KR102294796B1 - 유전자 변이 검출법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ASP-PCR법을 베이스로 한 1염기 치환의 검출 방법에 있어서, 반응성 및 식별력을 확보한 새로운 프라이머의 설계 방법을 제공함과 함께, 앰플리콘이 중복되는 복수의 점 변이, 특히 인접하는 2개의 1염기 치환을 간이하게 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 핵산 시료 중에 포함되는 1염기 치환의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하고, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지며, 또한 그 밖의 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를 사용함으로써, 1염기 치환을 간이하게 검출할 수 있다.

Description

유전자 변이 검출법
본 발명은 핵산 시료 중에 포함되는 특정한 1염기 다형(SNP) 혹은 점 변이 등의 특이적인 검출 방법에 관한 것이다.
유전자 변이에는, 유전적으로 계승되는 생식 세포 계열 변이와 후천적으로 각각의 세포 내에서 야기되는 체세포 변이가 있지만, 생식 세포 계열 변이 중의 특정한 유전자의 특정한 1염기 다형(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)이나 대표적인 체세포 변이인 점 변이(1염기 변이)가, 각종 질병에 관련되어 있는 것이 보고되어 있으며, 근년 그들 변이의 검출이, 특정한 약제의 효과가 기대되는 환자의 선별에 이용되고 있다.
예를 들어, 대장암 치료약인 항EGFR 항체는, 환자의 KRAS 유전자 및 NRAS 유전자의 엑손 2, 3, 4 영역에 점 변이가 확인되는 경우, 치료 효과가 기대되지 않는 것이 판명되고, KRAS 유전자 및 NRAS 유전자의 코돈 12, 13, 59, 61, 117 및 146에 있어서의 합계 48종류의 아미노산 치환을 수반하는 RAS(KRAS/NRAS) 유전자 변이를 검출할 수 있는 키트의 개발이 행하여지고 있다(비특허문헌 1). RAS에 있어서의 점 변이의 특징으로서, 3개의 염기로 구성되는 각 코돈에 있어서의 점 변이의 위치가 다양하다는 것을 들 수 있어, 매우 많은 종류의 1염기 치환을 검출할 필요가 있다.
또한, 폐암 치료약인 티로신 키나아제 저해제(TKI)의 약효 판단을 위하여, EGFR의 유전자 변이 검사가 행하여지고 있다. EGFR의 유전자 변이는, 결실·삽입·점 변이 등 다양한 변이 양식이 확인되는 것이 특징이다. 몇 가지 어느 점 변이 중에서, 엑손 18의 코돈 719에 있어서는, 2155번째의 염기 G가 A나 T로, 혹은 2156번째의 염기 G가 C로 치환되는 점 변이가 발생하여, 결과적으로 3종류의 아미노산 치환이 발생한다. 또한, EGFR 유전자 엑손 20의 코돈 790에 있어서, 2369번째의 염기 C가 T로 치환되면 TKI 내성이 부여되지만, 최근 제3 세대의 TKI에 대한 내성을 부여하는 유전자 변이로서, 엑손 20의 코돈 797의 점 변이가 새롭게 보고되었는데(비특허문헌 2), 그것은 2389번째의 염기 T가 A로, 혹은 2390번째의 염기 G가 C로 치환되는, 2가지 양식의 점 변이이다.
상술한 바와 같이, RAS 유전자나 EGFR 유전자 변이의 일부에 있어서는, 하나의 코돈 내에서 2개 이상의 점 변이가 일어나는 경우의 1염기 치환의 검출에도 대응할 필요가 있어, 가능한 한 간이하며 또한 식별력(discriminatory power)이 확보되는 변이 검출 방법이 소망된다.
그러한 1염기 치환을 판별하는 대표적인 방법으로서, 대립유전자 특이적 프라이머(Allele Specific Primer; ASP)와 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)을 조합한 ASP-PCR법이 있다. ASP는, 일반적으로 프라이머의 3' 말단의 뉴클레오티드를 SNP의 변이형(또는 야생형) 뉴클레오티드에 대응시켜 설계되어, 변이형(또는 야생형)의 주형에는 3' 말단이 하이브리다이즈되므로 신장 반응이 진행되지만, 야생형(또는 변이형)의 주형에는 3' 말단이 하이브리다이즈되지 않으므로 신장 반응이 진행되지 않는다. 1염기 치환의 유무는, ASP에 기인하는 증폭 산물이 얻어지는지 여부에 따라 판정한다.
그런데, 3' 말단의 1뉴클레오티드만의 차이로 식별력을 확보하기 위해서는, 반응 시의 온도 조건 등을 매우 엄밀하게 제어할 필요가 있다. 그래서, 프라이머 설계 방법에 고안이 이루어지고 있다. 예를 들어, 피검 핵산 시료의 검사하려고 하는 특정한 염기에 상보적인 염기를 3' 말단에 가지며, 또한 3' 말단으로부터 2번째 염기는 피검 핵산의 염기에 상보적이고, 3번째보다 상류의 적어도 하나의 염기를 피검 핵산 염기에 상보적인 염기와 상이한 염기(인공 미스매치)로 치환한 검출용 프라이머를 사용함으로써 간편하게 고정밀도로 1염기 치환의 검출을 행하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 1). 또한, 야생형용 프라이머의 3' 말단으로부터 2번째 염기가 1염기 다형 부위의 예상되는 야생형 뉴클레오티드에 대응하고, 해당 프라이머의 3' 말단의 3번째부터 5' 말단까지의 하나의 염기가, 염색체 또는 그의 단편 중의 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 염기와 상보적이지 않은 염기로 치환되어 있어도 되고, 해당 프라이머 중의 그 밖의 염기는 상기 염색체 또는 그의 단편 중의 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 염기와 상보적인 야생형용 프라이머, 그리고 변이형용 프라이머의 3' 말단으로부터 2번째 염기가 1염기 다형 부위의 예상되는 변이형 뉴클레오티드에 대응하고, 해당 프라이머의 3' 말단의 3번째부터 5' 말단까지의 하나의 염기가, 염색체 또는 그의 단편 중의 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 염기와 상보적이지 않은 염기로 치환되어 있어도 되고, 해당 프라이머 중의 그 밖의 염기는 상기 염색체 또는 그의 단편 중의 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를 사용함으로써 용이하게 명확한 판정을 가능하게 하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 2).
