JP6755857B2 - 遺伝子変異の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）−クランピング法を用いて遺伝子変異を検出する方法であって、野生型核酸のＰＣＲ増幅をより効果的に抑制することにより、変異型核酸をより高感度に検出するための方法に関する。
本願は、２０１５年４月１４日に日本に出願された特願２０１５−０８２４９５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

がん領域の分子標的薬の進歩により、がん治療法は改善され大きな転機を迎えつつある。とりわけ薬剤の効果を分子レベルで考えることが可能になり、遺伝子を調べることによってその効果を予測することも可能になってきている。例えば、大腸がんの治療薬である抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）抗体の場合、ｋ−ｒａｓ遺伝子に変異がある患者には効果がなく、ｋ−ｒａｓ遺伝子が野生型の患者にのみ効果があることがわかっている。このため、実際の臨床現場では治療の前にｋ−ｒａｓ遺伝子変異の検査が行われている。また、肺がんの分子標的薬の使用においては、ＥＧＦＲ遺伝子に変異がある患者のみ効果があり、肺がんの分子標的薬治療においても遺伝子変異の検査が実施されている。一方、がん患者の血液中には、がん細胞から遊離したＤＮＡやがん細胞そのものが浮遊していることが明らかとなってきており、それらを利用してがんの診断や薬剤の効果を予測する試みがなされている。

前記遺伝子変異の検査においては、正常細胞に混在するがん細胞に由来する比較的存在割合の低い変異遺伝子を検出する必要がある。特に肺がん治療においては、従来の検査方法では検出できないほど極めて小さい割合で薬剤に耐性の変異遺伝子をもつがん細胞が共存している。このため、投薬前の検査において変異遺伝子が検出されなかった患者において、薬剤治療において耐性変異遺伝子をもつがん細胞が次第に増加するという問題がある。耐性遺伝子変異をもつがん細胞を、従来よりも存在割合が小さい段階で検出できれば、薬剤耐性の出現を早期に予測することができ、よりよい治療に結びつけることができる。
以上のような観点から、がん関連遺伝子変異の高感度検出（野生型に混入した非常に低い割合の変異遺伝子の検出）はがん治療においてますます重要とされている。

遺伝子変異の検査法で最も典型的な方法はサンガーシーケンシング法である。サンガーシーケンシング法は遺伝子変異検出のゴールドスタンダードと呼ばれてきた。しかしながら、野生型遺伝子に混入する変異型遺伝子の割合が１０〜２０％を下回ると検出が困難である。従って、がん領域においてはサンガーシーケンシングの感度を上回る方法が必要とされ、種々の方法が考案され、一部は臨床で使用されている（非特許文献１参照。）。

それらの中にＰＣＲ−クランピング法と呼ばれる方法がある。当該方法は、最初にＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）を利用して行われた（非特許文献２参照。）。ＰＮＡは、ペプチド核酸とも呼ばれる人工核酸であり、核酸の糖部をつなぐリン酸ジエステル結合を、グリシンを単位とするペプチド結合に置換した構造をもつ。ＰＮＡは天然の核酸と異なり電荷はもたないが、相補的な配列をもつ核酸に対してＤＮＡやＲＮＡより強固に結合（ハイブリダイズ）し、しかも高い特異性を示す。ここで、高い特異性とは、ＰＮＡが完全に相補的なＤＮＡやＲＮＡには高い結合力を示すが、１塩基でも相補的でない塩基が含まれる場合、その結合力が大きく低下することである。ＰＣＲ−クランピング法は、野生型遺伝子に相補的な配列をもつＰＮＡオリゴヌクレオチド（ＰＮＡを含むオリゴヌクレオチド）をＰＣＲ反応中に添加し、ＰＮＡオリゴヌクレオチドが変異型遺伝子よりも野生型遺伝子に対して特異的にハイブリダイズすることを利用した方法である。つまり、ＰＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしない変異型遺伝子の増幅が優先的に進行し、野生型遺伝子に対して変異型遺伝子の割合が増大したＰＣＲ生成物を得る方法である。また、ＲＮＡやＤＮＡとのハイブリダイズが天然のＤＮＡよりも強固になり、ＰＮＡと同様にＰＣＲ−クランピング法に利用されている非天然の核酸として、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）がある（非特許文献３参照）。ＬＮＡは、リボヌクレオシドのリボース環の２’−酸素と４’−炭素との間をメチレン鎖で結合して新たな環状構造を導入し、リボース環の立体構造の変化に制約を加えた化合物である。

ＰＮＡやＬＮＡと同様に、ＲＮＡやＤＮＡと高い特異性で強固にハイブリダイズする非天然核酸として、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）がある（特許文献１参照。）。ＢＮＡは、ＬＮＡ同様、リボヌクレオシドのリボース環の２’−酸素と４'−炭素との間を架橋した構造であるが、ＬＮＡとは異なり、架橋内には窒素原子が含まれ、環構造も６員環となっている。さらに、窒素原子を介して官能基を導入することも容易である。ＢＮＡオリゴヌクレオチド（ＢＮＡを含むオリゴヌクレオチド）を利用したＰＣＲ−クランピング法により、ｋ−ｒａｓ遺伝子変異及びＥＧＦＲ遺伝子変異の検出を行ったことも報告されている（例えば、特許文献２参照。）。

その他、ＰＮＡオリゴヌクレオチド（ＰＮＡを含むオリゴヌクレオチド）を用いたＰＣＲ−クランピング法において、ＰＮＡオリゴヌクレオチドとＰＣＲに用いるプライマーとの位置関係がＰＣＲ−クランピングの効率、すなわち、ＰＮＡオリゴヌクレオチドによる野生型核酸増幅抑制効果に影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献４参照。）。
当該報告においては、鋳型ＤＮＡを構成する２本の１本鎖ＤＮＡのうち、ＰＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしない１本鎖ＤＮＡ上において、プライマーがハイブリダイズする領域が、ＰＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ領域と相補的な領域からより離れている場合、ＰＣＲ−クランピングの効率が高いという結果が示されている。

日本国特許第４７３１３２４号公報 国際公開第２０１４／０５１０７６号

Goto，et al.，Annals of Oncology，2012，vol.23，p.2914-2919. Thiede，et al.，Nucleic Acids Research，1996，vol.24，p.983-984. Domingeuz，et al.，Oncogene，2005，vol.24，p.6830-4. Luo，et al.，Nucleic Acids Research，2006，vol.34， e12.

