JP4453910B2 - 遺伝子多型の検出方法 - Google Patents
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本発明の課題を解決手段としては具体的には、
(1) 以下の(a)及び(b)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
(2) 以下の(a)及び(b)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
(3) 以下の(a)乃至(d)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(b)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(c)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(d)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(4) 以下の(a)乃至(d)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(b)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(c)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(d)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(5) 18乃至25塩基長からなることを特徴とする、(1)乃至(4)のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩、
(6) (1)乃至(5)のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型の検出方法、
(7) (1)乃至(5)のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法、
(8) 以下の工程(a)及び(b)を含む、遺伝子多型の検出方法:
(a)遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、(1)乃至(5)のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってPCRで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行う工程;
(b)工程(a)によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型の有無を判定する工程、
(9) 以下の工程(a)及び(b)を含む、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法:
(a)遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、(1)乃至(5)のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってPCRで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行う工程;
(b)工程(a)によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型部位のヌクレオチド配列を決定する工程、
(10) 反応産物の生成の有無の検出に、電気泳動、TaqMan PCR及びMALDI−TOF/MS法からなる群から選択される少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする(8)又は(9)に記載の方法、
(11) 遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、(6)乃至(10)のいずれか1項に記載の方法、
(12) 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液、
(13) 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液、
(14) 以下の(a)乃至(e)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(c)(a)又は(b)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(d)DNAポリメラーゼ;
(e)PCR緩衝液、
(15) 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)以下の(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液、
(16) 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩;
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液、
(17) 以下の(a)乃至(e)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)以下の(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩;
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩;
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
(c)(a)又は(b)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(d)DNAポリメラーゼ;
(e)PCR緩衝液、
(18) オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチドの塩基長が18乃至25塩基長であることを特徴とする、(12)乃至(17)のいずれか1項に記載の遺伝子多型検出用キット、
(19) 遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、(12)乃至(18)のいずれか1項に記載のキット、
からなる。
本明細書中において「遺伝子多型」とは、ある遺伝子座において、(a)1個の塩基が他の塩基に置き換わっているもの(一塩基多型(SNP))及び/又は(b)1から数十塩基(数千塩基のこともある)が欠失や挿入をしているもの(挿入/欠失多型)を意味する。本明細書において、一塩基多型とはSNP(single nucleotide polymorphism)ともいい、個人間におけるヌクレオチド配列中の一塩基の違いをいう。
天然型のヌクレオチドの構造式を以下に示す。
2.検体
本発明で遺伝子多型を検出する対象となる検体としては、核酸を含む試料を用いることができる。核酸としては一例として、ゲノムDNAを挙げることができるが、これに限定されない。
3.対象遺伝子の選択
遺伝子多型を検出する対象となる遺伝子は、少なくとも一部のヌクレオチド配列が既に知られており、その部分に多型が存在するものであればいずれでもよい。そのような遺伝子の一例として、薬効や薬の副作用に関与する薬物代謝遺伝子である、シトクロムP4501A2、シトクロムP4502A6、シトクロムP4502C9、シトクロムP4502C19,シトクロムP4502D6、シトクロムP4502E1などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、N−アセチルトランスフェラーゼ、UDP−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンS−トランスフェラーゼや、疾患との関連遺伝子として、潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのHLA、慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのTCRα、アルツハイマー病の原因遺伝子としてのAPOE4、精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンD3受容体、躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子VII及び肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどを挙げることができる。その他、human prothrombin等を挙げることもできる。
4.オリゴヌクレオチドプライマー
以下のオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機を用いて合成することができる。
(1)−1 本発明で用いる遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドとしては、以下の(a)及び(b)を挙げることができる。
以下の(i)乃至(iii)の特徴を有する;
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(ii) 3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