그러나, 특허문헌 1의 방법에 있어서는, 프라이머 신장 반응에 의해 생성된 인공 미스매치를 포함하는 염기 서열에 상보적인 서열을 갖는 포획용 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용할 필요가 있고, 특허문헌 2의 방법에 있어서는, 야생형용 프라이머 및 1종 또는 2종의 변이형용 프라이머를 사용할 필요가 있다. 여기서, ASP는 원칙 1염기마다의 변이에 대응하여 설계되기 때문에, 검출하고 싶은 1염기 치환의 수가 많아지면 다수의 프라이머를 준비할 필요가 있고, RAS 유전자나 EGFR 유전자 변이의 일부의 점 변이와 같이, 하나의 코돈 내에서 2개 이상의 점 변이가 일어나는 경우에는, 설계해야 할 프라이머의 종류는 필연적으로 많아진다. 그 때문에, 포획용 올리고뉴클레오티드 프로브를 필요로 하는 특허문헌 1의 방법이나, 야생형용 및 변이형용의 합계 2종 또는 3종의 프라이머를 필요로 하는 특허문헌 2의 방법에서는, 경우에 따라서는 변이 검출용 시약의 비용이 상승할 우려가 생긴다. 따라서, 간편성과 식별력을 겸비한 새로운 프라이머의 설계 방법이 요구되고 있다.
일본 특허 공개 제2005-160430호 공보 일본 특허 제3937136호 공보
Yoshino T, Muro K, Yamaguchi K, Nishina T, Denda T, Kudo T, Okamoto W, Taniguchi H, Akagi K, Kajiwara T, Hironaka S, Satoh T. Clinical Validation of a Multiplex Kit for RAS Mutations in Colorectal Cancer: Results of the RASKET(RAS KEy Testing) Prospective, Multicenter Study. EBioMedicine. 2015 Feb 14; 2(4): 317-23. Thress KS, Paweletz CP, Felip E, Cho BC, Stetson D, Dougherty B, Lai Z, Markovets A, Vivancos A, Kuang Y, Ercan D, Matthews SE, Cantarini M, Barrett JC, Jaenne PA, Oxnard GR. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nat Med. 2015 Jun; 21(6): 560-2.
본 발명의 목적은, 상기한 과제를 해결하기 위하여, ASP-PCR법을 베이스로 한 1염기 치환의 검출 방법에 있어서, 반응성 및 식별력을 확보한 새로운 프라이머의 설계 방법을 제공하는 것과 함께, 앰플리콘이 중복되는 복수의 점 변이, 특히 인접하는 2개의 1염기 다형 부위의 1염기 치환을 간이하게 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이하의 〔1〕 내지 〔7〕의 구성을 포함한다.
〔1〕핵산 증폭 반응을 이용하여, 핵산 시료 중에 포함되는 1염기 다형 부위의 1염기 치환을 검출하는 방법으로서, 해당 방법이,
(a) 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 상기 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하고, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지며, 또한 그 밖의 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를, 당해 핵산에 하이브리다이즈시키는 공정,
(b) DNA 폴리머라제와 그의 기질인 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산에 의해 변이형용 프라이머를 신장시키는 공정, 및
(c) 변이형용 프라이머가 신장되었는지 여부에 따라 그의 핵산 시료 중에 포함되는 1염기 치환을 검출하는 공정을 조합하는 것을 특징으로 하는 1염기 치환을 검출하는 방법.
〔2〕상기 1염기 다형 부위가 인접하는 제1 및 제2의 1염기 다형 부위이며, (a) 공정이, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기는 상기 제1의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 제1의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드를 갖는 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와는 상보적이지 않고, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 상기 제2의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 제2의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드를 갖는 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와는 상보적이지 않고, 또한 그 밖의 뉴클레오티드의 염기는 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를, 당해 핵산에 하이브리다이즈시키는 공정인, 상기 〔1〕에 기재된 1염기 치환을 검출하는 방법.
〔3〕 1염기 치환이 EGFR 유전자, KRAS 유전자 혹은 NRAS 유전자의 1염기 치환인, 상기 〔1〕또는 〔2〕에 기재된 1염기 치환을 검출하는 방법.
〔4〕핵산 증폭 반응이 폴리머라제 연쇄 반응인, 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔5〕폴리머라제 연쇄 반응의 증폭 산물의 유무에 따라, 변이형용 프라이머가 신장되었는지 여부를 판정하는, 상기 〔4〕에 기재된 방법.
〔6〕핵산 시료 중에 포함되는 1염기 다형 부위의 1염기 치환을 핵산 증폭 반응을 이용하여 검출하는 방법에 사용하기 위한 변이형용 프라이머를 포함하는 시약으로서, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 상기 1염기 치환의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하고, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지며, 또한 그 밖의 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를 포함하는 시약.
〔7〕상기한 변이형용 프라이머가, EGFR 유전자, KRAS 유전자 혹은 NRAS 유전자의 변이형 유전자를 증폭시키는, 상기 〔6〕에 기재된 시약.
〔8〕핵산 증폭 반응이 폴리머라제 연쇄 반응인, 상기 〔6〕또는 〔7〕에 기재된 시약.
〔9〕 이하의 공정을 포함하는, 뉴클레오티드 단편을 증폭시키는 방법:
(i) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를, 시료 중의 1염기 다형 부위를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA) 분자에 하이브리다이즈시키는 공정;
(ⅱ) 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산의 존재 하에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키는 공정;
(ⅲ) 신장된 제1 프라이머에 제2 프라이머를 하이브리다이즈시키고, 또한 신장된 제2 프라이머에 제1 프라이머를 하이브리다이즈시키는 공정;
(ⅳ) 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산의 존재 하에서, 신장된 제1 프라이머에 하이브리다이즈한 제2 프라이머 및 신장된 제2 프라이머에 하이브리다이즈한 제1 프라이머를, DNA 폴리머라제에 의해 신장시키는 공정; 및
(v) 임의로, 상기의 (ⅲ) 및 (ⅳ) 공정을 1 내지 50회, 바람직하게는 5 내지 45회, 10 내지 45회, 10 내지 40회, 10 내지 35회, 15 내지 35회, 20 내지 35회, 또는 25 내지 35회 반복하는 공정;
여기서, 제1 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 상기 DNA 분자의 한쪽 쇄와 상보적이고, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 1염기 다형의 하나의 유전자형을 특징짓는 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 염기는 당해 DNA쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않고,
제2 프라이머의 뉴클레오티드 서열은, 상기 DNA 분자의 다른 쪽 쇄와 상보적이고,
제1 프라이머와 제2 프라이머의 3' 말단은, 시료 중의 1염기 다형 부위를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA) 분자에 하이브리다이즈하였을 때에, 서로 다른 쪽 프라이머의 3' 말단으로부터 보아 3'측에 위치한다.
