JPWO2003102178A1 - 遺伝子多型のタイピング方法 - Google Patents
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Abstract
微量の核酸試料を使用して正確、かつ再現性に優れた塩基置換変異(例えばSNP)、挿入変異あるいは欠失変異を検出する手段、これらの手段を用いた遺伝子多型のタイピング方法。
Description
技術分野
本発明は遺伝子のタイピングに有用な、目的遺伝子上の塩基置換、挿入変異、欠失変異の検出方法ならびにそのためのキットに関する。
背景技術
同一種に属する生物個体のゲノム上に含有される遺伝暗号は同一ではなく、多型(polymorphism)と呼ばれる塩基配列上の差違が存在することが知られている。多型には1〜数十塩基の欠失や挿入、特定の塩基配列が重複するものなどが知られているが、1個の塩基が他の塩基に置換されているものは一塩基置換多型(single nucleotide polymorphism、SNP)と呼ばれている。
従来のSNPの検出手段は、ハイブリダイゼーションに基づくもの、プライマー伸長に基づくものあるいは酵素の基質特異性を利用するものに大別される。
ハイブリダイゼーション法は、塩基置換の有無を核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーションによって検出するものである。該方法は一塩基の違いによってハイブリダイゼーションが左右されるようなプローブ、ならびにハイブリダイゼーション条件を見出す必要があり、高い再現性を有する検出系の構築が困難である。
従来法としては、サイクルプローブ反応(cycle probe reaction、例えば米国特許第5,660,988号公報参照)を用いた変異検出方法が挙げられる。別法として、TaqMan法(例えば米国特許第5,210,015号公報あるいは米国特許第5,487,972号公報参照)を用いた変異検出方法が挙げられる。さらに塩基置換を検出しようとする塩基部分に3’末端がアニーリングするプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法(例えば、米国特許第5,137,806号公報参照)、3’末端から2番目のヌクレオチドに検出しようとする塩基置換部位が位置するプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法(例えば、国際公開第01/42498号パンフレット参照)、塩基置換を検出しようとする塩基の3’側に隣接する塩基に3’末端がアニーリングするプライマーを使用し、当該プライマーに取り込まれる塩基を判別して目的部分の変異の有無とその塩基を決定する方法等が挙げられる。また、DNAリガーゼを使用する方法がある。当該方法はプローブの末端部分を塩基置換を検出しようとする塩基部分に対応させることにより、ここに隣接したプローブとのライゲーションの有無から塩基置換を検出する。さらにインベーダー(Invader)法(例えば、米国特許第5,846,717号公報参照)のような二本鎖核酸の特殊な構造を認識して切断する活性を有する酵素を利用する方法が挙げられる。
上記の方法は、標的核酸が微量であった場合には検出できない、厳密な温度履歴条件下で行う必要がある、標的核酸とのアニーリングを厳密にコントロールする必要がある、あるいは検出のために特別な性質を有する酵素が必要である等の問題点を有していた。
そこで、等温条件下で標的核酸を増幅する方法として、ICAN法(例えば、国際公開第00/56877号パンフレット、国際公開第02/16639号パンフレット)のような鎖置換型核酸増幅方法が開発された。さらに、DNA−RNA−DNA型のキメラヌクレオチドを用いて遺伝子多型をタイピングする方法として、UCAN法(例えば、国際公開第02/64833号パンフレット)が開発された。
発明の目的
本発明の目的は、微量の核酸試料を使用して正確、かつ再現性に優れた塩基置換変異(例えばSNP)、挿入変異あるいは欠失変異を検出する手段を提供し、さらにこれらの手段を用いた遺伝子多型のタイピング方法を提供することにある。
発明の概要
上記課題を解決するためには、遺伝子における種々の多型、例えば塩基置換(例えばSNP)、挿入変異あるいは欠失変異を正確に検出し、かつその結果を強いシグナルとして得ることが可能な方法が望まれている。
本発明者らは、塩基置換を検出しようとする標的核酸にアニーリング可能であり、インタクトな状態ではその3’末端からはDNAポリメラーゼによるDNA伸長反応が開始されることがなく、かつ、アニーリングした鋳型鎖の塩基配列に応じてヌクレアーゼによる切断が左右されるようなヌクレオチドを作成し、当該ヌクレオチドならびに標的核酸を特異的に検出可能なプローブを組み合わせて、標的核酸上の遺伝子多型を正確、かつ高感度に検出可能な方法を構築した。さらに、本発明者らは、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換型DNAポリメラーゼ、RNaseHならびに標的核酸を特異的に検出可能なプローブを組み合わせた、遺伝子多型を正確、かつ高感度に検出可能な方法を構築し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第1の発明は、ヒトチトクローム遺伝子のCYP 2C19遺伝子のG636A、あるいはCYP 1A1遺伝子のT6235Cの遺伝子多型をタイピングする方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)ヒトチトクローム遺伝子上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、ヒトチトクローム遺伝子上の特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とするヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法に関する
第1の発明において、ヌクレオチドとしては配列表の配列番号14、15、21又は22記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドが好適に使用される。さらに、配列表の配列番号16又は23記載の塩基配列を有するプライマーを使用してもよい。
第1の発明の方法では、工程(2)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことができる。この工程においては、例えば配列表の配列番号20あるいは24記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることができる。
本発明の第2の発明は、第1のヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、配列表の配列番号14、15、21又は22記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とする。
第2の発明のキットは、さらに配列表の配列番号16又は23記載の塩基配列を有するプライマー、及び/又は配列表の配列番号20あるいは24記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有してもよい。
本発明の第3の発明は、ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の多型をタイピングする方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする。
第3の発明において、ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子としてはGSTM1遺伝子およびGSTT1遺伝子が例示される。キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては配列表の配列番号6〜8又は29〜31記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するものが好適に使用される。
第3の発明の方法では、工程(b)により増幅された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことができる。この工程においては、例えば配列表の配列番号9又は32記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることができる。
本発明の第4の発明は、第3のヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、配列表の配列番号配列番号6〜8又は29〜31記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とする。
第4の発明のキットは、さらに配列表の配列番号9又は32記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有してもよい。
本発明の第5の発明はヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のALDH2遺伝子のGlu487Lysの遺伝子多型をタイピングする方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子上の特定の塩基を含む任意の鎮長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とする。
第5の発明において、ヌクレオチドとしては配列表の配列番号25又は26記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドが好適に使用される。さらに、配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマーを使用してもよい。
第5の発明の方法では、工程(2)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことができる。この工程においては、例えば配列表の配列番号28記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることができる。
本発明の第6の発明は、第5の発明のヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、配列表の配列番号25、26記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とする。
第6の発明のキットは、さらに配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマー、及び/又は配列表の配列番号28記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有してもよい。
本発明の第7の発明は、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法に関する。
本発明の第8の発明は、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法に関する。
本発明の第9の発明は、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(A)少なくとも1つの標的となる核酸を、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含する方法で検出し、
(B)さらに上記(A)とは異なる別の標的となる核酸を、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の、塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含する方法で検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法に関する。
本発明の第7〜第9の発明において、標的となる核酸の少なくとも一つが内部標準となる核酸であってもよく、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを用いて内部標準となる核酸を検出しても良い。さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを用いて内部標準となる核酸を検出しても良い。
本発明の第10の発明は、本発明の第7〜第9の発明の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットに関する。
本発明の第10の発明において、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを含有していても良く、さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブ含んでいても良い。
発明の詳細な説明
本明細書に記載の「遺伝子多型」とは、同一の生物種集団内に含まれる個体間における遺伝子の塩基配列の相違を指す。遺伝子多型を構成する塩基配列の相違は特定の形式に限定されるものではなく、下記に示す「塩基置換」、「欠失変異」、「挿入変異」等種々のタイプのものを包含する。この遺伝情報の違いはバリエーション(variation)とも呼ばれている。
本明細書に記載の「塩基置換」とは、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基が他の塩基に置換されていることを指す。本明細書に記載の「塩基置換」において置換されている塩基の数には特に限定はなく、1塩基もしくはそれ以上の塩基に置換が存在してもよい。塩基配列中の一個の塩基に見られる置換は「一塩基置換多型(SNP)」と呼ばれている。また、核酸に人為的に導入された塩基置換も本明細書における「塩基置換」に含まれる。
本明細書に記載の「欠失変異」とは、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基配列が欠失していることを意味する。欠失した塩基配列は、1塩基でもよいし複数の塩基であってもよい。またこれらの塩基配列の欠失は、核酸上の特定の部位において複数箇所生じているものも含まれる。さらに、遺伝子の特定の領域、特に限定はされないが例えばエキソン及び/又はイントロンの領域、さらには当該遺伝子の全長が欠損した場合も「欠失変異」に含まれる。また、核酸に人為的に導入された塩基配列の欠失も本明細書における「欠失変異」に含まれる。
本明細書に記載の「挿入変異」とは、核酸上の特定の部位において、塩基配列が挿入されていることを意味する。挿入された塩基配列は、1塩基でもよいし複数の塩基であってもよいし、任意の鎖長であってもよい。また、これらの塩基配列の挿入は、核酸上の特定の部位において複数箇所生じているものも含まれる。また、核酸に人為的に導入された塩基配列の挿入も本明細書における「挿入変異」に含まれる。
本発明は、ゲノム多型やバリエーションの検出、特に、遺伝子上の塩基置換、例えばSNPの検出、遺伝子上の特定部位の挿入変異及び/または欠失変異の検出に好適である。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法に使用される、タイピングの対象となる遺伝子を含有する核酸(標的核酸)としては一本鎖、二本鎖の核酸、すなわちRNA、DNAを使用することができる。使用するヌクレアーゼによってはRNAを標的核酸とすることが困難な場合もあるが、その場合には当該RNAを鋳型として調製したcDNAを標的核酸として使用することにより、RNA上の塩基置換を検出することが可能である。
本発明においては、標的核酸を含有する試料をタイピング反応に使用することができる。
上記試料には特に限定はなく、標的核酸を含む可能性のあるあらゆる試料、例えば、細胞、組織(生検試料等)、全血、血清、脳脊髄液、精液、唾液、喀痰、尿、糞便、毛髪、細胞培養物等を使用することができる。上記の検体は、特に限定するものではないが、好ましくは適切な処理によって、例えばDNAポリメラーゼの反応を実施が可能な形態としたうえ、本発明の方法に供することができる。このような処理には細胞の溶解や試料からの核酸の抽出、精製が包含される。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法には、(I)標的核酸上の塩基配列と、そこにアニーリングするヌクレオチドとのミスマッチの有無の検出に基づく方法と、(II)標的核酸上の塩基配列の欠失および/または挿入を、プライマー対によって増幅される増幅断片の鎖長、もしくは増幅自体が起こるか否かによって判定する方法とがある。タイピングを行おうとする多型のタイプに応じて適切な方法を選択すればよい。
(1)本発明の標的核酸上の遺伝子多型のタイピング方法(I)
本発明の遺伝子多型のタイピング方法(I)は、
(A)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)多型のタイピングを行おうとする遺伝子上の、多型の存在する可能性のある特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(B)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程を包含することを特徴とする。
本発明のタイピング方法において、必要に応じてさらに標的核酸増幅用プライマーを併せて用いても良い。
本発明の検出方法において、必要に応じて上記工程(B)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含んでいても良い。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法においては、使用されるヌクレオチドの切断の有無、ならびにそれに続いて起こるDNA伸長反応の有無から塩基置換の存在が判定される。その方法には特に限定はなく、公知の核酸分析手法を使用することができる。例えば、DNA伸長反応の有無を調べる方法としては、生成した伸長産物をゲル電気泳動法(アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等)あるいはキャピラリー電気泳動法によって分離して確認する方法、伸長産物の鎖長の増加をマススペクトルによって測定する方法等を挙げることができる。また、別の態様としては、例えば、伸長産物へのヌクレオチドの取り込みを調べる方法がある。当該方法では、適切な標識を付加したヌクレオチド3リン酸が高分子の伸長産物に取り込まれる量として伸長産物の合成量を知ることができる。伸長産物は、例えば酸による沈殿処理やゲル電気泳動によって未反応のヌクレオチドと分離し、その生成量を測定することができる。さらに、DNA伸長反応によって生成するピロリン酸を酵素的に検出する方法を使用してもよい。
本発明のタイピング方法において、伸長反応を繰り返すことにより、結果として目的とする標的核酸が増幅される。さらに公知の核酸増幅反応を用いて当該伸長産物を増幅してもよい。このような態様は、高感度に塩基置換を検出する観点から有用である。
上記の核酸増幅反応には特に限定はなく、鋳型核酸に相補的な配列を有するプライマーが使用される種々の核酸増幅方法が使用できる。例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR;polymerase chain reaction、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号)、鎖置換型増幅法(SDA;strand displacement amplification、特公平7−114718号)、自立複製法(3SR;self−sustained sequence replication)、NASBA法(nucleic acid sequence based amplification、特許第2650159号)、TMA法(transcription−mediated amplification)、ICAN法(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第00/56877号あるいは第02/16639号パンフレット)等の公知の増幅方法を使用することができる。これらの方法において、鋳型DNA鎖に相補的なDNAを合成する際のプライマーとして本発明のヌクレオチドを使用することにより、標的核酸上の遺伝子多型のタイピングを行うことができる。
上記のような核酸増幅法を利用して本発明の遺伝子多型のタイピング方法を実施する場合には、各方法に使用されるプライマーの少なくとも一つとして本発明のヌクレオチドを使用し、さらに反応系中に当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼを共存させればよい。
上記のような、核酸増幅反応を利用した遺伝子多型のタイピングにおいては、当該反応による特異的な増幅産物の生成から塩基置換の存在を判定することができる。増幅産物の生成は、特に限定するものではないが、例えばゲル電気泳動、増幅産物に相補的な配列を有するプローブを使用したハイブリダイゼーション法、蛍光標識ヌクレオチドを利用した蛍光偏光法、サイクルプローブ反応法等が使用でき、さらに各遺伝子増幅方法に特有の検出反応も利用することができる。
本発明の検出方法を用いてゲノムレベルでの塩基置換を解析する場合には、大量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。該システムとしては、マイクロチップ、マイクロCE(capillary electophoresis)チップあるいはナノチップが例示される。
このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的のDNA断片が増幅されるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。特に限定はされないが例えば、ICAN法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適に使用できる。該方法を組み合わせることにより、当該システムの単純化が可能となり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。また、本発明の方法において、PCR法を組み合わせることもできる。
上記の標識が付加された本発明のヌクレオチドは、DNA伸長反応の有無の確認を容易にすることができ、本発明の遺伝子多型のタイピング方法に有用である。この場合、当該ヌクレオチド由来の標識物質を上記のような各標識に適した方法で検出し、伸長反応の有無を確認すればよい。
例えば、蛍光物質が付加された本発明のヌクレオチドを使用する場合、標識がプライマーとして利用される部分に付加されていれば、伸長産物をその蛍光を利用して検出することができる。また、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所よりも3’側に付加されていれば、3’側断片の標的核酸からの解離やDNAポリメラーゼの有する5’→3’エキソヌクレアーゼによる該断片の低分子化等に基づいて伸長反応の有無を検出することができる。このような、蛍光標識されたヌクレオチドの分子量の変化を伴う態様においては蛍光偏光法の利用が好適である。
また、蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質とを付加して蛍光を発することのないように標識した本発明のヌクレオチドを使用する場合、伸長反応が起こると同時に蛍光が発せられるようになるため、極めて容易に遺伝子多型のタイピングを行うことができる。
上記の各態様において、塩基置換を検出しようとする位置に対応してアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)あるいはウラシル(U)のそれぞれを有し、かつそれぞれが互いに区別可能な異なる標識を付されたヌクレオチドを利用することにより、塩基置換の存在とともに、塩基置換がある場合には置換している塩基の種類を同時に知ることができる。
本発明の方法において、ヒトを含む高等動物の両染色体ともに塩基置換を有しないホモ接合体(ホモ型)、両染色体ともに塩基置換が存在するホモ接合体(ホモ型)、あるいは一方の染色体のみに塩基置換を有するヘテロ接合体(ヘテロ型)の3通りを区別して検出することができる。このように、本発明の方法は、上記のような対立遺伝子上の塩基置換の検出にも有用である。
本発明の方法において用いるヌクレオチドは、標的核酸上の塩基置換を検出しようとする箇所を含む領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。インタクトな状態ではDNAポリメラーゼによるDNA伸長のプライマーとして機能することはないが、ヌクレアーゼによって切断を受けた後に初めてプライマーとして機能することができる。上記のような性質を有するものであればその鎖長には特に限定はなく、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドのいずれもが本発明に使用できる。通常、8〜50塩基、好ましくは10〜40塩基、特に好ましくは12〜30塩基のオリゴヌクレオチドが本発明のヌクレオチドとして使用される。
本発明のヌクレオチドは、通常、デオキシリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。必要に応じ、リボヌクレオチド、ヌクレオチドのアナログや誘導体(修飾物)を含有することができる。ヌクレオチドのアナログとしては、例えば塩基部分にイノシン、7−デアザグアニン等の塩基を有するヌクレオチドアナログあるいはリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログを使用することができる。また、修飾ヌクレオチドとしてはリン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)ヌクレオチドや標識化合物が付加されたヌクレオチド等が例示される。さらに、本発明のヌクレオチドはペプチド核酸〔PNA、Peptide Nucleic Acid;ネイチャー(Nature)、第365巻、第566〜568頁(1993)〕を含有するものであってもよい。本発明を特に限定するものではないが、好ましくは、上記のヌクレオチドのアナログや誘導体等は使用されるヌクレアーゼの作用に影響を与えない部位に導入される。本発明のヌクレオチドへのヌクレオチドアナログの導入は、ヌクレオチド自身の高次構造形成の抑制、標的核酸とヌクレオチドとのアニーリングの安定化の観点から有効である。すなわち、本発明の遺伝子多型のタイピング方法に用いることのできるヌクレオチドとしての機能を保持する範囲で、ヌクレオチドアナログ及び/又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。本発明のヌクレオチドに修飾ヌクレオチドを含ませること及び/又は反応温度を適宜調整することによりタイピングの特異性を向上させることができる。
本発明において使用されるヌクレオチドは、標的核酸上の特定の塩基における多型をタイピングするために、下記に示すような性質を有している。
A)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されている。
B)標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。
C)当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応する、すなわち該塩基と水素結合を形成するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する(または存在しない)場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない(または存在する)場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな3’末端を生じるような配列を含有している。
ここで、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレオチドの5’側断片は標的核酸とアニーリングした状態を保持することができる。また、このヌクレオチドの5’側断片の3’末端ではリボースまたはデオキシリボースの3位に水酸基が存在しており、該末端からのDNAポリメラーゼによるDNA伸長が可能である。すなわち、上記ヌクレオチドはヌクレアーゼによって切断される塩基配列を有する場合にはプライマーの前駆体として機能する。
上記のように本発明のヌクレオチドは、その3’末端がDNAポリメラーゼによるDNA伸長反応に使用できない形に修飾されている。上記目的を達成可能であればその修飾手段には特に限定はないが、例えば、3’末端にジデオキシヌクレオチド、リボースの3位の水酸基が修飾されたヌクレオチド、DNAポリメラーゼによる伸長が立体障害により妨害されるような修飾を付されたヌクレオチド等を付加することがあげられる。上記のヌクレオチドのリボースの3位の水酸基の修飾方法としては、アルキル化やその他の公知の修飾方法を利用することができ、例えばアミノアルキル化することにより、DNA伸長反応を防ぐことができる。
また、上記ヌクレオチドは、使用される条件において標的核酸の多型を調べようとする領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。すなわち、標的核酸と実質的に相補的な配列を有していればよく、目的とする塩基における置換の検出に支障をきたさない範囲であれば標的核酸に完全に相補的な塩基配列を有している必要はない。
上記のヌクレオチドを標的核酸とアニーリングさせ、適切なヌクレアーゼとDNAポリメラーゼの存在下にインキュベートを行った場合、標的核酸に塩基置換が存在するか否か、すなわち当該ヌクレオチドと標的核酸とがアニーリングして形成された二本鎖核酸にミスマッチ部位が存在するか否かでヌクレオチドの切断が左右される。ヌクレオチドが切断されて新たな3’末端が生じた場合にのみ標的核酸を鋳型としたDNA伸長が起こることから、DNA伸長の有無によってミスマッチの有無、すなわち塩基置換の有無を知ることができる。
本発明においては、検出しようとする塩基置換が存在する場合にミスマッチが生じるように前記ヌクレオチドを作成すること、逆に塩基置換が存在した場合にはミスマッチが生じないように作成することのどちらも可能である。さらに、目的の塩基に対応する位置に4種の塩基のいずれかを配置した4種のヌクレオチドを作成して使用し、どの塩基を有するプライマーで伸長が起こるかを調べることにより、塩基置換の存在と置換している塩基の種類とを同時に知ることもできる。
