MX2015000766A

MX2015000766A - Sondas, cebadores cooperativos y aplicaciones de ellos.

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Publication number: MX2015000766A
Application number: MX2015000766A
Authority: MX
Inventors: Brent C Satterfield
Original assignee: Dna Logix Inc
Priority date: 2012-07-17
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2015-08-06
Also published as: EP2875132A4; AU2013292706B2; MX363880B; CA2879421A1; KR20150036537A; RU2015103777A; JP2015522292A; IN2015KN00014A; AU2013292706A1; EP2875132A2; BR112015000911A2; WO2014014988A2; KR102270892B1; WO2014014988A3; CN104603268A

Abstract

Se describen composiciones y un método relacionado con la amplificación y la detección de ácidos nucleicos.

Description

SONDAS. CEBADORES COOPERATIVOS Y APLICACIONES DE ELLOS CAMPO DE LA INVENCIÓN En líneas generales, la invención descrita pertenece en su totalidad al campo de amplificación de ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A menudo, el ensayo de ácidos nucleicos requiere la amplificación de ácidos nucleicos para lograr una concentración y/o una pureza suficientes para ser sometidas a ensayos posteriores. En algunos casos, la amplificación de ácidos nucleicos es utilizada como sustituto en la detección de moléculas diferentes a ácidos nucleicos, tal como proteínas. La mayoría de las reacciones de extensión/amplificación de ácidos nucleicos dependen de la presencia de un cebador que comprende ácidos nucleicos naturales o modificados en el extremo 3' que permite la extensión en presencia de una polimerasa.

La presencia de dímeros cebadores es un problema universal de dichas reacciones de amplificación. Los dímeros cebadores se forman cuando los cebadores se extienden entre sí, en lugar de extender el ácido nucleico diana. Los dímeros cebadores agotan los cebadores, lo que resulta en la presencia de impurezas en la reacción. En algunos casos, los dímeros cebadores incluso pueden agotar suficientes cebadores como para generar falsos negativos. O, en caso de interactuar con una sonda, los dímeros cebadores pueden generar falsos positivos.

Se ha desarrollado una variedad de arranques fallidos en respuesta al problema de dímeros cebadores que incluyen la suspensión de la polimerasa en un material ceroso, la inhibición de polimerasa con anticuerpos, la modificación química de la polimerasa, el secuestro de cebadores y una variedad de métodos diferentes. El problema de todos estos métodos es que sólo son eficaces antes de la primera ronda de amplificación/extensión. Cualesquiera dímeros cebadores que se formen posteriormente se amplifican a una velocidad exponencial.

Otros métodos para lidiar con dímeros cebadores incluyen métodos tales como PCR anidada. Sin embargo, esto requiere dos reacciones independientes y aumenta las probabilidades de contaminación.

Además se acoplan muchas reacciones de amplificación/extensión a una sonda de detección. A menudo, los principios se centran en una sonda lineal marcada, tal como Taqman, o una sonda de horquilla marcada, tal como balizas moleculares. Algunos métodos lograron una increíble especificidad mediante el uso de dos sondas unidas en forma cooperativa, tales como sondas Tentacle probe. Sin embargo, cada uno de dichos métodos basados en sondas se ve limitado en la detección de mutantes en un entorno con gran contenido de tipo salvaje. Aunque pueden lograr la detección total o ninguna detección de polimorfismos de nucleótidos individuales y otras mutaciones, sólo pueden distinguir alrededor de un mutante en un entorno que contiene de 10 a 20 secuencias de tipo salvaje. Esto se debe a que los cebadores amplifican tanto el tipo salvaje como el mutante y son eliminados cuando no son capaces de detectar ambos. Es posible combinar métodos como ARMS con las teenologías de detección de sondas para resolver en cierta medida este problema, pero no puede llevarse a cabo el multiplexado eficaz para la detección en tiempo real cuando se produce más de una mutación en la misma región general.

Se han desarrollado diversos cebadores que incluyen un mecanismo de detección, tal como cebadores Amplifluor, cebadores Rapid Detex y cebadores Scorpion. Los primeros dos son especialmente propensos a falsos positivos por problemas con dímeros cebadores debido a que no son específicos para secuencias. El último es un cebador con sonda propia, en el que la sonda se une al producto de extensión del cebador, en lugar de unirse a la plantilla de ácido nucleico. Debido a que presenta una sonda específica para una secuencia, es menos probable que lleve a falsos positivos, pero todavía puede presentar problemas asociados a dímeros cebadores.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente se describe una molécula de ácido nucleico cooperativa que comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico en la que la primera secuencia de ácido nucleico es sustancialmente complementaria a una primera región de un ácido nucleico diana y en la que la primera secuencia de ácido nucleico puede extenderse en el extremo 3', b) una segunda secuencia de ácido nucleico complementaria a una segunda región del ácido nucleico diana, en la que la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico se unen entre sí y en la que la segunda secuencia de ácido nucleico se híbrida con la secuencia de ácido nucleico posteriormente al extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico.

Se describe adicionalmente un método de amplificación de un ácido nucleico diana que comprende: a) la provisión de una molécula de ácido nucleico cooperativa, tal como se describió en la presente, b) la provisión de un ácido nucleico diana y c) la amplificación del ácido nucleico diana en condiciones adecuadas para su amplificación y, de dicha forma, la amplificación del ácido nucleico diana.

También se describe un método de detección de un ácido nucleico en una muestra que comprende: a) la provisión de una molécula de ácido nucleico cooperativa, tal como se describió en la presente, en la que el ácido nucleico cooperativo comprende un marcador detectable, b) la provisión de un ácido nucleico diana y c) la detección del ácido nucleico diana y, de dicha forma, la detección del ácido nucleico diana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra una modalidad de cebadores cooperativos que presenta un enlazador interno al cebador unido al extremo 5‘ de la secuencia de captura. La secuencia de captura se une al ácido nucleico diana y la secuencia de captura hlbrldada mantiene el cebador cerca de la diana. Entonces, el cebador se extiende y escinde la secuencia de captura.

La Figura 2 ilustra otra modalidad de cebadores cooperativos con un enlazador que une el extremo 5' del cebador al extremo 3' de la secuencia de captura. La secuencia de captura se une al ácido nucleico diana. La secuencia de captura hibridada mantiene el cebador cerca de la diana. Entonces, el cebador se extiende y escinde la secuencia de captura.

La Figura 3 ilustra una modalidad preferida de un cebador cooperativo con el extremo 5' de la secuencia de captura unida al extremo 5' del cebador. La secuencia de captura se une al ácido nucleico diana. La secuencia de captura hibridada mantiene el cebador cerca de la diana. Entonces, el cebador se extiende y escinde la secuencia de captura.

La Figura 4 ilustra ejemplos de sondas que pueden unirse al cebador que incluyen, de modo no taxativo, sondas con doble marcado, sondas de horquilla y sondas con marcado único.

La Figura 5 ilustra una modalidad preferida para la detección de la extensión de ácidos nucleicos mediante el uso de un cebador cooperativo unido a una sonda con doble marcado. La sonda se une al ácido nucleico diana y la sonda hibridada mantiene el cebador cerca de la diana. El cebador se extiende y escinde la sonda, lo que provoca un aumento en la fluorescencia.

La Figura 6 ilustra el gel de cebadores cooperativos y cebadores normales. Los cebadores normales presentan cierta formación de dímeros cebadores (P-D) incluso sin agregados de P-D. Sin embargo, presentan amplificación de 60 copias iniciales de ADN de malaria. Cuando se agregan 600 P-D, los productos de amplificación de malaria se ven eclipsados y sólo se amplifica P-D. En contraste, los cebadores cooperativos no presentan amplificación de dímeros cebadores, incluso cuando se agregan hasta 600000 P-D. Los P-D no interfieren con la amplificación mediante cebadores cooperativos del ácido nucleico diana.

La Figura 7 ilustra algunos ejemplos de cebadores con mecanismos de detección incluidos que pueden ser utilizados en cebadores cooperativos.

La Figura 8 ¡lustra cebadores cooperativos con sondas integradas. Las sondas de hibridación normales o los cebadores cooperativos marcados fueron utilizados para la detección en tiempo real de 5000000, 50000, 500 o 0 copias de una plantilla de P. falciparum. Las secuencias de captura marcadas en cebadores cooperativos presentaron una señal fluorescente 2,5 veces mayor que la de las sondas de hibridación normales, a pesar de que la secuencia de captura tuvo una Tm por debajo de la temperatura de reacción.

La Figura 9 ilustra la diferenciación de SNP con cebadores cooperativos. Los cebadores cooperativos diferencian entre el complejo de tuberculosis con el SNP D516V de rpoB que genera resistencia a la rifampicina y sin que el SNP emplee diferenciación basada en sondas con SNP conforme a la secuencia de captura (9A) y el método ARMS con el SNP en el extremo 3' del cebador (9B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El método descrito utiliza determinados materiales y procedimientos que permiten la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos y genomas completos o de otras muestras de ácidos nucleicos complejos. A continuación se describen en forma detallada estos materiales y procedimientos.