〔10〕상기 1염기 다형 부위가 인접하는 제1 및 제2의 1염기 다형 부위이며, 제1 프라이머의 뉴클레오티드 서열은, 상기 DNA 분자의 한쪽 쇄와 상보적이고, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 제1의 1염기 다형의 하나의 유전자형을 특징짓는 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 염기는 당해 DNA쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않고, 또한 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 제2의 1염기 다형의 하나의 유전자형을 특징짓는 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 3번째 염기는 당해 DNA쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은, 상기 〔9〕에 기재된 뉴클레오티드 단편을 증폭시키는 방법.
본 발명은 염기 서열의 검출, 특히 1염기 치환의 검출을 행하기 위한 방법을 제공하며, 검출 시에 특수한 기기, 설비를 필요로 하지 않고 저렴하고 간편하게, 게다가 고정밀도로 다수의 검체를 효율적으로 검출할 수 있는, 각별한 효과를 갖는 검출 방법, 검출 시약 및 키트를 제공하는 것을 가능하게 하였다.
본 발명은 반응성 및 식별력을 확보한 새로운 ASP의 설계 방법을 제공하는 것과 함께, 당해 방법과 종래의 ASP의 설계 방법을 조합함으로써, 앰플리콘이 중복되는 복수의 점 변이, 특히 인접하는 2개의 1염기 다형 부위의 1염기 치환을 최소한의 ASP를 사용하여 검출하는 방법을 제공하는 것을 가능하게 하였다.
도 1은 EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 2는 EGFR 유전자의 엑손 20의 C797S 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 3은 EGFR 유전자의 엑손 18의 G719A 변이 및 G719S 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 4는 EGFR 유전자의 엑손 18의 G719A 변이 및 G719C 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 5는 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12의 G12S 및 G12D 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 6은 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12의 G12R 및 G12A 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 7은 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12의 G12C 및 G12V 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 8은 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13의 G13S 및 G13A 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 9는 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13의 G13R 및 G13V 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
도 10은 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13의 G13C 및 G13D 변이를 포함하는 DNA로부터 PCR 산물을 선택적으로 증폭시킨 결과를 나타낸다.
본 발명은 변이형용 프라이머를 표적이 되는 핵산 시료 중의 핵산에 하이브리다이즈시키고, 1염기 치환을 포함하는 DNA 서열만을 선택적으로 증폭시킴으로써, 1염기 치환을 검출하는 방법에 관한 발명이다.
핵산 시료란, 핵산이 포함되는 시료라면 특별히 한정되지는 않는다. 핵산 시료로서는, 추출이나 합성된 핵산을 포함한 시료나, 혈액, 수액 등의 각종 체액이나, 점막, 모발 등의 조직이나 그들 유래의 세포를 포함하는 생체 시료여도 되고, 게다가 단세포 생물이나 미생물 등 생물 개체 그 자체를 포함한 시료여도 된다. 그들 핵산의 유래는 한정되지 않고, 모든 생물종이나 바이러스종 유래의 핵산을 사용할 수 있다. 또한, 세포핵 내의 핵산이나, 미토콘드리아나 엽록체나 핵소체 등으로 대표되는 소기관이 유지하는 핵외 유래의 핵산이어도 된다. 또한, 인공적 합성된 핵산이나, 일반적으로 벡터로서 사용되는 플라스미드나 바이러스 벡터여도 된다.
핵산의 종류는 DNA와 RNA의 어느 쪽이든 좋다. DNA의 경우, 일반적으로 알려져 있는 다양한 DNA가 사용 가능하고, 게놈 DNA나, 상보적 DNA(cDNA)와 같이 mRNA를 역전사하여 얻어진 DNA여도 된다. RNA는, 일반적으로 알려져 있는 mRNA나 rRNA나 바이러스 RNA 등의 다양한 RNA를 사용할 수 있다.
본 발명에서 핵산 증폭에 행하여지는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 종래부터 알려져 있는 방법으로 행할 수 있어, 일반적으로 알려져 있는 PCR법 등으로 실시가 가능하다.
증폭의 대상이 되는 핵산 서열은 특별히 한정되지는 않는다. 핵산 서열이면 임의의 서열을 증폭시킬 수 있어, DNA와 RNA 모두 증폭 가능하다. 생물 유래의 핵산은 증폭 가능하고, 그의 생물종은 특별히 한정되지는 않는다. 또한, ORF(Open Reading Frame)에 해당하는 영역에서든 그 이외의 부분에서든 증폭 가능하다. 또한, 바람직하게는 생체 유래의 핵산은, 1 내지는 2개 이상의 뉴클레오티드의 변이에 의한 1염기 다형이 확인되는 영역을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 생체 유래의 핵산은, 인접하는 2개의 1염기 다형 부위가 확인되는 영역을 포함한다. 또한, 바람직하게는 생체 유래의 핵산은, 인간종의 EGFR 유전자, KRAS 유전자 혹은 NRAS 유전자의 1염기 다형을 포함하는 DNA 영역을 포함한다. EGFR 유전자의 1염기 다형을 포함하는 DNA 영역은, 바람직하게는 코돈 719, 790, 797 중 어느 1코돈, 혹은 복수의 코돈을 포함하는 DNA 영역이 바람직하다. KRAS 유전자의 1염기 다형을 포함하는 DNA 영역은, 바람직하게는 코돈 12, 13, 59, 61, 117, 146 중 어느 1코돈, 혹은 복수의 코돈을 포함하는 DNA 영역이다. NRAS 유전자의 1염기 다형을 포함하는 DNA 영역은, 바람직하게는 코돈 12, 13, 59, 61, 117, 146 중 어느 1코돈, 혹은 복수의 코돈을 포함하는 DNA 영역이다.