ＰＣＲ−クランピング法により、非常に存在割合の低い変異型遺伝子の検出感度が高められる。一方で、野生型遺伝子のＰＣＲ増幅を抑制するためのオリゴヌクレオチドとしてＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いる特許文献２に記載の方法であっても、臨床検査上で要求される変異型遺伝子の検出感度にはまだ不十分である。そのため、大過剰の野生型遺伝子の共存下において変異型遺伝子をより効率的に検出できる方法が必要とされている。

本発明は、野生型遺伝子のＰＣＲ増幅を抑制するためのオリゴヌクレオチドとしてＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ−クランピング法であって、野生型核酸のＰＣＲ増幅を効果的に抑制することにより、変異型核酸をより高感度に検出するための方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＣＲ−クランピング法において、クランピングに使用する野生型核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしてＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いる場合には、鋳型ＤＮＡを構成する２本の１本鎖ＤＮＡのうち、当該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖ＤＮＡ上において、プライマーがハイブリダイズする領域が、当該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域に近い場合、ＰＣＲ−クランピングの効率が高いことを見出し、本発明を完成させた。

本発明の第一態様に係る遺伝子変異の検出方法は、標的の遺伝子変異部位を含むゲノム領域と同一の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを有する鋳型ＤＮＡと、前記遺伝子変異部位を含む領域をＰＣＲにより増幅するように構成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーと、前記遺伝子変異部位が野生型であるゲノム領域と相補的な塩基配列を有し、かつ少なくとも１以上の非天然の核酸を含む野生型オリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅産物の総量、又は前記ＰＣＲ増幅産物中の前記遺伝子変異部位が変異型である核酸の量に基づいて、前記鋳型ＤＮＡから前記遺伝子変異部位が変異型である２本鎖ＤＮＡを検出し、前記非天然の核酸が、ＬＮＡ又はＢＮＡであり、前記鋳型ＤＮＡを構成する２本の１本鎖ＤＮＡのうち、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする第１の１本鎖ＤＮＡ上において、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域と、前記フォワードプライマー又は前記リバースプライマーがハイブリダイズする領域とが、１〜１８塩基離れている。
上記第一態様において、前記非天然の核酸がＢＮＡであってもよい。
上記第一態様において、前記ＰＣＲを行う際に、前記野生型オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子変異部位が野生型である前記鋳型ＤＮＡとはハイブリダイズし、かつ、前記遺伝子変異部位が変異型である前記鋳型ＤＮＡとはハイブリダイズしない温度で、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖伸長反応を行ってもよい。
上記第一態様において、前記ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲであってもよい。
本発明の第二態様に係る遺伝子変異検出用キットは、標的の遺伝子変異部位が野生型であるゲノム領域と相補的な塩基配列を有し、かつ少なくとも１以上の非天然の核酸を含む野生型オリゴヌクレオチドと、前記遺伝子変異部位を含むゲノム領域と同一の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型として、前記遺伝子変異部位を含む領域をＰＣＲにより増幅するように構成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーと、を有し、前記非天然の核酸が、ＬＮＡ又はＢＮＡであり、前記２本鎖ＤＮＡのうち、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする第１の１本鎖ＤＮＡ上において、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域と、前記フォワードプライマー又は前記リバースプライマーがハイブリダイズする領域とが、１〜１８塩基離れている。

本発明の上記態様に係る遺伝子変異の検出方法は、野生型核酸のＰＣＲ増幅を効果的に抑制することにより、大過剰の野生型遺伝子に含まれている極微量の変異型遺伝子を高感度に検出することができる。
また、本発明の上記態様に係る遺伝子変異検出用キットを用いることによって、本発明の上記態様に係る遺伝子変異の検出方法をより簡便に実施することができる。

本発明の第１実施形態に係る遺伝子変異の検出方法は、ＰＣＲ−クランピング法において、野生型オリゴヌクレオチドとして少なくとも１以上のＬＮＡ又はＢＮＡからなる非天然の核酸を含むオリゴヌクレオチドを用い、野生型オリゴヌクレオチドとＰＣＲに用いるプライマーの位置関係を特定の範囲内に調整することにより、ＰＣＲ−クランピングの効率を改善する方法である。ＰＣＲ−クランピング法は、遺伝子変異部位が野生型であるゲノム領域と相補的な塩基配列を有する野生型オリゴヌクレオチドの存在下でＰＣＲを行うことによって、野生型核酸（遺伝子変異部位が野生型である核酸）のＰＣＲ増幅を抑制し、変異型核酸（遺伝子変異部位が変異型である核酸）の検出感度を高める。野生型オリゴヌクレオチドとプライマーとの位置関係はＰＣＲ−クランピングの効率に影響する。ＰＣＲ−クランピングの効率を高めるために適した位置関係は、野生型オリゴヌクレオチドが有する非天然核酸の種類によって異なる。本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法においては、野生型オリゴヌクレオチドとしてＬＮＡ又はＢＮＡを含むオリゴヌクレオチドを用い、野生型オリゴヌクレオチドとプライマーとの鋳型ＤＮＡ上の距離を１８塩基以下に調整する。ＬＮＡ又はＢＮＡを含むオリゴヌクレオチドとプライマーとの距離を１８塩基以下と短くすることにより、ＰＣＲ−クランピングの効率を顕著に高めることができる。野生型オリゴヌクレオチドとプライマーとの距離がＰＣＲ−クランピングの効率に影響することは知られていた。しかしながら、ＰＣＲ−クランピングの効率改善に適した距離が、野生型オリゴヌクレオチドが有する非天然核酸の種類によって全く異なることは、本発明者らによって初めて見出された知見である。

本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法において用いられる野生型オリゴヌクレオチドは、検出対象である標的の遺伝子変異部位が野生型であるゲノム領域と相補的な塩基配列を有する。すなわち、標的の遺伝子変異部位が変異型である変異型核酸とは相補的ではない塩基が含まれる。このため、野生型オリゴヌクレオチドは、変異型核酸よりも野生型核酸に対して特異的にハイブリダイズする。

野生型オリゴヌクレオチドは、また、少なくとも１以上のＬＮＡ又はＢＮＡを含む。ＬＮＡ及びＢＮＡは、ヌクレオシドをリン酸ジエステル結合でつないだ構造を有し、ＰＮＡと比較すると天然の核酸に非常に近い構造といえる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドはその構造の特異性から鎖長の長いものの合成が困難なことや、塩基配列によっては水に対して著しく溶解性が低下するなどの問題がある。一方で、ＬＮＡオリゴヌクレオチド及びＢＮＡオリゴヌクレオチドではそのような問題がなく、ＰＣＲ−クランピング法にはより適した物質であると言える。ＢＮＡのヌクレオシド構造を下記式（１）及び（２）に示す。