Definiciones A menos que se defina lo contrario, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Las siguientes definiciones complementan aquellas de la técnica, hacen referencia a la presente solicitud y no serán necesariamente vinculadas a cualquier caso relacionado o no relacionado, por ejemplo, a cualquier patente o solicitud de propiedad común. Si bien puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente en la práctica para evaluar la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Por consiguiente, la terminología usada en la presente tiene el único propósito de describir modalidades particulares y no pretende limitarlas.

Tal como se usa en la presente, «secuencia de ácido nucleico» hace referencia al orden o secuencia de nucleótidos en una cadena de ácidos nucleicos. En algunos casos, el orden de dichos nucleótidos puede determinar el orden de los aminoácidos en una cadena de polipéptidos correspondiente. Por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ácido nucleico puede ser monocatenaria o de cadena doble, tal como se especificó, o puede contener partes tanto de secuencias de cadena doble como monocatenarias. La secuencia de ácidos nucleicos puede estar compuesta de ADN, tanto ADNc como genómico, ARN o un híbrido, en la que la secuencia comprende cualquier combinación de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, y cualquier combinación de bases que incluye uracilo (U), adenina (A), timina (T), citosina (C), guanina (G), inosina, xatanina hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc. Puede incluir bases modificadas que incluyen ácidos nucleicos bloqueados, ácidos péptidonucleicos y otros conocidos por los expertos en la téenica.

Un «oligonucleótido» es un polímero que comprende dos o más nucleótidos. Además, el polímero puede comprender elementos no nucleotídicos tales como marcadores, inactivadores, grupos de bloqueo o similares. Los nucleótidos del oligonucleótido pueden ser de origen natural o no natural y pueden encontrarse sustituidos, modificados, no sustituidos o no modificados. Los nucleótidos pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o mediante enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato, enlaces boranofosfato o similares.

Un «ácido péptidonucleico» (PNA) es un polímero que comprende dos o más monómeros de ácido péptidonucleico. Además, el polímero puede comprender elementos tales como marcadores, inactivadores, grupos de bloqueo o similares. Los monómeros de PNA pueden encontrarse sustituidos, modificados, no sustituidos o no modificados. «Ácido nucleico cooperativo» hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que incorpora mínimamente una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico, en el que la segunda secuencia de ácido nucleico se híbrida con el ácido nucleico diana posterior al extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico. El extremo 3' del ácido nucleico puede extenderse, tal como ya se discutió en la presente. En un ejemplo, el primer ácido nucleico es un cebador y el segundo ácido nucleico es una secuencia de captura. La primera y la segunda secuencias de ácido nucleico pueden ser separadas por un enlazador, por ejemplo.

Un «cebador» es un ácido nucleico que contiene una secuencia complementaria a una región de una hebra de ácido nucleico plantilla y que inicia la síntesis de una hebra complementaria a la plantilla (o a una parte de ella). Normalmente, los cebadores son oligonucleótidos sintetizados químicamente y relativamente cortos (por lo general, desoxirribonucleótidos), pero esto no es necesariamente así. En una amplificación, por ejemplo, una amplificación por PCR, un par de cebadores usualmente define los extremos 5' de las dos hebras complementarias del ácido nucleico diana que se amplifica. «Cebador cooperativo» o primera secuencia de ácido nucleico, hace referencia a un cebador unido a una segunda secuencia de ácido nucleico, a la que también se hace referencia como secuencia de ácido nucleico, a través de un enlazador. La segunda secuencia de ácido nucleico, o secuencia de captura, puede hibridarse con el ácido nucleico de plantilla posterior al extremo 3‘ del cebador o primera secuencia de ácido nucleico. «Cebador normal» hace referencia a un cebador que no presenta una secuencia de captura, o segunda secuencia de ácido nucleico, unida a él mediante un enlazador.

«Secuencia de captura», a la que también se hace referencia en la presente como «segunda secuencia de ácido nucleico», hace referencia a una secuencia que se híbrida con un ácido nucleico diana y permite que la primera secuencia de ácido nucleico, o secuencia cebadora, se encuentre próxima a la región diana del ácido nucleico diana.

«Posterior» hace referencia a la acción de la polimerasa durante la extensión o síntesis de ácidos nucleicos. Por ejemplo, cuando la polimerasa Taq extiende un cebador, agrega bases al extremo 3' del cebador y se mueve hacia una secuencia que se encuentra en una ubicación «posterior al extremo 3' del cebador».

Una «región diana» es una región de un ácido nucleico diana a ser amplificada, detectada o ambas.

La «Tm» (temperatura de fusión) de un dúplex de ácido nucleico en determinadas condiciones es la temperatura a la que la mitad de las secuencias de ácido nucleico se encuentran desasociadas y la otra mitad, asociadas. Tal como se usa en la presente, «Tm aislada» hace referencia a la temperatura de fusión individual ya sea de la primera o la segunda secuencia de ácidos nucleicos en el ácido nucleico cooperativo cuando no forma parte del par cooperativo. «Tm efectiva» hace referencia a la temperatura de fusión resultante ya sea del primer ácido nucleico o del segundo cuando se encuentran enlazados entre sí.

El término «enlazador» hace referencia a la composición que une el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico entre sí. El enlazador comprende al menos un resto no extensible, pero también puede comprender ácidos nucleicos extensibles y puede ser de cualquier extensión. El enlazador puede estar conectado al extremo 3', el extremo 5' o a una o más bases desde el extremo («la parte central») tanto de la primera secuencia de ácido nucleico, como de la segunda. La conexión puede ser covalente, enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas y similares. La expresión «no extensible» hace referencia a la incapacidad de la polimerasa Taq nativa para reconocer un resto y, por lo tanto, continuar la síntesis de ácido nucleico. La polimerasa reconoce una variedad de bases de ácido nucleico modificadas y naturales, y son «extensibles». Ejemplos de restos no extensibles incluyen, entre otros, fluoróforos, inactivadores, polietilenglicol, polipropilenglicol, polietileno, polipropileno, poliamidas, poliésteres y otros conocidos por los expertos en la téenica. En algunos casos, incluso una base de ácido nucleico de orientación inversa (por ejemplo, 5’ ACGT 3’ 3? 5’ 5’ AAGT 3’) o producida de otra forma tal que la polimerasa Taq no pudiera extenderse a lo largo de ella podría ser considerada «no extenslble». Tal como se usa en la presente, la expresión «enlazador diferente a ácido nucleico» hace referencia a un grupo químico reactivo capaz de unir en forma covalente un primer ácido nucleico a un segundo ácido nucleico o, más específicamente, el cebador a la secuencia de captura. Normalmente, los enlazadores flexibles adecuados son moléculas lineales en una cadena de al menos uno o dos átomos. Más usualmente, son una cadena polimérica orgánica de extensión de 1 a 12 átomos de carbono (y/u otros átomos de estructura). Ejemplos de enlazadores flexibles incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol, polietileno, polipropileno, poliamidas, poliésteres y similares.

Tal como se usan en la presente, «complementario» o «complementariedad» hacen referencia a la capacidad de un nucleótido en una molécula de polinucleótido para formar un par de bases con otro nucleótido en una segunda molécula de polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia 5'-A-C-T-3' es complementaria a la secuencia 3’-T-G-A-5'. La complementariedad puede ser parcial, en cuyo caso sólo algunos de los nucleótidos se corresponden conforme a apareamiento de bases, o total, en cuyo caso todos los nucleótidos se corresponden conforme a apareamiento de bases. A efectos de la presente invención, «sustancialmente complementario» hace referencia a 90 % de identidad o más en la extensión de la región de pares de base diana. La complementariedad también puede ser de 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %, o cualquier valor inferior o cualquier valor comprendido entre dichos valores.

Tal como se usa en la presente, «amplificar», «amplificación», «amplifica» y «amplificado» hacen referencia a la creación de una o más copias idénticas o complementarias del ADN diana. Las copias pueden ser de cadena simple o de doble cadena. La amplificación puede ser parte de una cantidad de procesos, tales como la extensión de un cebador, la transcripción inversa, la reacción en cadena de la polimerasa, la secuenciación de ácidos nucleicos, la amplificación por círculo rodante y similares.

Tal como se usa en la presente, «purificado» hace referencia a un polinucleótido, por ejemplo, a una secuencia de ácido nucleico diana que se separó de desechos celulares, por ejemplo, proteínas, ARN y ADN de peso molecular elevado. Esto incluiría una muestra de ARN aislada que se separaría de desechos celulares, lo que incluye ADN. También puede hacer referencia a ácidos nucleicos no nativos o de origen no natural.

Tal como se usan en la presente, «proteína», «péptido» y «polipéptido» son utilizadas en forma intercambiable para hacer referencia a un polímero aminoácido o a un conjunto de dos o más polímeros aminoácidos unidos o que interactúan.

Tal como se usa en la presente, «rigurosidad» hace referencia a las condiciones en las que se desarrolla la hibridación de polinucleótidos, es decir, temperatura, fuerza iónica, solventes y similares. La hibridación es el proceso que se desarrolla entre el cebador y el ADN de plantilla en la etapa de alineación del proceso de amplificación Se define o se caracteriza una variedad de términos adicionales en la presente.