본 발명에 사용되는 변이형용 프라이머는, 통상의 PCR에서 사용할 수 있는 프라이머라면 특별히 한정되지는 않는다. 변이형용 프라이머의 서열은, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가, 표적 핵산의 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 1염기 다형 부위의 변이형 뉴클레오티드의 염기와 상보적이고, 또한 3' 말단으로부터 2번째 염기가, 표적 핵산의 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 대응하는 염기와 상보적이지 않은 염기로 치환되고, 그 밖의 염기는 표적 핵산의 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 대응하는 염기와 상보적이다. 해당 변이형용 프라이머를 사용하여 핵산 증폭을 행할 때의 해당 변이형용 프라이머는, 포워드, 리버스 어느 한쪽에 해당하면 되고, 다른 쪽은 임의의 서열이어도 된다. 또한, 포워드, 리버스 양쪽의 프라이머 모두가, 변이형용 프라이머여도 된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 및 C797S 변이를 포함하는 DNA의 선택적 증폭
본 발명에 의해 설계한 ASP의 식별력에 관하여 평가하기 위해, 인간 EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 및 C797S 변이를 포함하는 DNA(변이형 DNA), 그리고 당해 2개의 유전자 변이를 포함하지 않는 DNA(야생형 DNA)를 준비하였다. 변이형 DNA로서는, 각각의 유전자 변이를 포함하는 서열(서열 번호 2, 서열 번호 3 및 4)을 편입시킨 플라스미드 DNA를 준비하고(유로핀 제노믹스 가부시키가이샤에 위탁), 또한 야생형 DNA로서는, K562 세포주로부터 추출 정제한 게놈 DNA를 사용하였다.
서열 번호 2는, EGFR 유전자의 T790M 변이를 포함하는 서열이며, 코돈 790을 하선으로 나타내고, 1염기 다형 부위를 굵은 글자로 나타낸다. 서열 번호 3 및 4는, EGFR 유전자의 서열 번호 2와 동일한 영역의 서열이지만, 각각 상이한 C797S 변이를 포함하는 서열이다. 코돈 797을 하선으로 나타내고, 1염기 다형 부위를 굵은 글자로 나타낸다. 서열 번호 1은, EGFR 유전자의 서열 번호 2 내지 4와 동일한 영역의 야생형 서열의 일부이다.
서열 번호 1(EGFR 유전자의 야생형 서열의 일부)
Figure 112018105847659-pct00001
서열 번호 2(EGFR 유전자의 T790M 변이 서열 [ATG] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00002
서열 번호 3(EGFR 유전자의 C797S 변이 서열 [AGC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00003
서열 번호 4(EGFR 유전자의 C797S 변이 서열 [TCC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00004
(1) EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 및 C797S 변이 검출용의 프라이머
서열 번호 5 내지 8로 표시되는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(이하, 프라이머 1 내지 4로 표시한다)의 합성을 DNA 합성 수탁 회사(시그마 알드리치 가부시키가이샤)에 위탁하였다.
프라이머 1은, 인간 EGFR 유전자의 코돈 790을 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 2의 상보쇄)에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기 (T)가 1염기 다형 부위에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (C)를 갖는다(즉, 프라이머 1은 서열 번호 2의 상보쇄에 1염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다).
프라이머 2는, 인간 EGFR 유전자의 코돈 797을 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 4의 쇄)에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기 (G)가 서열 번호 4로 나타내는 1염기 다형 부위에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (T)를 갖는다(즉, 프라이머 2는 서열 번호 4의 쇄에 1염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 또한, 프라이머 2는, 인간 EGFR 유전자의 코돈 797을 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 3의 쇄)에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기 (T)가 서열 번호 3으로 표시되는 1염기 다형 부위에 대응하지만, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (G)를 갖는다(즉, 프라이머 2는 서열 번호 3의 쇄에 1염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 프라이머 2는, 인간 EGFR 유전자의 코돈 797을 포함하는 야생형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 1의 쇄)에 상보적인 서열을 갖지만, 3' 말단으로부터 3번째 및 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (GT)를 갖는다(즉, 프라이머 2는 서열 번호 1의 쇄에 2염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다).
프라이머 3은 프라이머 1과 짝이 되는 리버스 프라이머이며, 프라이머 4는 프라이머 2와 짝이 되는 포워드 프라이머이다. 프라이머 1 및 2의 1염기 다형 부위에 대응하는 염기를 굵은 글자로 나타내고, 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기를 하선으로 나타낸다.
서열 번호 5(프라이머 1)
Figure 112018105847659-pct00005
서열 번호 6(프라이머 2)
Figure 112018105847659-pct00006
서열 번호 7(프라이머 3)
Figure 112018105847659-pct00007
서열 번호 8(프라이머 4)
Figure 112018105847659-pct00008
(2) ASP-PCR법에 의한 EGFR 유전자의 엑손 20의 T790M 및 C797S 변이의 해석
(a) 시약 및 증폭 조건
이하의 시약을 포함하는 25μL의 반응 용액을 제조하고, CFX96(바이오래드 사)을 사용하여 2스텝의 실시간 PCR에 의한 해석을 행하였다.
Figure 112018105847659-pct00009
그 결과를 도 1 및 도 2에 도시한다. 본 발명에서 설계한 프라이머를 사용하면, 40사이클까지 야생형 DNA로부터의 유의한 증폭은 확인되지 않아, 변이형 DNA를 선택적으로 증폭시키는(변이형 DNA를 야생형 DNA로부터 식별하는) 것이 가능하였다. 특히, EGFR 유전자의 코돈 797의 경우, 2가지 양식의 변이를 1종류의 프라이머로 동시에 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로, 효율적이다.