野生型オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡオリゴヌクレオチド又はＢＮＡオリゴヌクレオチドである。そのため、ＤＮＡやＲＮＡといった天然核酸のみから形成されるオリゴヌクレオチドやＰＮＡオリゴヌクレオチドに比べて、鋳型ＤＮＡとの結合力が強く、かつ特異性が高い。このため、野生型オリゴヌクレオチドは、野生型核酸とは強固に結合（ハイブリダイズ）するものの、変異型核酸とはほとんどハイブリダイズしない。そのため、野生型核酸を鋳型とするＰＣＲ増幅を特異的に抑制することができる。つまり、野生型オリゴヌクレオチドの存在下で、標的の遺伝子変異部位を含む領域をＰＣＲ増幅することにより、ＰＣＲ増幅産物中に占める変異型核酸の割合を、鋳型ＤＮＡ中に占める変異型核酸の割合よりも高められる。このような、野生型核酸の増幅を抑制し、ＰＣＲ増幅産物中に占める変異型核酸の割合を高める効果を、「変異濃縮効果」又は「野生型増幅抑制効果」ということがある。

本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法において用いられる野生型オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドであってもよく、ＢＮＡオリゴヌクレオチドであってもよく、ＬＮＡとＢＮＡとの両方を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。より鋳型ＤＮＡに対する結合力と特異性が高く、より高い変異濃縮効果が得られることから、ＢＮＡオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

野生型オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及びＢＮＡのうち少なくとも一方のみから構成されていてもよい。野生型オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及びＢＮＡのうち少なくとも一方と天然の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡのうち少なくとも一方）とから構成されていてもよい。また、ＬＮＡ及びＢＮＡのうち少なくとも一方と天然の核酸とから構成されている場合、野生型オリゴヌクレオチドが２個以上のＬＮＡを含んでもよいし、２個以上のＢＮＡを含んでもよいし、それらの両方を含んでもよい。ＢＮＡのヌクレオシドは、天然のヌクレオシドと同様にホスホロアミデート法による核酸合成のための保護基や活性化したリン酸基（アミデート）を導入することができ、通常のオリゴヌクレオチド合成と同様にＢＮＡオリゴヌクレオチドを合成することができる。また、ＬＮＡはリボヌクレオシドのリボース環の２’−酸素と４’−炭素との間をメチレン鎖で結合した構造のもの１種類のみである。この構成と４種類の塩基とを結合したものをヌクレオシド単位として、ＢＮＡと同様に天然のヌクレオシドと混合したＬＮＡオリゴヌクレオチドとして合成することができる。

野生型オリゴヌクレオチド中の標的の遺伝子変異部位とハイブリダイズする部位、すなわち、変異型核酸とは非相補的な部位は、変異型核酸との非特異的なハイブリダイズが充分に抑制されるように、遺伝子変異の種類や標的の遺伝子変異部位を含むゲノム領域の塩基配列等を考慮して適宜決定することができる。例えば、野生型オリゴヌクレオチドが全てＤＮＡのみから形成されるオリゴヌクレオチドと仮定した場合に、当該オリゴヌクレオチドと野生型核酸とのＴｍ値が当該オリゴヌクレオチドと変異型核酸とのＴｍ値よりも充分に高くなるように公知のプライマー設計ソフトウェア等を用いて野生型オリゴヌクレオチドの塩基配列を設計する。この設計された塩基配列中の１以上の塩基をＢＮＡ又はＬＮＡに置換することによって、野生型オリゴヌクレオチドを設計することができる。

野生型オリゴヌクレオチドは、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするため、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長反応を起こす場合がある。ただし、仮に、伸長反応が引き起こされたとしても、ＢＮＡ又はＬＮＡが存在する伸長生成物は、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型としてはポリメラーゼの活性を低下させる。そのため、鋳型となる効率は低く、特に問題となることはない。
特に、ＢＮＡ又はＬＮＡが連続している場合は、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型になりにくい。

野生型オリゴヌクレオチドは、その３’末端の水酸基を置換基で保護し、伸長反応を起こさせないようにしてもよい。当該置換基としては、リン酸基等が挙げられる。ただし、ＰＣＲに使われるＤＮＡポリメラーゼには修復機能を担う３’→５’ヌクレアーゼ活性をもつものもある。そのため、置換基によっては分解されて伸長反応が進むこともある。従って、野生型オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基に導入する置換基は、使用するＤＮＡポリメラーゼを考慮して決めることが好ましい。

本実施形態において用いられる野生型オリゴヌクレオチド中の標的の遺伝子変異部位とハイブリダイズする部位は、野生型オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端ではないことが好ましく、野生型オリゴヌクレオチドの中央付近であることがより好ましい。特に、遺伝子変異が１塩基変異である場合には、野生型オリゴヌクレオチドの中央付近に遺伝子変異部位とハイブリダイズする部位があることが好ましい。

なお、本実施形態において検出対象となる遺伝子変異としては特に限定されるものではなく、野生型の塩基配列に対して１又は複数の塩基が、置換された変異であってもよく、欠失された変異であってもよく、挿入された変異であってもよい。

本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法においては、標的の遺伝子変異部位を含むゲノム領域と同一の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、当該遺伝子変異部位を含む領域をＰＣＲにより増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーとを用い、前記野生型オリゴヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲを行う。以降、鋳型ＤＮＡを構成する２本の１本鎖ＤＮＡのうち、鋳型ＤＮＡが野生型である場合に野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖ＤＮＡを「第１の１本鎖鋳型ＤＮＡ」といい、もう一方の１本鎖ＤＮＡを「第２の１本鎖鋳型ＤＮＡ」という。また、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーのうち、第１の１本鎖鋳型ＤＮＡの一部分と相補的な塩基配列を有し、第１の１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするプライマーを「第１のプライマー」といい、第２の１本鎖鋳型ＤＮＡの一部分と相補的な塩基配列を有し、第２の１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするプライマーを「第２のプライマー」という。鋳型ＤＮＡ中、野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域は、第１のプライマーにハイブリダイズする領域と第２のプライマーにハイブリダイズする領域とに挟まれた領域にある。

本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法においては、第１の１本鎖鋳型ＤＮＡ上における、野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域と第１のプライマーがハイブリダイズする領域とが、一部重複している。又は、これらの領域が１〜１８塩基離れている。野生型オリゴヌクレオチドはＢＮＡ及びＬＮＡのうち少なくとも一方を含むオリゴヌクレオチドである。そのため、第１の１本鎖鋳型ＤＮＡに対して野生型オリゴヌクレオチドと第１のプライマーとがハイブリダイズする距離を近くすることにより、野生型オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ−クランピングの効率（すなわち、変異濃縮効果）をより高めることができる。本実施形態においては、第１の１本鎖鋳型ＤＮＡ上における、野生型オリゴヌクレオチドの５’末端から第１のプライマーの３’末端までの距離は、−５塩基〜１８塩基であることが好ましく、−２塩基〜１０塩基であることがより好ましく、１〜５塩基であることがさらに好ましい。距離が「−Ｘ塩基」とは、野生型オリゴヌクレオチドの５’末端側と第１のプライマーの３’末端側がＸ塩基重複していることを意味する。