Materiales y métodos La presente invención hace referencia a ácidos nucleicos cooperativos, tales como cebadores y sondas. Un ácido nucleico cooperativo comprende un cebador oligonucleótido enlazado a un segundo oligonucleótido complementario a una región de la plantilla posterior al extremo 3‘ del cebador (tal como se ilustra, por ejemplo, en la Figura 1). Dicho segundo oligonucleótido sirve como secuencia de captura. En algunas modalidades, esto hace posible que los cebadores con temperaturas de fusión (Tm) bajas se hibriden en forma eficaz con la diana.

La secuencia de captura mantiene el cebador cerca de la plantilla, lo que permite que la extensión/amplificación se desarrolle a pesar de la Tm baja. Sin embargo, las secuencias no específicas que no presentan una secuencia complementaria a la secuencia de captura, tales como dímeros cebadores, no se extienden en forma eficaz. Debido a que la secuencia de captura se híbrida en forma única posteriormente al extremo 3' del cebador, se logra especificidad de amplificación en cada ciclo. Esto contrasta con los métodos de arranque fallido convencionales cuya especificidad se agota luego del primer ciclo.

Esto también contrasta con conceptos tales como el de cebador de doble especificidad (Publicación de patente estadounidense 20120135473 que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia debido a su información respecto a cebadores de doble especificidad). El cebador de doble especificidad presenta una secuencia de captura enlazada a un cebador corto mediante residuos de inosina y la secuencia de captura se híbrida con la diana en el lado 5' del cebador. El resultado es que el cebador de doble especificidad es muy específico en la primera ronda de amplificación. Sin embargo, si los cebadores de doble especificidad se amplifican entre sí, la polimerasa se extiende completamente hasta el extremo 5', de forma que crea un dímero cebador de Tm elevada que se propagará en cada una de las rondas posteriores. Esto se contrasta con el ácido nucleico cooperativo cuya secuencia de captura se híbrida a la diana en el lado 3' del cebador, lo que evita que se incorpore al dímero cebador en el orden necesario para permitir la propagación del dímero cebador.

Los ácidos nucleicos cooperativos y los métodos para utilizarlos también difieren de sondas de cadena (Nilsson et ál. 1994: «Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection.» Science 265 (5181): 2085-2088), sondas de inversión molecular (MIP) (Hardenbol et ál 2003: «Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversión probes.» Nat Biotechnol 21 (6): 673-678) sondas de inversión de conectores (CIP) (Akhras et ál. 2007: Hall, Neil. ed. «Connector inversión probe technology: a powerful one-primer multiplex DNA amplification system for numerous scientific applications.» PLoS ONE 2 (9): e195). Por ejemplo, las sondas descritas en la presente pueden presentar un enlazador con al menos un resto no extensible. Asimismo, la molécula descrita en la presente es un cebador, al tiempo que las sondas de cadena se encuentran ligadas y las sondas de cadena no ligadas son digeridas o retiradas de otra forma antes de la amplificación y no pueden ser utilizadas como cebadores.

Las sondas de cadena son moléculas de ADN de cadena simple con dos segmentos de 20 nucleótidos de extensión complementarios a la diana que se conectan mediante una secuencia enlazadora de 40 nucleótidos de extensión. Cuando las regiones complementarias diana se hibridan con el ADN diana, las sondas de cadena también se tornan circulares. Sin embargo, a diferencia de las MIP, las sondas de cadena son diseñadas de forma que las regiones complementarias a la diana se extienden a lo largo de toda la región diana con la hibridación, sin dejar huecos. Por lo tanto, las sondas de cadena sólo son útiles para detectar moléculas de ADN de secuencias conocidas.

Las sondas de inversión molecular fueron desarrolladas para llevar a cabo genotipado de SNP y son sondas de cadena modificadas para que al hibridarse la sonda a la diana genómica, se genere un hueco en la posición del SNP. El uso de un nucleótido complementario al nucleótido en la ubicación del SNP para llenar un hueco determina la identidad del polimorfismo. Este diseño aporta varios beneficios en comparación con la téenica tradicional de sonda de cadena. El uso de múltiples sondas de cadena específicas para un SNP posible requiere un equilibrio cuidado de las concentraciones de dichas sondas específicas para alelos para asegurar la normalización adecuada del recuento de SNP en cualquier locus dado.

Las sondas de inversión de conectores emplean un diseño modificado de MIP mediante la extensión del hueco delimitado por los extremos de la sonda hibridada y son denominadas Sondas de inversión de conectores (CIP). El hueco corresponde a la región genómica de interés a ser capturada (por ejemplo, exones). La reacción de cobertura del hueco es llevada a cabo con ADN polimerasa mediante el uso de los cuatro nucleótidos. Entonces, la identificación de las regiones capturadas puede ser llevada a cabo mediante su secuenciación con cebadores específicos para locus que mapean uno de los extremos complementarios a la diana de las sondas.

Un dímero cebador (PD) es un posible subproducto de la PCR. Tal como su nombre lo implica, un PD consiste en moléculas de cebador que se unieron (se hibridaron) entre sí debido a las series de bases complementarias en los cebadores o a través de otras interacciones no específicas. Como resultado, la ADN polimerasa amplifica los PD, lo que lleva a la competencia de reactivos de PCR y, por lo tanto, la posible inhibición de la amplificación de la secuencia de ADN seleccionada como diana para la amplificación por PCR. En la PCR en tiempo real, es posible que los PD interfieran con la cuantificación precisa mediante la disminución de señales, falsos negativos, falsos positivos y similares.

La presente invención también hace referencia a ácidos nucleicos enlazados en forma cooperativa que también comprenden una sonda. Dicha sonda/cebador modificado es similar al ácido nucleico cooperativo, pero con la adición de uno o más marcadores detectables ya sea en la secuencia de captura o en el cebador, lo que lo transforma en una sonda. Debido a que la extensión de la sonda/cebador cooperativo es detectable, puede resultar útil en diversas aplicaciones que incluyen aplicaciones de multiplexado que requieren la diferenciación de SNP con un enfoque basado en ARMS. En algunas modalidades, tanto el cebador como la sonda son diseñados con Tm por debajo de la temperatura de fusión empleada en la reacción de amplificación, de forma tal que el cebador no se amplificaría sin la unión de la sonda y la sonda no tendría señal sin la unión al cebador. Esto genera dos puntos de especificidad en la misma combinación de sonda/cebador.

Los ácidos nucleicos cooperativos de la presente invención, tales como cebadores y sondas, son útiles en una variedad de reacciones de extensión/amplificación de cebadores conocidas por los expertos en la téenica que incluyen, de modo no taxativo, la reacción en cadena de polimerasa, la amplificación en círculo rodante, secuenciación de ácido nucleico y otras. Las sondas y cebadores cooperativos de la presente invención también pueden ser utilizados en aplicaciones con etapas posteriores a la extensión/amplificación, tal como la hibridación de un arreglo. Debido a que las sondas/cebadores cooperativos de la presente invención reducen en forma significativa los dímeros cebadores, son particularmente útiles en reacciones multiplexadas y muy multiplexadas.

El uso de un ácido nucleico cooperativo puede reducir la cantidad de dímero cebador presente en 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento en comparación con la cantidad de dímero cebador presente cuando se utiliza un cebador normal (un ácido nucleico no cooperativo).

Por lo tanto, en la presente se describe una molécula de ácido nucleico cooperativa que comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico en la que la primera secuencia de ácido nucleico es sustancialmente complementaria con una primera región de un ácido nucleico diana y en la que la primera secuencia de ácido nucleico se extiende en el extremo 3', b) una segunda secuencia de ácido nucleico complementaria con una segunda región del ácido nucleico diana, en la que la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico se unen entre sí y en la que la segunda secuencia de ácido nucleico se híbrida en la secuencia de ácido nucleico posterior al extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, y en la que se eleva la temperatura de fusión (Tm) efectiva de la primera molécula de ácido nucleico 1 °C, en comparación con la Tm aislada de la primera secuencia de ácido nucleico sin tener la segunda secuencia de ácido nucleico unida a ella.

El ácido nucleico cooperativo puede ser lineal o circular. «Extensible en el extremo 3'» hace referencia a que el primer ácido nucleico se encuentra libre en dicho extremo para ser amplificado o extendido. Esto pretende incluir cebadores activables por calor, tales como los descritos por Lebedev et ál., entre otras teenologías.

La primera secuencia de ácido nucleico es un cebador y, alternativamente, se hace referencia a la segunda secuencia de ácido nucleico como una «secuencia de ácido nucleico de captura». La primera o la segunda secuencias pueden presentar un marcador detectable, o una tercera secuencia puede presentar un marcador detectable. La primera y la segunda secuencias de ácido nucleico pueden unirse mediante un enlazador, el que puede ser una secuencia diferente de ácido nucleico. En un ejemplo, el enlazador puede adjuntar el extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico al extremo 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, esto puede observarse en la Figura 2. De manera alternativa, se invierte la primera secuencia de ácido nucleico de forma que el extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico se una al extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, esto puede observarse en la Figura 3. En aun otro ejemplo, el extremo 5' de la segunda secuencia de ácido nucleico puede enlazarse a la primera secuencia de ácido nucleico en la parte central de la secuencia, tal como se ve en la Figura 1. Cabe destacar que «la parte central de la secuencia» hace referencia a que el enlazador no se une a la primera secuencia de ácido nucleico ya sea en el extremo 5' como en el extremo 3' del ácido nucleico, sino que se adjunta a un nucleótido interno a los nucleótidos de los extremos 5' y 3'.