[실시예 2] EGFR 유전자의 엑손 18의 G719A, G719S 및 G719C 변이를 포함하는 DNA로부터의 선택적 증폭
본 발명에 의해 설계한 ASP의 식별력에 관하여 평가하기 위해, 인간 EGFR 유전자의 엑손 18의 코돈 719의 3종류의 변이(G719A, S, C)를 포함하는 DNA(변이형 DNA), 그리고 당해 3개의 유전자 변이를 포함하지 않는 DNA(야생형 DNA)를 준비하였다. 변이형 DNA로서는, 각각의 유전자 변이를 포함하는 서열(서열 번호 10, 11 및 12)을 편입시킨 플라스미드 DNA를 준비하고(유로핀 제노믹스 가부시키가이샤에 위탁), 또한 야생형 DNA로서는, 실시예 1과 마찬가지로 K562 세포주로부터 추출 정제한 게놈 DNA를 사용하였다.
서열 번호 10, 11 및 12는, 각각 EGFR 유전자의 G719A 변이, G719S 변이 및 G719C 변이를 포함하는 서열이며, 코돈 719를 하선으로 나타내고, 1염기 다형 부위를 굵은 글자로 나타낸다. 서열 번호 10, 11 및 12는, 모두 EGFR 유전자의 동일한 영역의 서열이다. 서열 번호 9는, EGFR 유전자의 서열 번호 10 내지 12와 동일한 영역의 야생형 서열의 일부이다.
서열 번호 9(EGFR 유전자의 야생형 서열의 일부)
Figure 112018105847659-pct00010
서열 번호 10(EGFR 유전자의 G719A 변이 서열 [GCC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00011
서열 번호 11(EGFR 유전자의 G719S 변이 서열 [AGC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00012
서열 번호 12(EGFR 유전자의 G719C 변이 서열 [TGC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00013
(1) EGFR 유전자의 엑손 18의 G719A, S, C 변이 검출용의 프라이머
서열 번호 13 내지 15로 표시되는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(이하, 프라이머 5 내지 7로 표시한다)의 합성을 DNA 합성 수탁 회사(시그마 알드리치 가부시키가이샤)에 위탁하였다.
프라이머 5는, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 10의 쇄)에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기 (G)가 G719A 변이의 1염기 다형 부위에 대응하지만, 그의 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (T)를 갖는다(즉, 프라이머 5는 서열 번호 10의 쇄에 1염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 또한, 프라이머 5는, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 11의 쇄)에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기 (T)가 G719S 변이의 1염기 다형 부위에 대응하지만, 그의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (G)를 갖는다(즉, 프라이머 5는 서열 번호 11의 쇄에 1염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 프라이머 5는, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 12의 쇄)에 상보적인 서열을 갖지만, 3' 말단으로부터 3번째 및 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (GT)를 갖는다(즉, 프라이머 5는 서열 번호 12의 쇄에 2염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 프라이머 5는, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 야생형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 9의 쇄)에 상보적인 서열을 갖지만, 3' 말단으로부터 3번째 및 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (GT)를 갖는다(즉, 프라이머 5는 서열 번호 9의 쇄에 2염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다).
프라이머 6은, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 10의 쇄)에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기 (G)가 G719A 변이의 1염기 다형 부위에 대응하지만, 그의 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (A)를 갖는다(즉, 프라이머 6은 서열 번호 10의 쇄에 1염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 또한, 프라이머 6은, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 12의 쇄)에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기 (A)가 G719C 변이의 1염기 다형 부위에 대응하지만, 그의 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (G)를 갖는다(즉, 프라이머 6은 서열 번호 12의 쇄에 1염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 프라이머 6은, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 변이형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 11의 쇄)에 상보적인 서열을 갖지만, 3' 말단으로부터 3번째 및 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (GA)를 갖는다(즉, 프라이머 6은, 서열 번호 11의 쇄에 2염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다). 프라이머 6은, 인간 EGFR 유전자의 코돈 719를 포함하는 야생형 핵산의 한쪽 쇄(서열 번호 9의 쇄)에 상보적인 서열을 갖지만, 3' 말단으로부터 3번째 및 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기 (GA)를 갖는다(즉, 프라이머 6은, 서열 번호 9의 쇄에 2염기의 미스매치를 갖고 하이브리다이즈한다).
프라이머 7은, 프라이머 5 및 6과 짝이 되는 공통의 포워드 프라이머이다. 프라이머 5 및 6의 1염기 다형 부위에 대응하는 염기를 굵은 글자로 나타내고, 해당 프라이머가 하이브리다이즈하는 쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기를 하선으로 나타낸다.
서열 번호 13(프라이머 5)
Figure 112018105847659-pct00014
서열 번호 14(프라이머 6)
Figure 112018105847659-pct00015
서열 번호 15(프라이머 7)
Figure 112018105847659-pct00016
(2) ASP-PCR법에 의한 EGFR 유전자의 엑손 18의 G719A, S, C 변이의 해석
(a) 시약 및 증폭 조건
실시예 1과 동일 조건에서 행하였다.
그 결과를 도 3 및 도 4에 도시한다. 본 발명에서 설계한 프라이머를 사용하면, 40사이클까지 야생형 DNA로부터의 유의한 증폭은 확인되지 않아, 변이형 DNA를 선택적으로 증폭시키는(특정한 변이형 DNA를, 야생형 DNA 및 다른 변이형 DNA로부터 식별하는) 것이 가능하였다. 특히, EGFR 유전자의 코돈 719의 경우, 3가지 양식의 변이를 2종류의 프라이머로 선택적으로 증폭시킬 수 있으므로, 효율적이다.
[실시예 3] KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12, 13의 선택적 증폭
인간 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 및 13은, 표 2에 나타내는 바와 같이, 각각 6종류의 점 변이가 발생하는 것이 알려져 있다. 코돈을 구성하는 3개의 염기 중, 1번째 또는 2번째 염기가 변이하는 양식이 각각 3종류씩 존재하는 점에서, 각각을 조합하여 본 발명에 따라 ASP를 설계하면, 코돈 12 및 13의 12패턴의 변이 검출용으로서는, 절반의 6종류의 프라이머로 선택적으로 증폭시키는 것이 가능해져, 검출 시약 및 조작의 간편화·생력화에 공헌할 수 있다.
