JP2020503838A - 核酸の対立形質特異的プライマー及びそれを用いた遺伝子型判別方法 - Google Patents

Abstract

【課題】一塩基多型（ＳＮＰ）を有する配列へのハイブリダイゼーション特異性を増大させたプライマー及びそれを用いた遺伝子型判別方法を提供することにより、一塩基多型の検出感度を増大させること。【解決手段】一般式：５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’（Ｘは、ハイブリダイズされる鋳型核酸に相補的な１５〜２５ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む第１の結合部位であり、Ｙは、３〜１０ｂｐのループ形成部位であり、Ｚは、前記鋳型核酸に対して相補的な５〜１０ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列、及び対立形質に相応するヌクレオチドとそれに続く１〜３ｂｐの非相補的ヌクレオチドを含む第２の結合部位であり、前記Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである）で示されるプライマーを含むプライマーセット。【選択図】図１

Description

本発明は、一塩基多型を有する配列へのハイブリダイゼーション特異性を増大させたプライマー及びそれを用いた遺伝子型判別方法に関する。

塩基配列多型は、１％を超える頻度で現れる塩基配列の変異を称するものであり、そのうち９０％は、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）である。ヒト遺伝子配列は、９９．９％同一であり、ＳＮＰは、約２５０〜１０００ｂｐ毎に一つずつ現れ、ヒト遺伝体の場合、約２百万個のＳＮＰが存在し、二重遺伝子には、約２１，０００個が存在する。また、１％以下の頻度で現れる他の一塩基の変異は、通常、突然変異と称する。

塩基配列突然変異の解析またはＳＮＰは、ＤＮＡ配列解析はもとより、疾患、例えば、癌、喘息、糖尿病のような疾患を引き起こす遺伝子の発掘または特定疾患との連関性を判断することができるマーカーとして重要な役割をする（非特許文献１）。

したがって、一塩基配列の変異またはＳＮＰを解析することにより、ヒトの場合、特定疾患への個人の感受性を把握し、塩基配列の違いにより発生する先天性疾病への予防または発病した疾患の治療に役立つ。

一塩基変異を解析する方法としては、重合酵素連鎖反応であるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行ってから、特異的制限酵素を用いて増幅産物のフラグメント長の差異で確認するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ)、対立形質に特異的なプライマーを用いてＤＮＡを増幅してから電気泳動で確認するＳＳＰ−ＰＣＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡを蛍光物質を用いて実時間で測定するリアルタイムＰＣＲ、プライマーの両末端に制限酵素が反応する塩基配列をさらに入れてプライマーの反応後、制限酵素により切断されたプライマーがさらに増幅反応に用いられるＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の方法が知られている。

しかしながら、これらの方法は、過多な時間が所要し、非特異的ＰＣＲ産物の汚染可能性、高価の装備及び試薬等の短所があった。また、対立形質に特異的なプライマーを用いるとき、プライマーの鋳型に対する特異性を向上させるための試みがあったが、依然として、遺伝子型判別において正確な結果が得られないことがあった。ここに、一塩基多型についてさらに迅速かつ正確な判別結果が得られる方法が、求め続けられている。

本明細書の全体にわたって、多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体をもって本明細書に参照として援用され、本発明が属する技術分野における水準及び本発明の内容がさらに明確に説明される。

韓国公開特許第１０−２０１４−００５６３９７号公報（２０１４．０５．０９．公開）

Ｙｅ Ｓ１， Ｄｈｉｌｌｏｎ Ｓ， Ｋｅ Ｘ， Ｃｏｌｌｉｎｓ ＡＲ， Ｄａｙ ＩＮ． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００１ Ｓｅｐ １；２９（１７）：Ｅ８８−８；ｏｏｋｅｓ ＡＪ． Ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ ＳＮＰｓ． Ｇｅｎｅ． １９９９ Ｊｕｌ ８；２３４（２）：１７７−８６．