本発明で用いるヌクレオチドは、上記のようにヌクレアーゼによる切断によってDNA伸長が可能なプライマーに変換される。ここで、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所より5’側の部分がDNA伸長におけるプライマーとして機能する。当該ヌクレアーゼとしては、ヌクレオチドと標的核酸とがアニーリングして形成された二本鎖核酸中のミスマッチの存在に対応して前記ヌクレオチドを切断もしくは切断しないものであれば特に限定はないが、例えば、リボヌクレアーゼH、制限酵素、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼ等があげられる。
リボヌクレアーゼH(RNaseH)はDNAとRNAから形成された二本鎖核酸を認識し、RNA鎖を選択的に切断する酵素である。本発明のヌクレオチドの置換を検出しようとする塩基に対応する部分にリボヌクレオチドを配置しておくことにより、ミスマッチが存在しない場合にのみリボヌクレアーゼHで切断されるヌクレオチドとすることができる。
本発明に使用されるリボヌクレアーゼとしては、上記のリボヌクレオチドを含有する本発明のヌクレオチドと、これと相補的なDNAから形成された二本鎖核酸を認識し、当該リボヌクレオチド部分を選択的に切断する活性を有していれば特に限定はない。このような酵素としては、リボヌクレアーゼHが好適に使用でき、例えばバチルス・カルドテナクス(Bacillus caldotenax)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、ピロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)、アルカエオグロバス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、メタノコッカス・ヤナシ(Methanococcus jannashi)由来のリボヌクレアーゼH等を使用することができる。
また、制限酵素はDNAの特定の塩基配列(4〜8塩基)を認識し、当該配列内部、もしくはその周辺部を切断する酵素である。置換を検出しようとする塩基部分が制限酵素の認識配列と重複する場合には、当該配列を含むヌクレオチドを作成し、塩基置換の検出に使用することができる。ヌクレオチドと標的核酸との間にミスマッチが生じる場合には制限酵素による切断が起こらず、これによって塩基置換の有無を知ることができる。このようなヌクレオチドを使用するにあたっては標的核酸側が制限酵素によって切断を受けないようにする必要があるが、使用する制限酵素に対応する修飾メチラーゼを使用して特定の塩基をメチル化するなどの方法により、標的核酸特異的に制限酵素への耐性を付与することが可能である。
上記の2種のヌクレアーゼとは逆に、標的核酸とヌクレオチドとの間のミスマッチを認識して切断するような酵素を使用してもよい。このような酵素としてはMutH等を使用することができる。
本発明で用いるヌクレオチドが上記のヌクレアーゼによる切断を受け、新たな3’末端が生じると、当該末端よりDNAの伸長が開始される。この工程に使用されるDNAポリメラーゼとしては、鋳型DNAの配列に依存してプライマーの3’末端よりDNA伸長が可能なものであれば特に限定はない。例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、クレノウ・フラグメント、T7 DNAポリメラーゼ、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ)、サーマス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Taq DNAポリメラーゼ等)、好熱性古細菌由来α型DNAポリメラーゼ(Pfu DNAポリメラーゼ等)が挙げられる。
本発明のヌクレオチドを遺伝子増幅反応と組み合わせて使用する場合には、それぞれの遺伝子増幅反応に適したDNAポリメラーゼを選択して使用すればよい。
本発明においてヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて生じる3’側部分の断片は、その鎖長が短い場合には標的核酸から遊離するが、十分な鎖長を有している場合には標的核酸とのアニーリングを維持することが可能である。DNAポリメラーゼとして鎖置換活性を有するものを使用した場合には、当該断片はDNAポリメラーゼによるDNAの伸長とともに標的核酸から解離させられる。また、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使用した場合には、当該断片はDNAポリメラーゼによって分解される。
上記の、ヌクレアーゼとしてリボヌクレアーゼHを使用する本発明のヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明に使用することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−N’−3’
(上記一般式において、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、N’:DNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されたヌクレオチド、なおdNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい。)
上記一般式において、Nbで表される部位は遺伝子多型のタイピングの対象となる塩基に対応する塩基を含んでいる。また、上記の各ヌクレオチドはその機能を損なわない範囲でヌクレオチドのアナログや誘導体(修飾ヌクレオチド)を含有していてもよい。
上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、aは5以上の整数であればよく、好ましくは6以上の整数、さらに好ましくは8以上の整数である。またbは1以上の整数であればよく、例えば1〜15の範囲、好ましくは1〜10の範囲、さらに好ましくは1〜7の範囲、特に好ましくは1〜5の範囲である。さらにcは0あってもよく、あるいは1以上の整数であり、好ましくは0〜5の範囲、さらに好ましくは0〜3の範囲である。
例えば、上記一般式において、N’が修飾デオキシリボヌクレオチドであり、a=8の場合における、b=1〜3、c=0〜3のヌクレオチド等が例示される。すなわち、本発明の方法に使用できるようなヌクレオチドとなるようにa、b、cの数値を調整すればよい。
本発明のヌクレオチドに適切な標識を施すことにより、ヌクレアーゼによる切断、あるいはそれに続くDNA伸長反応により生じる産物(伸長産物)によってヌクレオチドから分離した3’側断片の検出を容易にし、遺伝子多型の存在を簡便に確認することができる。
ヌクレオチドの標識方法には限定はなく、例えば放射性同位体(32P等)、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド(ビオチン、ジゴキシゲニン等)、酵素等が使用できる。標識されたヌクレオチド由来の産物は当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。例えば、リガンド標識したヌクレオチド由来の産物と酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
ヌクレオチドを蛍光標識する態様としては、例えば当該ヌクレオチドを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質の両者で、適当な間隔をとって標識したものが包含される。このようなプライマーはインタクトな状態では蛍光を発することはないが、ヌクレアーゼにより切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には蛍光を発するようになる。このようなヌクレオチドはDNA伸長反応の開始と同時に蛍光が発せられるため、反応中の反応液を直接観察することによって遺伝子の多型をタイピングすることができる。
本発明の方法において、必要に応じて鋳型となる核酸を予め、物理学的、化学的又は酵素的に変性処理しても良い。該変性処理の方法としては、特に限定はされないが例えば、鋳型となる核酸の溶液を90℃以上に加熱処理することによる熱変性処理、アルカリ溶液で処理することによるアルカリ変性処理、あるいはヘリカーゼやRecA等で処理することによる酵素処理等、いずれの方法も好適に使用できる。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法の対象となる遺伝子としては、ヒトチトクローム遺伝子、例えばCYP 2C19遺伝子のG636A、あるいはCYP 1A1遺伝子のT6235Cが例示される。また、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、例えば、ALDH2遺伝子のGlu487Lysが例示される。
また、本発明の遺伝子多型のタイピング方法において、同時あるいは個別に内部標準(インターナルコントロール)となる核酸を検出しながらタイピングを行ってもよい。該内部標準は、本発明の方法において偽陰性の判断に利用することができる。該内部標準は、目的とする遺伝子を伸長するためのプライマーと同じもので伸長産物を与えるもの、目的とする遺伝子を伸長するためのプライマーと異なるもので伸長産物を与えるもののいずれであってもよい。また、該内部標準としては、検体サンプル中に最初から含まれている遺伝子であってもよく、特に限定はされないが例えば、β−グロビン遺伝子等が好適に使用できる。あるいは、人工的に調製した内部標準として機能しうる核酸を検体サンプルに添加した後、本発明の方法に供してもよい。当該内部標準の検出は、目的の遺伝子多型のタイピングに用いる方法と同様の方法で行うことができる。
(2)本発明の遺伝子多型のタイピング方法(I)に使用されるキット
本発明は、上記の本発明の遺伝子多型のタイピング方法(I)に使用されるキットを提供する。1つの実施態様において、該キットは本発明の方法で用いることができるヌクレオチドを含有することを特徴とする。該ヌクレオチドとしては、特に限定はされないが、例えば、ヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピングには配列表の配列番号14、15、21及び/又は22記載の塩基配列を有するヌクレオチドが好適である。また、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピングには配列表の配列番号25及び/又は26記載の塩基配列を有するヌクレオチドが好適である。塩基置換の有無と同時に置換した塩基を特定できるような、4種の塩基それぞれを含有するヌクレオチドのセットを含有するものでもよい。該ヌクレオチドのセットとしては、特に限定はされないが、例えば、ヒトチトクローム遺伝子タイピング用の配列表の配列番号14及び15記載の塩基配列を有するヌクレオチドのセット、配列表の配列番号21及び22記載の塩基配列を有するヌクレオチドのセット、さらに、例えば、配列表の配列番号14〜16記載の塩基配列を有するヌクレオチド並びにプライマーのセットあるいは配列表の配列番号21〜23記載の塩基配列を有するヌクレオチド並びにプライマーのセットが好適に使用できる。ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子タイピング用としては、配列表の配列番号25及び26記載の塩基配列を有するヌクレオチドのセット、さらに25〜27記載の塩基配列を有するヌクレオチド並びにプライマーのセットが好適に使用できる。また、配列表の配列番号20、24記載の塩基配列を有するヒトチトクローム遺伝子の塩基置換を特定できるような特異的検出用プローブ、配列表の配列番号28記載の塩基配列を有するヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基置換を特定できるような特異的検出用プローブを含有してもよい。さらに、当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼやその基質(dNTP)、反応に適した緩衝液等を含有するものやプライマー伸長産物の検出のための試薬を含有するものであってもよい。核酸増幅法と組み合わせて遺伝子多型のタイピングするためのキットとしては、当該増幅法に使用される反応液を調製するための試薬を含有するものが好適である。
本発明のキットにおいては、内部標準(インターナルコントロール)検出用のプライマーおよびプローブを含んでいてもよい。また、検体に添加するための内部標準となる核酸を含んでいてもよい。上記プライマーならびにプローブとしては、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列から選択される塩基配列を有するβ−グロビン増幅用プライマー、および配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するβ−グロビン検出用プローブが挙げられる。
(3)本発明の標的核酸上の遺伝子多型のタイピング方法(II)
本発明の遺伝子多型のタイピング方法(II)は、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程を包含することを特徴とする。
上記タイピング方法においては、必要に応じて上記工程(b)により増幅された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて核酸を検出する工程を含んでもよい。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条件において、DNA鎖の伸長に寄与することができ、さらに、その3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは1以上の修飾リボヌクレオチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端又は3’末端側に配置され、エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるものであれば、未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含される。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)リボヌクレオチドや、リボースの2位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、米国特許第5,003,097号記載の硫化反応試薬(グレンリサーチ社製)を用いた方法で調製した(α−S)リボヌクレオチド3リン酸、あるいは2−OMe−RNA−CE ホスホアミダイド試薬(グレンリサーチ社製)を用いて作製することができる。
また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断位置を制御し得る点において有用である。
本発明の方法で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後のDNA断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって1種類もしくは2種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖DNAが望まれる場合には1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、また、二本鎖が望まれる場合には2種類のプライマーが使用される。
本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが存在し、ICAN法に使用できるものであればその鎖長に特に限定はない。
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば約6ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは、約10ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは、約12ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの範囲の鎖長のものが使用できる。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列を3’末端又は3’末端側に含む。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明のDNA合成方法にプライマーとして使用することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
(上記一般式において、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよく、3’末端のヌクレオチドは当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい。)
上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、aは5以上の整数であればよく、好ましくは6以上の整数、さらに好ましくは8以上の整数である。またbは1以上の整数であればよく、例えば1〜15の範囲、好ましくは1〜10の範囲、さらに好ましくは1〜7の範囲、特に好ましくは1〜5の範囲である。さらにcは0であってもよく、あるいは1以上の整数であり、好ましくは0〜5の範囲、さらに好ましくは0〜3の範囲である。
本発明に用いられるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの態様としては、特に限定はされないが、例えば、a=8の場合における、b=1、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=2、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=3〜5、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、さらにb=1〜3、c=0〜3のキメラオリゴヌクレオチドプライマー等が例示される。すなわち、本発明の方法に使用できるようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーとなるようにa、b、cの数値を調整すればよい。
さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。即ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、DNAポリメラーゼがその3’末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で1以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは7−デアザグアニンのような修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。さらに、同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導入しても良い。特に限定するものではないが、非特異的なエンドヌクレアーゼ(RNase)によるプライマーの分解を防ぐ観点からは、例えば、(α−S)リボヌクレオチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用できる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、公知の方法、あるいは市販の核酸合成装置を使用し、所望の塩基配列を有するものを作製することができる。
本発明の方法の行程(a)において、RNAを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を1段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、AMV RTase、MMLV RTaseあるいはRAV−2 RTaseとBca DNAポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。
本発明の方法で増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば200bp以下、さらに好ましくは150bp以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に遺伝子多型のタイピングを行うことができる。
さらに、本発明の検出方法では、ビシン(Bicine)、トリシン(Tricine)、ヘペス(Hepes)、リン酸塩あるいはトリス(Tris)緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとDNAポリメラーゼは特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来RNaseH及びBcaBEST DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)の組み合わせが好ましい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びDNAポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
本発明では、標的核酸の増幅の際に、dUTPを基質として取り込ませることができる。したがって、dUTPを基質に用いた場合には、ウラシル N−グリコシダーゼ(uracil N−glycosidase;UNG)を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができる。
本発明の遺伝子タイピング方法においては、上記の(a)、(b)工程によって増幅産物が生成するか否か、若しくは増幅産物の鎖長を測定することによって挿入変異及び/又は欠失変異の存在を判定することができる。増幅産物の有無、増幅産物の鎖長のどちらで判定を行うかは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーをタイピングを行おうとする遺伝子のどの位置に設定するかによって決定することができる。
上記検出工程には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。また、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。さらに、標的核酸の増幅工程時に生成するピロリン酸をマグネシウム塩のような不溶性物質とさせて、反応液を白濁させ、その濁度を測定してもよい。さらに上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、上記(b)工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)あるいは非蛍光共鳴エネルギー転移(Non−FRET)、電極と導電物質の析出を組み合わせた方法等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された2種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド(RNA)プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、FRETの標識対である6−FAM(6−carboxyfluorescein)とTAMRA(N,N,N’,N’−tetramethyl−6−carboxyrhodamine)との組み合わせ、あるいは非−FRETの標識対である6−FAM(6−carboxyfluorescein)とDABCYL(4−(4’−dimethylaminophenylazo)benzoic acid)が好適に使用できる。
さらに、本発明で使用できるプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイゼーション条件は、例えば1989年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T.Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング:ア ラボラトリー マニュアル第2版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.)に記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、0.5%SDS、5×デンハルツ[Denhardt’s、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400]及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、使用するプローブのTm値より約25℃低い温度で4時間〜一晩保温を行う条件を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法の等温下における増幅方法においては、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。また本発明の増幅方法では、使用するプライマーを1種類もしくは2種類と従来法よりも少なくすることができる。dNTPのような試薬もPCR等で用いられるものを流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はPCR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
本発明の挿入変異及び/又は欠失変異のタイピング方法も、上記のように反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせることによって、高効率、大量処理に適した解析システムとすることができる。
本発明の方法においても前記(1)の場合と同様に、必要に応じて鋳型となる核酸を予め、物理学的、化学的又は酵素的に変性処理しても良い。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法の対象としては、特に限定はされないがヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子、例えば、GSTM1遺伝子やGSTT1遺伝子における欠失変異が例示される。本発明の検出方法においては、上記欠失変異の領域中にキメラオリゴヌクレオチドプライマー対を設定してもよいし、当該プライマー対のいずれか一方を欠失変異領域内に設定してもよい。また、本発明の遺伝子多型のタイピング方法においても、前記の遺伝子多型のタイピング方法(1)と同様に、内部標準となる核酸の同時あるいは個別の検出を組み合わせてタイピングを行うことができる。
(4)本発明の遺伝子多型のタイピング方法(II)に使用されるキット
本発明は、遺伝子多型のタイピング方法(II)に使用されるキットを提供する。1つの実施態様において、該キットは本発明の方法で用いることができるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とする。該プライマーは特に限定はされないが、例えばヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子における欠失変異を検出するためのものとしては、配列表の配列番号6〜8、29〜31記載の塩基配列を有するものが好適である。また、挿入変異及び/又は欠失変異を特定できるような特異的検出用プローブを含有してもよい。該プローブとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号9、32記載の塩基配列を有するヌクレオチドが好適に使用できる。さらに、当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼやその基質(dNTPs)、反応に適した緩衝液等を含有するものやプライマー伸長産物の検出のための試薬を含有するものであってもよい。核酸増幅法と組み合わせて遺伝子多型をタイピングするためのキットとしては、当該増幅法に使用される反応液を調製するための試薬を含有するものが好適である。
本発明のキットにおいても前記遺伝子多型のタイピング方法のためのキット(2)と同様に、内部標準(インターナルコントロール)検出用のプライマーおよびプローブを含んでいてもよい。
(5)本発明の複数の標的となる核酸の遺伝子多型のタイピング方法並びに該方法のためのキット
本発明の複数の標的となる核酸の遺伝子多型のタイピング方法の一態様としては、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法が例示される。
また、別の態様としては、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法が例示される。
さらに、別の態様としては、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(A)少なくとも1つの標的となる核酸を、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含する方法で検出し、(B)さらに上記(A)とは異なる別の標的となる核酸を、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含する方法で検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法が例示される。
本発明の複数の標的となる核酸の遺伝子多型のタイピング方法において、標的となる核酸には特に限定はない。すなわち、遺伝子多型のタイピングの対象となる遺伝子のいずれもが好適に使用できる。また、標的となる核酸の遺伝子多型の組み合わせは、前記「塩基置換」、「欠失変異」、「挿入変異」等種々のタイプのものの同種あるいは異種の組み合わせのいずれであっても良い。上記標的となる核酸の遺伝子多型の組み合わせとしては、特に限定はされないが例えば、ヒトチトクローム遺伝子のCYP 2C19、CYP 1A1、ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子のGSTM1、GSTT1あるいはヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のALDH2から選択した組み合わせが例示される。
上記遺伝子の多型を検出するプライマー並びにプローブについては、例えば、前述の(1)〜(4)に記載のものが好適に使用できる。