Figure 112018105847659-pct00017
각각의 유전자 변이 서열(서열 번호 17 내지 28)을 편입시킨 플라스미드 DNA를 준비(유로핀 제노믹스 가부시키가이샤에 위탁)하고, 또한 2개의 유전자 변이를 확인하지 못한 유전자 서열(서열 번호 16)도 야생형으로서 마찬가지로 준비하여, 본 발명에 의해 설계한 ASP의 식별력에 관하여 평가하였다.
서열 번호 16(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 변이 서열 [GGT] 및 코돈 13 변이 서열 [GGC] 공통 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00018
서열 번호 17(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 변이 서열 G12S [AGT] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00019
서열 번호 18(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 변이 서열 G12R [CGT] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00020
서열 번호 19(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 변이 서열 G12C [TGT] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00021
서열 번호 20(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 변이 서열 G12D [GAT] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00022
서열 번호 21(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 변이 서열 G12A [GCT] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00023
서열 번호 22(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 변이 서열 G12V [GTT] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00024
서열 번호 23(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13 변이 서열 G13S [AGC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00025
서열 번호 24(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13 변이 서열 G13R [CGC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00026
서열 번호 25(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13 변이 서열 G13C [TGC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00027
서열 번호 26(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13 변이 서열 G13D [GAC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00028
서열 번호 27(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13 변이 서열 G13A [GCC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00029
서열 번호 28(KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13 변이 서열 G13V [GTC] 프래그먼트)
Figure 112018105847659-pct00030
(1) KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 및 코돈 13 변이 검출용의 프라이머
서열 번호 29 내지 35로 표시되는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(이하, 프라이머 8 내지 14로 표시한다)의 합성을 DNA 합성 위탁 회사(시그마 알드리치 가부시키가이샤)에 위탁하였다.
프라이머 8은 인간 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12의 G12S 및 G12D의 변이형 핵산에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 염기는 G12D 염기 다형 부위의 변이형 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 (T)를 갖지만, 그것은 G12S에서는 비상보적인 관계에 있으며, 또한 그의 3' 말단으로부터 2번째 염기는 G12D와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (T)를 갖지만, 그것은 G12S 염기 다형 부위 (A)에 상보적이다.
프라이머 9는 인간 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12의 G12R 및 G12A의 변이형 핵산에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 염기는 G12A 염기 다형 부위의 변이형 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 (G)를 갖지만, 그것은 G12R에서는 비상보적인 관계에 있으며, 또한 그의 3' 말단으로부터 2번째 염기는 G12A와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (G)를 갖지만, 그것은 G12R 염기 다형 부위 (C)에 상보적이다.
프라이머 10은 인간 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12의 G12C 및 G12V의 변이형 핵산에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 염기는 G12V 염기 다형 부위의 변이형 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 (A)를 갖지만, 그것은 G12C에서는 비상보적인 관계에 있으며, 또한 그의 3' 말단으로부터 2번째 염기는 G12V와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (A)를 갖지만, 그것은 G12C 염기 다형 부위 (T)에 상보적이다.
프라이머 11은 인간 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13의 G13S 및 G13A의 변이형 핵산에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 염기는 G13A 염기 다형 부위의 변이형 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 (G)를 갖지만, 그것은 G13S에서는 비상보적인 관계에 있으며, 또한 그의 3' 말단으로부터 2번째 염기는 G13A와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (T)를 갖지만, 그것은 G13S 염기 다형 부위 (A)에 상보적이다.
프라이머 12는 인간 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13의 G13R 및 G13V의 변이형 핵산에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 염기는 G13V 염기 다형 부위의 변이형 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 (A)를 갖지만, 그것은 G13R에서는 비상보적인 관계에 있으며, 또한 그의 3' 말단으로부터 2번째 염기는 G13V와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (G)를 갖지만, 그것은 G13R 염기 다형 부위 (C)에 상보적이다.
프라이머 13은 인간 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 13의 G13C 및 G13D의 변이형 핵산에 상보적인 서열을 갖고, 그의 3' 말단으로부터 3번째 염기는 G13D 염기 다형 부위의 변이형 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 (T)를 갖지만, 그것은 G13C에서는 비상보적인 관계에 있으며, 또한 그의 3' 말단으로부터 2번째 염기는 G13D와 상보가 아닌 뉴클레오티드 (A)를 갖지만, 그것은 G13C 염기 다형 부위 (T)에 상보적이다.
프라이머 14는, 프라이머 8 내지 13과 짝이 되는 공통의 포워드 프라이머이다.
서열 번호 29(프라이머 8)
Figure 112018105847659-pct00031
서열 번호 30(프라이머 9)
Figure 112018105847659-pct00032
서열 번호 31(프라이머 10)
Figure 112018105847659-pct00033
서열 번호 32(프라이머 11)
Figure 112018105847659-pct00034
서열 번호 33(프라이머 12)
Figure 112018105847659-pct00035
서열 번호 34(프라이머 13)
Figure 112018105847659-pct00036
서열 번호 35(프라이머 14)
Figure 112018105847659-pct00037
(2) ASP-PCR법에 의한 KRAS 유전자의 엑손 2의 코돈 12 및 13 변이의 해석
(a) 시약 및 증폭 조건
이하의 시약을 포함하는 25μL의 반응 용액을 제조하고, CFX96(바이오래드 사)으로 2스텝의 실시간 PCR에 의한 해석을 행하였다.
Figure 112018105847659-pct00038
코돈 12의 결과를 도 5 내지 7에, 코돈 13의 결과를 도 8 내지 10에 도시한다. 본 발명에서 설계한 프라이머를 사용하면, 야생형으로부터의 증폭은 확인되지 않아, 변이형을 특이적으로 증폭시키는 것이 가능하다고 말할 수 있다. 특히, KRAS 유전자의 경우, 코돈 12 및 13의 12패턴의 변이 검출용으로서는, 절반의 6종류의 프라이머로 특이적으로 증폭시키는 것이 가능해져, 검출 시약의 간편화·생력화에 공헌할 수 있다.