En un ejemplo, el ácido nucleico cooperativo comprende 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o menos nucleótidos continuos en la misma orientación. En otras palabras, esta es la cantidad de nucleótidos que forma parte de una única secuencia de ácido nucleico ininterrumpida y que se encuentra orientada en la misma dirección 5' a 3' o en dirección 3' a 5‘.

Por ejemplo, si el enlazador es una secuencia de ácido nucleico, puede incluir el enlazador en caso de que los nucleótidos en el enlazador se encuentren en la misma orientación de la primera o de la segunda secuencia de ácido nucleico a la que se conecta directamente.

El enlazador puede ser producido a partir de ácidos nucleicos, moléculas diferentes a ácidos nucleicos o de alguna combinación de ellos. Si el enlazador estuviera compuesto por ácidos nucleicos, podría tener una extensión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos, 0 de cualquier cantidad comprendida entre dichos valores. En otra parte de la presente se discuten tipos de enlazadores. El enlazador puede ser de cualquier extensión y puede ser mayor o menor que la extensión combinada de la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico, mayor o menor que sólo la primera secuencia de ácido nucleico, o mayor o menor que la segunda secuencia de ácido nucleico.

Asimismo, puede haber un espacio en el ácido nucleico diana en el que se hibridan la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico. En otras palabras, existen dos regiones diferentes en el ácido nucleico diana: una que se híbrida con la primera secuencia de ácido nucleico y otra que se híbrida con la segunda secuencia de ácido nucleico. La distancia entre la primera región y la segunda región en la diana puede tener una extensión de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 O más nucleótidos.

También se describe en la presente un kit que comprende moléculas de ácidos nucleicos cooperativos descritas en la presente junto con instrucciones para su uso. En algunas modalidades, se proveen moléculas de ácidos nucleicos cooperativos adicionales en el kit. En incluso otras modalidades, se incluyen reactivos para desarrollar la extensión, tales como polimerasa, dNTP, soluciones amortiguadoras y similares. En algunas modalidades, pueden incluirse controles positivos y negativos. En tales modalidades, los reactivos pueden envasarse todos en forma individual o combinados en un único tubo o recipiente.

También se describe un método para amplificar un ácido nucleico diana que comprende: a) proveer una molécula de ácido nucleico cooperativo descrita en la presente, b) proveer un ácido nucleico diana y c) amplificar el ácido nucleico diana en condiciones adecuadas para la amplificación, en el que la Tm efectiva de la primera molécula de ácido nucleico se eleva al menos 1 °C en comparación con la Tm aislada de la primera secuencia de ácido nucleico sin la segunda secuencia de ácido nucleico unida a ella, de forma que amplifica el ácido nucleico diana.

En otra parte de la presente se describen métodos de amplificación. Es posible proveer más de una molécula de ácido nucleico cooperativo y ellas pueden tener la misma secuencia o secuencias diferentes. Por ejemplo, es posible proveer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 O más moléculas de ácido nucleico de diferente secuencia.

Diseño de cebadores En algunas modalidades, la temperatura de fusión (T m) aislada del cebador, al que también se hace referencia en la presente como la primera secuencia de ácido nucleico, es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 o más grados menor que la temperatura de reacción utilizada en la fase de hibridación, de PCR o en la fase de extensión de reacciones sin fase de hibridación. Por lo tanto, la temperatura de fusión de la primera secuencia puede encontrarse entre alrededor de 1 °C y 40 °C, entre alrededor de 3 “C y 20 °C, entre alrededor de 5 °C y 15 °C por debajo de la temperatura de reacción utilizada en la reacción de PCR. En una modalidad preferida, la Tm aislada se encuentra entre alrededor de 7 °C y 12 °C por debajo de la temperatura de reacción. Esto provee menos que el 50 %, y más preferentemente, menos que el 20 %, de la plantilla a hibridarse con un cebador aislado.

Un experto en la téenica puede diseñar cebadores con una temperatura de fusión dada en base a diversos factores, tales como la extensión, y con contenido de GC creciente. Una fórmula sencilla para calcular la Tm es: Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C Asimismo, un experto en la téenica tendrá en cuenta que la concentración de Mg2+, K+ y cosolventes influirá en la Tm real. Existen diversos programas informáticos para asistir en el diseño de cebadores.

Para alcanzar las temperaturas de fusión deseadas, la primera secuencia de ácido nucleico, o el cebador, puede tener una extensión de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40 bases. Por ejemplo, los cebadores pueden tener una extensión de entre alrededor de 5 y 26, entre alrededor de 7 y 22, entre alrededor de 9 y 17 bases según el contenido de GC.

Es posible emplear cualquier cantidad de cebadores de diferente secuencia de nucleótidos, pero se prefiere el uso de un cebador o de pocos cebadores. La reacción de amplificación puede ser llevada a cabo, por ejemplo, con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o diecisiete cebadores. Es posible emplear más cebadores. No existe un límite superior fundamental para la cantidad de cebadores que pueden ser empleados. Sin embargo, se prefiere el uso de pocos cebadores. Cuando se emplean múltiples cebadores, cada cebador debería tener una secuencia de nucleótidos específica diferente.

La reacción de amplificación puede ser llevada a cabo con un único cebador, por ejemplo, sin cebadores adicionales, con 1 cebador adicional, con 2 cebadores adicionales, con 3 cebadores adicionales, con 4 cebadores adicionales, con 5 cebadores adicionales, con 6 cebadores adicionales, con 7 cebadores adicionales, con 8 cebadores adicionales, con 9 cebadores adicionales, con 10 cebadores adicionales, con 11 cebadores adicionales, con 12 cebadores adicionales, con 13 cebadores adicionales, con 14 cebadores adicionales, con 15 cebadores adicionales, con 16 cebadores adicionales, con 17 cebadores adicionales, con 18 cebadores adicionales, con 19 cebadores adicionales, con 20 cebadores adicionales, con 21 cebadores adicionales, con 22 cebadores adicionales, con 23 cebadores adicionales, con 24 cebadores adicionales, con 25 cebadores adicionales, con 26 cebadores adicionales, con 27 cebadores adicionales, con 28 cebadores adicionales, con 29 cebadores adicionales, con 30 cebadores adicionales, con 31 cebadores adicionales, con 32 cebadores adicionales, con 33 cebadores adicionales, con 34 cebadores adicionales, con 35 cebadores adicionales, con 36 cebadores adicionales, con 37 cebadores adicionales, con 38 cebadores adicionales, con 39 cebadores adicionales, con 40 cebadores adicionales, con 41 cebadores adicionales, con 42 cebadores adicionales, con 43 cebadores adicionales, con 44 cebadores adicionales, con 45 cebadores adicionales, con 46 cebadores adicionales, con 47 cebadores adicionales, con 48 cebadores adicionales, con 49 cebadores adicionales, con 50 cebadores adicionales, con 51 cebadores adicionales, con 52 cebadores adicionales, con 53 cebadores adicionales, con 54 cebadores adicionales, con 55 cebadores adicionales, con 56 cebadores adicionales, con 57 cebadores adicionales, con 58 cebadores adicionales, con 59 cebadores adicionales, con 60 cebadores adicionales, con 61 cebadores adicionales, con 62 cebadores adicionales, con 63 cebadores adicionales, con 64 cebadores adicionales, con 65 cebadores adicionales, con 66 cebadores adicionales, con 67 cebadores adicionales, con 68 cebadores adicionales, con 69 cebadores adicionales, con 70 cebadores adicionales, con 71 cebadores adicionales, con 72 cebadores adicionales, con 73 cebadores adicionales, con 74 cebadores adicionales, con 75 cebadores adicionales, con 76 cebadores adicionales, con 77 cebadores adicionales, con 78 cebadores adicionales, con 79 cebadores adicionales, con 80 cebadores adicionales, con 81 cebadores adicionales, con 82 cebadores adicionales, con 83 cebadores adicionales, con 84 cebadores adicionales, con 85 cebadores adicionales, con 86 cebadores adicionales, con 87 cebadores adicionales, con 88 cebadores adicionales, con 89 cebadores adicionales, con 90 cebadores adicionales, con 91 cebadores adicionales, con 92 cebadores adicionales, con 93 cebadores adicionales, con 94 cebadores adicionales, con 95 cebadores adicionales, con 96 cebadores adicionales, con 97 cebadores adicionales, con 98 cebadores adicionales, con 99 cebadores adicionales, con 100 cebadores adicionales, con 110 cebadores adicionales, con 120 cebadores adicionales, con 130 cebadores adicionales, con 140 cebadores adicionales, con 150 cebadores adicionales, con 160 cebadores adicionales, con 170 cebadores adicionales, con 180 cebadores adicionales, con 190 cebadores adicionales, con 200 cebadores adicionales, con 210 cebadores adicionales, con 220 cebadores adicionales, con 230 cebadores adicionales, con 240 cebadores adicionales, con 250 cebadores adicionales, con 260 cebadores adicionales, con 270 cebadores adicionales, con 280 cebadores adicionales, con 290 cebadores adicionales, con 300 cebadores adicionales, con 310 cebadores adicionales, con 320 cebadores adicionales, con 330 cebadores adicionales, con 340 cebadores adicionales, con 350 cebadores adicionales, con 360 cebadores adicionales, con 370 cebadores adicionales, con 380 cebadores adicionales, con 390 cebadores adicionales, con 400 cebadores adicionales, con 410 cebadores adicionales, con 420 cebadores adicionales, con 430 cebadores adicionales, con 440 cebadores adicionales, con 450 cebadores adicionales, con 460 cebadores adicionales, con 470 cebadores adicionales, con 480 cebadores adicionales, con 490 cebadores adicionales, con 500 cebadores adicionales, con 550 cebadores adicionales, con 600 cebadores adicionales, con 650 cebadores adicionales, con 700 cebadores adicionales, con 750 cebadores adicionales, con 800 cebadores adicionales, con 850 cebadores adicionales, con 900 cebadores adicionales, con 950 cebadores adicionales, con 1000 cebadores adicionales, con 1100 cebadores adicionales, con 1200 cebadores adicionales, con 1300 cebadores adicionales, con 1400 cebadores adicionales, con 1500 cebadores adicionales, con 1600 cebadores adicionales, con 1700 cebadores adicionales, con 1800 cebadores adicionales, con 1900 cebadores adicionales, con 2000 cebadores adicionales, con 2100 cebadores adicionales, con 2200 cebadores adicionales, con 2300 cebadores adicionales, con 2400 cebadores adicionales, con 2500 cebadores adicionales, con 2600 cebadores adicionales, con 2700 cebadores adicionales, con 2800 cebadores adicionales, con 2900 cebadores adicionales, con 3000 cebadores adicionales, con 3500 cebadores adicionales o con 4000 cebadores adicionales.

