JP2010172323A - 一塩基多型の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の方法は、従来のアレル特異的増幅法において用いられるSNPの特定の塩基に特異的なプライマーとともに、このプライマーがハイブリダイズしないSNPの他の塩基と優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるブロッキング剤を用いてPCRを行う工程を含む。このブロッキング剤は、3’末端にddNTPを含む。
【選択図】なし
Description
該所定の一塩基多型は、第1の塩基および第2の塩基の2種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第1の塩基を有するDNA鎖(第1のDNA鎖)および該所定の一塩基多型による第2の塩基を有するDNA鎖(第2のDNA鎖)のいずれか1または両方を含み、
該方法は、
(a)該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(b)該所定の一塩基多型の第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と該所定の一塩基多型の第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;および
(c)該核酸試料について、該工程(a)および(b)により検出されるDNA断片(それぞれF1およびF2)の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含み、
該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用の対プライマー(Pc1)は、該第1のDNA鎖の第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第2の塩基検出用の対プライマー(Pc2)は、該第2のDNA鎖の第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも低いが、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高く;そして
該第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも低いが、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高い。
上記工程(a)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが上記工程(b)により検出されるDNA断片(F2)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
上記工程(a)および(b)により検出されるDNA断片(F1およびF2)がともに存在する場合は遺伝子型が第1/第2型であり、そして
上記工程(a)により検出されるDNA断片(F1)が存在しないが上記工程(b)により検出されるDNA断片(F2)が存在する場合は遺伝子型が第2/第2型であると判定する。
該所定の一塩基多型は、第1の塩基、第2の塩基、および第3の塩基の3種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第1の塩基を有するDNA鎖(第1のDNA鎖)、該所定の一塩基多型による第2の塩基を有するDNA鎖(第2のDNA鎖)、および該所定の一塩基多型による第3の塩基を有するDNA鎖(第3のDNA鎖)からなる群より選択される1または2種を含み、
該方法は、
(d)該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(e)該所定の一塩基多型の第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と該所定の一塩基多型に対応する第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;
(f)該所定の一塩基多型の第3の塩基検出用プライマー対(第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)および第3の対プライマー(Pc3))と該所定の一塩基多型に対応する第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F3)を検出する工程;および
(g)該核酸試料について、該工程(d)〜(f)により検出されるDNA断片(それぞれF1、F2およびF3)の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含み、
該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)は、該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用の対プライマー(Pc1)は、該第1のDNA鎖の第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第2の塩基検出用の対プライマー(Pc2)は、該第2のDNA鎖の第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第3の塩基検出用の対プライマー(Pc3)は、該第3のDNA鎖の第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)は、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも低いが、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高く;
該第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)は、該第1のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも低いが、該第1のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも高く;そして
該第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)は、該第1のDNA鎖および該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも低いが、該第1のDNA鎖および該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも高い。
上記工程(d)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが上記工程(e)および(f)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
上記工程(d)および(e)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在するが上記工程(f)により検出されるDNA断片(F3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第2型であり、
上記工程(e)により検出されるDNA断片(F2)が存在するが上記工程(d)および(f)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第2型であり、
上記工程(e)および(f)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在するが上記工程(d)により検出されるDNA断片(F1)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第3型であり、
上記工程(f)により検出されるDNA断片(F3)が存在するが上記工程(d)および(e)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第3型であり、そして
上記工程(d)および(f)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在するが上記工程(e)により検出されるDNA断片(F2)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第3型であると判定する。