さらに本発明の方法においては、標的となる核酸の組み合わせは、前記遺伝子多型のタイプの少なくとも1種類と多型を持たない別の遺伝子との組み合わせであってもよい。当該多型を持たない遺伝子には特に限定はされない。さらに本発明の検出において内部標準となる核酸を組み合わせて用いても良い。
すなわち、複数の標的となる核酸の少なくとも一つが内部標準となる核酸であってもよい。該核酸としては、特に限定はされないが例えば、β−グロビン遺伝子が好適に使用できる。前記β−グロビン遺伝子を検出するためのプライマーとしては、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを用いることができる。さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを用いて検出することができる。また、本発明のタイピング方法においては、伸長反応を繰り返すことにより、結果として目的とする標的核酸が増幅される。さらに公知の核酸増幅反応を用いて当該伸長産物を増幅してもよい。
さらに本発明の方法のためのキットとしては、複数の標的となる核酸を検出するためのヌクレオチドあるいはプライマーを含んでいても良い。さらに本発明の方法で得られた増幅産物を検出するためのプローブを含んでいても良い。
例えば、複数の標的となる核酸の少なくとも一つが内部標準となる核酸、β−グロビン遺伝子の場合には、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを含有していても良く、さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを含有していても良い。
本発明の方法は、塩基置換、挿入変異ならびに欠失変異の検出に使用することができる。対象遺伝子としては、特に限定はされないが例えば、ヒトチトクローム遺伝子 CYP 2C19のG636A(m2)、CYP 1C1のT6235C、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)遺伝子のGlu487Lysの塩基置換等、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子(GSTM1、GSTT1)の欠失変異等が挙げられ、本発明の方法を用いてこれらを好適に検出することができる。さらに本発明の方法を用いることにより、遺伝子タイピング方法として使用することができる。
実施例
以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
参考例1 アルカエオグロバス フルギダスのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)アルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNAの調製
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM4139)8ml相当分の菌体を集め、100μlの25%ショ糖、50mM Tris−HCl(pH8.0)に懸濁し、20μlの0.5M EDTA、10μlの10mg/ml 塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に800μlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mM Tris−HCl(pH8.0)、10μlの20mg/ml プロテイナーゼK(タカラバイオ社製)及び50μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に50μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。
(2)RNaseHII遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)は全ゲノム配列が公開されており〔Klenk,HPら、ネイチャー(Nature)、第390巻、第364−370頁(1997)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(AF0621)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号1、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。
そこで、このAF0621遺伝子(配列番号1)の配列をもとにプライマーAfuNde(配列番号2)及びAfuBam(配列番号3)を合成した。
参考例1−(1)で得たアルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNA 30ngを鋳型にして、20pmolのAfuNde及び20pmolのAfuBamをプライマーに用い、100μlの容量でPCRを行なった。PCRでのDNAポリメラーゼはパイロベストDNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとし、40サイクル行った。増幅した約0.6kbのDNA断片をNdeI及びBamHI(ともにタカラバイオ社製)で消化し、得られたDNA断片をプラスミドベクターpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)のNdeI及びBamHI間に組込んだプラスミドpAFU204を作製した。
(3)RNaseHII遺伝子を含むDNA断片の塩基配列の決定
参考例1−(2)で得られたpAFU204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、RNaseHIIをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号4に示す。また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に示す。
なお、プラスミドpAFU204で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia coli JM109/pAFU204と命名、表示され、平成13年2月22日より日本国〒305−8566茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−18221として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP−7691[国際寄託への移管請求日:平成13年8月2日]として寄託されている。
(4)精製RNaseHII標品の調製
参考例1−(2)で得られたpAFU204で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpAFU204を含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を37.1mlのソニケーションバッファー〔50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、40.3mlの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーA〔50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕で平衡化したRESOURSE Qカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Qカラムを素通りした。
バッファーAで平衡化したRESOURSE Sカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Sカラムを素通りした。
素通りしたRNaseHII画分40.0mlを50mM NaClを含むバッファーB〔50mM Tris−HCl(pH7.0)、1mM EDTA〕2リットルを外液として、2時間の透析を3回行なった。透析後の酵素液40.2mlを50mM NaClを含むバッファーBで平衡化したHiTrap−heparinカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて50〜550mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。その結果、約240mM NaClのところに溶出されたRNaseHII画分を得た。
このRNaseHII画分7.8mlをセントリコン−10(アミコン社製)を用いた限外ろ過により濃縮し、約600μlの濃縮液を4回に分けて100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む50mM Tris−HCl(pH7.0)で平衡化したSuperose6ゲルろ過カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、RNaseHIIは、30.0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、RNaseHIIが1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたRNaseHIIをAfu RNaseHII標品とした。
上記で得られたAfu RNaseHII標品を用いて、以下に記載の方法により酵素活性を測定した結果、AfuRNaseHII標品にRNaseH活性が認められた。
(5)精製RNaseH活性の測定
a)使用する試薬液の調製
力価測定用反応液:最終濃度がそれぞれ40mM Tris−HCl(pH7.7、37℃)、4mM塩化マグネシウム、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロール、24μMポリ(dT)になるように滅菌水で調製した。
ポリ[8−3H]アデニル酸溶液:370kBqのポリ[8−3H]アデニル酸溶液を200μlの滅菌水に溶解した。
ポリアデニル酸溶液:ポリアデニル酸を3mMになるように滅菌超純水で希釈した。
酵素希釈液:最終濃度がそれぞれ25mM Tris−HCl(pH7.5、37℃)、5mM 2−メルカプトエタノール、0.5mM EDTA(pH7.5、37℃)、30mM塩化ナトリウム、50%グリセロールになるように滅菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺DNAの調製:子牛胸腺DNA 200mgをTEバッファー100mlに懸濁し、膨潤させた。該溶液のUV260nmの吸光度を測定し、1mg/mlの濃度に滅菌超純水で希釈した。次に、該溶液を100℃で10分間加熱後、氷浴中で急冷した。
b)活性測定方法
上記a)で調製した力価測定用反応液985μlにポリ[8−3H]アデニル酸溶液7μlを加え37℃で10分間保持した。次にポリアデニル酸を最終濃度が24μMになるように8μl加え、さらに37℃で5分間保持した。このようにしてポリ[8−3H]rA−ポリdT反応液1000μlを調製した。
次に、該反応液200μlを分取し、30℃で5分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液1μlを加え、これらの反応液を経時的に50μlずつサンプリングして、後の測定に用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間をY分とした。また、全CPM用反応液50μlおよびブランク用反応液50μlは、酵素液の代わりに酵素希釈液を1μl加えて調製した。該サンプリング溶液に100mMピロリン酸ナトリウム100μl、熱変性子牛胸腺DNA溶液50μlおよび10%トリクロロ酢酸300μl(全CPM測定の場合は、超純水300μl)を加え、0℃で5分間保持後、10000rpmで10分間遠心した。遠心後、得られた上清250μlをバイアルに入れ、アクアゾル−2(NENライフサイエンスプロダクツ社製)10mlを加え、液体シンチレーションカウンターでCPMを測定した。
c)ユニット計算
各酵素のユニット(Unit)数は、以下の計算式で算出した。
Unit/ml={(測定したCPM−ブランクCPM)×1.2*×20×1000×希釈率}×200(μl)/(全CPM×Y分×50(μl)×9**)
1.2*:全CPM中に含まれるポリ[8−3H]rA−ポリdTの50μl当たりのnmol数
9**:補正係数
以下の実施例における耐熱性RNaseHのunit数は、以下の方法により算出した。
ポリ(rA)及びポリ(dT)(ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製)1mgをそれぞれ1mM EDTAを含む40mMトリス−HCl(pH7.7)1mlに溶解し、ポリ(rA)溶液及びポリ(dT)溶液を調製した。
次に、4mM MgCl2、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロールを含む40mMトリス−HCl(pH7.7)に、終濃度20μg/mlとなるポリ(rA)溶液、終濃度30μg/mlとなるポリ(dT)溶液を加え、37℃で10分間反応後、4℃に冷却し、ポリ(rA)−ポリ(dT)溶液を調製した。このポリ(rA)−ポリ(dT)溶液100μlに任意に希釈した酵素液1μlを加え、40℃で10分間反応させ、0.5M EDTA 10μlを加えて反応を停止させた後、260nmの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に0.5M EDTA 10μlを加えた後、40℃で10分間反応させ、吸光度を測定した。その後、EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値(吸光度差)を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ(rA)−ポリ(dT)ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。RNaseHの1単位は、1nmolのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するA260を10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152×(110/100)×希釈率
実施例1
(1)ゲノムDNAの調製
インフォームドコンセントの得られた7人のヒト健常人ドナーより10ml採血を行った。それぞれ採取した血液100μlを使用してGenとるくん(血液用)(タカラバイオ社製)を用いてゲノムDNAの調製を行った。得られたゲノムDNA溶液の濃度を以下に示す。
検体No.1:182ng/μl
検体No.2:150ng/μl
検体No.3:156ng/μl
検体No.4:204ng/μl
検体No.5:105ng/μl
検体No.6:172ng/μl
検体No.7:253ng/μl
(2)プライマーおよびプローブの合成
ヒトglutathione−S−transferase M1(GSTM1)遺伝子(GenBank Accession No.X51451)の塩基配列に従って、3’末端の3残基をRNAにしたICAN反応による検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし合成した。すなわち、配列表の配列番号6及び7で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGS−F、GS−Rをそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGS−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGS−Rはアンチセンス方向のプライマーである。また、配列番号8で示されるGS−Rの5’末端をビオチン化したオリゴヌクレオチドプライマーGS−R−bioを合成した。GS−RとGS−R−bioは9:1の割合で混合し反応に供した(以下GS−R−mixと称す)。さらに、ELISAによるICAN反応増幅産物検出のための5’末端をFITC化した、配列番号9で示されるオリゴヌクレオチドプローブGS−Dを合成した。GS−Dはセンス方向のプローブである。ELISAによるICAN反応増幅産物検出の時に発色の基準となるELISAポジティブコントロール作製のためのオリゴヌクレオチドプライマーGS−Epc−F(配列番号10)および5’末端をビオチン化したGS−Epc−R(配列番号11)をそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGS−Epc−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGS−Epc−Rはアンチセンス方向のプライマーである。ELISAポジティブコントロールはICAN増幅産物よりも若干短くなるようにそれぞれのプライマーを設計した。
一方PCR反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーもデザインし合成した。すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーGS−PCR−F(配列番号12)、GS−PCR−R(配列番号13)をそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGS−PCR−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGS−PCR−Rはアンチセンス方向のプライマーである。
(3)ICAN反応によるGSTM1遺伝子の検出
上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(GS−FとGS−R−mix)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、(1)で調製した各検体ゲノムDNA溶液1μlを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、58℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は58℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲルの電気泳動に供した。その結果、検体5および検体7由来ゲノムDNAを用いた場合のみGSTM1遺伝子由来の増幅産物が確認でき、これら検体はGSTM1遺伝子を保持していることが確認できた。この結果を図1に示す。すなわち、図1はICAN反応産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No.1、2、3、4、5、6、7を示す。
一方、同じ各検体ゲノムDNA溶液1μlを用いてPCR法によりGSTM1遺伝子の検出を行った。配列表の配列番号12、13で示されるGS−PCR−F、GS−PCR−Rの各プライマーを用いてPCR反応を行い、該反応液を3.0%アガロースゲルの電気泳動に供した。その結果、検体5および検体7由来ゲノムDNAを用いた場合のみGSTM1遺伝子由来の増幅産物が確認できた。この結果を図2に示す。すなわち、図2はPCR反応産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No.1、2、3、4、5、6、7を示す。以上よりICAN法による結果とPCR法による結果が一致した。
(4)ICAN増幅産物のELISA法を用いた検出
1.ELISAポジティブコントロールの調製
上記実施例1−(2)で合成したプライマーGS−Epc−F、GS−Epc−Rを用いて前骨髄性白血病細胞株HL60由来のゲノムDNA 200ngを鋳型としてPCR反応を行った。得られた増幅産物は後述のELISAにより約1程度の吸光度を示すように適宜希釈して実際に使用した。この時のDNA濃度は340amol/μlであった。
2.ELISA法を用いた検出
上記実施例1−(3)で得られた各反応産物5μlおよびELISAポジティブコントロール溶液5μlを、ハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1% Triton−X100、1% BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmolのGS−Dプロープを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlを、TMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。ELISAポジティブコントロールの値をカットオフ値としてそれより高い吸光度を示すものをGSTM1遺伝子ポジティブと判定した。
その結果検体5および検体7由来ゲノムDNAからのICAN反応産物がGSTM1遺伝子ポジティブと判定でき、電気泳動による判定と同様の結果が得られた。これを図3に示す。すなわち、図3はELISAの結果をグラフにしたものであり、横軸の1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No.1、2、3、4、5、6、7を示し、8はポジティブコントロールを示す。縦軸に450nmの吸光度を示す。
実施例2
(1)ヒトCYP2C19(636)のアレル特異的な検出
ヒトCYP2C19の636番目の塩基のアレルを対象として、遺伝子的にホモ型あるいはヘテロ型であるかの検出方法について検討した。
インフォームドコンセントの得られた健常人全血200μl(サンプル番号1〜6)よりGenとるくんTM(タカラバイオ社製)を用いて、ゲノムDNAを調製した。調製したゲノムDNA 160ngを鋳型として、636G、636Aの各alleleを特異的に検出するセンス方向のプライマーとして、それぞれ配列番号14、15記載のヌクレオチド、アンチセンス方向のプライマーとして配列番号16記載のオリゴヌクレオチドを調製し、上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(センス方向とアンチセンス方向プライマー)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液を含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、53℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、11U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼおよび滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は、53℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図4A〜Fに示す。すなわち図4のA〜Fは、それぞれ血液サンプル1〜6から抽出したゲノムDNAを鋳型としてタイピングした結果を示す電気泳動パターンであり、各図のレーン1は配列番号14(636G検出用)、レーン2は配列番号15(636A検出用)をそれぞれヌクレオチドとして用いた場合である。図4のA〜Fに示した増幅産物のパターンから、各血液サンプルのCYP2C19 636塩基目のalleleは(サンプル1:G/A、2:G/G、3:G/A、4:G/G、5:G/G、6:G/G)とタイピングされた。
一方、同じゲノムDNAを鋳型に、配列表の配列番号17および18のプライマーを用いてPCR反応を行った。得られたPCR増幅産物をBamHIで処理した後、該反応液を3.0%アガロースゲル電気泳動に供し、PCR−RFLP法によりタイピングを行った。その結果を図4Gに示す。すなわち図4Gは血液サンプル1〜6から調製したゲノムDNAを鋳型とし、PCR−RFLP法によりタイピングを行った結果を示す電気泳動パターンであり、レーン1〜6はそれぞれ血液サンプル1〜6から抽出したゲノムDNAを鋳型とした場合である。図4Gに示す電気泳動結果から、これら各血液サンプルから調製したDNAを鋳型としたPCR増幅産物の切断パターンよりCYP2C19 636塩基目のalleleは(サンプル1:G/A、2:G/G、3:G/A、4:G/G、5:G/G、6:G/G)とタイピングされ、前記の結果と一致した。
(2)ELISAによるヒトCYP2C19(636)のアレル特異的な検出
HL−60のゲノムDNA(G/G)160ngを調製し、また、実施例2−(1)記載の血液サンプル1(G/A)、4(G/G)より、(1)と同様に調製したゲノムDNA 150ng、230ngをそれぞれ鋳型とし、636G、636Aの各alleleを特異的に検出するプライマーとして、それぞれ配列番号14、15記載のヌクレオチド、アンチセンスプライマーとして1%5’末端ビオチン標識化したものを含む配列番号19記載のプライマーを用いて、実施例2−(1)と同様の方法でSNPタイピング反応を行った。得られた、各タイピング反応産物2.5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.017N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5’末端FITC標識化した配列番号20記載のDNAプローブ2.5pmolを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図5に示した。図5において、■は636G、□は636Aの各alleleを特異的に検出するプライマー配列番号14、15のヌクレオチドを用いてタイピング反応を行った場合の図である。また、横軸の1、2、3はそれぞれHL−60、血液サンプル1、4をそれぞれタイピングした結果を示したものであり、4はポジティブコントロールを示したものである。図5よりELISAポジティブコントロールの値をカットオフとして、各サンプルのCYP2C19の636塩基目のalleleは各ゲノムDNAのallele通りにタイピングされた。
実施例3
ヒトCYP1A1 3’−franking regionにおけるSmaI多型(T6235C)のタイピングを行った。
ヒトCYP1A1の6235番目の塩基のalleleがそれぞれC、Tである場合を、それぞれ特異的に検出するプライマーとして配列番号21、22記載のヌクレオチドを合成した。これらヌクレオチドをアンチセンスプライマー、5’末端がビオチン化されたものを1%含有する配列番号23記載のプライマーをセンスプライマーとして用いて次のような反応を行った。上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(センス方向とアンチセンス方向プライマー)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、CYP1A1の6325番目の塩基のalleleがそれぞれ(C/C)、(T/T)である事をPCR−RFLPで確認したゲノムDNAそれぞれ100ngを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、53℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、14U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は60℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図6に示した。図6の電気泳動パターンにおいて、ヌクレオチドとして、レーン1、2、5、6は配列番号21のヌクレオチド、レーン3、4、7、8は配列番号22のヌクレオチドを用いた場合である。また、レーン1〜4はCYP1A1の6235番目の塩基のalleleが(C/C)、レーン5〜8は(T/T)であるゲノムDNAをテンプレートとしてそれぞれ用いた場合である。これらの結果より、各ヌクレオチドによりallele特異的な検出が行えることが分かった。
上記の反応産物を用いELISAによる検出を行った。上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.017N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5’末端FITC標識化した配列番号24記載のDNAプローブ5pmolを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図7に示した。図7のELISA結果において、1、2、5、6は配列番号21のヌクレオチド、3、4、7、8は配列番号22のヌクレオチドを用いた場合である。また、1〜4はCYP1A1の6235番目の塩基のalleleが(C/C)、レーン5〜8は(T/T)であるゲノムDNAをテンプレートとしてそれぞれ用いた場合である。図7より吸光度450nmの値1をカットオフ値として、各ゲノムDNAのallele通りにタイピング可能であった。
実施例4
ヒトALDH2(Aldehyde dehydrogenase 2)における一塩基多型(エクソン12、487Glu→Lys)のタイピングを行った。
ヒトALDH2のエクソン12に存在する一塩基多型の各alleleがそれぞれG、Aである場合を、特異的に検出するプライマーとして配列表の配列番号25、26記載の塩基配列を有するヌクレオチドを合成した。これらヌクレオチドをアンチセンスプライマー、5’末端がビオチン化されたものを0.5%含有する配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマーをセンスプライマーとして用いて次のような反応を行った。上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(センス方向とアンチセンス方向プライマー)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、ALDH2のエクソン12の一塩基多型のalleleがそれぞれ(G/G)、(A/A)、(G/A)である事を確認したゲノムDNAそれぞれ100ngを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、54℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、14U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は54℃、1時間保持した。得られた反応産物を用いELISAによる検出を行った。上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5’末端FITC標識化した配列表の配列番号28記載のDNAプローブ5pmolを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファー360μlで、各ウェルを4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図8に示した。図8は、ELISAの結果を示すグラフであり、縦軸は、ELISAにおける吸光度を示し、横軸は、サンプル番号を示す。横軸の番号1、3、5は配列表の配列番号25の塩基配列を有しALDH2のエキソン12の一塩基多型がGである場合を検出する(活性型検出用)ヌクレオチド、2、4,6は配列表の配列番号26の塩基配列を有しALDH2のエキソン12の一塩基多型がAである場合を検出する(失活型検出用)ヌクレオチドを用いた場合である。また、1、2はALDH2のエクソン12の一塩基多型が(G/G)、レーン3,4は(G/A)、レーン5,6(A/A)であるゲノムDNAをテンプレートとしてそれぞれ用いた場合である。図8に示したように吸光度450nmの値1をカットオフ値として、各ゲノムDNAのallele通りにタイピング可能であった。すなわち、本発明の方法によりヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ2の多型を正確に検出できることを確認した。