本実施形態において用いられる第１のプライマー及び第２のプライマーは、天然のＤＮＡを構成するヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドであってもよく、その一部に１種類又は２種類以上の非天然の塩基を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。非天然の塩基としては、ＬＮＡ及びＢＮＡ等が挙げられる。非天然の塩基を含むプライマーを用いることにより、鋳型ＤＮＡとの結合を強めることができたり、塩基特異性を高めることができる。
ただし、非天然の塩基は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を阻害する場合があるため、プライマーの３’末端側にあることが好ましい。また、ＰＣＲ増幅により得られた増幅産物の検出のために、マーカー物質を結合させて標識した構成であってもよい。マーカー物質としては、ビオチン等のように特定のタンパク質と特異的に結合する物質であってもよく、蛍光物質等のように直接検出可能な物質であってもよい。

第１のプライマー及び第２のプライマーは、標的の遺伝子変異部位を含む核酸断片を増幅可能なように、標的の遺伝子変異部位を含むゲノム領域の塩基配列に基づき、公知のソフトウェア等を利用して設計することができる。具体的には、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合力の指標であるＴｍ値、プライマー内での２次構造形成、プライマー間での結合、ゲノムの非特異的領域へのプライマーの結合力等を考慮して設計される。第１のプライマー及び第２のプライマーの塩基長は、一般的にＰＣＲに使用されるプライマーと同様に、例えば、１５〜３０塩基とすることができる。

第１のプライマーと第２のプライマーによりＰＣＲ増幅する核酸断片の長さは、特に限定されるものではなく、増幅した核酸断片の利用の仕方を考慮して決定することができる。例えば、４０〜数千塩基長とすることができ、４０〜５００塩基長とすることがより好ましい。

ＰＣＲは、第１のプライマーと第２のプライマー、野生型オリゴヌクレオチド、鋳型ＤＮＡ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、及び耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを緩衝液に混合させた混合物を反応溶液として用いる。さらに、当該反応溶液の液温を温度サイクルに従って高低させることによって実施される。使用されるデオキシヌクレオチド三リン酸、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、及び緩衝液は、ＰＣＲにおいて一般的に使用される構成の中から適宜選択して使用することができる。反応液中の第１のプライマー及び第２のプライマーの濃度は、一般的なＰＣＲで使用されるプライマーと同程度の濃度とすることができる。また、反応液中の野生型オリゴヌクレオチドの量は、ＰＣＲ−クランピングの効果が得られる量であれば特に限定されるものではなく、例えば、第１のプライマー又は第２のプライマーの１／３量とすることができる。なお、鋳型ＤＮＡ量が少なすぎた場合や、野生型オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ−クランピングの効果が強すぎる場合には、ＤＮＡポリメラーゼのエラーにより元の鋳型には存在しなかった塩基配列を有する増幅産物が得られる場合がある。このような場合には、ＰＣＲのサイクル数を減らしたり、エラー率の低い耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する等により、問題を回避することもできる。

鋳型ＤＮＡとして使用される標的の遺伝子変異部位を含むゲノム領域と同一の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡそのものであってもよく、ゲノムＤＮＡを鋳型として、標的の遺伝子変異部位を含むゲノム領域を予めＰＣＲ等で増幅して得られる増幅産物であってもよい。ゲノムＤＮＡは、細胞又は組織から常法により抽出することができる。
ゲノムＤＮＡを取得するために被験体から採取される細胞又は組織としては、ゲノムＤＮＡを含有する限り特に制限されず、いかなる細胞・組織を含むものであってもよい。被験体にとって低侵襲性であることが望ましいため、例えば、血液、血球成分、リンパ液、精液、毛髪などが好ましく、血液及びその分画である血球成分（例、白血球）がより好ましい。また、標的の遺伝子変異部位が構造遺伝子のコーディング領域にある場合、被験体から採取された細胞又は組織から抽出された総ＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成したｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとすることができる。

ＰＣＲのうち、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖伸長反応は、野生型オリゴヌクレオチドが、遺伝子変異部位が野生型である鋳型ＤＮＡとはハイブリダイズし、かつ、遺伝子変異部位が変異型である鋳型ＤＮＡとはハイブリダイズしない温度で行う。すなわち、伸長反応の温度は、第１のプライマーと第１の１本鎖鋳型ＤＮＡと、野生型オリゴヌクレオチドと野生型の第１の１本鎖鋳型ＤＮＡと、及び第２のプライマーと第２の１本鎖鋳型ＤＮＡとがハイブリダイズ可能であり、かつ野生型オリゴヌクレオチドと変異型の第１の１本鎖鋳型ＤＮＡとがハイブリダイズしない温度とする。一般的にＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応は６８〜７２℃程度で最も効率よく行われる。このため、本実施形態において用いられる野生型オリゴヌクレオチドは、野生型の第１の１本鎖鋳型ＤＮＡとのＴｍ値が６８℃以上であり、変異型の第１の１本鎖鋳型ＤＮＡとのＴｍ値が６８℃未満となるように設計されることが好ましい。

Ｔｍ値は、２本鎖形成の安定性、すなわち鋳型ＤＮＡとの結合力の指標である。天然のヌクレオシドから形成されるオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、経験値から得られた値をもとに計算により予測することが可能であり、一般的には計算により求められる。ＬＮＡオリゴヌクレオチドと鋳型ＤＮＡ（天然のヌクレオシドから形成される１本鎖ＤＮＡ）とのＴｍ値についても、天然のヌクレオシドと同様な計算式が考案されており、当該計算式を用いてＬＮＡオリゴヌクレオチドのＴｍ値を予測することができる。こうして求められたＴｍ値は、プライマー等の設計において参考にされる。ただし、計算によるＴｍ値はあくまでも予測値であり、天然のヌクレオシドのみから形成されるオリゴヌクレオチド及びＬＮＡオリゴヌクレオチドのいずれも、実際のＴｍ値が必ずしも予測値と一致するわけではない。

ＢＮＡオリゴヌクレオチドと鋳型ＤＮＡとのＴｍ値は、現在のところ予測するための信頼できる計算式はない。ＢＮＡはＬＮＡとは構造が異なる上に、上述の式（１）又は式（２）の２種類のヌクレオシドがあり、計算式の算出は極めて困難である。このため、非常に大まかな予想をたて、実際に実験して測定する以外に、ＢＮＡオリゴヌクレオチドのＴｍ値を調べる方法はない。

