JP6681804B2 - 変異プライマーの設計方法 - Google Patents
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Description
定量的PCRや等温増幅法のように標的配列の有無を判別するための核酸増幅系において、このような非特異的増幅が生じると、S/N比の低下、偽陽性の発生などの問題が生じ、標的配列の検出が不可能になる場合がある。
特許文献1には標識したプライマーを用いFRETの原理を応用することで、プライマーダイマーに起因するシグナルが検出されないようにし、S/N比を向上させる方法が開示されている。
同様の技術として特許文献3には、改変されたピリミジン核酸塩基を3´末端側の配列内に含むプライマーが開示されている。
特許文献2及び3には、これらプライマーを用いるとプライマーダイマーの形成が抑制できることが記載されている。
鋳型DNAに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する基礎配列設計工程と、
該基礎プライマー配列に含まれる1又は2以上のヌクレオチド残基であって、以下の(1)〜(4)からなる群から選ばれる1又は2以上の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択する変異導入部位選択工程を備える、設計方法である。
(1)プライマーダイマーの形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
(2)プライマー1分子内でのループ構造の形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
(3)前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
(4)前記基礎プライマー配列からなるプライマーが1分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
このような形態とすることによって、より非特異的増幅が生じにくいプライマーを設計することができる。
(A)前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の5´末端及び3´末端と、それぞれ5´末端及び3´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
(B)炭素鎖又はPEG鎖からなるスペーサー鎖。
(C)一般式1で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
一般式1
(D)光分解性修飾のされたスペーサー鎖。
変異プライマーに導入する変異を(A)〜(D)とすることによって、さらに非特異的増幅を生じにくいプライマーを設計することができる。
本発明のプライマー及び核酸増幅方法によれば、核酸増幅における非特異的増幅を低減することができる。
等温増幅法はPCR法とは異なり、二本鎖DNAの変性工程を含まず非特異的増幅が生じ易いため、本発明の核酸増幅法を適用することが特に好ましい。
本発明のプログラムによれば、非特異的増幅を生じにくい変異プライマーを簡便に設計することができる。
本発明の設計方法は特に等温増幅法に用いるためのプライマーの設計のために適用することが好ましい。
(A)前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の5´末端及び3´末端と、それぞれ5´末端及び3´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
(B)炭素鎖又はPEG鎖からなるスペーサー鎖。
(C)一般式1で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
(D)光分解性修飾のされたスペーサー鎖。
(A)の変異が導入されたプライマーは通常のヌクレオチド残基で構成されているが、変異導入部位におけるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチドの結合様式が通常とは逆転しているため、DNAポリメラーゼがこれをヌクレオチド残基であると認識できず、核酸合成反応を継続することができない(図2)。また、当該変異が導入されたプライマーが相補鎖とハイブリダイゼーションする際に、当該変異は相補鎖側の塩基と水素結合を形成しない。
また、導入する変異をPEG鎖とする場合には、置換するヌクレオチド残基1個当たりの当該PEG鎖の重合度は、好ましくは1〜3とすることができる。
なお、AbasicのTBDMS保護基(tert-butyldimethylsily基)はプライマー合成の際に脱保護される。そのため、Abasicを導入した後のプライマーの構造は、図5においてRをOHとした構造となる。
本発明のプライマーの設計方法は、基礎配列設計工程を含む。基礎配列設計工程は鋳型DNAに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する工程であり、通常の核酸増幅法におけるプライマーの設計と同様に行うことができる。すなわち、特異性、GC含有量、Tm値などの観点からプライマーに適した15〜50塩基程度の塩基配列を、標的とする塩基配列の中から選択する。特異性やGC含有量、Tm値などの算出方法は制限されず、手計算でもよいし一般的に利用されている計算ツールなどを使用してもよい。
(1)プライマーダイマーの形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
(2)プライマー1分子内でのループ構造の形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
(3)前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
(4)前記基礎プライマー配列からなるプライマーが1分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
(1)の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し(図7中黒塗り矢印)、変異を導入することでプライマーダイマーの形成を抑制し、非特異的増幅の発生を抑えることができる(図8)。
(2)の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し(図9中黒塗り矢印)、変異を導入することでループ構造の形成を抑制し、非特異的増幅の発生を抑えることができる(図10)。
プライマーダイマーが形成されると、図11に示すようにプライマー自体が鋳型となり、DNAポリメラーゼが最大限合成可能な鎖長にまで非特異的増幅が生じてしまう。(3)の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し(図11中黒塗り矢印)、変異を導入することで、変異導入部位においてDNAポリメラーゼのDNA合成反応を阻害し、非特異的増幅産物の鎖長を短く抑制することができる(図12)。
Mycobacterium bovis BCG str. Tokyo 172株のゲノムDNAにおけるDirect Repeat配列を、再表2012/124681号公報に記載の核酸増幅法(TRIAmp増幅法)により増幅するため、同公報においてDRa-21及びDRb-19として記載のプライマーのセットを用意した。これらプライマーの配列を表1上段にプライマー1F及びプライマー1Rとして示す。なお、特に指定のない場合には、本試験例記載のプライマーの溶媒は1×TE buffer である。