(iii)オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは15〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜35ヌクレオチド、更に好ましくは18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(ii) 3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
(iii)オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは15〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜35ヌクレオチド、更に好ましくは18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
以下の(i)乃至(v)の特徴を有する;
(i) オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは15〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜35ヌクレオチド、更に好ましくは18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
以下の(i)乃至(v)の特徴を有する;
(i) オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは15〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜35ヌクレオチド、更に好ましくは18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
このような特徴を有するオリゴヌクレオチドを、以下、「P−PRIMER」と呼ぶことにする。
(a)PCR用オリゴヌクレオチド
PCRにおいて上記(1)に記載の(a)乃至(d)のいずれかのオリゴヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、遺伝子多型を検出する対象となる遺伝子のヌクレオチド配列において、上記(1)の(a)乃至(d)のいずれかの遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドと対になってPCRによって対象の遺伝子中の目的の配列を増幅できる限りにおいて特に制限されないが、具体的には相補鎖にあたる配列中の最も5’末端側の位置よりもさらに5’末端側領域に存在する相補鎖の配列中の連続した15〜40ヌクレオチド、好ましくは18乃至35ヌクレオチド、更に好ましくは18乃至25ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドに互いに相補的な配列が存在すると、お互いにアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的な遺伝子多型の検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたオリゴヌクレオチド及び対になるオリゴヌクレオチドの設計を行うことが好ましい。
TaqMan PCRで用いる遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド(TaqManプローブ)は5’末端はFAMやVICなどの蛍光レポーター色素によって標識されており、同時に3’末端はクエンチャーで標識されており〔ジェネティク・アナリシス(Genet. Anal.), 14, p143-149 (1999), ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J. Clin. Microbiol.), 34, p2933-2936 (1996)〕。
5.遺伝子多型の検出方法
A.PCRによる遺伝子多型の検出
(1)PCR
上記「4.オリゴヌクレオチドプライマー」の項の「(1)遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド」の項目で設計した(a)乃至(d)のいずれかの遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチド及び該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとを用いたPCR反応を行うことにより、対象遺伝子の所定の位置の多型を検出することができる。ここでPCRは(i) 「X−PRIMER」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、(ii) 「Y−PRIMER」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、(iii) 「N−PRIMER」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、(iv) 「P−PRIMER」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、(v) (i)と(ii)の組み合わせ、(vi) (iii)と(iv)の組み合わせのいずれかの組み合わせで行うことができる。
核酸合成酵素としては、鋳型の核酸の種類に応じて、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素(reverse transcriptase)から適宜選択して用いることができる。ここで、DNAポリメラーゼとしては、例えば、Thermus aquaticus由来のTaq DNAポリメラーゼ、Thermus thermophilus由来のTth DNAポリメラーゼ、Pyrococcus由来のKOD、PfuあるいはPwoDNAポリメラーゼ、あるいは前記の耐熱性ポリメラーゼの混合等があるが、これらにのみ限定されるものではない。なおTth DNAポリメラーゼはRT活性も有しているため、RT-PCRをOne tube-One stepで行うときに、1種類の酵素で賄うことが出来る特徴を有している。逆転写酵素は、RNAをcDNAに逆転写出来る酵素を意味する。逆転写酵素としては、Rous associated virus(RAV)やAvian myeloblastosis virus(AMV)等のトリのレトロウイルス由来の逆転写酵素、Moloney murine leukemia virus(MMLV)等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素あるいは前記のTth DNAポリメラーゼ等があるが、これらにのみ限定されるものではない。
PCR反応は例えば、以下のとおりである。
塩化マグネシウム 2乃至2.5mM(好ましくは2.5mM);
1×PCR緩衝液(10mM トリス−塩酸(25℃におけるpH8.3乃至9.0(好ましくは8.3))、50mM 塩化カリウム;
dNTPs 0.2乃至0.25mM(好ましくは0.25mM);
遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド及び該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチド 0.2乃至0.5μM(好ましくは0.2μM);
Taqポリメラーゼ 1乃至2.5単位(好ましくは2.5単位);
滅菌水を加えて全量を80μlに調整し、その全量を、逆転写反応を終了した反応液全量に加えてからPCRを開始する。
反応温度条件: まず94℃で2分間加熱した後、90乃至95℃(好ましくは94℃)で30秒間、40乃至65℃(好ましくは、プライマーの特性から算出される解離温度(Tm)からそれより20度低い温度までの範囲内で30秒間、70乃至75℃(好ましくは72℃)で1.5分間の温度サイクルを28乃至50サイクル(好ましくは30サイクル)繰り返してから、4℃に冷却する。
PCR終了後、反応液を電気泳動し、目的配列の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。
X−PRIMER及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはX−PRIMERの3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、多型はないと判定することができる。
Y−PRIMERと該該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはY−PRIMERの3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
X−PRIMERと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認でき、Y−PRIMERと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型はないと判定することができる。
「N−PRIMER」及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「N−PRIMER」の3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、多型はないと判定することができる。
「P−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「P−PRIMER」の3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
「N−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認でき、「P−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型はないと判定することができる。