該所定の一塩基多型は、第1の塩基、第2の塩基、第3の塩基、および第4の塩基の4種類の塩基を有し、
該核酸試料は、該所定の一塩基多型による第1の塩基を有するDNA鎖(第1のDNA鎖)、該所定の一塩基多型による第2の塩基を有するDNA鎖(第2のDNA鎖)、該所定の一塩基多型による第3の塩基を有するDNA鎖(第3のDNA鎖)、および該所定の一塩基多型による第4の塩基を有するDNA鎖(第4のDNA鎖)からなる群より選択される1または2種を含み、
該方法は、
(h)第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(i)第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と該所定の一塩基多型に対応する第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;
(j)第3の塩基検出用プライマー対(第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)および第3の対プライマー(Pc3))と該所定の一塩基多型に対応する第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F3)を検出する工程;
(k)第4の塩基検出用プライマー対(第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)および第4の対プライマー(Pc4))と該所定の一塩基多型に対応する第4の塩基検出用ブロッキング剤(B4)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F4)を検出する工程;および
(l)該核酸試料について、該工程(h)〜(k)により検出されるDNA断片(それぞれF1、F2、F3およびF4)の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含み、
該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)は、該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)は、該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用の対プライマー(Pc1)は、該第1のDNA鎖の第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第2の塩基検出用の対プライマー(Pc2)は、該第2のDNA鎖の第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第3の塩基検出用の対プライマー(Pc3)は、該第3のDNA鎖の第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第4の塩基検出用の対プライマー(Pc4)は、該第4のDNA鎖の第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)は、該第2のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも低いが、該第2のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高く;
該第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)は、該第1のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも低いが、該第1のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも高く;
該第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)は、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも低いが、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも高く;そして
該第4の塩基検出用ブロッキング剤(B4)は、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)よりも低いが、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)よりも高い。
上記工程(h)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが上記工程(i)、(j)および(k)により検出されるDNA断片(F2、F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
上記工程(h)および(i)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在するが上記工程(j)および(k)により検出されるDNA断片(F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第2型であり、
上記工程(h)および(j)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在するが上記工程(i)および(k)により検出されるDNA断片(F2およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第3型であり、
上記工程(h)および(k)により検出されるDNA断片(F1およびF4)が存在するが上記工程(i)および(j)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第4型であり、
上記工程(i)により検出されるDNA断片(F2)が存在するが上記工程(h)、(j)および(k)により検出されるDNA断片(F1、F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第2型であり、
上記工程(i)および(j)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在するが上記工程(h)および(k)により検出されるDNA断片(F1およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第3型であり、
上記工程(i)および(k)により検出されるDNA断片(F2およびF4)が存在するが上記工程(h)および(j)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第4型であり、
上記工程(j)により検出されるDNA断片(F3)が存在するが上記工程(h)、(i)および(k)により検出されるDNA断片(F1、F2およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第3型であり、
上記工程(j)および(k)により検出されるDNA断片(F3およびF4)が存在するが上記工程(h)および(i)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第4型であり、そして
上記工程(k)により検出されるDNA断片(F4)が存在するが上記工程(h)、(i)および(j)により検出されるDNA断片(F1、F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第4/第4型であると判定する。
(a)所定の一塩基多型の第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(b)所定の一塩基多型の第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と所定の一塩基多型の第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;および
(c)核酸試料について、工程(a)および(b)により検出されるDNA断片(それぞれF1およびF2)の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含む。
Tm(B1−1) < Tm(Ps1−1)
Tm(Ps2−1)< Tm(B2−1)
となり、そして第2の塩基とハイブリダイズする場合には、それぞれ図2(i)および(ii)に示すように、