本発明は、前記問題点に鑑みなされたものであり、一塩基多型（ＳＮＰ）を有する配列へのハイブリダイゼーション特異性を増大させたプライマー及びそれを用いた遺伝子型判別方法を提供することにより、一塩基多型の検出感度を増大させることをその目的とする。

本発明の技術的課題は、上述した技術的課題に制限されず、言及されなかった他の技術的課題は、以下の記載に基づいて当業者に明確に理解される。

前記目的を達成するために、本発明者等は、既存のＤＰＯ（Ｄｕａｌ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）方式によるプライマー内におけるＳＮＰのすぐ手前に非相補的ヌクレオチドを挿入することにより、ＳＮＰを含む鋳型への特異性が向上することを見い出し、本発明を完成するに至った。

本発明の一態様は、下記一般式１で示されるプライマーを含むプライマーセットを提供する。

式１：
５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’
上記式において、Ｘは、ハイブリダイズされる鋳型核酸に相補的な１５〜２５ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む第１の結合部位であり、Ｙは、３〜１０ｂｐのループ形成部位であり、Ｚは、前記鋳型核酸に対して相補的な５〜１０ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列、及び対立形質に相応するヌクレオチドとそれに続く１〜３ｂｐの非相補的ヌクレオチドを含む第２の結合部位であり、前記Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。

本発明の一実施例によると、前記第２の結合部位において、非相補的ヌクレオチドは、前記対立形質に相応するヌクレオチドの５’位に連続されてもよい。

本発明の一実施例によると、前記非相補的ヌクレオチドは、１ｂｐであってもよい。

本発明の一実施例によると、前記ループ形成部位は、イノシン、デオキシイノシン、７−ジアザ−２−デオキシイノシン、２−アザ−２−デオキシイノシン、２−ＯＭｅ−イノシン、２’−Ｆ−イノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ−３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−５−ニトロインドール、２’−Ｆ−５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群より選ばれてもよい。

本発明の一実施例によると、前記ハイブリダイズされる鋳型核酸は、ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子、ＡＰＯＥ遺伝子、ＡＱＰ３遺伝子、及び前記遺伝子の組み合せからなる群より選ばれてもよい。

本発明の一実施例によると、前記プライマーセットは、配列番号１ないし配列番号３の塩基配列、配列番号４ないし配列番号６の塩基配列、及び配列番号７ないし配列番号９の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで構成されるプライマーを含んでもよい。

本発明の一態様は、前記プライマーセットを含む一塩基対立形質判別用の組成物を提供する。

本発明の他の一態様は、前記一塩基対立形質判別用の組成物を用いる一塩基対立形質判別方法を提供する。

本発明によれば、プライマーセットは、一塩基多型（ＳＮＰ）を有する核酸鋳型へのハイブリダイゼーション特異性を増大させることにより、一塩基多型の検出感度を増大させ、対象鋳型の遺伝子型判別においてさらに正確な結果を提供することができる。

本発明に係るプライマーを示す説明図 本発明に係るプライマーの鋳型特異的結合及びそれによる複製有無を示す説明図 本発明に係るプライマーセットを用いて遺伝子型を判別する方法の概念を示す説明図 本発明に係るプライマーと比較例に係るプライマーによるＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のＳＮＰ ｒｓ１１９５０６４６の遺伝子型の判別結果を示す説明図 温度による本発明のプライマーを用いたＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のＳＮＰ ｒｓ１１９５０６４６の遺伝子型の判別結果を示す説明図 本発明に係るプライマーと比較例に係るプライマーによるＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ ｒｓ４２９３５８の遺伝子型の判別結果を示す説明図 温度による本発明のプライマーを用いたＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ ｒｓ４２９３５８の遺伝子型の判別結果を示す説明図 本発明に係るプライマーと比較例に係るプライマーによるＡＱＰ３遺伝子のＳＮＰ ｒｓ３４３９１４９０の遺伝子型の判別結果を示す説明図 温度による本発明のプライマーを用いたＡＱＰ３遺伝子のＳＮＰ ｒｓ３４３９１４９０の遺伝子型の判別結果を示す説明図