実施例5
(1)プライマーおよびプローブの合成
ヒトglutathione−S−transferase T1(GSTT1)遺伝子(GenBank Accession No.AB057594)の塩基配列に従って、3’末端の3残基をRNAにしたICAN反応による検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし合成した。すなわち、配列表の配列番号29および30で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGST1−F、GST1−Rをそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGST1−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGST1−Rはアンチセンス方向のプライマーである。また、GST1−Fの5’末端をビオチン化した、配列表の配列番号31で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGST1−F−bioを合成した。GST1−FとGST1−F−bioは49:1の割合で混合し反応に供した(以下GST1−F−mixと称す)。さらに、ELISAによるICAN反応増幅産物検出のための5’末端をFITC化した、配列表の配列番号32で示されるオリゴヌクレオチドプローブGST1−Dを合成した。GST1−Dはアンチセンス方向のプローブである。
一方、PCR反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーもデザインし合成した。すなわち、配列表の配列番号33および34で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGST1−PCR−F、GST1−PCR−Rをそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGST1−PCR−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGST1−PCR−Rはアンチセンス方向のプライマーである。
(2)ICAN反応によるGSTT1遺伝子の検出
上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(GST1−F−mixとGST1−R)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、実施例1−(1)で調製した各検体ゲノムDNA溶液1μlを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、58℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルプミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8Uの Afu RNaseHII(タカラバイオ社製)、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は58℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、検体1、2、4、5、6由来ゲノムDNAを用いた場合にGSTT1遺伝子由来の増幅産物が確認でき、これら検体はGSTT1遺伝子を保持していることが確認できた。この結果を図9に示す。すなわち、図9はICAN反応産物のアガロース電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No1、2、3、4、5、6、7を示す。
一方、同じ各検体ゲノムDNA溶液1μlを用いてPCR法によりGSTT1遺伝子の検出を行った。GST1−PCR−F、GST1−PCR−Rの各プライマーを用いてPCR反応を行い、該反応液を3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、検体1、2、4、5、6由来ゲノムDNAを用いた場合にGSTT1遺伝子由来の増幅産物が確認できた。この結果を図10に示す。すなわち、図10はPCR反応産物のアガロース電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No1、2、3、4、5、6、7を示す。以上よりICAN法による結果とPCR法による結果が一致した。
(3)ICAN増幅産物のELISA法を用いた検出
上記実施例5−(2)で得られた各反応産物5μlを、ハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmol GST1−Dプローブを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で15分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlを、TMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。2以上の吸光度を示すものをGSTT1遺伝子ポジティブと判定した。
その結果検体1、2、4、5、6由来ゲノムDNAからのICAN反応産物がGSTT1遺伝子ポジティブと判定でき、電気泳動による判定と同様の結果が得られた。これを図11に示す。すなわち、図11はELISAの結果をグラフにしたものであり、横軸に各検体No.を、縦軸に450nmの吸光度を示す。
実施例6
(1)プライマーおよびプローブの合成
本発明のヒトの遺伝子タイピングにおいて使用するインターナルポジティブコントロールについて検討した。上記インターナルコントロール用ICANプライマーは、以下のようにして構築した。
ヒトのβ−globin遺伝子(GenBank Accession No.AF007546)の塩基配列に従って、3’末端の3残基をRNAにしたICAN反応用オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。すなわち、配列表の配列番号35、36、37、38、39で示されるオリゴヌクレオチドプライマーβG−F1、βG−R1、βG−F2、βG−R2、βG−R3をそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドプライマーβG−F1、βG−F2はセンス方向のプライマー、βG−R1、βG−R2、βG−R3はアンチセンス方向のプライマーである。また、βG−F1、βG−R2およびβG−R3の5’末端をそれぞれビオチン化した、配列表の配列番号40、41、42で示されるオリゴヌクレオチドプライマーβG−F1−Bio、βG−R2−BioおよびβG−R3−Bioを合成した。βG−F1とβG−F1−Bio、βG−R2とβG−R2−BioおよびβG−R3とβG−R3−Bioはそれぞれ49:1の割合で混合し、反応に供した(以下、それぞれβG−F1−mix、βG−R2−mixおよびβG−R3−mixと称す)。更に、ELISAによるICAN反応産物検出のための5’末端をFITC化した、配列番号表の配列番号43、44で示されるオリゴヌクレオチドプローブβG−D1、βG−D2を合成した。
(2)ICANのよるβ−globinの検出
ICAN反応のためのプライマーの組み合わせとして、βG−F1−mixとβG−R1(プライマーセット1)、βG−F2とβG−R2−mix(プライマーセット2)、βG−F2とβG−R3−mix(プライマーセット3)を用いて以下の反応を行った。上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマーと1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、HL−60のゲノムDNA(100ng、10ng、1ng、0ng)を含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、56℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mMのdNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mMの酢酸カリウム、5mMの酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8UのAfu RNaseHII、5.5UのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は56℃、1時間保持した。
反応終了後、上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウオッシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。次に、各ウェルに50μlの0.02NのNaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmolのβG−D1(プライマーセット1を用いた場合)またはβG−D2(プライマーセット2、3を用いた場合)を含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォッシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォッシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。
洗浄後、各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図12〜14に示す。すなわち、図12、13、14はそれぞれプライマーセット1、2、3を用いた場合のELISA結果を示したものであり、横軸にHL−60ゲノムDNA濃度、縦軸に450nmの吸光度を示す。
図12〜14に示したように、プライマーセット1、2および3を用いた、いずれの場合にも、HL−60ゲノムDNAからのβ−globin遺伝子の検出が可能であった。
(3)マルチプレックスICAN
上記(2)で検討したβ−globin遺伝子をインターナルポジティブコントロールとした、マルチプレックスICAN反応によるGSTM1、GSTT1の遺伝子タイピング反応を行った。反応は以下のようにして行った。
すなわち、GSTM1タイピング反応用のオリゴヌクレチドプライマーとして実施例1記載のGS−FおよびGS−R−mix、GSTT1タイピング反応用のオリゴヌクレチドプライマーとして実施例5記載のGST1−F−mixおよびGST1−Rを用いた。各25pmolの上記タイピング用プライマーおよびβ−globin遺伝子検出用のプライマーセット1または2と、1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、検体(検体1(GSTM1、GSTT1ともに欠失無し)、検体2(GSTM1、GSTT1ともに欠失))ゲノムDNA100ngを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、56℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mMのdNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mMの酢酸カリウム、5mMの酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8UのAfu RNaseHII、5.5UのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は56℃、1時間保持した。
反応終了後、上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォッシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02NのNaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmolのGS−D(GSTM1の検出の場合)、GST1−D(GSTT1の検出の場合)、βG−D1(プライマーセット1を用いた場合)またはβG−D2(プライマーセット2を用いた場合)を含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォッシングバッファー360μlで2回洗浄した。
洗浄後、各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォッシングバッファー360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。
その結果を図15、16、17、18に示す。すなわち、図15、16はいずれもGSTM1のタイピング結果を示したものであり、それぞれβ−globin遺伝子検出用プライマーセット1、2を用いた場合である。また、図17、18はいずれもGSTT1のタイピング結果を示したものであり、それぞれβ−globin遺伝子検出用プライマーセット1、2を用いた場合である。各図において横軸は検体番号、縦軸は450nmの吸光度を示す。また図15及び16において濃色の棒グラフはGSTM1のタイピング結果を淡色の棒グラフはβ−グロビン遺伝子の検出結果を示す。同様に図17及び18において濃色の棒グラフはGSTT1のタイピング結果を淡色の棒グラフはβ−グロビン遺伝子の検出結果を示す。
図15〜18に示したようにβ−globin遺伝子をインターナルポジティブコントロールとした、マルチプレックスICAN反応によるGSTM1、GSTT1の遺伝子タイピング反応が可能であることを確認した。
実施例7
本発明の方法で使用するためのキットを構築した。また、アルカリ変性処理を組み合わせたICAN及び/又はUCANによるヒト遺伝子多型のタイピング方法について検討した。
(1)ALDH2遺伝子多型のタイピング用キットの構築並びに該キットを用いたタイピング
ALDH2の一塩基多型タイピング反応を以下のように行った。まず、次のような試薬(16反応分)を調製した。
試薬▲1▼:配列表の配列番号25に記載の塩基配列を有するヌクレオチドおよび配列表の配列番号27に記載の塩基配列を有し、該5’末端がビオチン化されたものを0.5%含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー各50μMを含む0.1MのHepes溶液(80μl)。
試薬▲2▼:配列表の配列番号26に記載の塩基配列を有するヌクレオチドおよび配列表の配列番号27に記載の塩基配列を有し、該5’末端がビオチン化されたものを0.5%含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー各50μMを含む0.1MのHepes溶液(80μl)。
試薬▲3▼:32mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、100mM KOAc、4mM Mg(OAc)2、2.5mM dNTP混合液、0.05%ウシ血清アルブンミン、2.8U/μl Afu RNaseHII、1.1U/μlのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を含む溶液(80μl)。
試薬▲4▼:14mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、200mM KOAc、8mM Mg(OAc)2、2.5%ジメチルスルホキシドを含む溶液(160μl)。
上記の試薬を用いて以下の操作を行った。すなわち、ALDH2のエクソン12の一塩基多型のalleleがそれぞれ(G/G)、(G/A)、(A/A)である事を確認したゲノムDNAそれぞれ40ng/μlの溶液に、等量の0.1N NaOHを添加し、室温で5分放置した(サンプル溶液)。上記サンプル溶液のそれぞれ5μlを、試薬▲1▼もしくは試薬▲2▼各5μlに添加した。この溶液にさらに試薬▲3▼5μlに試薬▲4▼10μlの割合で混合した反応ミックス15μlを添加し、54℃、1時間保持した。得られた反応産物を、実施例4と同様の方法で検出した。その結果を図19に示す。
図19は、本発明のキットを用いたヒトALDH2遺伝子多型のELISA検出結果をグラフにしたものであり、横軸に試料No.を、縦軸に450nmの吸光度を示す。図中レーン1、3、5は配列番号25のヌクレオチドを、レーン2、4,6は配列番号26のヌクレオチドを用いた場合である。さらに、レーン1及び2はALDH2遺伝子のエクソン12の一塩基多型が(G/G)型、レーン3及び4は(G/A)型、レーン5及び6(A/A)型であるゲノムDNAを鋳型となる核酸としてそれぞれ用いた場合である。図19に示したように、吸光度450nmの値1をカットオフ値として、各ゲノムDNAのallele通りにタイピング可能であった。すなわち、本発明のキットが遺伝子多型のタイピング方法に使用できることを確認した。また、本発明の方法においてアルカリ変性処理を組み合わせてもよいことが確認できた。
(2)GSTM1の欠失多型タイピング用キットの構築並びに該キットを用いたタイピング
GSTM1の欠失多型タイピング反応を以下のように行った。まず、次のような試薬(32反応分)を調製した。
試薬▲1▼:実施例1記載のGS−FおよびGS−R−mixのオリゴヌクレチドプライマー各25μM、並びに実施例6−(2)記載のβ−globin遺伝子検出用のプライマーセット1のオリゴヌクレオチドプライマー各25μMを含む0.1MのHepes溶液(160μl)。
試薬▲2▼:32mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、100mM KOAc、4mM Mg(OAc)2、2.5mM dNTP混合液、0.05%ウシ血清アルブンミン、2.8U/μl Afu RNaseHII、1.1U/μlのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を含む溶液(160μl)。
試薬▲3▼:14mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、200mM KOAc、8mM Mg(OAc)2、2.5%ジメチルスルホキシドを含む溶液(320μl)。
上記の試薬を用いて以下の操作を行った。検体(検体1:GSTM1欠失無し、検体2:GSTM1欠失あり)のゲノムDNAそれぞれ40ng/μlの溶液に、等量の0.1N NaOHを添加し、室温で5分放置した(サンプル溶液)。上記サンプル溶液のそれぞれ5μlを、試薬▲1▼5μlに添加した。この溶液に試薬▲2▼5μlに試薬▲3▼10μlの割合で混合した反応ミックス15μlを添加し、56℃、1時間保持した。得られた反応産物を、実施例6−(3)と同様の方法で検出した。その結果を図20に示す。
図20は、本発明のキットを用いたヒトGSTM1遺伝子多型のELISA検出結果をグラフにしたものであり、横軸に試料No.を、縦軸に450nmの吸光度を示す。図中濃色棒グラフは、GSTM1の検出結果を、淡色棒グラフはβ−globinの検出結果を示す。図20に示したように、上記条件を用いてもβ−globin遺伝子をインターナルポジティブコントロールとしたマルチプレックスICAN反応によるGSTM1の遺伝子タイピングが可能であった。すなわち、本発明のキットが遺伝子多型のタイピング方法に使用できることを確認した。また、検出の対象が変わってもアルカリ変性処理を組み合わせることができることを確認した。
(3)GSTT1の欠失多型タイピング用キットの構築と該キットを用いたタイピング
GSTT1を検出対象とした場合について上記(2)と同様にして検討した。すなわち、実施例5記載のオリゴヌクレチドプライマー、GST1−F−mixおよびGST1−R以外は、上記(2)と同じ組成の試薬を調製した。該試薬について、上記のGSTM1と同様にタイピングを行ったところ、タイピング可能であった。すなわち、本発明のキットが遺伝子多型のタイピング方法に使用できることを確認した。また、いずれの場合においてもアルカリ変性処理を組み合わせることができることを確認した。
産業上の利用の可能性
上記の、本発明のヌクレオチド、ならびに該ヌクレオチドを使用する塩基置換及び挿入変異、欠失変異の検出方法は、天然に存在する、あるいは人為的に導入された塩基置換及び挿入変異、欠失変異の検出に有用である。
本発明によれば、標的核酸上の塩基置換及び挿入変異、欠失変異の有無を簡便、かつ再現性よく検出することができる。本発明の方法は公知の核酸増幅方法と容易に組み合せることができ、高感度に塩基置換及び挿入変異、欠失変異を検出することが可能である。さらに、適切な配列のヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、塩基置換及び挿入変異、欠失変異の有無と同時にどのような置換、挿入、欠失が起こっているかを知ることもできる。
本発明は、多型やバリエーションのような生物のゲノムDNA上に生じた塩基置換及び挿入変異、欠失変異、例えばSNPの検出、同定に使用することができ、ヒトにおける疾患遺伝子の検索、薬剤感受性の解析など、ゲノム創薬、ゲノム医療の分野においても有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図2 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図3 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図4 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す写真である。
図5 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示すグラフである。
図6 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す写真である。
図7 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
図8 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
図9 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図10 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図11 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図12 本発明の検出方法による、ヒトβ−グロビン遺伝子の検出の結果を示すグラフである。
図13 本発明の検出方法による、ヒトβ−グロビン遺伝子の検出の結果を示す図である。
図14 本発明の検出方法による、ヒトβ−グロビン遺伝子の検出の結果を示す図である。
図15 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図16 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図17 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図18 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図19 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子多型のタイピング結果を示す図である。
図20 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
本発明は遺伝子のタイピングに有用な、目的遺伝子上の塩基置換、挿入変異、欠失変異の検出方法ならびにそのためのキットに関する。
背景技術
同一種に属する生物個体のゲノム上に含有される遺伝暗号は同一ではなく、多型(polymorphism)と呼ばれる塩基配列上の差違が存在することが知られている。多型には1〜数十塩基の欠失や挿入、特定の塩基配列が重複するものなどが知られているが、1個の塩基が他の塩基に置換されているものは一塩基置換多型(single nucleotide polymorphism、SNP)と呼ばれている。
従来のSNPの検出手段は、ハイブリダイゼーションに基づくもの、プライマー伸長に基づくものあるいは酵素の基質特異性を利用するものに大別される。
ハイブリダイゼーション法は、塩基置換の有無を核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーションによって検出するものである。該方法は一塩基の違いによってハイブリダイゼーションが左右されるようなプローブ、ならびにハイブリダイゼーション条件を見出す必要があり、高い再現性を有する検出系の構築が困難である。
従来法としては、サイクルプローブ反応(cycle probe reaction、例えば米国特許第5,660,988号公報参照)を用いた変異検出方法が挙げられる。別法として、TaqMan法(例えば米国特許第5,210,015号公報あるいは米国特許第5,487,972号公報参照)を用いた変異検出方法が挙げられる。さらに塩基置換を検出しようとする塩基部分に3’末端がアニーリングするプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法(例えば、米国特許第5,137,806号公報参照)、3’末端から2番目のヌクレオチドに検出しようとする塩基置換部位が位置するプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法(例えば、国際公開第01/42498号パンフレット参照)、塩基置換を検出しようとする塩基の3’側に隣接する塩基に3’末端がアニーリングするプライマーを使用し、当該プライマーに取り込まれる塩基を判別して目的部分の変異の有無とその塩基を決定する方法等が挙げられる。また、DNAリガーゼを使用する方法がある。当該方法はプローブの末端部分を塩基置換を検出しようとする塩基部分に対応させることにより、ここに隣接したプローブとのライゲーションの有無から塩基置換を検出する。さらにインベーダー(Invader)法(例えば、米国特許第5,846,717号公報参照)のような二本鎖核酸の特殊な構造を認識して切断する活性を有する酵素を利用する方法が挙げられる。
上記の方法は、標的核酸が微量であった場合には検出できない、厳密な温度履歴条件下で行う必要がある、標的核酸とのアニーリングを厳密にコントロールする必要がある、あるいは検出のために特別な性質を有する酵素が必要である等の問題点を有していた。
そこで、等温条件下で標的核酸を増幅する方法として、ICAN法(例えば、国際公開第00/56877号パンフレット、国際公開第02/16639号パンフレット)のような鎖置換型核酸増幅方法が開発された。さらに、DNA−RNA−DNA型のキメラヌクレオチドを用いて遺伝子多型をタイピングする方法として、UCAN法(例えば、国際公開第02/64833号パンフレット)が開発された。
発明の目的
本発明の目的は、微量の核酸試料を使用して正確、かつ再現性に優れた塩基置換変異(例えばSNP)、挿入変異あるいは欠失変異を検出する手段を提供し、さらにこれらの手段を用いた遺伝子多型のタイピング方法を提供することにある。
発明の概要
上記課題を解決するためには、遺伝子における種々の多型、例えば塩基置換(例えばSNP)、挿入変異あるいは欠失変異を正確に検出し、かつその結果を強いシグナルとして得ることが可能な方法が望まれている。
本発明者らは、塩基置換を検出しようとする標的核酸にアニーリング可能であり、インタクトな状態ではその3’末端からはDNAポリメラーゼによるDNA伸長反応が開始されることがなく、かつ、アニーリングした鋳型鎖の塩基配列に応じてヌクレアーゼによる切断が左右されるようなヌクレオチドを作成し、当該ヌクレオチドならびに標的核酸を特異的に検出可能なプローブを組み合わせて、標的核酸上の遺伝子多型を正確、かつ高感度に検出可能な方法を構築した。さらに、本発明者らは、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換型DNAポリメラーゼ、RNaseHならびに標的核酸を特異的に検出可能なプローブを組み合わせた、遺伝子多型を正確、かつ高感度に検出可能な方法を構築し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明の第1の発明は、ヒトチトクローム遺伝子のCYP 2C19遺伝子のG636A、あるいはCYP 1A1遺伝子のT6235Cの遺伝子多型をタイピングする方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)ヒトチトクローム遺伝子上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、ヒトチトクローム遺伝子上の特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とするヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法に関する
第1の発明において、ヌクレオチドとしては配列表の配列番号14、15、21又は22記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドが好適に使用される。さらに、配列表の配列番号16又は23記載の塩基配列を有するプライマーを使用してもよい。
第1の発明の方法では、工程(2)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことができる。この工程においては、例えば配列表の配列番号20あるいは24記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることができる。
