产物进行改性，分别立刻应用于工序(4)中制成的测试条上的试样添加部位，基于色谱进行检测。

将其结果示于以下。

(i)：仅第一条检测线着色。

(ii)：第一条线、第二条检测线两者均着色。

(iii)：仅第二条检测线着色。

(iv)：任一检测线均无法确认到着色。

由该结果，可特异性地对各自的靶质粒进行检测，可辨别质粒内有无插入物。另外，利用色谱的检测所需的时间为较短时间5～15分钟。

如上所述可辨别质粒中有无基因的插入，也可使用同样的方法简便地对基因组中的基因的插入及缺失等变异进行检测。

附图标记说明

1.引物区

2.标签区

3.聚合酶反应抑制区(间隔区)

4.第一引物(联合引物)的引物区

5.第一引物(联合引物)的共有区

6.第二引物的共有区

7.第二引物的标签区

8.第二引物的聚合酶反应抑制区(间隔区)

9.靶核酸序列

10.正向引物

11.正向引物的引物区

12.正向引物的标签区

13.反向引物

14.反向引物的引物区

15.反向引物的标签区

16.在两末端具有单链区的DNA扩增产物

17.靶核酸序列

18.正向第一引物

19.正向第一引物的引物区

20.正向第一引物的标签区

21.反向第一引物

22.反向第一引物的引物区

23.反向第一引物的标签区

24.基于第一引物的双链PCR产物

25.正向第二引物

26.正向第二引物的引物区

27.正向第二引物的标签区

28.反向第二引物

29.反向第二引物的引物区

30.反向第二引物的标签区

31.在两末端具有单链区的DNA扩增产物

32.样品垫

33.结合垫

34.保持有捕捉用寡核苷酸的载体

35.吸收垫

36.基材

37.测试线

38.对照线

39.标识分子结合用寡核苷酸

40.标识分子

41.PCR产物-标识分子复合物

42.多孔膜

43.捕捉用寡核苷酸

44.保持捕捉用寡核苷酸于各孔的载体(微阵列)

45.保持有捕捉用寡核苷酸的珠载体

46.改性PAGE、染色后的聚丙烯酰胺凝胶

47.约360mer的单链

48.约330mer的单链

49.色谱样条

50.测试线

51.测试线1

52.测试线2

53.测试线3

Claims

1.一种核酸的扩增方法，该方法包括，使用5’末端侧连接有不会通过核酸扩增反应而双链化的标签区的引物来进行核酸扩增反应，从而得到在两末端具有单链区的核酸。

2.如权利要求1所述的核酸的扩增方法，其中，标签区经由间隔区与引物连接。

3.如权利要求2所述的靶核酸的扩增方法，其中，间隔区含有核酸衍生物。

4.如权利要求3所述的核酸的扩增方法，其中，核酸衍生物为选自L型核酸、3-脱氧-2-羟基-dN、修饰碱基核酸、损伤碱基核酸、磷酸结合部位修饰核酸、RNA、2’-OMe-N及它们的衍生物中的至少1种以上。

5.如权利要求4所述的核酸的扩增方法，其中，L型核酸选自L型DNA、L型RNA及它们的衍生物中的至少1种以上。

6.如权利要求4所述的核酸的扩增方法，其中，3-脱氧-2-羟基-dN通过2’-5’结合与引物连接。

7.如权利要求4所述的核酸的扩增方法，其中，修饰碱基核酸含有发色团或生物素。

8.如权利要求7所述的核酸的扩增方法，其中，发色团选自芘、亚乙烯基、吡咯并、苝、荧光素、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA、DABCYL、花青苷及它们的衍生物中的至少1种以上。

9.如权利要求4所述的核酸的扩增方法，其中，损伤碱基核酸选自脱碱基核苷酸、5-羟甲基-dN及它们的衍生物中的至少1种以上。

10.如权利要求4所述的核酸的扩增方法，其中，磷酸结合部位修饰核酸含有硫代磷酸酯或其衍生物。

11.如权利要求3～10中任一项所述的核酸的扩增方法，其中，核酸衍生物通过5’-5’结合与引物连接，且通过3’-3’结合与标签区连接。

12.如权利要求2所述的靶核酸的扩增方法，其中，间隔区含有非核酸衍生物。

13.如权利要求12所述的核酸的扩增方法，其中，非核酸衍生物具有D-苏氨醇骨架。

14.如权利要求13所述的核酸的扩增方法，其中，在D-苏氨醇骨架上导入有选自偶氮苯、生物素、EDTA及发色团中的至少1种以上。

15.如权利要求14所述的核酸的扩增方法，其中，发色团选自芘、亚乙烯基、吡咯并、苝、荧光素、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA、DABCYL、花青苷及它们的衍生物中的至少1种以上。

16.如权利要求12所述的核酸的扩增方法，其中，非核酸衍生物选自碳链(C_n)、聚乙二醇链((CH₂CH₂O)_n)、含有二硫醚的链(C_nSSC_n)及二硫醇亚磷酰胺中的至少1种以上。

17.如权利要求2所述的核酸的扩增方法，其中，间隔区为多种及/或多个。

18.一种核酸的检测方法，其中，对权利要求1～17中任一项所述的核酸的扩增方法所得到的两末端具有单链区的核酸进行检测。

19.如权利要求18所述的核酸的检测方法，其包括：

将含有与一个单链区互补的序列的第一寡核苷酸探针固定于固相的工序；以及

使所述第一寡核苷酸探针与两末端具有单链区的核酸进行杂交的工序。

20.如权利要求19所述的核酸的检测方法，其进一步包括：使含有与另一个单链区互补的序列的第二寡核苷酸探针与标记物质结合的工序；以及

使所述第二寡核苷酸探针与两末端具有单链区的核酸进行杂交的工序。

21.如权利要求20所述的核酸的检测方法，其还包括目视辨别核酸的工序。

22.如权利要求20或21所述的核酸的检测方法，其中，标记物质为着色载体。

23.如权利要求18～22中任一项所述的核酸的检测方法，其中，在核酸检测设备上对两末端具有单链区的核酸进行检测。

24.如权利要求23所述的核酸的检测方法，其中，核酸检测设备为阵列检测器或色谱检测器。