Tm(Ps1−2)< Tm(B1−2)
Tm(B2−2) < Tm(Ps2−2)
となるように、SNP対応プライマーとddNTPブロッキング剤とを設計する。
Tm(℃)=4×(プライマー中のG+Cの数)+2×(A+Tの数)
により求めることができる。したがって、各プライマーの長さを調節するなどの手段によって、適切なTm値に調節することができる。
工程(a)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが工程(b)により検出されるDNA断片(F2)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
工程(a)および(b)により検出されるDNA断片(F1およびF2)がともに存在する場合は遺伝子型が第1/第2型であり、そして
工程(a)により検出されるDNA断片(F1)が存在しないが上記工程(b)により検出されるDNA断片(F2)が存在する場合は遺伝子型が第2/第2型であると判定する。
(d)所定の一塩基多型の第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(e)所定の一塩基多型の第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と所定の一塩基多型に対応する第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;
(f)所定の一塩基多型の第3の塩基検出用プライマー対(第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)および第3の対プライマー(Pc3))と所定の一塩基多型に対応する第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F3)を検出する工程;および
(g)核酸試料について、工程(d)〜(f)により検出されるDNA断片(それぞれF1、F2およびF3)の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含む。
Tm(B1−1) < Tm(Ps1−1)
Tm(Ps2−1)< Tm(B2−1)
Tm(Ps3−1)< Tm(B3−1)
となり、第2の塩基とハイブリダイズする場合には、
Tm(B2−2) < Tm(Ps2−2)
Tm(Ps1−2)< Tm(B1−2)
Tm(Ps3−2)< Tm(B3−2)
となり、そして第3の塩基とハイブリダイズする場合には、
Tm(B3−3) < Tm(Ps3−3)
Tm(Ps1−3)< Tm(B1−3)
Tm(Ps2−3)< Tm(B2−3)
となる。
工程(d)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが工程(e)および(f)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
工程(d)および(e)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在するが工程(f)により検出されるDNA断片(F3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第2型であり、
工程(e)により検出されるDNA断片(F2)が存在するが工程(d)および(f)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第2型であり、
工程(e)および(f)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在するが工程(d)により検出されるDNA断片(F1)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第3型であり、
工程(f)により検出されるDNA断片(F3)が存在するが上記工程(d)および(e)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第3型であり、そして
工程(d)および(f)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在するが上記工程(e)により検出されるDNA断片(F2)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第3型であると判定する。
(h)第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(i)第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と所定の一塩基多型に対応する第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;
(j)第3の塩基検出用プライマー対(第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)および第3の対プライマー(Pc3))と所定の一塩基多型に対応する第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F3)を検出する工程;
(k)第4の塩基検出用プライマー対(第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)および第4の対プライマー(Pc4))と所定の一塩基多型に対応する第4の塩基検出用ブロッキング剤(B4)とを、核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F4)を検出する工程;および
(l)核酸試料について、工程(h)〜(k)により検出されるDNA断片(それぞれF1、F2、F3およびF4)の存在により、一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含む。
Tm(B1−1) < Tm(Ps1−1)
Tm(Ps2−1)< Tm(B2−1)
Tm(Ps3−1)< Tm(B3−1)
Tm(Ps4−1)< Tm(B4−1)
となり、第2の塩基とハイブリダイズする場合には、
Tm(B2−2) < Tm(Ps2−2)
Tm(Ps1−2)< Tm(B1−2)
Tm(Ps3−2)< Tm(B3−2)
Tm(Ps4−2)< Tm(B4−2)
となり、第3の塩基とハイブリダイズする場合には、
Tm(B3−3) < Tm(Ps3−3)
Tm(Ps1−3)< Tm(B1−3)
Tm(Ps2−3)< Tm(B2−3)
Tm(Ps4−3)< Tm(B4−3)
となり、そして第4の塩基とハイブリダイズする場合には、
Tm(B4−4) < Tm(Ps4−4)
Tm(Ps1−4)< Tm(B1−4)
Tm(Ps2−4)< Tm(B2−4)
Tm(Ps3−4)< Tm(B3−4)
となる。
工程(h)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが工程(i)、(j)および(k)により検出されるDNA断片(F2、F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
工程(h)および(i)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在するが工程(j)および(k)により検出されるDNA断片(F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第2型であり、
工程(h)および(j)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在するが工程(i)および(k)により検出されるDNA断片(F2およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第3型であり、
工程(h)および(k)により検出されるDNA断片(F1およびF4)が存在するが工程(i)および(j)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第4型であり、
工程(i)により検出されるDNA断片(F2)が存在するが工程(h)、(j)および(k)により検出されるDNA断片(F1、F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第2型であり、