本発明の第2の発明は、第1のヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、配列表の配列番号14、15、21又は22記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とする。
第2の発明のキットは、さらに配列表の配列番号16又は23記載の塩基配列を有するプライマー、及び/又は配列表の配列番号20あるいは24記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有してもよい。
本発明の第3の発明は、ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の多型をタイピングする方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする。
第3の発明において、ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子としてはGSTM1遺伝子およびGSTT1遺伝子が例示される。キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては配列表の配列番号6〜8又は29〜31記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するものが好適に使用される。
第3の発明の方法では、工程(b)により増幅された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことができる。この工程においては、例えば配列表の配列番号9又は32記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることができる。
本発明の第4の発明は、第3のヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、配列表の配列番号配列番号6〜8又は29〜31記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とする。
第4の発明のキットは、さらに配列表の配列番号9又は32記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有してもよい。
本発明の第5の発明はヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のALDH2遺伝子のGlu487Lysの遺伝子多型をタイピングする方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子上の特定の塩基を含む任意の鎮長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とする。
第5の発明において、ヌクレオチドとしては配列表の配列番号25又は26記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドが好適に使用される。さらに、配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマーを使用してもよい。
第5の発明の方法では、工程(2)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことができる。この工程においては、例えば配列表の配列番号28記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることができる。
本発明の第6の発明は、第5の発明のヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、配列表の配列番号25、26記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とする。
第6の発明のキットは、さらに配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマー、及び/又は配列表の配列番号28記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有してもよい。
本発明の第7の発明は、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法に関する。
本発明の第8の発明は、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法に関する。
本発明の第9の発明は、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(A)少なくとも1つの標的となる核酸を、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含する方法で検出し、
(B)さらに上記(A)とは異なる別の標的となる核酸を、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の、塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含する方法で検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法に関する。
本発明の第7〜第9の発明において、標的となる核酸の少なくとも一つが内部標準となる核酸であってもよく、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを用いて内部標準となる核酸を検出しても良い。さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを用いて内部標準となる核酸を検出しても良い。
本発明の第10の発明は、本発明の第7〜第9の発明の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットに関する。
本発明の第10の発明において、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを含有していても良く、さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブ含んでいても良い。
発明の詳細な説明
本明細書に記載の「遺伝子多型」とは、同一の生物種集団内に含まれる個体間における遺伝子の塩基配列の相違を指す。遺伝子多型を構成する塩基配列の相違は特定の形式に限定されるものではなく、下記に示す「塩基置換」、「欠失変異」、「挿入変異」等種々のタイプのものを包含する。この遺伝情報の違いはバリエーション(variation)とも呼ばれている。
本明細書に記載の「塩基置換」とは、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基が他の塩基に置換されていることを指す。本明細書に記載の「塩基置換」において置換されている塩基の数には特に限定はなく、1塩基もしくはそれ以上の塩基に置換が存在してもよい。塩基配列中の一個の塩基に見られる置換は「一塩基置換多型(SNP)」と呼ばれている。また、核酸に人為的に導入された塩基置換も本明細書における「塩基置換」に含まれる。
本明細書に記載の「欠失変異」とは、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基配列が欠失していることを意味する。欠失した塩基配列は、1塩基でもよいし複数の塩基であってもよい。またこれらの塩基配列の欠失は、核酸上の特定の部位において複数箇所生じているものも含まれる。さらに、遺伝子の特定の領域、特に限定はされないが例えばエキソン及び/又はイントロンの領域、さらには当該遺伝子の全長が欠損した場合も「欠失変異」に含まれる。また、核酸に人為的に導入された塩基配列の欠失も本明細書における「欠失変異」に含まれる。
本明細書に記載の「挿入変異」とは、核酸上の特定の部位において、塩基配列が挿入されていることを意味する。挿入された塩基配列は、1塩基でもよいし複数の塩基であってもよいし、任意の鎖長であってもよい。また、これらの塩基配列の挿入は、核酸上の特定の部位において複数箇所生じているものも含まれる。また、核酸に人為的に導入された塩基配列の挿入も本明細書における「挿入変異」に含まれる。
本発明は、ゲノム多型やバリエーションの検出、特に、遺伝子上の塩基置換、例えばSNPの検出、遺伝子上の特定部位の挿入変異及び/または欠失変異の検出に好適である。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法に使用される、タイピングの対象となる遺伝子を含有する核酸(標的核酸)としては一本鎖、二本鎖の核酸、すなわちRNA、DNAを使用することができる。使用するヌクレアーゼによってはRNAを標的核酸とすることが困難な場合もあるが、その場合には当該RNAを鋳型として調製したcDNAを標的核酸として使用することにより、RNA上の塩基置換を検出することが可能である。
本発明においては、標的核酸を含有する試料をタイピング反応に使用することができる。
上記試料には特に限定はなく、標的核酸を含む可能性のあるあらゆる試料、例えば、細胞、組織(生検試料等)、全血、血清、脳脊髄液、精液、唾液、喀痰、尿、糞便、毛髪、細胞培養物等を使用することができる。上記の検体は、特に限定するものではないが、好ましくは適切な処理によって、例えばDNAポリメラーゼの反応を実施が可能な形態としたうえ、本発明の方法に供することができる。このような処理には細胞の溶解や試料からの核酸の抽出、精製が包含される。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法には、(I)標的核酸上の塩基配列と、そこにアニーリングするヌクレオチドとのミスマッチの有無の検出に基づく方法と、(II)標的核酸上の塩基配列の欠失および/または挿入を、プライマー対によって増幅される増幅断片の鎖長、もしくは増幅自体が起こるか否かによって判定する方法とがある。タイピングを行おうとする多型のタイプに応じて適切な方法を選択すればよい。
(1)本発明の標的核酸上の遺伝子多型のタイピング方法(I)
本発明の遺伝子多型のタイピング方法(I)は、
(A)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)多型のタイピングを行おうとする遺伝子上の、多型の存在する可能性のある特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(B)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程を包含することを特徴とする。
本発明のタイピング方法において、必要に応じてさらに標的核酸増幅用プライマーを併せて用いても良い。
本発明の検出方法において、必要に応じて上記工程(B)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含んでいても良い。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法においては、使用されるヌクレオチドの切断の有無、ならびにそれに続いて起こるDNA伸長反応の有無から塩基置換の存在が判定される。その方法には特に限定はなく、公知の核酸分析手法を使用することができる。例えば、DNA伸長反応の有無を調べる方法としては、生成した伸長産物をゲル電気泳動法(アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等)あるいはキャピラリー電気泳動法によって分離して確認する方法、伸長産物の鎖長の増加をマススペクトルによって測定する方法等を挙げることができる。また、別の態様としては、例えば、伸長産物へのヌクレオチドの取り込みを調べる方法がある。当該方法では、適切な標識を付加したヌクレオチド3リン酸が高分子の伸長産物に取り込まれる量として伸長産物の合成量を知ることができる。伸長産物は、例えば酸による沈殿処理やゲル電気泳動によって未反応のヌクレオチドと分離し、その生成量を測定することができる。さらに、DNA伸長反応によって生成するピロリン酸を酵素的に検出する方法を使用してもよい。
本発明のタイピング方法において、伸長反応を繰り返すことにより、結果として目的とする標的核酸が増幅される。さらに公知の核酸増幅反応を用いて当該伸長産物を増幅してもよい。このような態様は、高感度に塩基置換を検出する観点から有用である。
上記の核酸増幅反応には特に限定はなく、鋳型核酸に相補的な配列を有するプライマーが使用される種々の核酸増幅方法が使用できる。例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR;polymerase chain reaction、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号)、鎖置換型増幅法(SDA;strand displacement amplification、特公平7−114718号)、自立複製法(3SR;self−sustained sequence replication)、NASBA法(nucleic acid sequence based amplification、特許第2650159号)、TMA法(transcription−mediated amplification)、ICAN法(Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第00/56877号あるいは第02/16639号パンフレット)等の公知の増幅方法を使用することができる。これらの方法において、鋳型DNA鎖に相補的なDNAを合成する際のプライマーとして本発明のヌクレオチドを使用することにより、標的核酸上の遺伝子多型のタイピングを行うことができる。
上記のような核酸増幅法を利用して本発明の遺伝子多型のタイピング方法を実施する場合には、各方法に使用されるプライマーの少なくとも一つとして本発明のヌクレオチドを使用し、さらに反応系中に当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼを共存させればよい。
上記のような、核酸増幅反応を利用した遺伝子多型のタイピングにおいては、当該反応による特異的な増幅産物の生成から塩基置換の存在を判定することができる。増幅産物の生成は、特に限定するものではないが、例えばゲル電気泳動、増幅産物に相補的な配列を有するプローブを使用したハイブリダイゼーション法、蛍光標識ヌクレオチドを利用した蛍光偏光法、サイクルプローブ反応法等が使用でき、さらに各遺伝子増幅方法に特有の検出反応も利用することができる。
本発明の検出方法を用いてゲノムレベルでの塩基置換を解析する場合には、大量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。該システムとしては、マイクロチップ、マイクロCE(capillary electophoresis)チップあるいはナノチップが例示される。
このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的のDNA断片が増幅されるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。特に限定はされないが例えば、ICAN法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適に使用できる。該方法を組み合わせることにより、当該システムの単純化が可能となり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。また、本発明の方法において、PCR法を組み合わせることもできる。
上記の標識が付加された本発明のヌクレオチドは、DNA伸長反応の有無の確認を容易にすることができ、本発明の遺伝子多型のタイピング方法に有用である。この場合、当該ヌクレオチド由来の標識物質を上記のような各標識に適した方法で検出し、伸長反応の有無を確認すればよい。
例えば、蛍光物質が付加された本発明のヌクレオチドを使用する場合、標識がプライマーとして利用される部分に付加されていれば、伸長産物をその蛍光を利用して検出することができる。また、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所よりも3’側に付加されていれば、3’側断片の標的核酸からの解離やDNAポリメラーゼの有する5’→3’エキソヌクレアーゼによる該断片の低分子化等に基づいて伸長反応の有無を検出することができる。このような、蛍光標識されたヌクレオチドの分子量の変化を伴う態様においては蛍光偏光法の利用が好適である。
また、蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質とを付加して蛍光を発することのないように標識した本発明のヌクレオチドを使用する場合、伸長反応が起こると同時に蛍光が発せられるようになるため、極めて容易に遺伝子多型のタイピングを行うことができる。
上記の各態様において、塩基置換を検出しようとする位置に対応してアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)あるいはウラシル(U)のそれぞれを有し、かつそれぞれが互いに区別可能な異なる標識を付されたヌクレオチドを利用することにより、塩基置換の存在とともに、塩基置換がある場合には置換している塩基の種類を同時に知ることができる。
本発明の方法において、ヒトを含む高等動物の両染色体ともに塩基置換を有しないホモ接合体(ホモ型)、両染色体ともに塩基置換が存在するホモ接合体(ホモ型)、あるいは一方の染色体のみに塩基置換を有するヘテロ接合体(ヘテロ型)の3通りを区別して検出することができる。このように、本発明の方法は、上記のような対立遺伝子上の塩基置換の検出にも有用である。
本発明の方法において用いるヌクレオチドは、標的核酸上の塩基置換を検出しようとする箇所を含む領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。インタクトな状態ではDNAポリメラーゼによるDNA伸長のプライマーとして機能することはないが、ヌクレアーゼによって切断を受けた後に初めてプライマーとして機能することができる。上記のような性質を有するものであればその鎖長には特に限定はなく、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドのいずれもが本発明に使用できる。通常、8〜50塩基、好ましくは10〜40塩基、特に好ましくは12〜30塩基のオリゴヌクレオチドが本発明のヌクレオチドとして使用される。
本発明のヌクレオチドは、通常、デオキシリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。必要に応じ、リボヌクレオチド、ヌクレオチドのアナログや誘導体(修飾物)を含有することができる。ヌクレオチドのアナログとしては、例えば塩基部分にイノシン、7−デアザグアニン等の塩基を有するヌクレオチドアナログあるいはリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログを使用することができる。また、修飾ヌクレオチドとしてはリン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)ヌクレオチドや標識化合物が付加されたヌクレオチド等が例示される。さらに、本発明のヌクレオチドはペプチド核酸〔PNA、Peptide Nucleic Acid;ネイチャー(Nature)、第365巻、第566〜568頁(1993)〕を含有するものであってもよい。本発明を特に限定するものではないが、好ましくは、上記のヌクレオチドのアナログや誘導体等は使用されるヌクレアーゼの作用に影響を与えない部位に導入される。本発明のヌクレオチドへのヌクレオチドアナログの導入は、ヌクレオチド自身の高次構造形成の抑制、標的核酸とヌクレオチドとのアニーリングの安定化の観点から有効である。すなわち、本発明の遺伝子多型のタイピング方法に用いることのできるヌクレオチドとしての機能を保持する範囲で、ヌクレオチドアナログ及び/又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。本発明のヌクレオチドに修飾ヌクレオチドを含ませること及び/又は反応温度を適宜調整することによりタイピングの特異性を向上させることができる。
本発明において使用されるヌクレオチドは、標的核酸上の特定の塩基における多型をタイピングするために、下記に示すような性質を有している。
A)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されている。
B)標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。
C)当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応する、すなわち該塩基と水素結合を形成するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する(または存在しない)場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない(または存在する)場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな3’末端を生じるような配列を含有している。
ここで、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレオチドの5’側断片は標的核酸とアニーリングした状態を保持することができる。また、このヌクレオチドの5’側断片の3’末端ではリボースまたはデオキシリボースの3位に水酸基が存在しており、該末端からのDNAポリメラーゼによるDNA伸長が可能である。すなわち、上記ヌクレオチドはヌクレアーゼによって切断される塩基配列を有する場合にはプライマーの前駆体として機能する。
上記のように本発明のヌクレオチドは、その3’末端がDNAポリメラーゼによるDNA伸長反応に使用できない形に修飾されている。上記目的を達成可能であればその修飾手段には特に限定はないが、例えば、3’末端にジデオキシヌクレオチド、リボースの3位の水酸基が修飾されたヌクレオチド、DNAポリメラーゼによる伸長が立体障害により妨害されるような修飾を付されたヌクレオチド等を付加することがあげられる。上記のヌクレオチドのリボースの3位の水酸基の修飾方法としては、アルキル化やその他の公知の修飾方法を利用することができ、例えばアミノアルキル化することにより、DNA伸長反応を防ぐことができる。
また、上記ヌクレオチドは、使用される条件において標的核酸の多型を調べようとする領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。すなわち、標的核酸と実質的に相補的な配列を有していればよく、目的とする塩基における置換の検出に支障をきたさない範囲であれば標的核酸に完全に相補的な塩基配列を有している必要はない。
上記のヌクレオチドを標的核酸とアニーリングさせ、適切なヌクレアーゼとDNAポリメラーゼの存在下にインキュベートを行った場合、標的核酸に塩基置換が存在するか否か、すなわち当該ヌクレオチドと標的核酸とがアニーリングして形成された二本鎖核酸にミスマッチ部位が存在するか否かでヌクレオチドの切断が左右される。ヌクレオチドが切断されて新たな3’末端が生じた場合にのみ標的核酸を鋳型としたDNA伸長が起こることから、DNA伸長の有無によってミスマッチの有無、すなわち塩基置換の有無を知ることができる。
本発明においては、検出しようとする塩基置換が存在する場合にミスマッチが生じるように前記ヌクレオチドを作成すること、逆に塩基置換が存在した場合にはミスマッチが生じないように作成することのどちらも可能である。さらに、目的の塩基に対応する位置に4種の塩基のいずれかを配置した4種のヌクレオチドを作成して使用し、どの塩基を有するプライマーで伸長が起こるかを調べることにより、塩基置換の存在と置換している塩基の種類とを同時に知ることもできる。
本発明で用いるヌクレオチドは、上記のようにヌクレアーゼによる切断によってDNA伸長が可能なプライマーに変換される。ここで、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所より5’側の部分がDNA伸長におけるプライマーとして機能する。当該ヌクレアーゼとしては、ヌクレオチドと標的核酸とがアニーリングして形成された二本鎖核酸中のミスマッチの存在に対応して前記ヌクレオチドを切断もしくは切断しないものであれば特に限定はないが、例えば、リボヌクレアーゼH、制限酵素、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼ等があげられる。
リボヌクレアーゼH(RNaseH)はDNAとRNAから形成された二本鎖核酸を認識し、RNA鎖を選択的に切断する酵素である。本発明のヌクレオチドの置換を検出しようとする塩基に対応する部分にリボヌクレオチドを配置しておくことにより、ミスマッチが存在しない場合にのみリボヌクレアーゼHで切断されるヌクレオチドとすることができる。
本発明に使用されるリボヌクレアーゼとしては、上記のリボヌクレオチドを含有する本発明のヌクレオチドと、これと相補的なDNAから形成された二本鎖核酸を認識し、当該リボヌクレオチド部分を選択的に切断する活性を有していれば特に限定はない。このような酵素としては、リボヌクレアーゼHが好適に使用でき、例えばバチルス・カルドテナクス(Bacillus caldotenax)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、ピロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)、アルカエオグロバス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、メタノコッカス・ヤナシ(Methanococcus jannashi)由来のリボヌクレアーゼH等を使用することができる。
また、制限酵素はDNAの特定の塩基配列(4〜8塩基)を認識し、当該配列内部、もしくはその周辺部を切断する酵素である。置換を検出しようとする塩基部分が制限酵素の認識配列と重複する場合には、当該配列を含むヌクレオチドを作成し、塩基置換の検出に使用することができる。ヌクレオチドと標的核酸との間にミスマッチが生じる場合には制限酵素による切断が起こらず、これによって塩基置換の有無を知ることができる。このようなヌクレオチドを使用するにあたっては標的核酸側が制限酵素によって切断を受けないようにする必要があるが、使用する制限酵素に対応する修飾メチラーゼを使用して特定の塩基をメチル化するなどの方法により、標的核酸特異的に制限酵素への耐性を付与することが可能である。
上記の2種のヌクレアーゼとは逆に、標的核酸とヌクレオチドとの間のミスマッチを認識して切断するような酵素を使用してもよい。このような酵素としてはMutH等を使用することができる。
本発明で用いるヌクレオチドが上記のヌクレアーゼによる切断を受け、新たな3’末端が生じると、当該末端よりDNAの伸長が開始される。この工程に使用されるDNAポリメラーゼとしては、鋳型DNAの配列に依存してプライマーの3’末端よりDNA伸長が可能なものであれば特に限定はない。例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、クレノウ・フラグメント、T7 DNAポリメラーゼ、好熱性バチルス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ)、サーマス属細菌由来DNAポリメラーゼ(Taq DNAポリメラーゼ等)、好熱性古細菌由来α型DNAポリメラーゼ(Pfu DNAポリメラーゼ等)が挙げられる。
本発明のヌクレオチドを遺伝子増幅反応と組み合わせて使用する場合には、それぞれの遺伝子増幅反応に適したDNAポリメラーゼを選択して使用すればよい。
本発明においてヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて生じる3’側部分の断片は、その鎖長が短い場合には標的核酸から遊離するが、十分な鎖長を有している場合には標的核酸とのアニーリングを維持することが可能である。DNAポリメラーゼとして鎖置換活性を有するものを使用した場合には、当該断片はDNAポリメラーゼによるDNAの伸長とともに標的核酸から解離させられる。また、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使用した場合には、当該断片はDNAポリメラーゼによって分解される。
上記の、ヌクレアーゼとしてリボヌクレアーゼHを使用する本発明のヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明に使用することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−N’−3’
(上記一般式において、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、N’:DNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されたヌクレオチド、なおdNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよい。)
上記一般式において、Nbで表される部位は遺伝子多型のタイピングの対象となる塩基に対応する塩基を含んでいる。また、上記の各ヌクレオチドはその機能を損なわない範囲でヌクレオチドのアナログや誘導体(修飾ヌクレオチド)を含有していてもよい。
上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、aは5以上の整数であればよく、好ましくは6以上の整数、さらに好ましくは8以上の整数である。またbは1以上の整数であればよく、例えば1〜15の範囲、好ましくは1〜10の範囲、さらに好ましくは1〜7の範囲、特に好ましくは1〜5の範囲である。さらにcは0あってもよく、あるいは1以上の整数であり、好ましくは0〜5の範囲、さらに好ましくは0〜3の範囲である。
例えば、上記一般式において、N’が修飾デオキシリボヌクレオチドであり、a=8の場合における、b=1〜3、c=0〜3のヌクレオチド等が例示される。すなわち、本発明の方法に使用できるようなヌクレオチドとなるようにa、b、cの数値を調整すればよい。
本発明のヌクレオチドに適切な標識を施すことにより、ヌクレアーゼによる切断、あるいはそれに続くDNA伸長反応により生じる産物(伸長産物)によってヌクレオチドから分離した3’側断片の検出を容易にし、遺伝子多型の存在を簡便に確認することができる。