본 발명의 프라이머 설계 방법을 이용한 프라이머는, 생체 시료를 사용한 유전자 진단 방법, 유전자 진단 시약, 가계 해석 방법, 가계 해석용 시약, 식물 품종 식별 방법, 식물 품종 식별 시약, 식육 품종 감정 방법, 식육 품종 감정 시약, 법의학 해석 방법 및 법의학 해석 시약 등에 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SEKISUI MEDICAL CO. LTD. <120> Gene mutation detection method <130> temporary <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actcaagatc gcattcatgc gtcttcacct ggaaggggtc catgtgcccc tccttctggc 60 caccatgcga agccacactg acgtgcctct ccctccctcc aggaagccta cgtgatggcc 120 agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct gcctcacctc caccgtgcag 180 ctcatcacgc agctcatgcc cttcggctgc ctcctggact atgtccggga acacaaagac 240 aatattggct cccagtacct gctcaactgg tgtgtgcaga tcgcaaaggt aatcagggaa 300 gggagatacg gggaggggag ataaggagcc aggatcctca catgcggtct gcgctcctgg 360 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (188)..(188) <223> T790M amino acid substitution <400> 2 actcaagatc gcattcatgc gtcttcacct ggaaggggtc catgtgcccc tccttctggc 60 caccatgcga agccacactg acgtgcctct ccctccctcc aggaagccta cgtgatggcc 120 agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct gcctcacctc caccgtgcag 180 ctcatcatgc agctcatgcc cttcggctgc ctcctggact atgtccggga acacaaagac 240 aatattggct cccagtacct gctcaactgg tgtgtgcaga tcgcaaaggt aatcagggaa 300 gggagatacg gggaggggag ataaggagcc aggatcctca catgcggtct gcgctcctgg 360 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (208)..(208) <223> C797S amino acid substitution <400> 3 actcaagatc gcattcatgc gtcttcacct ggaaggggtc catgtgcccc tccttctggc 60 caccatgcga agccacactg acgtgcctct ccctccctcc aggaagccta cgtgatggcc 120 agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct gcctcacctc caccgtgcag 180 ctcatcacgc agctcatgcc cttcggcagc ctcctggact atgtccggga acacaaagac 240 aatattggct cccagtacct gctcaactgg tgtgtgcaga tcgcaaaggt aatcagggaa 300 gggagatacg gggaggggag ataaggagcc aggatcctca catgcggtct gcgctcctgg 360 <210> 4 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (209)..(209) <223> C797S amino acid substitution <400> 4 actcaagatc gcattcatgc gtcttcacct ggaaggggtc catgtgcccc tccttctggc 60 caccatgcga agccacactg acgtgcctct ccctccctcc aggaagccta cgtgatggcc 120 agcgtggaca acccccacgt gtgccgcctg ctgggcatct gcctcacctc caccgtgcag 180 ctcatcacgc agctcatgcc cttcggctcc ctcctggact atgtccggga acacaaagac 240 aatattggct cccagtacct gctcaactgg tgtgtgcaga tcgcaaaggt aatcagggaa 300 gggagatacg gggaggggag ataaggagcc aggatcctca catgcggtct gcgctcctgg 360 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccgtgcagct catcatcc 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggacatagtc caggagggtg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gggagccaat attgtctttg tg 22 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atgcgaagcc acactgac 18 <210> 9 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gtagagaagg cgtacatttg tccttccaaa tgagctggca agtgccgtgt cctggcaccc 60 aagcccatgc cgtggctgct ggtccccctg ctgggccatg tctggcactg ctttccagca 120 tggtgagggc tgaggtgacc cttgtctctg tgttcttgtc ccccccagct tgtggagcct 180 cttacaccca gtggagaagc tcccaaccaa gctctcttga ggatcttgaa ggaaactgaa 240 ttcaaaaaga tcaaagtgct gggctccggt gcgttcggca cggtgtataa ggtaaggtcc 300 ctggcacagg cctctgggct gggccgcagg gcctctcatg gtctggtggg gagcccagag 360 tccttgcaag ctgtatattt ccatcatcta ctttactctt 400 <210> 10 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (263)..(263) <223> G719A amino acid substitution <400> 10 gtagagaagg cgtacatttg tccttccaaa tgagctggca agtgccgtgt cctggcaccc 60 aagcccatgc cgtggctgct ggtccccctg ctgggccatg tctggcactg ctttccagca 120 tggtgagggc tgaggtgacc cttgtctctg tgttcttgtc ccccccagct tgtggagcct 180 cttacaccca gtggagaagc tcccaaccaa gctctcttga ggatcttgaa ggaaactgaa 240 ttcaaaaaga tcaaagtgct ggcctccggt gcgttcggca cggtgtataa ggtaaggtcc 300 ctggcacagg cctctgggct gggccgcagg gcctctcatg gtctggtggg gagcccagag 360 tccttgcaag ctgtatattt ccatcatcta ctttactctt 400 <210> 11 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (262)..(262) <223> G719S amino acid substitution <400> 11 gtagagaagg cgtacatttg tccttccaaa tgagctggca agtgccgtgt cctggcaccc 60 aagcccatgc cgtggctgct ggtccccctg ctgggccatg tctggcactg ctttccagca 120 tggtgagggc tgaggtgacc cttgtctctg tgttcttgtc ccccccagct tgtggagcct 180 cttacaccca gtggagaagc tcccaaccaa gctctcttga ggatcttgaa ggaaactgaa 240 ttcaaaaaga tcaaagtgct gagctccggt gcgttcggca cggtgtataa ggtaaggtcc 300 ctggcacagg cctctgggct gggccgcagg gcctctcatg gtctggtggg gagcccagag 360 tccttgcaag ctgtatattt ccatcatcta ctttactctt 400 <210> 12 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (262)..(262) <223> G719C amino acid substitution <400> 12 gtagagaagg cgtacatttg tccttccaaa tgagctggca agtgccgtgt cctggcaccc 60 aagcccatgc cgtggctgct ggtccccctg ctgggccatg tctggcactg ctttccagca 120 tggtgagggc tgaggtgacc cttgtctctg tgttcttgtc ccccccagct tgtggagcct 180 cttacaccca gtggagaagc tcccaaccaa gctctcttga ggatcttgaa ggaaactgaa 240 ttcaaaaaga tcaaagtgct gtgctccggt gcgttcggca cggtgtataa ggtaaggtcc 300 ctggcacagg cctctgggct gggccgcagg gcctctcatg gtctggtggg gagcccagag 360 tccttgcaag ctgtatattt ccatcatcta ctttactctt 400 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgaacgcacc ggaggtc 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cgaacgcacc ggaggac 17 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 agctctcttg aggatcttga agg 23 <210> 16 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 17 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (130)..(130) <223> G12S amino acid substitution <400> 17 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagcta gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 18 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (130)..(130) <223> G12R amino acid substitution <400> 18 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctc gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 19 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (130)..(130) <223> G12C amino acid substitution <400> 19 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctt gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 20 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (131)..