La reacción de amplificación puede ser llevada a cabo con un único cebador, por ejemplo, sin cebadores adicionales, con menos de 2 cebadores adicionales, con menos de 3 cebadores adicionales, con menos de 4 cebadores adicionales, con menos de 5 cebadores adicionales, con menos de 6 cebadores adicionales, con menos de 7 cebadores adicionales, con menos de 8 cebadores adicionales, con menos de 9 cebadores adicionales, con menos de 10 cebadores adicionales, con menos de 11 cebadores adicionales, con menos de 12 cebadores adicionales, con menos de 13 cebadores adicionales, con menos de 14 cebadores adicionales, con menos de 15 cebadores adicionales, con menos de 16 cebadores adicionales, con menos de 17 cebadores adicionales, con menos de 18 cebadores adicionales, con menos de 19 cebadores adicionales, con menos de 20 cebadores adicionales, con menos de 21 cebadores adicionales, con menos de 22 cebadores adicionales, con menos de 23 cebadores adicionales, con menos de 24 cebadores adicionales, con menos de 25 cebadores adicionales, con menos de 26 cebadores adicionales, con menos de 27 cebadores adicionales, con menos de 28 cebadores adicionales, con menos de 29 cebadores adicionales, con menos de 30 cebadores adicionales, con menos de 31 cebadores adicionales, con menos de 32 cebadores adicionales, con menos de 33 cebadores adicionales, con menos de 34 cebadores adicionales, con menos de 35 cebadores adicionales, con menos de 36 cebadores adicionales, con menos de 37 cebadores adicionales, con menos de 38 cebadores adicionales, con menos de 39 cebadores adicionales, con menos de 40 cebadores adicionales, con menos de 41 cebadores adicionales, con menos de 42 cebadores adicionales, con menos de 43 cebadores adicionales, con menos de 44 cebadores adicionales, con menos de 45 cebadores adicionales, con menos de 46 cebadores adicionales, con menos de 47 cebadores adicionales, con menos de 48 cebadores adicionales, con menos de 49 cebadores adicionales, con menos de 50 cebadores adicionales, con menos de 51 cebadores adicionales, con menos de 52 cebadores adicionales, con menos de 53 cebadores adicionales, con menos de 54 cebadores adicionales, con menos de 55 cebadores adicionales, con menos de 56 cebadores adicionales, con menos de 57 cebadores adicionales, con menos de 58 cebadores adicionales, con menos de 59 cebadores adicionales, con menos de 60 cebadores adicionales, con menos de 61 cebadores adicionales, con menos de 62 cebadores adicionales, con menos de 63 cebadores adicionales, con menos de 64 cebadores adicionales, con menos de 65 cebadores adicionales, con menos de 66 cebadores adicionales, con menos de 67 cebadores adicionales, con menos de 68 cebadores adicionales, con menos de 69 cebadores adicionales, con menos de 70 cebadores adicionales, con menos de 71 cebadores adicionales, con menos de 72 cebadores adicionales, con menos de 73 cebadores adicionales, con menos de 74 cebadores adicionales, con menos de 75 cebadores adicionales, con menos de 76 cebadores adicionales, con menos de 77 cebadores adicionales, con menos de 78 cebadores adicionales, con menos de 79 cebadores adicionales, con menos de 80 cebadores adicionales, con menos de 81 cebadores adicionales, con menos de 82 cebadores adicionales, con menos de 83 cebadores adicionales, con menos de 84 cebadores adicionales, con menos de 85 cebadores adicionales, con menos de 86 cebadores adicionales, con menos de 87 cebadores adicionales, con menos de 88 cebadores adicionales, con menos de 89 cebadores adicionales, con menos de 90 cebadores adicionales, con menos de 91 cebadores adicionales, con menos de 92 cebadores adicionales, con menos de 93 cebadores adicionales, con menos de 94 cebadores adicionales, con menos de 95 cebadores adicionales, con menos de 96 cebadores adicionales, con menos de 97 cebadores adicionales, con menos de 98 cebadores adicionales, con menos de 99 cebadores adicionales, con menos de 100 cebadores adicionales, con menos de 110 cebadores adicionales, con menos de 120 cebadores adicionales, con menos de 130 cebadores adicionales, con menos de 140 cebadores adicionales, con menos de 150 cebadores adicionales, con menos de 160 cebadores adicionales, con menos de 170 cebadores adicionales, con menos de 180 cebadores adicionales, con menos de 190 cebadores adicionales, con menos de 200 cebadores adicionales, con menos de 210 cebadores adicionales, con menos de 220 cebadores adicionales, con menos de 230 cebadores adicionales, con menos de 240 cebadores adicionales, con menos de 250 cebadores adicionales, con menos de 260 cebadores adicionales, con menos de 270 cebadores adicionales, con menos de 280 cebadores adicionales, con menos de 290 cebadores adicionales, con menos de 300 cebadores adicionales, con menos de 310 cebadores adicionales, con menos de 320 cebadores adicionales, con menos de 330 cebadores adicionales, con menos de 340 cebadores adicionales, con menos de 350 cebadores adicionales, con menos de 360 cebadores adicionales, con menos de 370 cebadores adicionales, con menos de 380 cebadores adicionales, con menos de 390 cebadores adicionales, con menos de 400 cebadores adicionales, con menos de 410 cebadores adicionales, con menos de 420 cebadores adicionales, con menos de 430 cebadores adicionales, con menos de 440 cebadores adicionales, con menos de 450 cebadores adicionales, con menos de 460 cebadores adicionales, con menos de 470 cebadores adicionales, con menos de 480 cebadores adicionales, con menos de 490 cebadores adicionales, con menos de 500 cebadores adicionales, con menos de 550 cebadores adicionales, con menos de 600 cebadores adicionales, con menos de 650 cebadores adicionales, con menos de 700 cebadores adicionales, con menos de 750 cebadores adicionales, con menos de 800 cebadores adicionales, con menos de 850 cebadores adicionales, con menos de 900 cebadores adicionales, con menos de 950 cebadores adicionales, con menos de 1000 cebadores adicionales, con menos de 1100 cebadores adicionales, con menos de 1200 cebadores adicionales, con menos de 1300 cebadores adicionales, con menos de 1400 cebadores adicionales, con menos de 1500 cebadores adicionales, con menos de 1600 cebadores adicionales, con menos de 1700 cebadores adicionales, con menos de 1800 cebadores adicionales, con menos de 1900 cebadores adicionales, con menos de 2000 cebadores adicionales, con menos de 2100 cebadores adicionales, con menos de 2200 cebadores adicionales, con menos de 2300 cebadores adicionales, con menos de 2400 cebadores adicionales, con menos de 2500 cebadores adicionales, con menos de 2600 cebadores adicionales, con menos de 2700 cebadores adicionales, con menos de 2800 cebadores adicionales, con menos de 2900 cebadores adicionales, con menos de 3000 cebadores adicionales, con menos de 3500 cebadores adicionales o con menos de 4000 cebadores adicionales.