ヌクレオチドの標識方法には限定はなく、例えば放射性同位体(32P等)、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド(ビオチン、ジゴキシゲニン等)、酵素等が使用できる。標識されたヌクレオチド由来の産物は当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。例えば、リガンド標識したヌクレオチド由来の産物と酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
ヌクレオチドを蛍光標識する態様としては、例えば当該ヌクレオチドを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質の両者で、適当な間隔をとって標識したものが包含される。このようなプライマーはインタクトな状態では蛍光を発することはないが、ヌクレアーゼにより切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には蛍光を発するようになる。このようなヌクレオチドはDNA伸長反応の開始と同時に蛍光が発せられるため、反応中の反応液を直接観察することによって遺伝子の多型をタイピングすることができる。
本発明の方法において、必要に応じて鋳型となる核酸を予め、物理学的、化学的又は酵素的に変性処理しても良い。該変性処理の方法としては、特に限定はされないが例えば、鋳型となる核酸の溶液を90℃以上に加熱処理することによる熱変性処理、アルカリ溶液で処理することによるアルカリ変性処理、あるいはヘリカーゼやRecA等で処理することによる酵素処理等、いずれの方法も好適に使用できる。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法の対象となる遺伝子としては、ヒトチトクローム遺伝子、例えばCYP 2C19遺伝子のG636A、あるいはCYP 1A1遺伝子のT6235Cが例示される。また、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、例えば、ALDH2遺伝子のGlu487Lysが例示される。
また、本発明の遺伝子多型のタイピング方法において、同時あるいは個別に内部標準(インターナルコントロール)となる核酸を検出しながらタイピングを行ってもよい。該内部標準は、本発明の方法において偽陰性の判断に利用することができる。該内部標準は、目的とする遺伝子を伸長するためのプライマーと同じもので伸長産物を与えるもの、目的とする遺伝子を伸長するためのプライマーと異なるもので伸長産物を与えるもののいずれであってもよい。また、該内部標準としては、検体サンプル中に最初から含まれている遺伝子であってもよく、特に限定はされないが例えば、β−グロビン遺伝子等が好適に使用できる。あるいは、人工的に調製した内部標準として機能しうる核酸を検体サンプルに添加した後、本発明の方法に供してもよい。当該内部標準の検出は、目的の遺伝子多型のタイピングに用いる方法と同様の方法で行うことができる。
(2)本発明の遺伝子多型のタイピング方法(I)に使用されるキット
本発明は、上記の本発明の遺伝子多型のタイピング方法(I)に使用されるキットを提供する。1つの実施態様において、該キットは本発明の方法で用いることができるヌクレオチドを含有することを特徴とする。該ヌクレオチドとしては、特に限定はされないが、例えば、ヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピングには配列表の配列番号14、15、21及び/又は22記載の塩基配列を有するヌクレオチドが好適である。また、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピングには配列表の配列番号25及び/又は26記載の塩基配列を有するヌクレオチドが好適である。塩基置換の有無と同時に置換した塩基を特定できるような、4種の塩基それぞれを含有するヌクレオチドのセットを含有するものでもよい。該ヌクレオチドのセットとしては、特に限定はされないが、例えば、ヒトチトクローム遺伝子タイピング用の配列表の配列番号14及び15記載の塩基配列を有するヌクレオチドのセット、配列表の配列番号21及び22記載の塩基配列を有するヌクレオチドのセット、さらに、例えば、配列表の配列番号14〜16記載の塩基配列を有するヌクレオチド並びにプライマーのセットあるいは配列表の配列番号21〜23記載の塩基配列を有するヌクレオチド並びにプライマーのセットが好適に使用できる。ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子タイピング用としては、配列表の配列番号25及び26記載の塩基配列を有するヌクレオチドのセット、さらに25〜27記載の塩基配列を有するヌクレオチド並びにプライマーのセットが好適に使用できる。また、配列表の配列番号20、24記載の塩基配列を有するヒトチトクローム遺伝子の塩基置換を特定できるような特異的検出用プローブ、配列表の配列番号28記載の塩基配列を有するヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基置換を特定できるような特異的検出用プローブを含有してもよい。さらに、当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼやその基質(dNTP)、反応に適した緩衝液等を含有するものやプライマー伸長産物の検出のための試薬を含有するものであってもよい。核酸増幅法と組み合わせて遺伝子多型のタイピングするためのキットとしては、当該増幅法に使用される反応液を調製するための試薬を含有するものが好適である。
本発明のキットにおいては、内部標準(インターナルコントロール)検出用のプライマーおよびプローブを含んでいてもよい。また、検体に添加するための内部標準となる核酸を含んでいてもよい。上記プライマーならびにプローブとしては、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列から選択される塩基配列を有するβ−グロビン増幅用プライマー、および配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するβ−グロビン検出用プローブが挙げられる。
(3)本発明の標的核酸上の遺伝子多型のタイピング方法(II)
本発明の遺伝子多型のタイピング方法(II)は、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程を包含することを特徴とする。
上記タイピング方法においては、必要に応じて上記工程(b)により増幅された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて核酸を検出する工程を含んでもよい。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条件において、DNA鎖の伸長に寄与することができ、さらに、その3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは1以上の修飾リボヌクレオチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端又は3’末端側に配置され、エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるものであれば、未修飾リボヌクレオチドおよび/または修飾リボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含される。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された(α−S)リボヌクレオチドや、リボースの2位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、米国特許第5,003,097号記載の硫化反応試薬(グレンリサーチ社製)を用いた方法で調製した(α−S)リボヌクレオチド3リン酸、あるいは2−OMe−RNA−CE ホスホアミダイド試薬(グレンリサーチ社製)を用いて作製することができる。
また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断位置を制御し得る点において有用である。
本発明の方法で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後のDNA断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって1種類もしくは2種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖DNAが望まれる場合には1種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、また、二本鎖が望まれる場合には2種類のプライマーが使用される。
本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、当該プライマーの3’末端又は3’末端側にリボヌクレオチドが存在し、ICAN法に使用できるものであればその鎖長に特に限定はない。
上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば約6ヌクレオチドから約100ヌクレオチドの範囲、好ましくは、約10ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの範囲、さらに好ましくは、約12ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの範囲の鎖長のものが使用できる。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列を3’末端又は3’末端側に含む。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明のDNA合成方法にプライマーとして使用することができる。
一般式:5’−dNa−Nb−dNc−3’
(上記一般式において、dN:デオキシリボヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログ、N:未修飾リボヌクレオチド及び/又は修飾リボヌクレオチド、なお、dNaの部位の一部のdNはNで置換されていてもよく、3’末端のヌクレオチドは当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい。)
上記一般式において、特に限定はされないが、例えば、aは5以上の整数であればよく、好ましくは6以上の整数、さらに好ましくは8以上の整数である。またbは1以上の整数であればよく、例えば1〜15の範囲、好ましくは1〜10の範囲、さらに好ましくは1〜7の範囲、特に好ましくは1〜5の範囲である。さらにcは0であってもよく、あるいは1以上の整数であり、好ましくは0〜5の範囲、さらに好ましくは0〜3の範囲である。
本発明に用いられるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの態様としては、特に限定はされないが、例えば、a=8の場合における、b=1、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=2、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、b=3〜5、c=0のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、さらにb=1〜3、c=0〜3のキメラオリゴヌクレオチドプライマー等が例示される。すなわち、本発明の方法に使用できるようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーとなるようにa、b、cの数値を調整すればよい。
さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。即ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、DNAポリメラーゼがその3’末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で1以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは7−デアザグアニンのような修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。さらに、同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導入しても良い。特に限定するものではないが、非特異的なエンドヌクレアーゼ(RNase)によるプライマーの分解を防ぐ観点からは、例えば、(α−S)リボヌクレオチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用できる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、公知の方法、あるいは市販の核酸合成装置を使用し、所望の塩基配列を有するものを作製することができる。
本発明の方法の行程(a)において、RNAを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を1段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型DNAポリメラーゼの組み合わせとして例えば、AMV RTase、MMLV RTaseあるいはRAV−2 RTaseとBca DNAポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。
本発明の方法で増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば200bp以下、さらに好ましくは150bp以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に遺伝子多型のタイピングを行うことができる。
さらに、本発明の検出方法では、ビシン(Bicine)、トリシン(Tricine)、ヘペス(Hepes)、リン酸塩あるいはトリス(Tris)緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとDNAポリメラーゼは特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来RNaseH及びBcaBEST DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)の組み合わせが好ましい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びDNAポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
本発明では、標的核酸の増幅の際に、dUTPを基質として取り込ませることができる。したがって、dUTPを基質に用いた場合には、ウラシル N−グリコシダーゼ(uracil N−glycosidase;UNG)を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性を防止することができる。
本発明の遺伝子タイピング方法においては、上記の(a)、(b)工程によって増幅産物が生成するか否か、若しくは増幅産物の鎖長を測定することによって挿入変異及び/又は欠失変異の存在を判定することができる。増幅産物の有無、増幅産物の鎖長のどちらで判定を行うかは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーをタイピングを行おうとする遺伝子のどの位置に設定するかによって決定することができる。
上記検出工程には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。また、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。さらに、標的核酸の増幅工程時に生成するピロリン酸をマグネシウム塩のような不溶性物質とさせて、反応液を白濁させ、その濁度を測定してもよい。さらに上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、上記(b)工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)あるいは非蛍光共鳴エネルギー転移(Non−FRET)、電極と導電物質の析出を組み合わせた方法等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された2種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド(RNA)プローブあるいはリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドで構成されるキメラオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、FRETの標識対である6−FAM(6−carboxyfluorescein)とTAMRA(N,N,N’,N’−tetramethyl−6−carboxyrhodamine)との組み合わせ、あるいは非−FRETの標識対である6−FAM(6−carboxyfluorescein)とDABCYL(4−(4’−dimethylaminophenylazo)benzoic acid)が好適に使用できる。
さらに、本発明で使用できるプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイゼーション条件は、例えば1989年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T.Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング:ア ラボラトリー マニュアル第2版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.)に記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、0.5%SDS、5×デンハルツ[Denhardt’s、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%フィコール400]及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、使用するプローブのTm値より約25℃低い温度で4時間〜一晩保温を行う条件を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法の等温下における増幅方法においては、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。また本発明の増幅方法では、使用するプライマーを1種類もしくは2種類と従来法よりも少なくすることができる。dNTPのような試薬もPCR等で用いられるものを流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はPCR法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
本発明の挿入変異及び/又は欠失変異のタイピング方法も、上記のように反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせることによって、高効率、大量処理に適した解析システムとすることができる。
本発明の方法においても前記(1)の場合と同様に、必要に応じて鋳型となる核酸を予め、物理学的、化学的又は酵素的に変性処理しても良い。
本発明の遺伝子多型のタイピング方法の対象としては、特に限定はされないがヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子、例えば、GSTM1遺伝子やGSTT1遺伝子における欠失変異が例示される。本発明の検出方法においては、上記欠失変異の領域中にキメラオリゴヌクレオチドプライマー対を設定してもよいし、当該プライマー対のいずれか一方を欠失変異領域内に設定してもよい。また、本発明の遺伝子多型のタイピング方法においても、前記の遺伝子多型のタイピング方法(1)と同様に、内部標準となる核酸の同時あるいは個別の検出を組み合わせてタイピングを行うことができる。
(4)本発明の遺伝子多型のタイピング方法(II)に使用されるキット
本発明は、遺伝子多型のタイピング方法(II)に使用されるキットを提供する。1つの実施態様において、該キットは本発明の方法で用いることができるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とする。該プライマーは特に限定はされないが、例えばヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子における欠失変異を検出するためのものとしては、配列表の配列番号6〜8、29〜31記載の塩基配列を有するものが好適である。また、挿入変異及び/又は欠失変異を特定できるような特異的検出用プローブを含有してもよい。該プローブとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号9、32記載の塩基配列を有するヌクレオチドが好適に使用できる。さらに、当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼやその基質(dNTPs)、反応に適した緩衝液等を含有するものやプライマー伸長産物の検出のための試薬を含有するものであってもよい。核酸増幅法と組み合わせて遺伝子多型をタイピングするためのキットとしては、当該増幅法に使用される反応液を調製するための試薬を含有するものが好適である。
本発明のキットにおいても前記遺伝子多型のタイピング方法のためのキット(2)と同様に、内部標準(インターナルコントロール)検出用のプライマーおよびプローブを含んでいてもよい。
(5)本発明の複数の標的となる核酸の遺伝子多型のタイピング方法並びに該方法のためのキット
本発明の複数の標的となる核酸の遺伝子多型のタイピング方法の一態様としては、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法が例示される。
また、別の態様としては、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法が例示される。
さらに、別の態様としては、複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(A)少なくとも1つの標的となる核酸を、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含する方法で検出し、(B)さらに上記(A)とは異なる別の標的となる核酸を、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含する方法で検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法が例示される。
本発明の複数の標的となる核酸の遺伝子多型のタイピング方法において、標的となる核酸には特に限定はない。すなわち、遺伝子多型のタイピングの対象となる遺伝子のいずれもが好適に使用できる。また、標的となる核酸の遺伝子多型の組み合わせは、前記「塩基置換」、「欠失変異」、「挿入変異」等種々のタイプのものの同種あるいは異種の組み合わせのいずれであっても良い。上記標的となる核酸の遺伝子多型の組み合わせとしては、特に限定はされないが例えば、ヒトチトクローム遺伝子のCYP 2C19、CYP 1A1、ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子のGSTM1、GSTT1あるいはヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のALDH2から選択した組み合わせが例示される。
上記遺伝子の多型を検出するプライマー並びにプローブについては、例えば、前述の(1)〜(4)に記載のものが好適に使用できる。
さらに本発明の方法においては、標的となる核酸の組み合わせは、前記遺伝子多型のタイプの少なくとも1種類と多型を持たない別の遺伝子との組み合わせであってもよい。当該多型を持たない遺伝子には特に限定はされない。さらに本発明の検出において内部標準となる核酸を組み合わせて用いても良い。
すなわち、複数の標的となる核酸の少なくとも一つが内部標準となる核酸であってもよい。該核酸としては、特に限定はされないが例えば、β−グロビン遺伝子が好適に使用できる。前記β−グロビン遺伝子を検出するためのプライマーとしては、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを用いることができる。さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを用いて検出することができる。また、本発明のタイピング方法においては、伸長反応を繰り返すことにより、結果として目的とする標的核酸が増幅される。さらに公知の核酸増幅反応を用いて当該伸長産物を増幅してもよい。
さらに本発明の方法のためのキットとしては、複数の標的となる核酸を検出するためのヌクレオチドあるいはプライマーを含んでいても良い。さらに本発明の方法で得られた増幅産物を検出するためのプローブを含んでいても良い。
例えば、複数の標的となる核酸の少なくとも一つが内部標準となる核酸、β−グロビン遺伝子の場合には、配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを含有していても良く、さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを含有していても良い。
本発明の方法は、塩基置換、挿入変異ならびに欠失変異の検出に使用することができる。対象遺伝子としては、特に限定はされないが例えば、ヒトチトクローム遺伝子 CYP 2C19のG636A(m2)、CYP 1C1のT6235C、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2(ALDH2)遺伝子のGlu487Lysの塩基置換等、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子(GSTM1、GSTT1)の欠失変異等が挙げられ、本発明の方法を用いてこれらを好適に検出することができる。さらに本発明の方法を用いることにより、遺伝子タイピング方法として使用することができる。
実施例
以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
参考例1 アルカエオグロバス フルギダスのRNaseHII遺伝子のクローニング
(1)アルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNAの調製
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンGmbHより購入:DSM4139)8ml相当分の菌体を集め、100μlの25%ショ糖、50mM Tris−HCl(pH8.0)に懸濁し、20μlの0.5M EDTA、10μlの10mg/ml 塩化リゾチーム(ナカライテスク社製)水溶液を加えて、20℃で1時間反応させた。反応終了後、この反応液に800μlの150mM NaCl、1mM EDTA、20mM Tris−HCl(pH8.0)、10μlの20mg/ml プロテイナーゼK(タカラバイオ社製)及び50μlの10%ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、37℃で1時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に50μlのTEに溶解してゲノムDNA溶液を得た。
(2)RNaseHII遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)は全ゲノム配列が公開されており〔Klenk,HPら、ネイチャー(Nature)、第390巻、第364−370頁(1997)〕、RNaseHIIのホモログをコードする遺伝子(AF0621)が1つ存在することが明らかになっている(配列番号1、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)。
そこで、このAF0621遺伝子(配列番号1)の配列をもとにプライマーAfuNde(配列番号2)及びAfuBam(配列番号3)を合成した。
参考例1−(1)で得たアルカエオグロバス フルギダス ゲノムDNA 30ngを鋳型にして、20pmolのAfuNde及び20pmolのAfuBamをプライマーに用い、100μlの容量でPCRを行なった。PCRでのDNAポリメラーゼはパイロベストDNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を添付のプロトコールに従って用い、PCRは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を1サイクルとし、40サイクル行った。増幅した約0.6kbのDNA断片をNdeI及びBamHI(ともにタカラバイオ社製)で消化し、得られたDNA断片をプラスミドベクターpTV119Nd(pTV119NのNcoIサイトをNdeIサイトに変換したもの)のNdeI及びBamHI間に組込んだプラスミドpAFU204を作製した。
(3)RNaseHII遺伝子を含むDNA断片の塩基配列の決定
参考例1−(2)で得られたpAFU204の挿入DNA断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、RNaseHIIをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号4に示す。また、該塩基配列から推定されるRNaseHIIのアミノ酸配列を配列表の配列番号5に示す。
なお、プラスミドpAFU204で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia coli JM109/pAFU204と命名、表示され、平成13年2月22日より日本国〒305−8566茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−18221として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP−7691[国際寄託への移管請求日:平成13年8月2日]として寄託されている。