本発明の詳細な説明において引用される図面をさらに十分理解するために、各図面の簡単な説明が提供される。
以下、添付された図面を参照して、本発明の好適な実施例について詳述する。後述する説明は、本発明の実施例を理解しやすくするためのものであり、保護範囲を制限するためのものではない。

本発明は、第１の結合部位、ループ形成部位、及び第２の結合部位を有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、第２の結合部位の対立形質に相応するヌクレオチドとそれに続く非相補的ヌクレオチドを含むことを特徴とする。

以下、本発明について詳述する。

本発明は、下記一般式１で示されるプライマーを含むプライマーセットを提供する。

式１：
５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’
上記式において、Ｘは、ハイブリダイズされる鋳型核酸に相補的な１５〜２５ｂｐ、好ましくは２１〜２３ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む第１の結合部位であり、Ｙは、３〜１０ｂｐ、好ましくは５〜７ｂｐのループ形成部位であり、Ｚは、前記鋳型核酸に対して相補的な５〜１０ｂｐ、好ましくは６または７ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列、及び対立形質に相応するヌクレオチドとそれに続く１〜３ｂｐの非相補的ヌクレオチドを含む第２の結合部位であり、前記Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。

本発明において、「プライマー」は、複製対象である鋳型（核酸）に相補的に結合して複製合成の開始点として作用する単一筋のオリゴヌクレオチドであって、合成酵素（ポリメラーゼ）を用いた核酸増幅または合成反応において、その３’末端にヌクレオチドが共有結合により付加されて延長される核酸分子を称する。プライマーを構成するオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであってもよいが、デオキシリボヌクレオチドが好ましい。

本発明に係るプライマーは、第１の結合部位、ループ形成部位、及び第２の結合部位を含み（図１）、結合鋳型へのプライマーの結合特異性は、第１の結合部位及び第２の結合部位により二重に決定される。

鋳型の複製等において、ループ形成部位により連結された第１の結合部位と第２の結合部位が全て鋳型に結合された場合は、当該プライマーからの鋳造複製が始まるが、第１の結合部位と第２の結合部位のいずれか一つの結合部位だけが結合された場合、または両方の結合部位が全て結合されていない場合は、鋳型の複製が行われない（図２）

本発明において、第１の結合部位と非相補的部位を除いた第２の結合部位は、鋳型の結合対象の配列と相補的な配列を有することが好ましいが、非相補的配列を含む場合であっても、プライマーと鋳型の結合が可能であれば、非相補的配列を含んでもよい。このとき、非相補的配列は、第１の結合部位と第２の結合部位において、それぞれ１〜３ｂｐ、及び１または２ｂｐであってもよい。

本発明において、第２の結合部位は、対立形質に相応するヌクレオチドとそれに続く非相補的ヌクレオチドを含んでもよい。

本発明において、第２の結合部位は、下記一般式２で示されるポリヌクレオチドを含んでもよい。

式２：
５’−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−３’
上記式において、Ｚ１は、ハイブリダイズされる鋳型核酸に相補的な２〜５ｂｐ、好ましくは２または３ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列、Ｚ２は、１〜３ｂｐ、好ましくは１ｂｐの非相補的ヌクレオチド、Ｚ３は、対立形質に相応するヌクレオチド、及びＺ４は、前記鋳型核酸に対して相補的な２〜８ｂｐ、好ましくは３〜５ｂｐ、より好ましくは３ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列である。

本発明において、「対立形質に相応するヌクレオチド」は、染色体の単一部位において、多くのＤＮＡ塩基の一つに現れる一般の突然変異により一塩基多型（ＳＮＰ）が観察される位置である。一般に、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴによる一塩基多型が観察され、本発明における一塩基多型は、ＡとＧまたはＴとＣによるものが観察される。これにより、観察可能なＳＮＰ遺伝子型としては、ＡＡ型、ＡＧ型及びＧＧ型、またはＴＴ、ＴＣ及びＣＣ型が存在する。