(131) <223> G12D amino acid substitution <400> 20 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg atggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 21 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (131)..(131) <223> G12A amino acid substitution <400> 21 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg ctggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 22 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (131)..(131) <223> G12V amino acid substitution <400> 22 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg ttggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 23 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (133)..(133) <223> G13S amino acid substitution <400> 23 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg gtagcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 24 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (133)..(133) <223> G13R amino acid substitution <400> 24 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg gtcgcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 25 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (133)..(133) <223> G13R amino acid substitution <400> 25 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg gttgcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 26 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (134)..(134) <223> G13D amino acid substitution <400> 26 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg gtgacgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 27 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (134)..(134) <223> G13A amino acid substitution <400> 27 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg gtgccgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt ctttgataca gataaagg 268 <210> 28 <211> 268 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mutation <222> (134)..(134) <223> G13V amino acid substitution <400> 28 ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taatatagtc 60 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta 120 gttggagctg gtgtcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt 180 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg 240 caggaccatt 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Claims (10)

  1. 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여, 핵산 시료 중에 포함되는 1염기 다형 부위의 1염기 치환을 검출하는 방법으로서, 해당 방법이,
    (a) 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 상기 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하고, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지며, 또한 그 밖의 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를, 당해 핵산에 하이브리다이즈시키는 공정,
    (b) DNA 폴리머라제와 그의 기질인 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산에 의해 변이형용 프라이머를 신장시키는 공정, 및
    (c) 폴리머라제 연쇄 반응의 증폭 산물의 유무에 따라 변이형용 프라이머가 신장되었는지 여부를 판정하고, 그에 따라 당해 핵산 시료 중에 포함되는 1염기 치환을 검출하는 공정을 조합하는 것을 특징으로 하는, 1염기 치환을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1염기 다형 부위가 인접하는 제1 및 제2의 1염기 다형 부위이며, (a) 공정이, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기는 상기 제1의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 제1의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드를 갖는 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와는 상보적이지 않고, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기는 상기 제2의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기는 당해 제2의 1염기 다형의 변이형 뉴클레오티드를 갖는 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와는 상보적이지 않고, 또한 그 밖의 뉴클레오티드의 염기는 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를, 당해 핵산에 하이브리다이즈시키는 공정인, 1염기 치환을 검출하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1염기 치환이 EGFR 유전자, KRAS 유전자 혹은 NRAS 유전자의 1염기 치환인, 1염기 치환을 검출하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 폴리머라제 연쇄 반응의 증폭 산물의 유무에 따라 변이형용 프라이머가 신장되었는지 여부를 판정하고, 그에 따라 핵산 시료 중에 포함되는 1염기 다형 부위의 1염기 치환을 검출하는 방법에 사용하기 위한 변이형용 프라이머를 포함하는 시약으로서, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 상기 1염기 치환의 변이형 뉴클레오티드의 염기에 대응하고, 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은 염기를 가지며, 또한 그 밖의 뉴클레오티드의 염기가 당해 핵산의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적인 변이형용 프라이머를 포함하는 시약.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변이형용 프라이머가, EGFR 유전자, KRAS 유전자 혹은 NRAS 유전자의 변이형 유전자를 증폭시키는 시약.
  8. 삭제
  9. 이하의 공정을 포함하는, 뉴클레오티드 단편을 증폭시키는 방법:
    (i) 제1 프라이머 및 제2 프라이머를, 시료 중의 1염기 다형 부위를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA) 분자에 하이브리다이즈시키는 공정;
    (ⅱ) 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산의 존재 하에서, 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 DNA 폴리머라제에 의해 신장시키는 공정;
    (ⅲ) 신장된 제1 프라이머에 제2 프라이머를 하이브리다이즈시키고, 또한 신장된 제2 프라이머에 제1 프라이머를 하이브리다이즈시키는 공정;
    (ⅳ) 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산의 존재 하에서, 신장된 제1 프라이머에 하이브리다이즈된 제2 프라이머 및 신장된 제2 프라이머에 하이브리다이즈된 제1 프라이머를, DNA 폴리머라제에 의해 신장시키는 공정; 및
    (v) 임의로, 상기의 (ⅲ) 및 (ⅳ) 공정을 1 내지 50회 반복하는 공정;
    여기서, 제1 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 상기 DNA 분자의 한쪽 쇄와 상보적이고, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 1염기 다형의 하나의 유전자형을 특징짓는 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 염기는 당해 DNA쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않고,
    제2 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 상기 DNA 분자의 다른 쪽 쇄와 상보적이고,
    제1 프라이머와 제2 프라이머의 3' 말단은, 시료 중의 1염기 다형 부위를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA) 분자에 하이브리다이즈하였을 때에, 서로 다른 쪽 프라이머의 3' 말단으로부터 보아 3'측에 위치한다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 1염기 다형 부위가 인접하는 제1 및 제2의 1염기 다형 부위이며, 제1 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 상기 DNA 분자의 한쪽 쇄와 상보적이고, 3' 말단으로부터 3번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 제1의 1염기 다형의 하나의 유전자형을 특징짓는 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 2번째 염기는 당해 DNA쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않고, 또한 3' 말단으로부터 2번째 뉴클레오티드의 염기가 당해 제2의 1염기 다형의 하나의 유전자형을 특징짓는 염기에 대응하지만, 3' 말단으로부터 3번째 염기는 당해 DNA쇄의 대응하는 뉴클레오티드의 염기와 상보적이지 않은, 뉴클레오티드 단편을 증폭시키는 방법.
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