La reacción de amplificaciónpuede serllevada a cabo,porejemplo, con menos de 2 cebadores,con menos de 3 cebadores,con menos de 4 cebadores,con menos de 5 cebadores,con menos de 6 cebadores,con menos de 7 cebadores,con menos de 8 cebadores,con menos de 9 cebadores,con menos de 10 cebadores,con menosde 11 cebadores,con menos de 12 cebadores,con menos de 13 cebadores,con menos de 14 cebadores,con menosde 15 cebadores,con menosde 16 cebadores,con menos de 17 cebadores,con menos de 18 cebadores,con menos de 19 cebadores,con menos de 20 cebadores,con menosde 21cebadores,con menos de 22 cebadores,con menos de 23 cebadores,con menos de 24 cebadores,con menos de 25 cebadores,con menosde 26 cebadores,con menos de 27 cebadores,con menos de 28 cebadores,con menos de 29 cebadores,con menos de 30 cebadores,con menosde 31 cebadores,con menos de 32 cebadores,con menos de 33 cebadores,con menos de 34 cebadores,con menos de 35 cebadores,con menosde 36 cebadores,con menos de 37 cebadores,con menos de 38 cebadores,con menos de 39 cebadores,con menos de 40 cebadores,con menosde 41cebadores,con menos de 42 cebadores,con menos de 43 cebadores,con menos de 44 cebadores,con menos de 45 cebadores,con menosde 46 cebadores,con menos de 47 cebadores,con menos de 48 cebadores,con menos de 49 cebadores,con menos de 50 cebadores,con menosde 51 cebadores,con menos de 52 cebadores,con menos de 53 cebadores,con menos de 54 cebadores,con menosde 55 cebadores,con menosde 56 cebadores,con menos de 57 cebadores,con menos de 58 cebadores,con menos de 59 cebadores,con menosde 60 cebadores,con menosde 61cebadores,con menos de 62 cebadores,con menos de 63 cebadores,con menos de 64 cebadores,con menosde 65 cebadores,con menosde 66 cebadores,con menos de 67 cebadores,con menos de 68 cebadores,con menos de 69 cebadores,con menosde 70 cebadores,con menosde 71cebadores,con menos de 72 cebadores,con menos de 73 cebadores,con menos de 74 cebadores,con menosde 75 cebadores,con menosde 76 cebadores,con menos de 77 cebadores,con menos de 78 cebadores,con menos de 79 cebadores,con menos de 80 cebadores,con menosde 81cebadores,con menos de 82 cebadores,con menos de 83 cebadores,con menos de 84 cebadores,con menos de 85 cebadores,con menosde 86 cebadores,con menos de 87 cebadores,con menos de 88 cebadores,con menos de 89 cebadores,con menos de 90 cebadores,con menosde 91cebadores,con menos de 92 cebadores,con menos de 93 cebadores,con menos de 94 cebadores,con menos de 95 cebadores,con menosde 96 cebadores,con menos de 97 cebadores,con menos de 98 cebadores,con menos de 99 cebadores,conmenosde 100cebadores,conmenosde 110cebadores,con menos de 120cebadores,conmenosde 130 cebadores,conmenosde 140 cebadores,conmenosde150cebadores,conmenosde 160cebadores,con menos de 170cebadores,conmenosde 180cebadores,conmenosde 190 cebadores,conmenosde200cebadores,conmenosde210cebadores,con menos de220cebadores,conmenosde 230cebadores,conmenosde 240 cebadores,conmenosde250cebadores,conmenosde260cebadores,con menos de270cebadores,conmenosde280 cebadores,conmenosde 290 cebadores,conmenosde300cebadores,conmenosde310cebadores,con menos de320cebadores,conmenosde330 cebadores,conmenosde 340 cebadores,conmenosde350cebadores,conmenosde360cebadores,con menos de370cebadores,conmenosde380 cebadores,conmenosde 390 cebadores,conmenosde400cebadores,conmenosde410cebadores,con menos de420cebadores,conmenosde430 cebadores,conmenosde 440 cebadores,conmenosde450cebadores,conmenosde460cebadores,con menos de470cebadores,conmenosde480 cebadores,conmenosde 490 cebadores,conmenosde500cebadores,conmenosde550cebadores,con menos de600cebadores,conmenosde650 cebadores,conmenosde 700 cebadores,conmenosde750cebadores,conmenosde800cebadores,con menos de850cebadores,conmenosde900 cebadores,conmenosde950 cebadores,con menosde 1000 cebadores,con menosde 1100cebadores, con menosde 1200 cebadores,con menosde 1300 cebadores,con menos de 1400 cebadores,con menos de 1500 cebadores,con menos de 1600 cebadores,con menosde 1700 cebadores,con menosde 1800 cebadores, con menosde 1900 cebadores,con menosde 2000 cebadores,con menos de 2100 cebadores,con menos de 2200 cebadores,con menos de 2300 cebadores, con menos de 2400 cebadores, con menos de 2500 cebadores, con menos de 2600 cebadores, con menos de 2700 cebadores, con menos de 2800 cebadores, con menos de 2900 cebadores, con menos de 3000 cebadores, con menos de 3500 cebadores o con menos de 4000 cebadores.

Los cebadores descritos pueden presentar uno o más nucleótidos modificados. En la presente se hace referencia a dichos cebadores como cebadores modificados. También es posible emplear cebadores quiméricos. Los cebadores quiméricos son cebadores con al menos dos tipos de nucleótidos, tales como dos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, ribonucleótidos y nucleótidos modificados, dos o más tipos de nucleótidos modificados, desoxirribonucleótidos, y dos o más tipos diferentes de nucleótidos modificados, ribonucleótidos, y dos o más tipos diferentes de nucleótidos modificados, o desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y dos o más tipos diferentes de nucleótidos modificados. Una forma de cebador quimérico es la de cebadores de ácidos nucleicos/ácidos péptidonucleicos.

Por ejemplo, los cebadores 5’-PNA-ADN-3’ o 5’-PNA-ARN-3’ pueden ser utilizados para la invasión de polimerización o la invasión de cadena más eficaz. Por ejemplo, otras formas de cebadores quiméricos son 5’-(2’-O-Metilo)ARN-ARN-3’ o 5’-(2’-0-Metilo)ARN-ADN-3’.

Se conocen muchos nucleótidos modificados (análogos de nucleótidos) y pueden ser utilizados en oligonucleótidos. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene algún tipo de modificación, ya sea en los restos básicos, de azúcares o de fosfatos. Las modificaciones al resto básico incluirían modificaciones naturales y sintéticas de A, C, G y T/U, así como diferentes bases purinas o pirimidinas, tal como uracil-5-ilo, hipoxantin-9-ilo (I) y 2-aminoadenin-9-ilo. Una base modificada incluye, de modo no taxativo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Se pueden encontrar modificaciones de bases adicionales, por ejemplo, en la patente estadounidense N.° 3687808, Englisch et ál., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, págs. 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993. Determinados análogos de nucleótidos, tales como pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. La 5-metilcitosina puede aumentar la estabilidad de la formación de dúplex. Otras bases modificadas son aquellas que funcionan como bases universales. Las bases universales incluyen 3-nitropirrolo y 5-nitroindol. Las bases universales sustituyen las bases normales, pero no tienen preferencias para el apareamiento de bases. Esto quiere decir que las bases universales pueden aparearse con cualesquiera otras bases. No se considera que un cebador con una o más bases universales sea un cebador con una secuencia específica.

A menudo, las modificaciones de bases pueden combinarse, por ejemplo, con modificaciones de azúcares, tales como 2'-O-metoxietilo, para lograr propiedades únicas tales como mayor estabilidad de dúplex. Existen numerosas patentes estadounidenses tales como 4845205, 5 130 302, 5 134066, 5 175273, 5367066, 5432272, 5457 187, 5459255, 5484908, 5502 177, 5525711 , 5552540, 5587469, 5594 121 5596091 , 5614617 y 5 681 941 en las que se detalla y describe un una variedad de modificaciones de bases. Cada una de dichas patentes se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Los análogos de nucleótidos también pueden incluir modificaciones del resto de azúcar. Las modificaciones del resto de azúcar incluirían modificaciones naturales de la ribosa y la desoxirribosa, así como modificaciones sintéticas. Las modificaciones de azúcares incluyen, de modo no taxativo, las siguientes modificaciones en posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alqulnilo pueden estar sustituidos o no sustituidos por alquilo C1 a C10, o alquenilo y alquinilo C2 a C10. Las modificaciones de azúcares en 2' también incluyen, de modo no taxativo, -0[(CH2)n 0]m CH3, -0(CH2)n OCH3, -0(CH2)n NH2, -0(CH2)n CH3, -0(CH2)n -ONH2 y -0(CH2)n0N[(CH2)n CH3)]2, donde n y m varían de 1 a alrededor de 10.

Otras modificaciones en posición 2' incluyen, de modo no taxativo: alquilo inferior de C1 a C10, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo o alquilo inferior sustituido, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02 CH3, 0NO2, N02I N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes con propiedades similares. Pueden realizarse modificaciones similares en otras posiciones en el azúcar, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 31 o en los oligonucleótidos unidos en la posición 2'-5‘ y en la posición 5‘ del nucleótido del extremo 5'. Los azúcares modificados también incluirían los que contienen modificaciones en el oxígeno del anillo que forma un puente, tales como CH2 y S. Los análogos de azúcares de nucleótidos también pueden presentar miméticos de azúcares tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo.