本発明において、「非相補的ヌクレオチド」は、鋳型に相補的な配列のうち、選択により任意的に変更され、鋳型のヌクレオチドと結合されない部位であって、１〜３ｂｐ、好ましくは１ｂｐからなる。非相補的ヌクレオチドは、ＳＮＰに連続して存在してもよく、好ましくはＳＮＰの５’位に連続してもよい（アップストリーム）。

非相補的ヌクレオチドは、鋳型に相補的なヌクレオチドの１種を除いた３種のヌクレオチドのうちから選ばれてもよい。例えば、鋳型に相補的な塩基がＡである場合、非相補的ヌクレオチドとしては、Ａを除いたＧ、Ｃ、及びＴのうちいずれか一つが選ばれて代替されてもよい。前記３種のヌクレオチドのいずれが選ばれても、本発明に係るプライマーを作製することができるが、下記表１に記載された順位によって非相補的ヌクレオチドが選ばれる場合、順位の高い非相補的ヌクレオチドを選ぶほど、一塩基多型の検出感度がさらに向上する。

本発明において、ループ形成部位は、第１の結合部位と第２の結合部位を連結し、結合部位を構成するヌクレオチドの種類を問わず、鋳型に結合されることなく、ループを形成する。ループ形成部位は、３〜１０ｂｐ、好ましくは５〜７ｂｐ、より好ましくは５ｂｐである。ループ形成部位は、イノシン、デオキシイノシン、７−ジアザ−２−デオキシイノシン、２−アザ−２−デオキシイノシン、２−ＯＭｅ−イノシン、２’−Ｆ−イノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ−３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−５−ニトロインドール、２’−Ｆ−５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群より選ばれてもよいが、これに限定されず、好ましくはイノシンである。

本発明において、「鋳型」は、複製または合成の対象となるＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列を意味し、単鎖ＤＮＡ、複鎖ＤＮＡ、単鎖ＲＮＡ、複鎖ＲＮＡ等が鋳型として作用することができる。鋳型が、複鎖ＤＮＡまたは複鎖ＲＮＡである場合、二本筋のポリヌクレオチド鎖の両方が鋳型として作用する。

複製または合成の対象である鋳型となる配列には限定がないが、本発明者等は、ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のＳＮＰ ｒｓ１１９５０６４６、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ ｒｓ４２９３５８、及びＡＱＰ３遺伝子のＳＮＰ ｒｓ３４３９１４９０において、第２の結合部位に非相補的ヌクレオチドを含まないプライマーを用いると、不正確に解析されるのとは異なり、本発明に係るプライマーを用いると、正確な結果が得られることが確認された（図４、６、及び８参照）。

本発明は、本発明に係るプライマーセットを含む一塩基対立形質判別用の組成物を提供する。本発明に係る一塩基対立形質判別用の組成物は、本発明に係るプライマーセットのほか、ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、緩衝液、塩化マグネシウム、及びＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。また、反応性の向上のために、ベタイン、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）等の物質をさらに含んでもよいが、これに限定されるものではない。

本発明は、本発明に係る一塩基対立形質判別用の組成物を用いる一塩基対立形質判別方法を提供する。本発明に係る一塩基対立形質判別方法は、本発明に係る一塩基対立形質判別用の組成物のうちのプライマーを用いて、試料中の鋳型を複製合成し、当該対立形質における塩基ピークを確認することにより、遺伝子型を確認することができるが、これに限定されるものではない。

以下、一つ以上の実施例を通じてさらに詳述する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例
実施例１．プライマーセットのデザイン及び製造（ＳＬＣ２３Ａ１）
ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のｒｓ１１９５０６４６の座位を用いて、その対立形質を特異的に検出可能であるかを確認するために、表２のように、プライマーセットを作製した。

ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のｒｓ１１９５０６４６の座位に対する一塩基多型の正確な判別のために、標的遺伝子の塩基配列をＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＳＮＰデータベースから得て、ｒｓ１１９５０６４６の検出プライマーの作製に用いた。

ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のｒｓ１１９５０６４６の座位の配列を基本とするが、ループ形成部位として１９番目及び２４番目の塩基間にイノシンが位置するようにデザインした。また、ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のｒｓ１１９５０６４６の座位の５’方向には、チミン（Ｔ）が存在するので、その代わりにシトシン（Ｃ）が位置するようにデザインした。前記配列を標的核酸とし、対立形質ＡとＧの検出用としてプライマーセットを完成した。

本願の一具現例によりデザインされた各プライマー配列は、上記表２に記載された通りである。また、各プライマー塩基配列は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、及びＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて検証した結果、当該遺伝子以外には、一致する塩基配列が存在しなかった。

実施例２．プライマーセットのデザイン及び製造（ＡＰＯＥ）
ＡＰＯＥ遺伝子のｒｓ４２９３５８の座位を用いて、その対立形質を特異的に検出可能であるかを確認するために、表３のように、プライマーセットを作製した。

ＡＰＯＥ遺伝子のｒｓ４２９３５８の座位に対する一塩基多型の正確な判別のために、標的遺伝子の塩基配列をＮＣＢＩのＳＮＰデータベースから得て、ｒｓ４２９３５８の検出プライマーの作製に用いた。

ＡＰＯＥ遺伝子のｒｓ４２９３５８の座位の配列を基本とするが、ループ形成部位として１８番目及び２３番目の塩基間にイノシンが位置するようにデザインした。また、ＡＰＯＥ遺伝子のｒｓ４２９３５８の座位の５’方向には、グアニン（Ｇ）が存在するので、その代わりにチミン（Ｔ）が位置するようにデザインした。前記配列を標的核酸とし、対立形質ＣとＴの検出用としてプライマーセットを完成した。

本願の一具現例によりデザインされた各プライマー配列は、上記表３に記載された通りである。また、各プライマー塩基配列は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、及びＢｌａｓｔを用いて検証した結果、当該遺伝子以外には、一致する塩基配列が存在しなかった。

実施例３．プライマーセットのデザイン及び製造（ＡＱＰ３）
ＡＱＰ３遺伝子のｒｓ３４３９１４９０の座位を用いて、その対立形質を特異的に検出可能であるかを確認するために、表４のように、プライマーセットを作製した。

ＡＱＰ３遺伝子のｒｓ３４３９１４９０の座位に対する一塩基多型の正確な判別のために、標的遺伝子の塩基配列をＮＣＢＩのＳＮＰデータベースから得て、ｒｓ３４３９１４９０の検出プライマーの作製に用いた。

ＡＱＰ３遺伝子のｒｓ３４３９１４９０の座位の配列を基本とするが、ループ形成部位として２２番目及び２８番目の塩基間にイノシンが位置するようにデザインした。また、 ＡＱＰ３遺伝子のｒｓ３４３９１４９０の座位の５’方向には、グアニン（Ｇ）が存在するので、その代わりにアデニン（Ａ）が位置するようにデザインした。前記配列を標的核酸とし、対立形質ＡとＧの検出用としてプライマーセットを完成した。

本願の一具現例によりデザインされた各プライマー配列は、上記表４に記載された通りである。また、各プライマー塩基配列は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、及びＢｌａｓｔを用いて検証した結果、当該遺伝子以外には、一致する塩基配列が存在しなかった。

比較例１ないし３．非相補的部位が不在するプライマーの製造
プライマーの作製時、各遺伝子において、ＳＮＰ相補的部位の５’方向に存在する塩基に非相補的な塩基を位置させるのを除いては、前記実施例１ないし３に記載の方法と同様にして、それぞれ比較例１ないし３のプライマー（表５）を製造した。