本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法においては、得られたＰＣＲ増幅産物の総量、又は当該ＰＣＲ増幅産物中の変異型核酸の量に基づいて、鋳型ＤＮＡ中の遺伝子変異部位が変異型である２本鎖ＤＮＡを検出する。例えば、増幅産物がプラトーに達する前のサイクル数におけるＰＣＲ増幅産物の総量が、予め全て野生型核酸である鋳型ＤＮＡを用いて同じ条件でＰＣＲを行った場合の同じサイクル数における、ＰＣＲ増幅産物の総量よりも多い場合には、鋳型ＤＮＡ中に変異型核酸が存在していると判断できる。また、得られたＰＣＲ増幅産物に変異型核酸が存在していた場合には、鋳型ＤＮＡ中に変異型核酸が存在していると判断できる。

本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法において行われるＰＣＲとしては、定量ＰＣＲを用いることができる。ＰＣＲ増幅産物の量の測定が容易であることから、リアルタイムＰＣＲであることが好ましい。本実施形態では、リアルタイムＰＣＲを行う場合について説明する。これらの手法は、蛍光試薬を用いてＤＮＡの増幅量をリアルタイムで検出する方法であり、サーマルサイクラーと蛍光分光光度計とを一体化した装置を必要とする。このような装置は市販されている。用いる蛍光試薬によりいくつかの方法があり、代表的には、インターカレーター法と加水分解プローブ法がある。

インターカレーター法は、ＰＣＲの反応溶液中に添加したインターカレーターが、生成された２本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発することを利用した方法であり、増幅されたＤＮＡ断片の増加とともに蛍光が増大する。反応溶液に励起光を照射して蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニタリングすることができる。

加水分解プローブ法は、蛍光物質と消光物質とで標識されており、検出する目的のＰＣＲ増幅産物と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる方法である。当該加水分解プローブは、そのままではＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）により蛍光を発しない。アニーリング時にＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズし、伸長反応時にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。従って、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができる。加水分解プローブを標識する蛍光物質及び消光物質は、ＦＲＥＴに使用可能な蛍光物質と消光物質との組み合わせの中から適宜選択して用いることができる。ＦＲＥＴに使用可能な蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。また、ＦＲＥＴに使用可能な消光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。

野生型オリゴヌクレオチドのＰＣＲ−クランピングの効果（効率の大きさ）は、以下の式から求めることができる。

ΔΔCt=ΔCt（野生型）｛Ct（野生型：野生型オリゴヌクレオチドあり）−Ct（野生型：野生型オリゴヌクレオチドなし）｝−ΔCt（変異型）｛Ct（変異型：野生型オリゴヌクレオチドあり）−Ct（変異型：野生型オリゴヌクレオチドなし）｝

ここで「Ｃｔ」は、蛍光測定によるリアルタイムＰＣＲを行った場合の一定以上の蛍光値（閾値）が得られるサイクル数である。「ΔＣｔ（野生型）」は、野生型核酸のみを鋳型ＤＮＡとしたときのＰＣＲの増幅が野生型オリゴヌクレオチドの添加によりどれだけ阻害されたかを示す指標であり、できるだけ大きいほうが好ましい。一方、「ΔＣｔ（変異型）」は、変異型核酸のみを鋳型ＤＮＡとしたときのＰＣＲの増幅が野生型オリゴヌクレオチドの添加によりどれだけ阻害されたかを示す指標であり、できるだけ小さいほうが好ましい。ＰＣＲ−クランピングの高い効果を得るためには、ΔＣｔ（野生型）が大きく、かつΔＣｔ（変異型）が小さいほうがよい。すなわち、ΔΔＣｔが大きいほうが好ましい。ΔΔＣｔを指標とすることにより、野生型オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ−クランピングの効果を適切に評価することができる。なお、インターカレーター法及び加水分解プローブ法のいずれの方法を用いてもΔΔＣｔを求めることができる。ただし、加水分解プローブ法を用いる場合には、野生型核酸及び変異型核酸に共通に結合する加水分解プローブを使用しなければならない。

例えば、インターカレーター法により行う場合には、野生型オリゴヌクレオチドの存在下でリアルタイムＰＣＲを行い、野生型核酸のみを鋳型ＤＮＡとした場合のＣｔ値を予め求めておく。遺伝子変異の有無を検出する被検対象である鋳型ＤＮＡのＣｔ値がそれより小さい場合は、当該鋳型ＤＮＡには変異型核酸が存在していたと判断することができる。加水分解プローブ法を、野生型核酸及び変異型核酸に共通に結合する加水分解プローブを用いて行う場合には、インターカレーター法と同様に、野生型オリゴヌクレオチドの存在下でリアルタイムＰＣＲを行い、野生型核酸のみを鋳型ＤＮＡとした場合のＣｔ値を予め求めておく。遺伝子変異の有無を検出する被検対象である鋳型ＤＮＡのＣｔ値がそれより小さい場合は、当該鋳型ＤＮＡには変異型核酸が存在していたと判断することができる。

加水分解プローブ法を、変異型核酸に特異的に結合する加水分解プローブを用いて行う場合には、変異型核酸である増幅産物が検出された場合には、当該鋳型ＤＮＡには変異型核酸が存在していたと判断することができる。本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法においては、野生型オリゴヌクレオチドにより変異濃縮効果が得られるため、変異型核酸に特異的に結合する加水分解プローブにより、増幅産物中の変異型核酸をより高感度に検出することができる。

濃縮された変異型核酸は、インターカレーター法及び加水分解プローブ法以外にも、種々の方法を用いて検出することが可能である。このため、本実施形態においてＰＣＲ増幅産物中の変異型核酸の量の測定は、簡便性、感度、コスト、ＰＣＲの増幅産物に由来するキャリーオーバーコンタミネーションなどを考慮し、公知の測定方法の中から適宜選択して行うことができる。例えば、増幅産物中の変異型核酸を検出する方法として、サンガーシーケンシング法がある。サンガーシーケンシング法は、単独で用いた場合には変異検出感度は高くない。しかしながら、本実施形態に係る遺伝子変異の検出方法においては、変異濃縮効果によって増幅産物中の変異型核酸の割合が高められている。そのため、元の検体中の変異型核酸の割合が低い場合でもサンガーシーケンシング法によって増幅産物中の変異型核酸を検出することができる。また、融解曲線分析法を用いることによっても、濃縮された変異型核酸を容易に検出することが可能である。

本発明の第２実施形態に係る遺伝子変異検出用キットは、前記野生型オリゴヌクレオチドと、前記第１のプライマーと、前記第２のプライマーと、を有する。当該遺伝子変異検出用キットを用いることによって、第１実施形態に係る遺伝子変異の検出方法をより簡便に実施することができる。