Existe gran cantidad de patentes estadounidenses que presentan información sobre la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas, tales como 4981 957, 5 118800, 5319080, 5359044, 5393878, 5 446 137, 5466786, 5514785, 5519 134, 5567811, 5576427, 5 591 722, 5597909, 5610300, 5627053, 5639873, 5646265, 5 658873, 5670633 y 5700920, cada una de las cuales se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

Los análogos de nucleótidos también pueden modificarse en el resto fosfato. Los restos fosfato modificados incluyen, de modo no taxativo, los que pueden ser modificados de forma tal que el enlace entre dos nucleótidos contenga un fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosforotriéster, aminoalquilfosforotriéster, fosfonatos de metilo y otros alquilos que incluyen 3'-alquilenfosfonato y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos. Se entiende que dichos enlaces fosfato o fosfato modificados entre dos nucleótidos pueden establecerse a través de enlace 3'-5' o enlace 2'-5', y el enlace puede contener polaridad inversa, tal como 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen varias sales, sales mixtas y formas ácidas libres. Gran cantidad de patentes estadounidenses presentan información relativa a la producción y el uso de fosfatos modificados que contienen nucleótidos, y estas incluyen, de modo no taxativo, 3687808, 4469863, 4476301 , 5023243, 5 177 196, 5 188897, 5264423, 5276019, 5 278302, 5286717, 5321 131 , 5399676, 5405939, 5453496, 5 455233, 5466677, 5476925, 5519 126, 5536821 , 5541 306, 5 550 111 , 5563253, 5571 799, 5587361 y 5625050, cada una de las que se incorpora en la presente mediante esta referencia.

Se entiende que sólo es necesario que los análogos de nucleótidos contengan una única modificación, pero también pueden contener múltiples modificaciones en uno de los restos o entre restos diferentes.

Los sustitutos de nucleótidos son moléculas con propiedades funcionales similares a las de los nucleótidos, pero que no contienen un resto fosfato, tal como un ácido péptidonucleico (PNA). Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que reconocerán ácidos nucleicos complementarios y que se hibridarán con ellos conforme al modelo de Watson y Crick o al de Hoogsteen, pero que se enlazan entre sí a través de un resto diferente a un resto fosfato. Los sustitutos de nucleótidos tienen la capacidad de conformar una estructura tipo doble hélice al interactuar con las moléculas de ácido nucleico adecuadas.

Los sustitutos de nucleótidos son nucleótidos o análogos de nucleótidos en los que se reemplazó el resto fosfato y/o los restos de azúcares. Los sustitutos de nucleótidos no contienen un átomo de fósforo estándar. Por ejemplo, los sustitutos de fosfato pueden ser enlaces internucleosídicos cicloalquilo o alquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos cicloalquilo o alquilo y heteroátomos mezclados, o uno o más enlaces internucleosídicos heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta. Estas incluyen aquellas con enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes componentes N, O, S y CH2 mezcladas. Gran cantidad de patentes estadounidenses describen formas de producción y de uso de dichos tipos de reemplazos de fosfatos e incluyen, de modo no taxativo, 5034506, 5 166315, 5185444, 5214134, 5216 141, 5235 033, 5264562, 5264564, 5405938, 5434257, 5466677, 5470 967, 5489677, 5541 307, 5561 225, 5596086, 5602240, 5610 289, 5602240, 5608046, 5610289, 5618704, 5623070, 5663 312, 5633360, 5677437 y 5677439, cada una de las que se incorpora en la presente mediante esta referencia.

También se entiende que en un sustituto de nucleótido tanto los restos azúcares como fosfato del nucleótido pueden ser reemplazados, por ejemplo, por un enlace tipo amida (aminoetilglicina) (PNA). Las patentes estadounidenses 5539082, 5714331 y 5719262 plantean cómo producir y utilizar moléculas de PNA, y se incorporan a la presente mediante esta referencia. (Véase también Nielsen etál., Science 254:1497-1500 (1991)).

Los cebadores pueden comprender nucleótidos y pueden producirse a partir de diferentes tipos de nucleótidos o del mismo tipo de nucleótidos. Por ejemplo, uno o más de los nucleótidos en un cebador pueden ser ribonucleótidos, 2'-O-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-0-metil ribonucleótidos; de alrededor de 10 % a alrededor de 50 % de los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, 2'-0-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-0-metil ribonucleótidos; alrededor de 50 % o más de los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, 2'-0-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-0-metil ribonucleótidos; o todos los nucleótidos son ribonucleótidos, 2'-0-metil ribonucleótidos o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-0-metil ribonucleótidos. Los nucleótidos pueden comprender bases (es decir, la parte básica del nucleótido) y pueden comprender diferentes tipos de bases (y, normalmente, los comprenderán).

Diseño de secuencia de captura La secuencia de captura, a la que también se hace referencia en la presente como «segunda secuencia de ácido nucleico», es complementaria a la plantilla, de forma que se híbrida a la molécula de ácido nucleico diana posteriormente al extremo 3' del cebador. En algunas modalidades, se desea resistencia a las mutaciones en el ácido nucleico diana y se diseña la secuencia de captura con una temperatura de fusión mayor que la temperatura de reacción. En dichas modalidades, la secuencia de captura es diseñada con una Tm aislada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más grados por encima de la temperatura de reacción. Por ejemplo, la segunda secuencia o secuencia de captura puede encontrarse entre alrededor de 0 °C y 40 °C, entre alrededor de 5 °C y 30 °C, entre alrededor de 7 °C y 25 °C por encima de la temperatura de reacción. En algunas modalidades, la temperatura de fusión prevista para la secuencia de captura también es obtenida en el caso de los mutantes esperados. En dichas modalidades, la Tm aislada de la secuencia de captura de los mutantes esperados se encuentra entre alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19, 20 O más grados Celsius por debajo de la temperatura de reacción, o 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50 O más grados Celsius por encima de la temperatura de reacción. Por ejemplo, puede ser 10 °C menor que la temperatura de reacción y 30 °C mayor que la temperatura de reacción, entre alrededor de 3 °C menor que la temperatura de reacción y alrededor de 10 °C mayor de la temperatura de reacción.

Para alcanzar dichas temperaturas de fusión, la extensión de la secuencia de captura puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75 O más bases. Por ejemplo, puede ser de entre alrededor de 20 y alrededor de 50, entre alrededor de 22 y alrededor de 40, entre alrededor de 23 y alrededor de 37 bases.

En algunas modalidades, se desea incluso mayor resistencia a las mutaciones en la secuencia diana. En dichas modalidades, además de una captura de secuencia con una Tm aislada de entre alrededor de 0 °C y 40 °C mayor que la temperatura de reacción, se diseña el cebador cooperativo con una Tm aislada de entre alrededor de 7 °C menor y alrededor de 20 °C mayor, entre alrededor de 5 °C menor y alrededor de 10 °C mayor, entre alrededor de 3 °C menor y alrededor de 3 °C mayor que la temperatura de reacción. La interacción cooperativa entre el cebador y la secuencia de captura resultará en una Tm efectiva incluso mayor para el cebador cooperativo, lo que la volverá prácticamente insensible a las mutaciones en la secuencia. En comparación, puede ser necesario que un cebador normal tenga una extensión de 5 a 30 bases adicionales para que presente una resistencia equivalente a mutaciones en la secuencia diana y, por consiguiente, sería mucho más susceptible a la formación de dímeros cebadores.

En otras modalidades, se prefiere una mayor resistencia a dímeros cebadores y se diseña la temperatura de fusión de la secuencia de ácido nucleico de captura, o segunda secuencia, aislada para que sea menor que la temperatura de reacción. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de captura, o segunda secuencia, se encuentra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más grados por debajo de la temperatura de reacción, o fase de hibridación, de PCR. En modalidades preferidas, la Tm de la secuencia de ácido nucleico de captura, o segunda secuencia, se encuentra entre alrededor de 0 °C y 12 °C, entre alrededor de 1 °C y 8 °C, entre alrededor de 2 °C y 5 °C por debajo de la temperatura de reacción. Para alcanzar dichas temperaturas de fusión bajas, la extensión de la secuencia de captura puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más bases. Por ejemplo, la segunda secuencia de ácido nucleico o de captura pueden encontrarse entre alrededor de 5 y 30, entre alrededor de 8 y 25, entre alrededor de 10 y 22 bases.

En algunas modalidades, la secuencia de captura se une a la secuencia diana y la libera rápidamente, de forma tal que la polimerasa se pueda extender bajo la secuencia de captura y dejar la secuencia de captura intacta. En algunas modalidades, esto es mejorado con un cebador cooperativo con el enlazador unido al extremo 5' de la secuencia de captura. En una modalidad preferida, la polimerasa es capaz de escindir la secuencia de captura durante la extensión. En una modalidad preferida, esto es mejorado con un cebador cooperativo con el enlazador unido al extremo 3' de la secuencia de captura.

Enlazador Resulta importante la cantidad de bases entre el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico o cebador, y el extremo 5' de las ubicaciones de hibridación de la segunda secuencia de ácido nucleico o secuencia de captura en la plantilla. En algunas modalidades, la cantidad de bases entre el cebador y la secuencia de captura es 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50. Por ejemplo, pueden ser entre alrededor de 0 y 30, entre alrededor de 0 y 20, entre alrededor de 0 y 10 bases.