(4)精製RNaseHII標品の調製
参考例1−(2)で得られたpAFU204で大腸菌JM109を形質転換し、得られたpAFU204を含む大腸菌JM109を100μg/mlのアンピシリンを含む2リットルのLB培地に植菌し、37℃で16時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を37.1mlのソニケーションバッファー〔50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mMフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を12000rpmで10分間の遠心分離を行い、得られた上清を70℃、15分間の熱処理にかけた。その後、再度12000rpmで10分の遠心分離を行い、上清を集め、40.3mlの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーA〔50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕で平衡化したRESOURSE Qカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Qカラムを素通りした。
バッファーAで平衡化したRESOURSE Sカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、RNaseHIIはRESOURSE Sカラムを素通りした。
素通りしたRNaseHII画分40.0mlを50mM NaClを含むバッファーB〔50mM Tris−HCl(pH7.0)、1mM EDTA〕2リットルを外液として、2時間の透析を3回行なった。透析後の酵素液40.2mlを50mM NaClを含むバッファーBで平衡化したHiTrap−heparinカラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、FPLCシステムを用いて50〜550mM NaCl直線濃度勾配により溶出した。その結果、約240mM NaClのところに溶出されたRNaseHII画分を得た。
このRNaseHII画分7.8mlをセントリコン−10(アミコン社製)を用いた限外ろ過により濃縮し、約600μlの濃縮液を4回に分けて100mM NaCl、0.1mM EDTAを含む50mM Tris−HCl(pH7.0)で平衡化したSuperose6ゲルろ過カラム(アマシャム ファルマシア バイオテク社製)に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、RNaseHIIは、30.0キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、RNaseHIIが1量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたRNaseHIIをAfu RNaseHII標品とした。
上記で得られたAfu RNaseHII標品を用いて、以下に記載の方法により酵素活性を測定した結果、AfuRNaseHII標品にRNaseH活性が認められた。
(5)精製RNaseH活性の測定
a)使用する試薬液の調製
力価測定用反応液:最終濃度がそれぞれ40mM Tris−HCl(pH7.7、37℃)、4mM塩化マグネシウム、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロール、24μMポリ(dT)になるように滅菌水で調製した。
ポリ[8−3H]アデニル酸溶液:370kBqのポリ[8−3H]アデニル酸溶液を200μlの滅菌水に溶解した。
ポリアデニル酸溶液:ポリアデニル酸を3mMになるように滅菌超純水で希釈した。
酵素希釈液:最終濃度がそれぞれ25mM Tris−HCl(pH7.5、37℃)、5mM 2−メルカプトエタノール、0.5mM EDTA(pH7.5、37℃)、30mM塩化ナトリウム、50%グリセロールになるように滅菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺DNAの調製:子牛胸腺DNA 200mgをTEバッファー100mlに懸濁し、膨潤させた。該溶液のUV260nmの吸光度を測定し、1mg/mlの濃度に滅菌超純水で希釈した。次に、該溶液を100℃で10分間加熱後、氷浴中で急冷した。
b)活性測定方法
上記a)で調製した力価測定用反応液985μlにポリ[8−3H]アデニル酸溶液7μlを加え37℃で10分間保持した。次にポリアデニル酸を最終濃度が24μMになるように8μl加え、さらに37℃で5分間保持した。このようにしてポリ[8−3H]rA−ポリdT反応液1000μlを調製した。
次に、該反応液200μlを分取し、30℃で5分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液1μlを加え、これらの反応液を経時的に50μlずつサンプリングして、後の測定に用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間をY分とした。また、全CPM用反応液50μlおよびブランク用反応液50μlは、酵素液の代わりに酵素希釈液を1μl加えて調製した。該サンプリング溶液に100mMピロリン酸ナトリウム100μl、熱変性子牛胸腺DNA溶液50μlおよび10%トリクロロ酢酸300μl(全CPM測定の場合は、超純水300μl)を加え、0℃で5分間保持後、10000rpmで10分間遠心した。遠心後、得られた上清250μlをバイアルに入れ、アクアゾル−2(NENライフサイエンスプロダクツ社製)10mlを加え、液体シンチレーションカウンターでCPMを測定した。
c)ユニット計算
各酵素のユニット(Unit)数は、以下の計算式で算出した。
Unit/ml={(測定したCPM−ブランクCPM)×1.2*×20×1000×希釈率}×200(μl)/(全CPM×Y分×50(μl)×9**)
1.2*:全CPM中に含まれるポリ[8−3H]rA−ポリdTの50μl当たりのnmol数
9**:補正係数
以下の実施例における耐熱性RNaseHのunit数は、以下の方法により算出した。
ポリ(rA)及びポリ(dT)(ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製)1mgをそれぞれ1mM EDTAを含む40mMトリス−HCl(pH7.7)1mlに溶解し、ポリ(rA)溶液及びポリ(dT)溶液を調製した。
次に、4mM MgCl2、1mM DTT、0.003%BSA、4%グリセロールを含む40mMトリス−HCl(pH7.7)に、終濃度20μg/mlとなるポリ(rA)溶液、終濃度30μg/mlとなるポリ(dT)溶液を加え、37℃で10分間反応後、4℃に冷却し、ポリ(rA)−ポリ(dT)溶液を調製した。このポリ(rA)−ポリ(dT)溶液100μlに任意に希釈した酵素液1μlを加え、40℃で10分間反応させ、0.5M EDTA 10μlを加えて反応を停止させた後、260nmの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に0.5M EDTA 10μlを加えた後、40℃で10分間反応させ、吸光度を測定した。その後、EDTA非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値(吸光度差)を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ(rA)−ポリ(dT)ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。RNaseHの1単位は、1nmolのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するA260を10分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位(unit)=〔吸光度差×反応液量(ml)〕/0.0152×(110/100)×希釈率
実施例1
(1)ゲノムDNAの調製
インフォームドコンセントの得られた7人のヒト健常人ドナーより10ml採血を行った。それぞれ採取した血液100μlを使用してGenとるくん(血液用)(タカラバイオ社製)を用いてゲノムDNAの調製を行った。得られたゲノムDNA溶液の濃度を以下に示す。
検体No.1:182ng/μl
検体No.2:150ng/μl
検体No.3:156ng/μl
検体No.4:204ng/μl
検体No.5:105ng/μl
検体No.6:172ng/μl
検体No.7:253ng/μl
(2)プライマーおよびプローブの合成
ヒトglutathione−S−transferase M1(GSTM1)遺伝子(GenBank Accession No.X51451)の塩基配列に従って、3’末端の3残基をRNAにしたICAN反応による検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし合成した。すなわち、配列表の配列番号6及び7で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGS−F、GS−Rをそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGS−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGS−Rはアンチセンス方向のプライマーである。また、配列番号8で示されるGS−Rの5’末端をビオチン化したオリゴヌクレオチドプライマーGS−R−bioを合成した。GS−RとGS−R−bioは9:1の割合で混合し反応に供した(以下GS−R−mixと称す)。さらに、ELISAによるICAN反応増幅産物検出のための5’末端をFITC化した、配列番号9で示されるオリゴヌクレオチドプローブGS−Dを合成した。GS−Dはセンス方向のプローブである。ELISAによるICAN反応増幅産物検出の時に発色の基準となるELISAポジティブコントロール作製のためのオリゴヌクレオチドプライマーGS−Epc−F(配列番号10)および5’末端をビオチン化したGS−Epc−R(配列番号11)をそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGS−Epc−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGS−Epc−Rはアンチセンス方向のプライマーである。ELISAポジティブコントロールはICAN増幅産物よりも若干短くなるようにそれぞれのプライマーを設計した。
一方PCR反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーもデザインし合成した。すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーGS−PCR−F(配列番号12)、GS−PCR−R(配列番号13)をそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGS−PCR−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGS−PCR−Rはアンチセンス方向のプライマーである。
(3)ICAN反応によるGSTM1遺伝子の検出
上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(GS−FとGS−R−mix)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、(1)で調製した各検体ゲノムDNA溶液1μlを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、58℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は58℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲルの電気泳動に供した。その結果、検体5および検体7由来ゲノムDNAを用いた場合のみGSTM1遺伝子由来の増幅産物が確認でき、これら検体はGSTM1遺伝子を保持していることが確認できた。この結果を図1に示す。すなわち、図1はICAN反応産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No.1、2、3、4、5、6、7を示す。
一方、同じ各検体ゲノムDNA溶液1μlを用いてPCR法によりGSTM1遺伝子の検出を行った。配列表の配列番号12、13で示されるGS−PCR−F、GS−PCR−Rの各プライマーを用いてPCR反応を行い、該反応液を3.0%アガロースゲルの電気泳動に供した。その結果、検体5および検体7由来ゲノムDNAを用いた場合のみGSTM1遺伝子由来の増幅産物が確認できた。この結果を図2に示す。すなわち、図2はPCR反応産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No.1、2、3、4、5、6、7を示す。以上よりICAN法による結果とPCR法による結果が一致した。
(4)ICAN増幅産物のELISA法を用いた検出
1.ELISAポジティブコントロールの調製
上記実施例1−(2)で合成したプライマーGS−Epc−F、GS−Epc−Rを用いて前骨髄性白血病細胞株HL60由来のゲノムDNA 200ngを鋳型としてPCR反応を行った。得られた増幅産物は後述のELISAにより約1程度の吸光度を示すように適宜希釈して実際に使用した。この時のDNA濃度は340amol/μlであった。
2.ELISA法を用いた検出
上記実施例1−(3)で得られた各反応産物5μlおよびELISAポジティブコントロール溶液5μlを、ハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1% Triton−X100、1% BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmolのGS−Dプロープを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlを、TMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。ELISAポジティブコントロールの値をカットオフ値としてそれより高い吸光度を示すものをGSTM1遺伝子ポジティブと判定した。
その結果検体5および検体7由来ゲノムDNAからのICAN反応産物がGSTM1遺伝子ポジティブと判定でき、電気泳動による判定と同様の結果が得られた。これを図3に示す。すなわち、図3はELISAの結果をグラフにしたものであり、横軸の1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No.1、2、3、4、5、6、7を示し、8はポジティブコントロールを示す。縦軸に450nmの吸光度を示す。
実施例2
(1)ヒトCYP2C19(636)のアレル特異的な検出
ヒトCYP2C19の636番目の塩基のアレルを対象として、遺伝子的にホモ型あるいはヘテロ型であるかの検出方法について検討した。
インフォームドコンセントの得られた健常人全血200μl(サンプル番号1〜6)よりGenとるくんTM(タカラバイオ社製)を用いて、ゲノムDNAを調製した。調製したゲノムDNA 160ngを鋳型として、636G、636Aの各alleleを特異的に検出するセンス方向のプライマーとして、それぞれ配列番号14、15記載のヌクレオチド、アンチセンス方向のプライマーとして配列番号16記載のオリゴヌクレオチドを調製し、上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(センス方向とアンチセンス方向プライマー)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液を含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、53℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、11U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼおよび滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は、53℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図4A〜Fに示す。すなわち図4のA〜Fは、それぞれ血液サンプル1〜6から抽出したゲノムDNAを鋳型としてタイピングした結果を示す電気泳動パターンであり、各図のレーン1は配列番号14(636G検出用)、レーン2は配列番号15(636A検出用)をそれぞれヌクレオチドとして用いた場合である。図4のA〜Fに示した増幅産物のパターンから、各血液サンプルのCYP2C19 636塩基目のalleleは(サンプル1:G/A、2:G/G、3:G/A、4:G/G、5:G/G、6:G/G)とタイピングされた。
一方、同じゲノムDNAを鋳型に、配列表の配列番号17および18のプライマーを用いてPCR反応を行った。得られたPCR増幅産物をBamHIで処理した後、該反応液を3.0%アガロースゲル電気泳動に供し、PCR−RFLP法によりタイピングを行った。その結果を図4Gに示す。すなわち図4Gは血液サンプル1〜6から調製したゲノムDNAを鋳型とし、PCR−RFLP法によりタイピングを行った結果を示す電気泳動パターンであり、レーン1〜6はそれぞれ血液サンプル1〜6から抽出したゲノムDNAを鋳型とした場合である。図4Gに示す電気泳動結果から、これら各血液サンプルから調製したDNAを鋳型としたPCR増幅産物の切断パターンよりCYP2C19 636塩基目のalleleは(サンプル1:G/A、2:G/G、3:G/A、4:G/G、5:G/G、6:G/G)とタイピングされ、前記の結果と一致した。
(2)ELISAによるヒトCYP2C19(636)のアレル特異的な検出
HL−60のゲノムDNA(G/G)160ngを調製し、また、実施例2−(1)記載の血液サンプル1(G/A)、4(G/G)より、(1)と同様に調製したゲノムDNA 150ng、230ngをそれぞれ鋳型とし、636G、636Aの各alleleを特異的に検出するプライマーとして、それぞれ配列番号14、15記載のヌクレオチド、アンチセンスプライマーとして1%5’末端ビオチン標識化したものを含む配列番号19記載のプライマーを用いて、実施例2−(1)と同様の方法でSNPタイピング反応を行った。得られた、各タイピング反応産物2.5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.017N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5’末端FITC標識化した配列番号20記載のDNAプローブ2.5pmolを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図5に示した。図5において、■は636G、□は636Aの各alleleを特異的に検出するプライマー配列番号14、15のヌクレオチドを用いてタイピング反応を行った場合の図である。また、横軸の1、2、3はそれぞれHL−60、血液サンプル1、4をそれぞれタイピングした結果を示したものであり、4はポジティブコントロールを示したものである。図5よりELISAポジティブコントロールの値をカットオフとして、各サンプルのCYP2C19の636塩基目のalleleは各ゲノムDNAのallele通りにタイピングされた。
実施例3
ヒトCYP1A1 3’−franking regionにおけるSmaI多型(T6235C)のタイピングを行った。
ヒトCYP1A1の6235番目の塩基のalleleがそれぞれC、Tである場合を、それぞれ特異的に検出するプライマーとして配列番号21、22記載のヌクレオチドを合成した。これらヌクレオチドをアンチセンスプライマー、5’末端がビオチン化されたものを1%含有する配列番号23記載のプライマーをセンスプライマーとして用いて次のような反応を行った。上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(センス方向とアンチセンス方向プライマー)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、CYP1A1の6325番目の塩基のalleleがそれぞれ(C/C)、(T/T)である事をPCR−RFLPで確認したゲノムDNAそれぞれ100ngを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、53℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、14U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は60℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図6に示した。図6の電気泳動パターンにおいて、ヌクレオチドとして、レーン1、2、5、6は配列番号21のヌクレオチド、レーン3、4、7、8は配列番号22のヌクレオチドを用いた場合である。また、レーン1〜4はCYP1A1の6235番目の塩基のalleleが(C/C)、レーン5〜8は(T/T)であるゲノムDNAをテンプレートとしてそれぞれ用いた場合である。これらの結果より、各ヌクレオチドによりallele特異的な検出が行えることが分かった。
上記の反応産物を用いELISAによる検出を行った。上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.017N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5’末端FITC標識化した配列番号24記載のDNAプローブ5pmolを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図7に示した。図7のELISA結果において、1、2、5、6は配列番号21のヌクレオチド、3、4、7、8は配列番号22のヌクレオチドを用いた場合である。また、1〜4はCYP1A1の6235番目の塩基のalleleが(C/C)、レーン5〜8は(T/T)であるゲノムDNAをテンプレートとしてそれぞれ用いた場合である。図7より吸光度450nmの値1をカットオフ値として、各ゲノムDNAのallele通りにタイピング可能であった。
実施例4
ヒトALDH2(Aldehyde dehydrogenase 2)における一塩基多型(エクソン12、487Glu→Lys)のタイピングを行った。
ヒトALDH2のエクソン12に存在する一塩基多型の各alleleがそれぞれG、Aである場合を、特異的に検出するプライマーとして配列表の配列番号25、26記載の塩基配列を有するヌクレオチドを合成した。これらヌクレオチドをアンチセンスプライマー、5’末端がビオチン化されたものを0.5%含有する配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマーをセンスプライマーとして用いて次のような反応を行った。上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(センス方向とアンチセンス方向プライマー)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、ALDH2のエクソン12の一塩基多型のalleleがそれぞれ(G/G)、(A/A)、(G/A)である事を確認したゲノムDNAそれぞれ100ngを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、54℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、14U Afu RNaseHII、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は54℃、1時間保持した。得られた反応産物を用いELISAによる検出を行った。上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5’末端FITC標識化した配列表の配列番号28記載のDNAプローブ5pmolを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォシングバッファー360μlで、各ウェルを4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図8に示した。図8は、ELISAの結果を示すグラフであり、縦軸は、ELISAにおける吸光度を示し、横軸は、サンプル番号を示す。横軸の番号1、3、5は配列表の配列番号25の塩基配列を有しALDH2のエキソン12の一塩基多型がGである場合を検出する(活性型検出用)ヌクレオチド、2、4,6は配列表の配列番号26の塩基配列を有しALDH2のエキソン12の一塩基多型がAである場合を検出する(失活型検出用)ヌクレオチドを用いた場合である。また、1、2はALDH2のエクソン12の一塩基多型が(G/G)、レーン3,4は(G/A)、レーン5,6(A/A)であるゲノムDNAをテンプレートとしてそれぞれ用いた場合である。図8に示したように吸光度450nmの値1をカットオフ値として、各ゲノムDNAのallele通りにタイピング可能であった。すなわち、本発明の方法によりヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ2の多型を正確に検出できることを確認した。
実施例5
(1)プライマーおよびプローブの合成
ヒトglutathione−S−transferase T1(GSTT1)遺伝子(GenBank Accession No.AB057594)の塩基配列に従って、3’末端の3残基をRNAにしたICAN反応による検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし合成した。すなわち、配列表の配列番号29および30で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGST1−F、GST1−Rをそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGST1−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGST1−Rはアンチセンス方向のプライマーである。また、GST1−Fの5’末端をビオチン化した、配列表の配列番号31で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGST1−F−bioを合成した。GST1−FとGST1−F−bioは49:1の割合で混合し反応に供した(以下GST1−F−mixと称す)。さらに、ELISAによるICAN反応増幅産物検出のための5’末端をFITC化した、配列表の配列番号32で示されるオリゴヌクレオチドプローブGST1−Dを合成した。GST1−Dはアンチセンス方向のプローブである。
一方、PCR反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーもデザインし合成した。すなわち、配列表の配列番号33および34で示されるオリゴヌクレオチドプライマーGST1−PCR−F、GST1−PCR−Rをそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドGST1−PCR−Fはセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドGST1−PCR−Rはアンチセンス方向のプライマーである。
(2)ICAN反応によるGSTT1遺伝子の検出
上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマー(GST1−F−mixとGST1−R)と1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、実施例1−(1)で調製した各検体ゲノムDNA溶液1μlを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、58℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mM dNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルプミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8Uの Afu RNaseHII(タカラバイオ社製)、5.5U BcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は58℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液5μlを3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、検体1、2、4、5、6由来ゲノムDNAを用いた場合にGSTT1遺伝子由来の増幅産物が確認でき、これら検体はGSTT1遺伝子を保持していることが確認できた。この結果を図9に示す。すなわち、図9はICAN反応産物のアガロース電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No1、2、3、4、5、6、7を示す。
一方、同じ各検体ゲノムDNA溶液1μlを用いてPCR法によりGSTT1遺伝子の検出を行った。GST1−PCR−F、GST1−PCR−Rの各プライマーを用いてPCR反応を行い、該反応液を3.0%アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、検体1、2、4、5、6由来ゲノムDNAを用いた場合にGSTT1遺伝子由来の増幅産物が確認できた。この結果を図10に示す。すなわち、図10はPCR反応産物のアガロース電気泳動パターンを示す図であり、レーン1、2、3、4、5、6、7はそれぞれ検体No1、2、3、4、5、6、7を示す。以上よりICAN法による結果とPCR法による結果が一致した。
(3)ICAN増幅産物のELISA法を用いた検出