本実施形態に係る遺伝子変異検出用キット中には、その他にも、ＰＣＲの反応溶液を調製するための緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、当該遺伝子変異検出用キットの使用説明書等を備えていてもよい。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

＜プライマー及びＢＮＡオリゴヌクレオチド＞
以下の実験で使用したプライマー類は、オペロンバイオテクノロジー株式会社（現ユーロフィンジェノミクス株式会社）に合成依頼し、カートリッジ精製したものを使用した。
また、ＢＮＡオリゴヌクレオチド類は、株式会社ジーンデザインに合成依頼し、逆相ＨＰＬＣ精製したものを使用した。以下、ＢＮＡオリゴヌクレオチドをＢＮＡオリゴと略す場合がある。

なお、以下の実施例において、使用されたＢＮＡオリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下の表記法に従って記載した。すなわち、前記式（２）で示されるＢＮＡの構造をもつもののうち、アデニン塩基を含むものはＡ（Ｅ）、グアニン塩基を含むものはＧ（Ｅ）、５−メチルシトシン塩基を含ものは５（Ｅ）、チミン塩基を含むものはＴ（Ｅ）と表記する。また、前記式（１）で示されるＢＮＡの構造をもつもののうち、チミンを含むものはＴ（Ｈ）、５−メチルシトシンを含むものは５（Ｈ）と表記する。さらに、ＢＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の３’水酸基にリン酸基を導入した場合は「ｐ」を付加した。天然のヌクレオシドはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔと表記した。

＜プラスミド＞
以下の実験で使用したＰＣＲの鋳型ＤＮＡは、人工合成したプラスミドを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して直線化したものを使用し、ＰＣＲの１反応あたり、２０，０００〜３０，０００コピー使用した。プラスミドは、ｐＭＤ２０Ｔの制限酵素ＥｃｏＲＶサイトにｈＥＧＦＲの断片配列を挿入したものであり、タカラバイオ株式会社から購入した。
プラスミドの名称、挿入したｈＥＧＦＲ断片の塩基配列及びその配列番号を表１に示す。なお、プラスミドの名称の「ＥＧ＿」の後ろには、当該プラスミドに挿入されたＥＧＦＲ断片の遺伝子型を表す。

＜リアルタイムＰＣＲ＞
リアルタイムＰＣＲには、サイバーグリーン法を採用し、市販のキット「Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｄｉｍｅｒ Ｅｒａｃｅｒ（タカラバイオ株式会社）」を使用した。ＰＣＲの反応溶液の組成を表２に示す。なお、ＢＮＡオリゴヌクレオチドを添加しない場合は、ＢＮＡオリゴヌクレオチドに相当する液量のＨ_２Ｏを添加して全体の反応溶液量を調節した。

リアルタイムＰＣＲ装置は、「ＣＦＸ９６ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ社製）」を使用した。反応条件は、９５℃（３０秒間）の後、９５℃（２０秒間）、５８℃（３０秒間）、及び７２℃（３０秒間）の順を1サイクルとして、５０サイクルの反応を行った。
また、Ｃｔ値の算出は、装置の自動計算法で算出されたものを使用し、ΔΔＣｔ値は前述の式に基づいて算出した。

［実施例１］
表３に記載のプライマー及びＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｈＥＧＦＲのエキソン１９の欠失変異を検出する場合における、ＰＣＲ−クランピングによる変異濃縮効果（ΔΔＣｔ）を調べた。配列番号２２は、ＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）の各種修飾をする前の塩基配列の番号である。

鋳型ＤＮＡとして、野生型のプラスミドであるＥＧ＿１９ｗｔと、Ｌ７４７Ｔ７５１＞Ｓ変異をもつプラスミドであるＥＧ＿ ｄｅｌＬ７４７＿Ｔ７５１ｉｎｓＳを用いた。リバースプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、フォワードプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと相補的な１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする。

プライマーの組み合わせとＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）を用いた場合のΔΔＣｔ値とを表４に示す。表４中、「野生型のΔＣｔ」は野生型プラスミドＥＧ＿１９ｗｔを用いた場合のΔＣｔを、「変異型のΔＣｔ」は変異型プラスミドＥＧ＿ ｄｅｌＬ７４７＿Ｔ７５１ｉｎｓＳを用いた場合のΔＣｔを、それぞれ意味する。

この結果、ＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）による変異濃縮効果は、プライマーの組み合わせにより劇的な影響を受けることが明らかとなった。リバースプライマーがｄｅｌＲ３の場合のみΔΔＣｔ値が１０以上と大きく、変異濃縮効果があり、フォワードプライマーには影響されないことがわかった。鋳型ＤＮＡ上において、ＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）の５’末端は、リバースプライマーｄｅｌＲ３の３’末端とは５塩基離れている。また、リバースプライマーＥ１９Ｒ２の３’末端とは３３塩基、リバースプライマーＥ１９Ｒ１の３’末端とは７２塩基、それぞれ離れている。また、鋳型ＤＮＡ上において、ＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）の３’末端と相補的な塩基は、フォワードプライマーｄｅｌＦ７の３’末端とは６塩基、フォワードプライマーＥ１９Ｆ１の３’末端とは４２塩基、それぞれ離れている。つまり、ＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）がハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと同じ１本鎖鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするプライマーの３’末端とＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）の５’末端との距離が７２塩基又は３３塩基の場合はＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）による野生型増幅抑制効果（変異濃縮効果）は全くみられなかった。一方で、当該距離が５塩基の場合は顕著な効果が得られた。また、ＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）がハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと相補的な１本鎖鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするプライマーとＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）との間の塩基数は、ＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）による変異濃縮効果に全く影響しないことが明らかとなった。すなわち、これらの結果から、ＢＮＡオリゴヌクレオチドによる変異濃縮効果には、同じ１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするプライマーとの距離が極めて重要であることがわかった。

［実施例２］
実施例１において顕著な変異濃縮効果の認められたプライマーセット（フォワードプライマーＥ１９Ｆ１及びリバースプライマーｄｅｌＲ３）とＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）との組み合わせを用いて、同じゲノム領域中にある別の欠失変異についても同じ効果が得られるかどうかを調べた。各変異については、鋳型ＤＮＡとして、プラスミドＥＧ＿ｄｅｌ７４６＿７５０（２２３５）、プラスミドＥＧ＿ｄｅｌ７４６＿７５０（２２３６）、プラスミドＥＧ＿ＤｅｌＬ７４７＿Ｐ７５３ ｉｎｓＳ、プラスミドＥＧ＿ｄｅｌＬ７４７＿Ａ７５０ｉｎｓＰ、プラスミドＥＧ＿Ｌ７４７＿Ｓ７５２ Ｅ７４６Ｖをそれぞれ使用した。得られたΔΔＣｔ値を表５に示した。