上記、「A.」の項目において遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチドと上記「4.」の項目に記載のTaqManプローブを用い、ABI社ABI PRISM等を用い、その添付プロトコールに従ってTaqMan PCRを行うことによって遺伝子多型を検出することができる。
「X−PRIMER」とTaqManプローブとの組み合わせによるTaqMan PCRによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはX−PRIMERの3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型はないと判定することができる。
Y−PRIMERとTaqManプローブとの組み合わせによるPCRによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドはY−PRIMERの3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
X−PRIMERとTaqManプローブとの組み合わせによるPCRによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認でき、Y−PRIMERとTaqManプローブとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
「N−PRIMER」とTaqManプローブとの組み合わせによるTaqMan PCRによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「N−PRIMER」の3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型はないと判定することができる。
「P−PRIMER」とTaqManプローブとの組み合わせによるPCRによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレオチドは「P−PRIMER」の3’末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判定することができる。
「N−PRIMER」とTaqManプローブとの組み合わせによるPCRによって蛍光強度の増加によって目的とする配列の増幅が確認でき、「P−PRIMER」とTaqManプローブとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できない場合には、遺伝子多型を有さないと判定することができる。
MALDI−TOF/MS法による多型の検出法(「SNP遺伝子多型の戦略」(中村祐輔編), 中山書店, 東京, (2000)、p.106−117)に記載の方法を一部改変することによって遺伝子多型を検出することができる。以下、具体的に説明する。
6.遺伝子多型の存在状態の確認
本発明の方法によると鋳型となる核酸中の多型がヘテロで存在するかホモで存在するかを判定することができる。具体的には以下の(a)乃至(f)のいずれかの方法によって判定することができる。
「X−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合にホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
Y−PRIMERと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合にホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
X−PRIMERと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認でき、Y−PRIMERと該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによっても目的とする配列の増幅が確認できる場合には、多型はヘテロであると判定することができる。
「N−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合に、ホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
「P−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認できた場合に、ホモであることが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型は基準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
「N−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによって目的とする配列の増幅が確認でき、「P−PRIMER」と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによるPCRによっても目的とする配列の増幅が確認できる場合には、多型はヘテロであると判定することができる。
7.遺伝子多型検出用キット
本発明の方法を行うために使用するプライマー及び試薬類を遺伝子多型検出用キットとして提供することができる。そのようなキットは以下の物を含む。
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液、
(13) 以下のものを含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液。
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(c)(a)又は(b)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(d)DNAポリメラーゼ;
(e)PCR緩衝液。
(a)以下の(i)乃至(v)の特徴を有するオリゴヌクレオチド:
(i) オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは15〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜35ヌクレオチド、更に好ましくは18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液。
(a)以下の特徴を有するオリゴヌクレオチド:
(i) オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる、
(ii) オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さはPCRによって核酸を増幅できる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは15〜40ヌクレオチド、より好ましくは18〜35ヌクレオチド、更に好ましくは18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液。
発明を実施するための最良の形態
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-5Ce2p-Tp-Ctの合成
核酸自動合成機(パーキンエルマー社製 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer)を用い、40 nmolのプログラムで行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。CPGは、約0.1μmol用いた。非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例22(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP、カラム(Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm))、A溶液:5%アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH 7.0、B溶液:アセトニトリル、B%:10%→ 50%(10min, linear gradient);60℃;2 ml/min;254 nm)にて精製し、 ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、TEAAを除いた。80%酢酸水溶液(200μl)を加え、20分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP、カラム(Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm))、A溶液:5%アセトニトリル、0.1M TEAA, pH 7.0、B溶液:25%アセトニトリル, 0.1M TEAA、B%:0%→ 40%(10min, linear gradient);60℃;2 ml/min;254 nm)にて精製し、目的物のピークを集めた。減圧下溶媒を留去後、水1mlに溶かし、(9.4 A260 units)。また、本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6214.11、測定値:6214.62)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-5Ce2p-Tp-Ttの合成