上記実施例5−(2)で得られた各反応産物5μlを、ハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02N NaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmol GST1−Dプローブを含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で15分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォシングバッファー360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories社製)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlを、TMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。2以上の吸光度を示すものをGSTT1遺伝子ポジティブと判定した。
その結果検体1、2、4、5、6由来ゲノムDNAからのICAN反応産物がGSTT1遺伝子ポジティブと判定でき、電気泳動による判定と同様の結果が得られた。これを図11に示す。すなわち、図11はELISAの結果をグラフにしたものであり、横軸に各検体No.を、縦軸に450nmの吸光度を示す。
実施例6
(1)プライマーおよびプローブの合成
本発明のヒトの遺伝子タイピングにおいて使用するインターナルポジティブコントロールについて検討した。上記インターナルコントロール用ICANプライマーは、以下のようにして構築した。
ヒトのβ−globin遺伝子(GenBank Accession No.AF007546)の塩基配列に従って、3’末端の3残基をRNAにしたICAN反応用オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。すなわち、配列表の配列番号35、36、37、38、39で示されるオリゴヌクレオチドプライマーβG−F1、βG−R1、βG−F2、βG−R2、βG−R3をそれぞれ合成した。オリゴヌクレオチドプライマーβG−F1、βG−F2はセンス方向のプライマー、βG−R1、βG−R2、βG−R3はアンチセンス方向のプライマーである。また、βG−F1、βG−R2およびβG−R3の5’末端をそれぞれビオチン化した、配列表の配列番号40、41、42で示されるオリゴヌクレオチドプライマーβG−F1−Bio、βG−R2−BioおよびβG−R3−Bioを合成した。βG−F1とβG−F1−Bio、βG−R2とβG−R2−BioおよびβG−R3とβG−R3−Bioはそれぞれ49:1の割合で混合し、反応に供した(以下、それぞれβG−F1−mix、βG−R2−mixおよびβG−R3−mixと称す)。更に、ELISAによるICAN反応産物検出のための5’末端をFITC化した、配列番号表の配列番号43、44で示されるオリゴヌクレオチドプローブβG−D1、βG−D2を合成した。
(2)ICANのよるβ−globinの検出
ICAN反応のためのプライマーの組み合わせとして、βG−F1−mixとβG−R1(プライマーセット1)、βG−F2とβG−R2−mix(プライマーセット2)、βG−F2とβG−R3−mix(プライマーセット3)を用いて以下の反応を行った。上記各50pmolの合成オリゴヌクレオチドプライマーと1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、HL−60のゲノムDNA(100ng、10ng、1ng、0ng)を含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、56℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mMのdNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mMの酢酸カリウム、5mMの酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8UのAfu RNaseHII、5.5UのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は56℃、1時間保持した。
反応終了後、上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウオッシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。次に、各ウェルに50μlの0.02NのNaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmolのβG−D1(プライマーセット1を用いた場合)またはβG−D2(プライマーセット2、3を用いた場合)を含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォッシングバッファー360μlで2回洗浄した。各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、ウォッシングバッファーで、各ウェルを360μlで4回洗浄した。
洗浄後、各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。その結果を図12〜14に示す。すなわち、図12、13、14はそれぞれプライマーセット1、2、3を用いた場合のELISA結果を示したものであり、横軸にHL−60ゲノムDNA濃度、縦軸に450nmの吸光度を示す。
図12〜14に示したように、プライマーセット1、2および3を用いた、いずれの場合にも、HL−60ゲノムDNAからのβ−globin遺伝子の検出が可能であった。
(3)マルチプレックスICAN
上記(2)で検討したβ−globin遺伝子をインターナルポジティブコントロールとした、マルチプレックスICAN反応によるGSTM1、GSTT1の遺伝子タイピング反応を行った。反応は以下のようにして行った。
すなわち、GSTM1タイピング反応用のオリゴヌクレチドプライマーとして実施例1記載のGS−FおよびGS−R−mix、GSTT1タイピング反応用のオリゴヌクレチドプライマーとして実施例5記載のGST1−F−mixおよびGST1−Rを用いた。各25pmolの上記タイピング用プライマーおよびβ−globin遺伝子検出用のプライマーセット1または2と、1μlの0.05%プロピレンジアミン水溶液、検体(検体1(GSTM1、GSTT1ともに欠失無し)、検体2(GSTM1、GSTT1ともに欠失))ゲノムDNA100ngを含む全量5μlの反応液をサーマルサイクラーパーソナル(タカラバイオ社製)で98℃で2分間の後、56℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に0.625mMのdNTP混合液、40mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、125mMの酢酸カリウム、5mMの酢酸マグネシウム、0.0125%ウシ血清アルブミン、1.25%ジメチルスルホキシド、13.8UのAfu RNaseHII、5.5UのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および滅菌水を含む全液量20μlを添加し、最終容量を25μlとした。該反応液は56℃、1時間保持した。
反応終了後、上記反応産物5μlをハイブリダイゼーションバッファー(5×SSC、1%Triton−X100、1%BSA)50μlをあらかじめ分注したavidinプレート(Labsystems社製)の各ウェルに添加した。室温で15分反応後、反応液を捨て各ウェルをウォッシングバッファー(25mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05%Tween20)360μlで1回洗浄した。各ウェルに50μlの0.02NのNaOH溶液を添加し、室温で3分反応した後、5pmolのGS−D(GSTM1の検出の場合)、GST1−D(GSTT1の検出の場合)、βG−D1(プライマーセット1を用いた場合)またはβG−D2(プライマーセット2を用いた場合)を含有するハイブリダイゼーションバッファー100μlを各ウェルに添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォッシングバッファー360μlで2回洗浄した。
洗浄後、各ウェルにPOD標識抗FITC抗体を含むハイブリダイゼーションバッファー100μlを添加した。室温で20分反応した後、反応液を捨て、各ウェルをウォッシングバッファー360μlで4回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(BioFX Laboratories)100μlを添加し、室温で10分反応した後、1N硫酸100μlをTMB溶液を添加した順に添加した。各ウェルの吸光度(450nm)をプレートリーダで測定した。
その結果を図15、16、17、18に示す。すなわち、図15、16はいずれもGSTM1のタイピング結果を示したものであり、それぞれβ−globin遺伝子検出用プライマーセット1、2を用いた場合である。また、図17、18はいずれもGSTT1のタイピング結果を示したものであり、それぞれβ−globin遺伝子検出用プライマーセット1、2を用いた場合である。各図において横軸は検体番号、縦軸は450nmの吸光度を示す。また図15及び16において濃色の棒グラフはGSTM1のタイピング結果を淡色の棒グラフはβ−グロビン遺伝子の検出結果を示す。同様に図17及び18において濃色の棒グラフはGSTT1のタイピング結果を淡色の棒グラフはβ−グロビン遺伝子の検出結果を示す。
図15〜18に示したようにβ−globin遺伝子をインターナルポジティブコントロールとした、マルチプレックスICAN反応によるGSTM1、GSTT1の遺伝子タイピング反応が可能であることを確認した。
実施例7
本発明の方法で使用するためのキットを構築した。また、アルカリ変性処理を組み合わせたICAN及び/又はUCANによるヒト遺伝子多型のタイピング方法について検討した。
(1)ALDH2遺伝子多型のタイピング用キットの構築並びに該キットを用いたタイピング
ALDH2の一塩基多型タイピング反応を以下のように行った。まず、次のような試薬(16反応分)を調製した。
試薬▲1▼:配列表の配列番号25に記載の塩基配列を有するヌクレオチドおよび配列表の配列番号27に記載の塩基配列を有し、該5’末端がビオチン化されたものを0.5%含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー各50μMを含む0.1MのHepes溶液(80μl)。
試薬▲2▼:配列表の配列番号26に記載の塩基配列を有するヌクレオチドおよび配列表の配列番号27に記載の塩基配列を有し、該5’末端がビオチン化されたものを0.5%含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー各50μMを含む0.1MのHepes溶液(80μl)。
試薬▲3▼:32mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、100mM KOAc、4mM Mg(OAc)2、2.5mM dNTP混合液、0.05%ウシ血清アルブンミン、2.8U/μl Afu RNaseHII、1.1U/μlのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を含む溶液(80μl)。
試薬▲4▼:14mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、200mM KOAc、8mM Mg(OAc)2、2.5%ジメチルスルホキシドを含む溶液(160μl)。
上記の試薬を用いて以下の操作を行った。すなわち、ALDH2のエクソン12の一塩基多型のalleleがそれぞれ(G/G)、(G/A)、(A/A)である事を確認したゲノムDNAそれぞれ40ng/μlの溶液に、等量の0.1N NaOHを添加し、室温で5分放置した(サンプル溶液)。上記サンプル溶液のそれぞれ5μlを、試薬▲1▼もしくは試薬▲2▼各5μlに添加した。この溶液にさらに試薬▲3▼5μlに試薬▲4▼10μlの割合で混合した反応ミックス15μlを添加し、54℃、1時間保持した。得られた反応産物を、実施例4と同様の方法で検出した。その結果を図19に示す。
図19は、本発明のキットを用いたヒトALDH2遺伝子多型のELISA検出結果をグラフにしたものであり、横軸に試料No.を、縦軸に450nmの吸光度を示す。図中レーン1、3、5は配列番号25のヌクレオチドを、レーン2、4,6は配列番号26のヌクレオチドを用いた場合である。さらに、レーン1及び2はALDH2遺伝子のエクソン12の一塩基多型が(G/G)型、レーン3及び4は(G/A)型、レーン5及び6(A/A)型であるゲノムDNAを鋳型となる核酸としてそれぞれ用いた場合である。図19に示したように、吸光度450nmの値1をカットオフ値として、各ゲノムDNAのallele通りにタイピング可能であった。すなわち、本発明のキットが遺伝子多型のタイピング方法に使用できることを確認した。また、本発明の方法においてアルカリ変性処理を組み合わせてもよいことが確認できた。
(2)GSTM1の欠失多型タイピング用キットの構築並びに該キットを用いたタイピング
GSTM1の欠失多型タイピング反応を以下のように行った。まず、次のような試薬(32反応分)を調製した。
試薬▲1▼:実施例1記載のGS−FおよびGS−R−mixのオリゴヌクレチドプライマー各25μM、並びに実施例6−(2)記載のβ−globin遺伝子検出用のプライマーセット1のオリゴヌクレオチドプライマー各25μMを含む0.1MのHepes溶液(160μl)。
試薬▲2▼:32mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、100mM KOAc、4mM Mg(OAc)2、2.5mM dNTP混合液、0.05%ウシ血清アルブンミン、2.8U/μl Afu RNaseHII、1.1U/μlのBcaBest DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を含む溶液(160μl)。
試薬▲3▼:14mM Hepes−KOH緩衝溶液(pH7.8)、200mM KOAc、8mM Mg(OAc)2、2.5%ジメチルスルホキシドを含む溶液(320μl)。
上記の試薬を用いて以下の操作を行った。検体(検体1:GSTM1欠失無し、検体2:GSTM1欠失あり)のゲノムDNAそれぞれ40ng/μlの溶液に、等量の0.1N NaOHを添加し、室温で5分放置した(サンプル溶液)。上記サンプル溶液のそれぞれ5μlを、試薬▲1▼5μlに添加した。この溶液に試薬▲2▼5μlに試薬▲3▼10μlの割合で混合した反応ミックス15μlを添加し、56℃、1時間保持した。得られた反応産物を、実施例6−(3)と同様の方法で検出した。その結果を図20に示す。
図20は、本発明のキットを用いたヒトGSTM1遺伝子多型のELISA検出結果をグラフにしたものであり、横軸に試料No.を、縦軸に450nmの吸光度を示す。図中濃色棒グラフは、GSTM1の検出結果を、淡色棒グラフはβ−globinの検出結果を示す。図20に示したように、上記条件を用いてもβ−globin遺伝子をインターナルポジティブコントロールとしたマルチプレックスICAN反応によるGSTM1の遺伝子タイピングが可能であった。すなわち、本発明のキットが遺伝子多型のタイピング方法に使用できることを確認した。また、検出の対象が変わってもアルカリ変性処理を組み合わせることができることを確認した。
(3)GSTT1の欠失多型タイピング用キットの構築と該キットを用いたタイピング
GSTT1を検出対象とした場合について上記(2)と同様にして検討した。すなわち、実施例5記載のオリゴヌクレチドプライマー、GST1−F−mixおよびGST1−R以外は、上記(2)と同じ組成の試薬を調製した。該試薬について、上記のGSTM1と同様にタイピングを行ったところ、タイピング可能であった。すなわち、本発明のキットが遺伝子多型のタイピング方法に使用できることを確認した。また、いずれの場合においてもアルカリ変性処理を組み合わせることができることを確認した。
産業上の利用の可能性
上記の、本発明のヌクレオチド、ならびに該ヌクレオチドを使用する塩基置換及び挿入変異、欠失変異の検出方法は、天然に存在する、あるいは人為的に導入された塩基置換及び挿入変異、欠失変異の検出に有用である。
本発明によれば、標的核酸上の塩基置換及び挿入変異、欠失変異の有無を簡便、かつ再現性よく検出することができる。本発明の方法は公知の核酸増幅方法と容易に組み合せることができ、高感度に塩基置換及び挿入変異、欠失変異を検出することが可能である。さらに、適切な配列のヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、塩基置換及び挿入変異、欠失変異の有無と同時にどのような置換、挿入、欠失が起こっているかを知ることもできる。
本発明は、多型やバリエーションのような生物のゲノムDNA上に生じた塩基置換及び挿入変異、欠失変異、例えばSNPの検出、同定に使用することができ、ヒトにおける疾患遺伝子の検索、薬剤感受性の解析など、ゲノム創薬、ゲノム医療の分野においても有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図2 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図3 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図4 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す写真である。
図5 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示すグラフである。
図6 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す写真である。
図7 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
図8 本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
図9 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図10 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す写真である。
図11 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図12 本発明の検出方法による、ヒトβ−グロビン遺伝子の検出の結果を示すグラフである。
図13 本発明の検出方法による、ヒトβ−グロビン遺伝子の検出の結果を示す図である。
図14 本発明の検出方法による、ヒトβ−グロビン遺伝子の検出の結果を示す図である。
図15 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図16 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図17 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図18 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
図19 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子多型のタイピング結果を示す図である。
図20 本発明の検出方法による、ヒト遺伝子上の欠失変異の検出の結果を示す図である。
Claims (32)
- ヒトチトクローム遺伝子のCYP 2C19遺伝子のG636A、あるいはCYP 1A1遺伝子のT6235Cの遺伝子多型をタイピングする方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)ヒトチトクローム遺伝子上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、ヒトチトクローム遺伝子上の特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とするヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法。 - ヌクレオチドが、配列表の配列番号14、15、21又は22記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項1記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- さらに、配列表の配列番号16又は23記載の塩基配列を有するプライマーを使用することを特徴とする請求項1記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- さらに、工程(2)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことを特徴とする請求項1記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 配列表の配列番号20あるいは24記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることを特徴とする請求項4記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 請求項1記載のヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、配列表の配列番号14、15、21又は22記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とするヒトチトクローム遺伝子の遺伝子多型のタイピング用キット。
- さらに配列表の配列番号16又は23記載の塩基配列を有するプライマーを含有する請求項6記載のキット。
- さらに配列表の配列番号20あるいは24記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有することを特徴とする請求項7記載のキット。
- ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の多型をタイピングする方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とするヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の多型のタイピング方法。 - ヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子がGSTM1遺伝子およびGSTT1遺伝子から選択されるものである請求項9記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 配列表の配列番号6〜8又は29〜31記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーから選択されるプライマーを使用することを特徴とする請求項9記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- さらに、工程(b)により増幅された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことを特徴とする請求項9記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 配列表の配列番号9又は32記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることを特徴とする請求項12記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 請求項9記載のヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の多型のタイピング方法のためのキットであって、
配列表の配列番号6〜8又は29〜31記載の塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とするヒトグルタチオン−S−トランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピング用キット。 - さらに配列表の配列番号9又は32記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有することを特徴とする請求項14記載のキット。
- ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のALDH2遺伝子のGlu487Lysの遺伝子多型をタイピングする方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子上の特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とするヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子上の遺伝子多型のタイピング方法。 - ヌクレオチドが、配列表の配列番号25又は26記載の塩基配列あるいは該配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項16記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- さらに配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマーを用いることを特徴とする請求項16記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- さらに、工程(2)により伸長された核酸を、該核酸に厳密な条件下でハイブリダイズ可能なプローブを用いて検出する工程を含むことを特徴とする請求項16記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 配列表の配列番号28記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを用いることを特徴とする請求項19記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 請求項16記載のヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピング方法のためのキットであって、
配列表の配列番号25〜26記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを含有することを特徴とするヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子多型のタイピング用キット。 - さらに配列表の配列番号27記載の塩基配列を有するプライマーを用いることを特徴とする請求項21記載のキット。
- さらに配列表の配列番号28記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブを含有することを特徴とする請求項21記載のキット。
- 複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法。 - 複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも2種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法。 - 複数の標的となる核酸を同時に検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法であって、
(A)少なくとも1つの標的となる核酸を、
(1)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のヌクレオチド、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで当該ヌクレオチドは、
(a)その3’末端が当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
(b)複数の標的となる核酸の特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており;
(2)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、前記特定の塩基を含む任意の鎖長の領域を伸長する工程、を包含する方法で検出し、(B)さらに上記(A)とは異なる別の標的となる核酸を、
(a)鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、少なくとも1種類のプライマー、およびRNaseHを混合して反応混合物を調製する工程;ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの3’末端又は3’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり;および、
(b)反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートし、標的核酸を増幅する工程、
を包含する方法で検出することを特徴とする遺伝子多型のタイピング方法。 - 標的となる核酸の少なくとも一つが内部標準となる核酸であることを特徴とする請求項24〜26のいずれか1項に記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを用いて内部標準となる核酸を検出することを特徴とする請求項27記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを用いて内部標準となる核酸を検出することを特徴とする請求項28記載の遺伝子多型のタイピング方法。
- 請求項24〜26記載の遺伝子多型のタイピング方法のためのキット。
- 配列表の配列番号35〜42記載の塩基配列を有するプライマー群から選択される少なくとも2つのプライマーを含有することを特徴とする請求項30記載のキット。
- さらに配列表の配列番号43〜44記載の塩基配列あるいは該塩基配列に相補的な塩基配列のいずれかから選択される塩基配列を有するプローブを含有することを特徴とする請求項31記載のキット。
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