以上の結果、本実験に使用したプライマーとＢＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせは、Ｌ７４７Ｔ７５１＞Ｓと同じゲノム領域にある他の欠失変異の検出においても、変異濃縮効果が得られることが明らかとなった。

［実施例３］
実施例1で用いたＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ４）と塩基配列は同じであり、ＢＮＡ構造をもつヌクレオシドの数を増やして結合力を高めたＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、野生型核酸の増幅抑制の効果を調べた。また、プライマーとＢＮＡオリゴヌクレオチドとの間の塩基数と増幅抑制効果との関係を調べた。プライマーの組み合わせは、実施例１で用いたもののうち、Ｅ１９Ｆ１−ｄｅｌＲ３、Ｅ１９Ｆ１−Ｅ１９Ｒ１、Ｅ１９Ｆ１−Ｅ１９Ｒ２の３種類とした。鋳型ＤＮＡとして、野生型のプラスミドであるＥＧ＿１９ｗｔと、変異型プラスミドであるＥＧ＿ｄｅｌ７４６＿７５０（２２３５）を用いた。新しく用いたＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ９）の塩基配列を表６に示す。

測定されたΔΔＣｔ値と、鋳型ＤＮＡ上におけるＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ９）の５’末端とリバースプライマーの３’末端との間の塩基数（表中、「リバースプライマーとＢＮＡオリゴの間の塩基数」）とを表７に示す。この結果、より結合力を高めたＢＮＡオリゴ（Ｅ１９Ｂ９）を用いたため、いずれの場合でも実施例１の結果と比較してΔΔＣｔ値が高く、全体的に野生型核酸の増幅抑制効果が強くなっていた。さらに、実施例１と同様に、リバースプライマーとＢＮＡオリゴヌクレオチドの距離が５塩基であった場合が、当該距離が３３塩基又は７２塩基であった場合よりも明らかに高い野生型核酸の増幅抑制効果が得られた。これらの結果から、ＢＮＡオリゴヌクレオチドの種類にかかわらず、ＢＮＡオリゴヌクレオチドによる変異濃縮効果には、同じ１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするプライマーとの距離が極めて重要であることがわかった。

［実施例４］
表８に記載のプライマー及びＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｈＥＧＦＲのエキソン１９の欠失変異であるｄｅｌ７５２＿７５９（２２５３）を含む欠失領域の遺伝子変異群を検出する場合における、ＰＣＲ−クランピングによる変異濃縮効果（ΔΔＣｔ）を調べた。配列番号２５は、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）の各種修飾をする前の塩基配列の番号である。

鋳型ＤＮＡとして、野生型のプラスミドであるＥＧ＿１９ｗｔと、変異型のプラスミドであるＥＧ＿ｄｅｌ７５２＿７５９（２２５３）を用いた。フォワードプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、リバースプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと相補的な１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする。

プライマーの組み合わせとＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）を用いた場合のΔΔＣｔ値とを表９に示す。表９中、「野生型のΔＣｔ」は野生型プラスミドＥＧ＿１９ｗｔを用いた場合のΔＣｔを、「変異型のΔＣｔ」は変異型プラスミドＥＧ＿ｄｅｌ７５２＿７５９（２２５３）を用いた場合のΔＣｔを、それぞれ意味する。

この結果、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）による変異濃縮効果は、プライマーの組み合わせにより劇的な影響を受けることが明らかとなった。フォワードプライマーがＳ７５２Ｆ１の場合のみΔΔＣｔ値が１０以上と大きく、変異濃縮効果があり、リバースプライマーには影響されないことがわかった。鋳型ＤＮＡ上において、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）の５’末端は、フォワードプライマーＳ７５２Ｆ１の３’末端とは３塩基、フォワードプライマーＥ１９Ｆ１の３’末端とは６１塩基、それぞれ離れている。また、鋳型ＤＮＡ上において、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）の３’末端と相補的な塩基は、リバースプライマーＳ７５２Ｒ２の３’末端とは１０塩基、リバースプライマーＥ１９Ｒ１の３’末端とは５７塩基、それぞれ離れている。つまり、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）がハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと同じ１本鎖鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするプライマーの３’末端とＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）の５’末端との距離が６１塩基の場合はＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）による変異濃縮効果は全くみられず、当該距離が３塩基の場合は顕著な効果が得られた。一方、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）がハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと相補的な１本鎖鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするプライマーとＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）の間の塩基数は、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）による変異濃縮効果に全く影響しないことが明らかとなった。すなわち、これらの結果から、ＢＮＡオリゴヌクレオチドによる変異濃縮効果には、同じ１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするプライマーとの距離が極めて重要であることがわかった。

また、プライマーセット（フォワードプライマーＳ７５２Ｆ１とリバースプライマーＥ１９Ｒ１）とＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）とを用いて、ｄｅｌ７５２＿７５９（２２５３）と同じゲノム領域にある別の欠失変異ｄｅｌ７５２＿７５９（２２５４）について、変異濃縮効果を調べた。その結果、ΔΔＣｔ値は１０．４であり、欠失変異ｄｅｌ７５２＿７５９（２２５３）の場合と同様の変異濃縮効果が得られた。これらの結果により、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）による変異濃縮効果を高めるためには、ＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）と同じ１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズするプライマーの位置がＢＮＡオリゴ（Ｓ７５２−ＢＮＡ１）に近いほうがよいことがわかった。

［実施例５］
表１０に記載のプライマー及びＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｈＥＧＦＲのエキソン２０の１塩基変異であるＴ７９０Ｍを検出する場合における、ＰＣＲ−クランピングによる変異濃縮効果（ΔΔＣｔ）を調べた。配列番号２８は、ＢＮＡオリゴ（Ｔ７９０−ＢＮＡ２）の各種修飾をする前の塩基配列の番号である。

鋳型ＤＮＡとして、野生型のプラスミドであるＥＧ＿２０ｗｔと、変異型のプラスミドであるＥＧ＿Ｔ７９０Ｍを用いた。フォワードプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、リバースプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと相補的な１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする。

この結果、ΔΔＣｔ値は１３．４であり、変異濃縮効果が得られることが確認できた。
本実施例では、鋳型ＤＮＡ上において、ＢＮＡオリゴ（Ｔ７９０−ＢＮＡ２）の５’末端は、フォワードプライマーＥ２０Ｆ５の３’末端とは８塩基離れている。

［実施例６］
表１１に記載のプライマー及びＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｈＥＧＦＲのエキソン１８の１塩基変異であるＧ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃを検出する場合における、ＰＣＲ−クランピングによる変異濃縮効果（ΔΔＣｔ）を調べた。配列番号３１は、ＢＮＡオリゴ（Ｇ７１９−ＢＮＡ１）の各種修飾をする前の塩基配列の番号である。