実施例2の化合物は、実施例1と同様に合成した(21 A260 units)。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6229.12、測定値:6229.21)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-5Ce2p-Ap-Ttの合成の合成
実施例3の化合物は、実施例1と同様に合成した(8.9 A260 units)。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8530.67、測定値:8530.75)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-5Ce2p-Ap-Ctの合成の合成
実施例4の化合物は、実施例1と同様に合成した(10.1 A260 units)。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8515.66、測定値:8515.56)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Ct
参考例1の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Tt
参考例2の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Ce2tの合成
参考例3の化合物は、実施例1と同様に合成した(0.3 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例5(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-4-N-ベンゾイルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用い、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6200.08、測定値:6200.25)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Te2tの合成
参考例4の化合物は、実施例1と同様に合成した(0.94 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用い、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6215.09、測定値:6215.06)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Te2p-Ctの合成
参考例5の化合物は、実施例1と同様に合成した(2.28 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6200.08、測定値:6200.26)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Te2p-Ttの合成
参考例6の化合物は、実施例1と同様に合成した(4.98 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6215.09、測定値:6215.26)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Ge2p-Cp-Tp-Ctの合成
参考例7の化合物は、実施例1と同様に合成した(4.32 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例27 (5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6200.08、測定値:6199.95)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Ge2p-Cp-Tp-Ttの合成
参考例8の化合物は、実施例1と同様に合成した(8.0 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例27 (5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6215.09、測定値:6215.06)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Ce1p-Tp-Ctの合成
参考例9の化合物は、実施例1と同様に合成した(13.28 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、文献Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. 記載の5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-メチレン-4-N-ベンゾイルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、の化合物(Ce1p)を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6186.05、測定値:6186.45)。
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Ce1p-Tp-Ttの合成
参考例10の化合物は、実施例1と同様に合成した(8.0 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、文献Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. 記載の5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-メチレン-4-N-ベンゾイルシチジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、の化合物(Ce1p)を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:6201.07、測定値:6201.14)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Ttの合成
参考例11の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Ctの合成
参考例12の化合物は、核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Te2tの合成
参考例13の化合物は、実施例1と同様に合成した(7.8 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例9(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-5-メチルウリジン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用い、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8516.64、測定値:8515.88)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-5Ce2tの合成
参考例14の化合物は、実施例1と同様に合成した(7.4 A260 units)。但し、固相担体は、universal-Q 500 CPG(Glen Research製) 約0.1μmolを用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8516.66、測定値:8516.00)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Ttの合成
参考例15の化合物は、実施例1と同様に合成した(8.4 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8516.64、測定値:8516.32)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Ctの合成
参考例16の化合物は、実施例1と同様に合成した(7.9 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8501.63、測定値:8500.70)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Cp-Ap-Ttの合成
参考例17の化合物は、実施例1と同様に合成した(9.7 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8516.64、測定値:8517.14)。
HO-Ap-Tp-Cp-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Tp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ap-Cp-Ae2p-Cp-Ap-Ctの合成
参考例18の化合物は、実施例1と同様に合成した(7.2 A260 units)。但し、非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例14(5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-6-N-ベンゾイルアデノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。本化合物は、負イオンESI質量分析により同定した(計算値:8501.63、測定値:8501.65)。