工程(i)および(j)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在するが工程(h)および(k)により検出されるDNA断片(F1およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第3型であり、
工程(i)および(k)により検出されるDNA断片(F2およびF4)が存在するが工程(h)および(j)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第4型であり、
工程(j)により検出されるDNA断片(F3)が存在するが工程(h)、(i)および(k)により検出されるDNA断片(F1、F2およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第3型であり、
工程(j)および(k)により検出されるDNA断片(F3およびF4)が存在するが工程(h)および(i)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第4型であり、そして
工程(k)により検出されるDNA断片(F4)が存在するが工程(h)、(i)および(j)により検出されるDNA断片(F1、F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第4/第4型であると判定する。
ヒトエストロゲン受容体遺伝子(以下、ER遺伝子と略する)を含む溶液を3種類準備した。これら3種類の溶液に含まれるER遺伝子は、予めXX型、Xx型およびxx型であることがそれぞれ判明している。ER遺伝子多型は、第1エクソンと第2エクソンとの間のイントロン領域に存在する遺伝子多型であり、制限酵素XbaIにより切断されるかまたはされないかによって判別可能な遺伝子多型を有する。ここで、x型とは制限酵素XbaIにより切断される制限部位を有さないER遺伝子の遺伝子型をいい、そしてX型とは制限酵素XbaIにより切断される制限部位を有するER遺伝子の遺伝子型をいう。
(1)ブロッキング剤の調製
1μLのTdT(30ユニット/反応)、2μLの10×buffer、4μLのddTTP溶液(0.5mM)および2μLのオリゴDNA(ccaatgctcatcccaacttt:配列番号4)(50μM)を含む溶液中で、37℃にて4時間反応後、70℃で10分間反応させることにより、配列番号4のオリゴDNAの3’末端にddTTPを付加したブロッキング剤(ccaatgctcatcccaactttdT:配列番号5)を調製した。また、上記溶液のddTTPをddCTPに置き換えた溶液で同様の反応を行い、配列番号4のオリゴDNAの3’末端にddCTPを付加したブロッキング剤(ccaatgctcatcccaactttdC:配列番号6)を調製した。ブロッキング剤は、後述するリバースプライマーと競合するものである。付加したddTTPおよびddCTPは、上記ER遺伝子の遺伝子多型部位に対応するように設計した。
上記3種類それぞれの検体についてSNPの判定を、配列番号5および6のブロッキング剤をそれぞれ用いたPCR反応(i)および(ii)にて行った。
まず、第1のPCR反応として、PCR反応専用のキット(BIOLINE社 BIOTAQ DNA POLYMERASE(dNTP付き))、配列番号5のブロッキング剤(G検出用ブロッキング剤)、フォワードプライマー(ctgtgttgtccatcagttga:配列番号7)およびリバースプライマー(ccaatgctcatcccaacttc:配列番号8)(G検出用プライマー)を用いて、最初の変性工程を95℃で5分行った後、1サイクルの変性工程が94℃で30秒、アニール工程が60℃で30秒、鎖伸長工程が74℃で30秒とするサイクルを30サイクル行った。そして、最後の伸長工程を74℃で7分行った。
第2のPCR反応は、上記第1のPCR反応におけるリバースプライマー(配列番号8)の代わりに、配列番号9に示すリバースプライマー(ccaatgctcatcccaacact:配列番号9)(A検出用プライマー)を用い、配列番号5に示すブロッキング剤の代わりに、配列番号6に示すブロッキング剤(A検出用ブロッキング剤)を用いたこと以外は、上記第1のPCR反応と同様に行った。
Tm(Ps1)=53.9℃<Tm(B1)=54.6℃、および
Tm(B2)=54.3℃<Tm(Ps2)=56.3℃
であり、そしてX型の遺伝子(塩基G)に対しては、
Tm(B1)=54.3℃<Tm(Ps1)=56.3℃、および
Tm(Ps2)=56.1℃<Tm(B2)=56.5℃
である。ここで、B1とは配列番号5に示すブロッキング剤(G検出用ブロッキング剤)を、B2とは配列番号6に示すブロッキング剤(A検出用ブロッキング剤)を、Ps1とは配列番号8に示すリバースプライマー(G検出用プライマー)を、Ps2とは配列番号9に示すリバースプライマー(A検出用プライマー)をそれぞれ意味する。
第1のPCR反応および第2のPCR反応後のそれぞれの溶液中に増幅された遺伝子が存在するか否かの判定を、マイクロチップ電気泳動(株式会社島津製作所製、MultiNA、DNA−500キット)により行った。結果を図4のレーン1〜6に示す。なお、レーンMは、分子量マーカーである。図4の電気泳動写真の各レーンの下部に、検体の遺伝子型および用いたリバースプライマーの種類を示す。
第1のPCR反応において配列番号5のブロッキング剤(G検出用ブロッキング剤)を用いなかったこと、および第2のPCR反応において配列番号6のブロッキング剤(A検出用ブロッキング剤)を用いなかったこと以外は、実施例1と同様に行った。これは、いわゆるMASA法という従来手法である。結果を図4のレーン7〜12に示す。
Claims (10)
- 核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第1の塩基および第2の塩基の2種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第1の塩基を有するDNA鎖(第1のDNA鎖)および該所定の一塩基多型による第2の塩基を有するDNA鎖(第2のDNA鎖)のいずれか1または両方を含み、
(a)該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(b)該所定の一塩基多型の第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と該所定の一塩基多型の第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;および
(c)該核酸試料について、該工程(a)および(b)により検出されるDNA断片(それぞれF1およびF2)の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含み、
該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用の対プライマー(Pc1)は、該第1のDNA鎖の第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第2の塩基検出用の対プライマー(Pc2)は、該第2のDNA鎖の第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも低いが、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高く;そして
該第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも低いが、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高い、
方法。 - 前記第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)が、前記第1の塩基に相補的な塩基を3’末端側に有し、そして前記第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)が、前記第2の塩基に相補的な塩基を3’末端側に有する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)が、前記第2の塩基に相補的な塩基を3’末端側に有し、そして前記第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)が、前記第1の塩基に相補的な塩基を3’末端側に有する、請求項2に記載の方法。