実験例１．遺伝子型の判別（ＳＬＣ２３Ａ１）
ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のｒｓ１１９５０６４６の座位に対する遺伝子型は、遺伝子型別のサンプルを用いて、全ての遺伝子型（ＡＡ／ＡＧ／ＧＧ）において、実施例と比較例によるプライマーの特異性の比較を行った。

実施例１及び比較例１によるプライマーセットを用いて、ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子のｒｓ１１９５０６４６の座位に対する各遺伝子型のＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅した。増幅は、プロトコールに従い、ＰＣＲ条件、９５℃５分から開始し、（９５℃３０秒、６６℃３０秒、及び７２℃３０秒）を３５回繰り返し、最終７２℃で５分間処理して行った。

実施例１及び比較例１のプライマーを用いたＰＣＲ産物を両方向にシーケンシングし、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＳＷ １．１を用いて、その遺伝子型ピークを解析した（図４、赤色：Ａ−ピーク；青色：Ｇ−ピーク）。

図４の（ａ）は、実施例１のプライマーセットを、（ｂ）は、比較例１のプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物に対するクロマトグラム結果である。比較例１の場合、プライマーの非特異的結合により、ＡＡ及びＧＧ遺伝子型でもＡＧ型と解析され、不正確な結果が得られるのに対して、実施例１の場合、全ての遺伝子型において正確な結果が得られた。

遺伝子型解析の適正温度を決定するために、ＡＡ遺伝子型サンプル及び実施例１で製造されたプライマーセットを用いたＰＣＲにおいて、結合段階（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）の温度を６０℃、６２℃、６４℃、６６℃、及び６８℃に異ならせて試験した。実験結果、６４℃及び６６℃で正確な結果が確認された（図５）。

実験例２．遺伝子型の判別（ＡＰＯＥ）
ＡＰＯＥ遺伝子のｒｓ４２９３５８の座位に対するＴＴ遺伝子型サンプルを用いて、前記座位における実施例と比較例によるプライマーの特異性の比較を行った。

実施例２及び比較例２によるプライマーセットを用いて、ＡＰＯＥ遺伝子のｒｓ４２９３５８の座位に対するＡＡ遺伝子型のＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅した。増幅は、プロトコールに従い、ＰＣＲ条件、９５℃５分から開始し、９５℃３０秒、６４℃３０秒、及び７２℃３０秒を３５回繰り返し、最終７２℃で５分間処理して行った。

実施例２及び比較例２のプライマーを用いたＰＣＲ産物を両方向にシーケンシングし、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＳＷ １．１を用いて、その遺伝子型ピークを解析した（図６、赤色：Ｔ−ピーク；青色：Ｃ−ピーク）。

図６の（ａ）は、実施例２のプライマーセットを、（ｂ）は、比較例２のプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物に対する遺伝子型の解析結果である。比較例２の場合、プライマーの非特異的結合により、ＴＴ遺伝子型においてＴＣ型と解析され、不正確な結果が得られるのに対して、実施例１の場合、ＴＴ遺伝子型として正確に一致した結果が得られた。

遺伝子型解析の適正温度を決定するために、ＴＴ遺伝子型サンプル及び実施例２で製造されたプライマーセットを用いたＰＣＲにおいて、結合段階の温度を６０℃、６３℃、６６℃、及び６９℃に異ならせて試験した。実験の結果、６３℃で正確な結果が確認された（図７）。

実験例３．遺伝子型の判別（ＡＱＰ３）
ＡＱＰ３遺伝子のｒｓ３４３９１４９０の座位に対するＧＧ遺伝子型サンプルを用いて、前記座位における実施例と比較例によるプライマーの特異性の比較を行った。