human prothrombin gene (coagulation factor II), GenBank accession No. M17262)のSNP(F2 20210G-A)の検出のために、Reverse primer, Human DNAは、Proligo社のTrueSNP Demo Kitを同プロトコールに従って調製したものを使用した。Reverse primerのヌクレオチド配列はGenBank accession No.M17262 )のヌクレオチド番号 26588−26605に相当し、以下のとおりである。
5'−GGGTGAAGGCTGTGACCG-3'(配列表の配列番号5)
Forward primerとして実施例1、実施例2、参考例1、参考例2、参考例3、参考例4、参考例5、参考例6、参考例7及び参考例8のいずれかに記載の化合物(1.25 μM) 5 μL、Reverse primer 1.3μL、Premix Taq(宝酒造製)12.5 μL、Human DNA溶液1 μL、滅菌水5.2 μLを含む溶液をTakara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使って、PCR反応(Hot Start法)を行った。反応サイクルは、94℃ 10分間の処理の後、94℃ 1分、63℃ 1分、72℃ 1分、の反応を31サイクル繰り返した。反応後、反応液5 μLに1 μLのloading solutionを加え、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(1xTBE, 200V定電圧, 約1時間)を行い、SYBR Green I (Cambrex社製)で染色後、Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio-Rad)を用いバンドを可視化し、Quantity One software (Bio-Rad)を使って定量した。
(1)マウスゲノムDNAの調製
マウスAKR strain、KKマウスNga strain及び KKマウスSnk strainのマウス(4週齢)より採取した尾(1.5cm)を840μlの溶解液(720μlの1×SSC、80μlの10% SDS、40μlの10mg/ml プロテイナーゼKを含む)に浸漬し、50℃で保温しながら一晩振盪した。次いで、1mg/ml リボヌクレアーゼAを20μl加えて、50℃で1時間保温した。その後、フェノール・クロロホルム抽出を2回、エタノール沈殿操作を1回行い、沈殿を10mM トリス−塩酸(pH7.5)、1mM EDTAを含む緩衝液150μlに溶解した。溶液を分光光度計(U−3000、(株)日立製作所製)で260nm波長における吸光度を測定し、滅菌水を加えて濃度を25ng/μlに調整してゲノムDNA試料とした。
Angiopoietin-like protein 3遺伝子プロモーター内の多型は、direct sequenceの結果から、図8のような多型を持つ。図8では、マウスKK/Nga strain、KK/Snk strainと比べてマウスAKR strainでは「:」で示す2塩基(CA)が欠失している多型を有することを示している。
PCRにおけるReverse primerは以下の配列:
5’-GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3’(配列表の配列番号6)
(本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60658-60682に相補的な配列である)のものを用いた。Forward primerとして実施例3、実施例4、参考例11、参考例12、参考例13、参考例14、参考例15、参考例16、参考例17及び参考例18のいずれかに記載の化合物(1.25 μM) 5 μL、Reverse primer (1.25 μM) 5μL、Premix Taq(宝酒造製)12.5 μL、ゲノム DNA溶液(100 ng/1μL) 0.125 μL、滅菌水2.38 μLの溶液を、Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使って、PCR反応(Hot Start法)を行った。反応サイクルは、94℃ 10分間の熱処理後、94℃ 分、63℃ 1分、72℃ 1分のサイクルを30サイクル繰り返した。反応後、反応液5 μLに1 μLのloading solutionを加え、10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動(1xTBE, 200V定電圧, 約1時間)を行い、SYBR Green I (Cambrex社製)で染色後、Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio-Rad)を用い可視化した。
マウスAKR strain由来のゲノムDNA(AKR)を鋳型として用いた結果を図9−Aに示す。ENAユニットを3’末端から3番目に導入した実施例3及び4に記載の化合物において、実施例3の化合物をforward primerに用いたものが、選択的に遺伝子(152 bp)を増幅できることがわかった。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-Gt
の合成
核酸自動合成機(パーキンエルマー社製 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer)を用い、40 nmolのプログラムで
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-Gtを合成した(以下、「プライマーA」とする。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。CPGは、約0.1μmol用いた。非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第3420984号の実施例27 (5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O,4’-C-エチレン-2-N-イソブチリルグアノシン-3’-O-(2-シアノエチル N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP、カラム(Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm))、A溶液:5%アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH 7.0、B溶液:アセトニトリル、B%:10%→ 50%(10min, linear gradient);60℃;2 ml/min;254 nm)にて精製し、 ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、TEAAを除いた。80%酢酸水溶液(200μl)を加え、20分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち逆相HPLC(島津製作所製LC−10VP、カラム(Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6×100mm))、A溶液:5%アセトニトリル、0.1M TEAA, pH 7.0、B溶液:25%アセトニトリル, 0.1M TEAA、B%:0%→ 40%(10min, linear gradient);60℃;2 ml/min;254 nm)にて精製し、目的物のピークを集めた。減圧下溶媒を留去後、水1mlに溶かし、MALDI-TOF質量分析により同定した(計算値:7625.0、測定値:7624.1)。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-At
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Tp-At
(以下「プライマーB」とする。)を、実施例5と同様の方法で合成し、MALDI-TOF質量分析により同定した(計算値:7609.0、測定値:7609.2)。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-Gt
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-Gt
(以下、「プライマーC」とする。)を、実施例1と同様の方法で合成し、MALDI-TOF質量分析により同定した(計算値:7650.0、測定値:7649.4)。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-At
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Ge2p-Gp-At(以下、「プライマーD」とする。)を、実施例5と同様の方法により合成し、MALDI-TOF質量分析により同定した(計算値:7634.1、測定値:7634.2)。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Gt
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Gt