鋳型ＤＮＡとして、野生型のプラスミドであるＥＧ＿Ｇ７１９ｗｔ、Ｇ７１９Ｃ変異型のプラスミドであるＥＧ＿Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ変異型のプラスミドであるＥＧ＿Ｇ７１９Ｓ、及びＧ７１９Ａ変異型のプラスミドであるＥＧ＿Ｇ７１９Ａをそれぞれ用いた。リバースプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、フォワードプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと相補的な１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする。

得られたΔΔＣｔ値と変異濃縮倍率（２のΔΔＣｔ乗［２^ΔΔCt］）を表１２に示した。この結果、本実験に使用したプライマーとＢＮＡオリゴヌクレオチドとの組み合わせは、いずれの変異についても大きなΔΔＣｔ値が得られた。また、変異濃縮倍率も１８，０００以上であり、大きなＰＣＲ−クランピング効果が得られることがわかった。本実施例では、鋳型ＤＮＡ上において、ＢＮＡオリゴ（Ｇ７１９−ＢＮＡ１）の５’末端は、リバースプライマーＥ１８Ｒ１の３’末端とは１８塩基離れている。

［実施例７］
表１３に記載のプライマー及びＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｈＥＧＦＲのエキソン２１の１塩基変異であるＬ８５８Ｒ及びＬ８６１Ｑを検出する場合における、ＰＣＲ−クランピングによる変異濃縮効果（ΔΔＣｔ）を調べた。配列番号３６は、ＢＮＡオリゴ（Ｅ２１Ｂ６）の各種修飾をする前の塩基配列の番号である。

鋳型ＤＮＡとして、野生型のプラスミドであるＥＧ＿２１ｗｔ、Ｌ８５８Ｒ変異型のプラスミドであるＥＧ＿Ｌ８５８Ｒ、及びＬ８６１Ｑ変異型のプラスミドであるＥＧ＿Ｌ８６１Ｑをそれぞれ用いた。リバースプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、フォワードプライマーは、ＢＮＡオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと相補的な１本鎖鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする。

プライマーの組み合わせとＢＮＡオリゴ（Ｅ２１Ｂ６）を用いた場合のΔΔＣｔ値とを表１４に示す。表１４中、「ΔΔＣｔ（Ｌ８５８Ｒ）」はＬ８５８Ｒ変異を検出した場合のΔΔＣｔ値を、「ΔΔＣｔ（Ｌ８６１Ｑ）」はＬ８６１Ｑ変異を検出した場合のΔΔＣｔ値を、それぞれ示す。

この結果、いずれの変異についても、リバースプライマーが８５８Ｒ２の場合のみΔΔＣｔ値が１０程度と大きく、変異濃縮効果があり、フォワードプライマーには影響されないことがわかった。本実施例では、鋳型ＤＮＡ上において、ＢＮＡオリゴ（Ｅ２１Ｂ６）の５’末端は、リバースプライマー８５８Ｒ２の３’末端と２塩基重複しており、リバースプライマー８５８Ｒ２の３’末端とは３４塩基離れている。つまり、ＢＮＡオリゴ（Ｅ２１Ｂ６）がハイブリダイズする１本鎖鋳型ＤＮＡと同じ１本鎖鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするプライマーの３’末端とＢＮＡオリゴ（Ｅ２１Ｂ６）の５’末端との距離が３４塩基の場合はＢＮＡオリゴ（Ｅ２１Ｂ６）による変異濃縮効果は全くみられなかった。一方で、両末端が２塩基重複している場合であっても変異濃縮効果が十分に得られることがわかった。

実施例１〜７では、野生型オリゴヌクレオチドとしてＢＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。しかしながら、ＬＮＡ及びＢＮＡはいずれもリボヌクレオシドのリボース環の２’−酸素と４'−炭素との間を架橋した非天然核酸であり、そのＰＣＲ−クランピングの作用機構は同じである。そのため、ＢＮＡオリゴヌクレオチドとプライマーとの位置関係は、そのままＬＮＡオリゴヌクレオチドとプライマーとの位置関係にも適用できる。

本発明によれば、大過剰の野生型遺伝子に含まれている極微量の変異型遺伝子を高感度に検出することができる。このため、本発明に係る遺伝子変異の検出方法は、特に臨床検査において有用である。

Claims (5)

1. 標的の遺伝子変異部位を含むゲノム領域と同一の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを有する鋳型ＤＮＡと、前記遺伝子変異部位を含む領域をＰＣＲにより増幅するように構成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーと、前記遺伝子変異部位が野生型であるゲノム領域と相補的な塩基配列を有し、かつ少なくとも１以上の非天然の核酸を含む野生型オリゴヌクレオチドとを用いてＰＣＲを行い、
   得られたＰＣＲ増幅産物の総量、又は前記ＰＣＲ増幅産物中の前記遺伝子変異部位が変異型である核酸の量に基づいて、前記鋳型ＤＮＡから前記遺伝子変異部位が変異型である２本鎖ＤＮＡを検出し、
   前記非天然の核酸が、ＬＮＡ又はＢＮＡであり、
   前記鋳型ＤＮＡを構成する２本の１本鎖ＤＮＡのうち、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする第１の１本鎖ＤＮＡ上において、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域と、前記フォワードプライマー又は前記リバースプライマーがハイブリダイズする領域とが、１〜１８塩基離れている遺伝子変異の検出方法。
2. 前記非天然の核酸がＢＮＡである、請求項１に記載の遺伝子変異の検出方法。
3. 前記ＰＣＲを行う際に、前記野生型オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子変異部位が野生型である前記鋳型ＤＮＡとはハイブリダイズし、かつ、前記遺伝子変異部位が変異型である前記鋳型ＤＮＡとはハイブリダイズしない温度で、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖伸長反応を行う、請求項１又は２に記載の遺伝子変異の検出方法。
4. 前記ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子変異の検出方法。
5. 標的の遺伝子変異部位が野生型であるゲノム領域と相補的な塩基配列を有し、かつ少なくとも１以上の非天然の核酸を含む野生型オリゴヌクレオチドと、
   前記遺伝子変異部位を含むゲノム領域と同一の塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型として、前記遺伝子変異部位を含む領域をＰＣＲにより増幅するように構成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーと、
   を有し、
   前記非天然の核酸が、ＬＮＡ又はＢＮＡであり、
   前記２本鎖ＤＮＡのうち、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする第１の１本鎖ＤＮＡ上において、前記野生型オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域と、前記フォワードプライマー又は前記リバースプライマーがハイブリダイズする領域とが、１〜１８塩基離れている、
   遺伝子変異検出用キット。