- 前記第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)と前記第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項1から3のいずれかの項に記載の方法。
- 前記第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)と前記第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項1から4のいずれかの項に記載の方法。
- 前記工程(c)において、
前記工程(a)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが前記工程(b)により検出されるDNA断片(F2)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
前記工程(a)および(b)により検出されるDNA断片(F1およびF2)がともに存在する場合は遺伝子型が第1/第2型であり、そして
前記工程(a)により検出されるDNA断片(F1)が存在しないが前記工程(b)により検出されるDNA断片(F2)が存在する場合は遺伝子型が第2/第2型であると判定する、
請求項1から5のいずれかの項に記載の方法。 - 核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第1の塩基、第2の塩基、および第3の塩基の3種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第1の塩基を有するDNA鎖(第1のDNA鎖)、該所定の一塩基多型による第2の塩基を有するDNA鎖(第2のDNA鎖)、および該所定の一塩基多型による第3の塩基を有するDNA鎖(第3のDNA鎖)からなる群より選択される1または2種を含み、
(d)該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(e)該所定の一塩基多型の第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と該所定の一塩基多型に対応する第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;
(f)該所定の一塩基多型の第3の塩基検出用プライマー対(第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)および第3の対プライマー(Pc3))と該所定の一塩基多型に対応する第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F3)を検出する工程;および
(g)該核酸試料について、該工程(d)〜(f)により検出されるDNA断片(それぞれF1、F2およびF3)の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含み、
該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)は、該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用の対プライマー(Pc1)は、該第1のDNA鎖の第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第2の塩基検出用の対プライマー(Pc2)は、該第2のDNA鎖の第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第3の塩基検出用の対プライマー(Pc3)は、該第3のDNA鎖の第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)は、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも低いが、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高く;
該第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)は、該第1のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも低いが、該第1のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも高く;そして
該第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)は、該第1のDNA鎖および該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも低いが、該第1のDNA鎖および該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも高い、
方法。 - 前記工程(g)において、
前記工程(d)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが前記工程(e)および(f)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
前記工程(d)および(e)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在するが前記工程(f)により検出されるDNA断片(F3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第2型であり、
前記工程(e)により検出されるDNA断片(F2)が存在するが前記工程(d)および(f)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第2型であり、
前記工程(e)および(f)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在するが前記工程(d)により検出されるDNA断片(F1)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第3型であり、
前記工程(f)により検出されるDNA断片(F3)が存在するが前記工程(d)および(e)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第3型であり、そして
前記工程(d)および(f)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在するが前記工程(e)により検出されるDNA断片(F2)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第3型であると判定する、
請求項7に記載の方法。 - 核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第1の塩基、第2の塩基、第3の塩基、および第4の塩基の4種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第1の塩基を有するDNA鎖(第1のDNA鎖)、該所定の一塩基多型による第2の塩基を有するDNA鎖(第2のDNA鎖)、該所定の一塩基多型による第3の塩基を有するDNA鎖(第3のDNA鎖)、および該所定の一塩基多型による第4の塩基を有するDNA鎖(第4のDNA鎖)からなる群より選択される1または2種を含み、
(h)第1の塩基検出用プライマー対(第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)および第1の対プライマー(Pc1))と該所定の一塩基多型の第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F1)を検出する工程;
(i)第2の塩基検出用プライマー対(第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)および第2の対プライマー(Pc2))と該所定の一塩基多型に対応する第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F2)を検出する工程;
(j)第3の塩基検出用プライマー対(第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)および第3の対プライマー(Pc3))と該所定の一塩基多型に対応する第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F3)を検出する工程;