これにより選出されたヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し、表1に示すプライマーセット2及び3のプライマーを設計し、これを調製した。
また、プライマーセット2及び3における変異導入部位より3´末端側の配列からなるプライマーを用意した(プライマーセット4及び5、表1)。
これらの結果は、本発明の方法で変異が導入されたプライマーは、同プライマーの変異導入部位から5´末端側を単純に欠損させたプライマーとは機能が異なるということを示している。
表1に示すFプライマー及びRプライマーのプライマーセットを用いて、表2に示す組成においてテンプレートDNAを水に代えた反応溶液を調製し、試験例1と同様の条件でTRIAmp増幅反応を行い増幅曲線及びCt値を算出した。結果を表4及び図19、20に示す。
なお、TRIAmp増幅反応はそれぞれのプライマーの組み合わせについて反応溶液を4セット調製し(以下、それぞれのサンプルを非特異的サンプル1〜4という)、それぞれについて増幅曲線とCt値を算出した。
この結果は、プライマーへの変異の導入により、非特異的増幅が強く抑制されていることを示している。
また、プライマーセット5はプライマーセット3における変異導入部位より3´末端側の配列を有するが、プライマー5を用いた場合では、反応溶液にテンプレートDNAが含まれていたとしても、核酸増幅反応が起こらない。
これらの結果は、本発明の方法で変異が導入されたプライマーは、同プライマーの変異導入部位から5´末端側を単純に欠損させたプライマーとは機能が異なるということを示している。
表5に示した配列中、mで表される位置にSpacer C3、dSpacer、Spacer 9、Abasic、又はPC Spacerから誘導される構造が導入されたFプライマー及びRプライマーのプライマーセットを用意した。
なお、プライマーセット3 Abasicの溶媒は0.2Mトリエチルアミン−酢酸溶液を滅菌水で10μMに希釈したものである。
また、表5に示すFプライマー及びRプライマーのプライマーセット及び、表1に示すFプライマー及びRプライマーのプライマーセット1〜3を用いて、表2に示す組成においてテンプレートDNAを水に代えた反応溶液を調製し、試験例1と同様の条件でTRIAmp増幅反応を行い増幅曲線及びCt値を算出した。結果を表7及び図29、30に示す。
なお、TRIAmp増幅反応はそれぞれのプライマーの組み合わせについて反応溶液を4セット調製し(以下、それぞれのサンプルを非特異的サンプル1〜4という)、それぞれについて増幅曲線とCt値を算出した。
この結果は、本発明の方法によるプライマーへの変異の導入により、非特異的増幅が強く抑制されていることを示している。
Claims (6)
- 核酸増幅法に用いる、変異が導入されたプライマーの設計方法であって、
鋳型DNAに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する基礎配列設計工程と、
該基礎プライマー配列に含まれる1又は2以上のヌクレオチド残基であって、以下の(1)〜(4)からなるヌクレオチド残基群から選ばれる1又は2以上の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択する変異導入部位選択工程を備え、
前記変異が、以下の(A)〜(D)からなる変異群から選ばれる1種又は2種以上である、設計方法。
[ヌクレオチド残基群]
(1)プライマーダイマーの形成に寄与すると予測されるヌクレオチド残基。
(2)プライマー1分子内でのループ構造の形成に寄与すると予測されるヌクレオチド残基。
(3)前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
(4)前記基礎プライマー配列からなるプライマーが1分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
[変異群]
(A)前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の5´末端及び3´末端と、それぞれ5´末端及び3´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
(B)炭素鎖又はPEG鎖からなるスペーサー鎖。
(C)一般式1で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
一般式1
(一般式1中、RはH,または水酸基、nは自然数を示す。)
(D)光分解性修飾のされたスペーサー鎖。 - 核酸増幅法に用いる、変異が導入されたプライマーの設計方法であって、
鋳型DNAに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する基礎配列設計工程と、
該基礎プライマー配列に含まれる、プライマーダイマー又はループ構造の形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基を予測する、予測工程と、
前記予測工程の後に、該基礎プライマー配列に含まれる1又は2以上のヌクレオチド残基であって、以下の(1)〜(4)からなるヌクレオチド残基群から選ばれる1又は2以上の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択する変異導入部位選択工程を備え、
前記変異が、以下の(A)〜(D)からなる変異群から選ばれる1種又は2種以上である、設計方法。
[ヌクレオチド残基群]
(1)前記予測工程において、プライマーダイマーの形成に寄与すると予測されたヌクレオチド残基。
(2)前記予測工程において、プライマー1分子内でのループ構造の形成に寄与すると予測されたヌクレオチド残基。
(3)前記予測工程の結果、前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
(4)前記予測工程の結果、前記基礎プライマー配列からなるプライマーが1分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
[変異群]
(A)前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の5´末端及び3´末端と、それぞれ5´末端及び3´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
(B)炭素鎖又はPEG鎖からなるスペーサー鎖。
(C)一般式1で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
一般式1
(一般式1中、RはH,または水酸基、nは自然数を示す。)
(D)光分解性修飾のされたスペーサー鎖。 - 請求項1又は2に記載の設計方法により設計されたプライマーを合成する工程を含む、変異プライマーの製造方法。
- 請求項3に記載の製造方法により合成されたプライマーを用いることを特徴とする、核酸増幅法。
- 等温増幅法であることを特徴とする請求項4に記載の核酸増幅法。
- 請求項1又は2に記載の設計方法の各工程を手順としてコンピュータに実行させるためのプログラム。
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