(以下、「プライマーE」とする。)を核酸自動合成機を用いて常法により合成した。本化合物(プライマーE)の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがTであって、ヌクレオチド番号 60523のAがGになっている配列であり、配列表の配列番号7に示されている。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Atの合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-At(以下、「プライマーF」とする。)を核酸自動合成機を用いて常法により合成した。本化合物(プライマーF)の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325.14 記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522のCがTになっている配列であり、配列表の配列番号8に示されている。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-Gtの合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-Gt本(以下、「プライマーG」とする。)は核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-At
の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Gp-At本(以下、「プライマーH」とする。)を核酸自動合成機を用いて常法により合成した。
マウスAKR 系統(strain)及びKKマウスNga 系統(strain)由来マウス(4週齢)より採取した尾(1.5cm)を840μlの溶解液(720μlの1×SSC、80μlの10% SDS、40μlの10mg/ml プロテイナーゼKを含む)に浸漬し、50℃で保温しながら一晩振盪した。次いで、1mg/ml リボヌクレアーゼAを20μl加えて、50℃で1時間保温した。その後、フェノール・クロロホルム抽出を2回、エタノール沈殿操作を1回行い、沈殿を10mM トリス−塩酸(pH7.5)、1mM EDTAを含む緩衝液150μlに溶解した。その後、分光光度計(U−3000、(株)日立製作所製)で260nm波長における吸光度を測定し、滅菌水を加えて濃度を25ng/μlに調整してゲノムDNA試料とした。
5’-GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3’(配列表の配列番号6)、
(本化合物の塩基配列は、GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60658-60682に相補的な配列である。)である。
配列番号8:プライマーF
配列番号9:プライマーG
配列番号10:プライマーH
Claims (19)
- 以下の(a)及び(b)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する。 - 以下の(a)及び(b)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する。 - 以下の(a)乃至(d)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(b)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(c)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(d)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。 - 以下の(a)乃至(d)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(b)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(c)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(d)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。 - 18乃至25塩基長からなることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型の検出方法。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法。
- 以下の工程(a)及び(b)を含む、遺伝子多型の検出方法:
(a)遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってPCRで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行う工程;
(b)工程(a)によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型の有無を判定する工程。 - 以下の工程(a)及び(b)を含む、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決定方法:
(a)遺伝子多型部位を含む核酸を鋳型として、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドと対になってPCRで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いてPCRを行う工程;
(b)工程(a)によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型部位のヌクレオチド配列を決定する工程。 - 反応産物の生成の有無の検出に、電気泳動、TaqMan PCR及びMALDI−TOF/MS法からなる群から選択される少なくともいずれか一つを用いることを特徴とする請求項8又は9に記載の方法。
- 遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、請求項6乃至10のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液。 - 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマー;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液。 - 以下の(a)乃至(e)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(b)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなり、3’末端部位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド;
(c)(a)又は(b)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(d)DNAポリメラーゼ;
(e)PCR緩衝液。 - 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)以下の(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩:
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液。 - 以下の(a)乃至(d)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩;
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)(a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(c)DNAポリメラーゼ;
(d)PCR緩衝液。 - 以下の(a)乃至(e)を含む、遺伝子多型検出用キット:
(a)以下の(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩;
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる;
(b)(i)乃至(iv)の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩;
(i)オリゴヌクレオチドの3’末端部位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなる;
(ii)オリゴヌクレオチドの3’末端から2番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として2番目)のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからなる;
(iii)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する;
(iv)オリゴヌクレオチドの3’末端から3番目(3’末端のヌクレオチドを1番目として3番目)のヌクレオチドが2’-O,4’-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
(c)(a)又は(b)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチド;
(d)DNAポリメラーゼ;
(e)PCR緩衝液。 - オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌクレオチドの塩基長が18乃至25塩基長であることを特徴とする、請求項12乃至17のいずれか1項に記載の遺伝子多型検出用キット。
- 遺伝子多型が一塩基多型であることを特徴とする、請求項12乃至18のいずれか1項に記載のキット。
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