実施例３及び比較例３によるプライマーセットを用いて、ＡＱＰ３遺伝子のｒｓ３４３９１４９０の座位に対するＧＧ遺伝子型のＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅した。増幅は、プロトコールに従い、ＰＣＲ条件、９５℃５分から開始し、９５℃３０秒、６４℃３０秒、及び７２℃３０秒を３５回繰り返し、最終７２℃で５分間処理して行った。

実施例３及び比較例３のプライマーを用いたＰＣＲ産物を両方向にシーケンシングし、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＳＷ １．１を用いて、その遺伝子型ピークを解析した（図８、赤色：Ａ−ピーク；青色：Ｇ−ピーク）。

図８の（ａ）は、実施例３のプライマーセットを、（ｂ）は、比較例３のプライマーセットを用いたＰＣＲ増幅産物に対するクロマトグラム結果である。実施例３と比較例３のプライマー共に正確な遺伝子型が確認された。

しかしながら、結果ピークをみると、実施例３では、Ａ遺伝子型に対する非特異的プライマーの付着が全く観察されないのに対して、比較例３では、Ｇよりも相対的に低くはあるが、非特異的に結合したプライマーによってＡ−ピークが現れることが確認された。

遺伝子型解析の適正温度を決定するために、ＧＧ遺伝子型サンプル及び実施例３で製造されたプライマーセットを用いたＰＣＲにおいて、結合段階の温度を５５℃、５８℃、６２℃、及び６４℃に異ならせて試験した。実験結果、５５℃、５８℃、及び６２℃で正確な遺伝子型の解析結果が確認された（図９）。

以上、本発明について、その好適な実施例に基づいて説明した。本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が、その本質的な特性を逸脱しない範囲内で変形された形態で具体化され得ることが理解される。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮される。本発明の範囲は、上述した詳細な説明よりも後述する特許請求の範囲により定められ、特許請求の範囲の意味及び範囲、またその均等概念から導出される全ての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれる。

Claims (8)

1. 下記一般式：
   ５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’
   （Ｘは、ハイブリダイズされる鋳型核酸に相補的な１５〜２５ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む第１の結合部位であり、
   Ｙは、３〜１０ｂｐのループ形成部位であり、
   Ｚは、前記鋳型核酸に対して相補的な５〜１０ｂｐのハイブリダイゼーションヌクレオチド配列、及び対立形質に相応するヌクレオチドとそれに続く１〜３ｂｐの非相補的ヌクレオチドを含む第２の結合部位であり、
   前記Ｘ、Ｙ、及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである）
   で示されるプライマーを含む
   ことを特徴とするプライマーセット。
2. 前記第２の結合部位において、非相補的ヌクレオチドは、前記対立形質に相応するヌクレオチドの５’位に連続されたものである
   請求項１に記載のプライマーセット。
3. 前記非相補的ヌクレオチドは、１ｂｐである
   請求項２に記載のプライマーセット。
4. 前記ループ形成部位は、イノシン、デオキシイノシン、７−ジアザ−２−デオキシイノシン、２−アザ−２−デオキシイノシン、２−ＯＭｅ−イノシン、２’−Ｆ−イノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ−３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−５−ニトロインドール、２’−Ｆ−５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群より選ばれるものである
   請求項１に記載のプライマーセット。
5. 前記ハイブリダイズされる鋳型核酸は、ＳＬＣ２３Ａ１遺伝子、ＡＰＯＥ遺伝子、ＡＱＰ３遺伝子、及び前記遺伝子の組み合せからなる群より選ばれるものである
   請求項１に記載のプライマーセット。
6. 前記プライマーセットは、配列番号１ないし配列番号３の塩基配列、配列番号４ないし配列番号６の塩基配列、及び配列番号７ないし配列番号９の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで構成されるプライマーを含む
   請求項１に記載のプライマーセット。
7. 請求項１ないし６のいずれかに記載のプライマーセットを含む一塩基対立形質判別用の組成物。
8. 請求項７に記載の一塩基対立形質判別用の組成物を用いる一塩基対立形質判別方法。
   
   

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