(k)第4の塩基検出用プライマー対(第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)および第4の対プライマー(Pc4))と該所定の一塩基多型に対応する第4の塩基検出用ブロッキング剤(B4)とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるDNA断片(F4)を検出する工程;および
(l)該核酸試料について、該工程(h)〜(k)により検出されるDNA断片(それぞれF1、F2、F3およびF4)の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程;
を含み、
該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)は、該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)は、該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)は、該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)は、該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用の対プライマー(Pc1)は、該第1のDNA鎖の第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第2の塩基検出用の対プライマー(Pc2)は、該第2のDNA鎖の第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第3の塩基検出用の対プライマー(Pc3)は、該第3のDNA鎖の第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第4の塩基検出用の対プライマー(Pc4)は、該第4のDNA鎖の第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし;
該第1の塩基検出用ブロッキング剤(B1)は、該第2のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第1のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも低いが、該第2のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第1の一塩基多型対応プライマー(Ps1)よりも高く;
該第2の塩基検出用ブロッキング剤(B2)は、該第1のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第2のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも低いが、該第1のDNA鎖、該第3のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型含む領域に対するTm値が、該第2の一塩基多型対応プライマー(Ps2)よりも高く;
該第3の塩基検出用ブロッキング剤(B3)は、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも低いが、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第3の一塩基多型対応プライマー(Ps3)よりも高く;そして
該第4の塩基検出用ブロッキング剤(B4)は、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、3’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)を有するポリヌクレオチドであり、そして該第4のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)よりも低いが、該第1のDNA鎖、該第2のDNA鎖および該第3のDNA鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するTm値が、該第4の一塩基多型対応プライマー(Ps4)よりも高い、
方法。 - 前記工程(l)において、
前記工程(h)により検出されるDNA断片(F1)が存在するが前記工程(i)、(j)および(k)により検出されるDNA断片(F2、F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第1型であり、
前記工程(h)および(i)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在するが前記工程(j)および(k)により検出されるDNA断片(F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第2型であり、
前記工程(h)および(j)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在するが前記工程(i)および(k)により検出されるDNA断片(F2およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第3型であり、
前記工程(h)および(k)により検出されるDNA断片(F1およびF4)が存在するが前記工程(i)および(j)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第1/第4型であり、
前記工程(i)により検出されるDNA断片(F2)が存在するが前記工程(h)、(j)および(k)により検出されるDNA断片(F1、F3およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第2型であり、
前記工程(i)および(j)により検出されるDNA断片(F2およびF3)が存在するが前記工程(h)および(k)により検出されるDNA断片(F1およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第3型であり、
前記工程(i)および(k)により検出されるDNA断片(F2およびF4)が存在するが前記工程(h)および(j)により検出されるDNA断片(F1およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第2/第4型であり、
前記工程(j)により検出されるDNA断片(F3)が存在するが前記工程(h)、(i)および(k)により検出されるDNA断片(F1、F2およびF4)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第3型であり、
前記工程(j)および(k)により検出されるDNA断片(F3およびF4)が存在するが前記工程(h)および(i)により検出されるDNA断片(F1およびF2)が存在しない場合は遺伝子型が第3/第4型であり、そして
前記工程(k)により検出されるDNA断片(F4)が存在するが前記工程(h)、(i)および(j)により検出されるDNA断片(F1、F2およびF3)が存在しない場合は遺伝子型が第4/第4型であると判定する、
請求項9に記載の方法。
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KR101312241B1 (ko) | 2010-04-27 | 2013-09-27 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 증폭억제시발체를 이용하는 유전자 돌연변이 검출 방법 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2004194619A (ja) * | 2002-12-20 | 2004-07-15 | Olympus Corp | 競合核酸を使用した酵素反応方法 |
JP2007530026A (ja) * | 2004-03-26 | 2007-11-01 | キアゲン アーエス | 核酸配列決定 |
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2009
- 2009-02-02 JP JP2009021801A patent/JP2010172323A/ja active Pending
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