Si se desea la escisión de la secuencia de captura, cuantas más bases existan entre los dos sitios, más largo tendrá que ser el enlazador. Cuanto más largo sea el enlazador, más entropía ingresa al sistema, lo cual disminuye el efecto de la unión cooperativa. Esto se expresa en la siguiente ecuación: Donde Kef es la constante de equilibrio cooperativo o eficaz, Kcebador es la constante de equilibrio del cebador aislado, Kcaptura es la constante de equilibrio de la secuencia de captura en equilibrio y Le es la concentración local definida como: Donde r es la extensión del enlazador en decímetros. Esto provee una concentración local eficaz en molaridad debido a la interacción cooperativa entre el cebador y la sonda. Por consiguiente, la extensión del enlazador determina directamente la contribución cooperativa (LcKcebadorKcaptura) respecto a la constante de equilibrio eficaz.

Se puede calcular Kcebador y capíUra mediante la obtención de valores de entalpia y entropía para las secuencias de captura y el cebador con el vecino más próximo u otros cálculos conocidos por los expertos en la téenica.

La cantidad total de plantilla unida por el cebador se puede calcular de la siguiente manera: donde Tcebador es la plantilla unida por el cebador, T0 es la cantidad total de plantilla y P0 es la concentración cooperativa de cebador de partida. Se puede observar que el efecto cooperativo es mayor cuando LcKcebadorKcaptura es mucho mayor que Kcebador· Para que esto ocurra, la extensión del enlazador debe ser lo más corta posible.

Si bien la matemática muestra que la extensión del enlazador debería ser lo más corta posible, existen varias limitaciones respecto a qué tan corto puede ser el enlazador. Cuando la secuencia de captura y la sonda se unen a la plantilla, forman hélices dobles rígidas. La extensión del enlazador debe ser suficiente para ubicar esta estructura.

En algunas modalidades, el enlazador une el extremo 5' del cebador al extremo 3' de la secuencia de captura (Figura 2). En esta modalidad, el enlazador es más largo que la extensión combinada de secuencias de captura y de cebador. En una modalidad preferida en la que el enlazador se une al extremo 3‘ de la secuencia de captura, el enlazador comprende 6 hexaetilengllcoles. En otra modalidad, el cebador se invierte de manera que el extremo 51 del cebador esté unido al extremo 5' de la secuencia de captura (Figura 3). En esta modalidad, el enlazador es más largo que el cebador. En una modalidad preferida en la que el enlazador se une al extremo 5' de la secuencia de captura, el enlazador comprende 3 hexaetilenglicoles. En aun otra modalidad, el extremo 3' de la secuencia de captura se encuentra unido al medio del cebador (Figura 1). En esta instancia, el enlazador puede ser más corto que la extensión del cebador.

Los expertos en la téenica conocen una variedad de tipos de enlazadores y composiciones. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, enlazadores carbono y polietilenglicol. Los enlazadores se pueden unir a través de una variedad de métodos que incluyen, de modo no taxativo, enlaces covalentes, enlaces iónicos, unión de hidrógeno, asociación polar, asociación magnética y asociación de van der wals. Un método preferido es la unión covalente a través de métodos de síntesis de ADN estándar.

La extensión de enlazadores de polietilenglicol es de alrededor de 0,34 nm por monómero. En algunas modalidades, la extensión del enlazador de polietilenglicol es de entre alrededor de 1 y 90, entre alrededor de 2 y 50, entre alrededor de 3 y 30 monómeros (entre alrededor de 1 y 10 nm completamente extendido).

Uso de secuencia de captura como sonda En algunas modalidades, es preferible hacer que la secuencia de captura también sirva como sonda. En algunas modalidades, esto se logra a través de la adición de una o más marcas en la secuencia de captura. En una modalidad preferida, las marcas incluyen un par FRET.

Los expertos en la téenica conocen varias construcciones de sonda de ácido nucleico. Esto incluye, de modo no taxativo, sondas con doble marcado, sondas con horquillas y sondas con marcado único (ver Figura 4).

En algunas modalidades, se desea una señal de fondo baja para la relación de señal alta respecto al ruido. En algunas modalidades, se utiliza una sonda de horquilla para proveer mayor inactivación del contacto para colaborar en el suministro de una señal alta respecto al ruido.

En otras modalidades, se desea una sonda más corta para minimizar los dímeros cebador-sonda. En algunas modalidades que requieren una sonda más corta, se utiliza una sonda con doble marcado. En modalidades que requieren un énfasis aún mayor en la reducción de productos de extensión espuria, la temperatura de fusión del complejo de sonda diana aislada es menor que la temperatura de reacción.

Los expertos en la téenica conocen una variedad de métodos para detectar la señal de sondas marcadas. En algunas modalidades, se utiliza una polimerasa que escinde la sonda y libera un marcador que modifica la señal. En otras modalidades, se utiliza una polimerasa que no escinde la sonda. En su lugar, la señal es modificada por la hibridación de la sonda con la plantilla.

Uso de un cebador con un mecanismo de detección propio En algunas modalidades, el cebador presenta un mecanismo de detección. En algunas modalidades, el mecanismo de detección incluye una o más marcas detectables. En una modalidad preferida, el mecanismo de detección incluye un par FRET. Los ejemplos de cebadores con mecanismos de detección propios incluyen, de modo no taxativo, cebadores Amplifluor, cebadores Rapid Detex y otros conocidos por el experto en la técnica. Un ejemplo de ello se observa en la Figura 7.

Los ácidos nucleicos cooperativos con mecanismos de detección pueden ser más útiles para realizar ensayos de diseñadores que los ácidos nucleicos no cooperativos (cebadores normales) con mecanismos de detección. Sin restringirse por la teoría, esto se debe a que es menos probable que los ácidos nucleicos cooperativos generen una señal de productos no específicos, como dímeros cebadores.

En algunas modalidades, se utiliza un marcador de unión de ácido nucleico, tal como SYBR Green, para controlar el avance de la reacción de amplificación.

Las sondas de cambio fluorescente y los cebadores de cambio fluorescente hacen referencia a todas las sondas y cebadores que implican un cambio en la intensidad de la fluorescencia o la longitud de onda con base en un cambio en la forma o la conformación de la sonda o el cebador y el ácido nucleico a ser detectado, utilizado en un ensayo o replicado. Los ejemplos de cebadores y sondas de cambio fluorescente incluyen balizas moleculares, Amplifluors, sondas FRET, sondas FRET que se pueden escindir, sondas TaqMan, cebadores Scorpion, oligos triples fluorescentes, polímeros conjugados solubles en agua fluorescentes, sondas de PNA y sondas QPNA.

Los cebadores y las sondas de cambio fluorescente se pueden clasificar conforme a su estructura y/o función. Las sondas de cambio fluorescente incluyen sondas de horquilla inactivadas, sondas de escisión inactivadas, sondas de escisión activadas y sondas fluorescentes activadas. Los cebadores de cambio fluorescente incluyen cebadores de vástago inactivados y cebadores de horquilla inactivados. El uso de varios tipos de cebadores y sondas de cambio fluorescente se discute en Schweitzer y Kingsmore, Curr. Opin. Biotech. 12:21-27 (2001). Hall etái, Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 97:8272-8277 (2000), describe el uso de sondas de cambio fluorescente con ensayos Invader.

Las sondas de horquilla inactivadas son sondas que cuando no se encuentran unidas a una secuencia diana, forman una estructura de horquilla (y, normalmente, un lazo) que aproxima un marcador fluorescente y un resto de inactivación de manera que la fluorescencia del marcador sea inactivada. Cuando la sonda se une a una secuencia diana, se interrumpe el vástago, el resto de inactivación ya no se encuentra en la proximidad del marcador fluorescente y aumenta la fluorescencia. Los ejemplos de sondas de horquilla inactivadas son balizas moleculares, oligos triples fluorescentes y sondas QPNA.

Las sondas activadas por escisión son sondas en las que la fluorescencia aumenta por escisión de la sonda. Las sondas activadas por escisión pueden incluir un marcador fluorescente y un resto de inactivación en la proximidad, de manera que la fluorescencia del marcador sea inactivada. Cuando la sonda se corta o se digiere (normalmente por la actividad de exonucleasa en los extremos 5'-3' de una polimerasa durante la amplificación), el resto de inactivación ya no se encuentra próximo al marcador fluorescente y la fluorescencia incrementa. Las sondas TaqMan (Holland et á/., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:7276-7280 (1991)) son un ejemplo de sondas activadas por escisión.

Las sondas activadas por escisión son sondas en las que la fluorescencia disminuye o se altera por escisión de la sonda. Las sondas inactivadas por escisión pueden incluir un marcador fluorescente aceptor y un resto donante de manera que cuando el aceptor y el donante se encuentren próximos, la transferencia de energía de resonancia fluorescente del donante al aceptor cause que el aceptor se torne fluorescente. Por lo tanto, las sondas son fluorescentes, por ejemplo, cuando se hibridan con una secuencia diana. Cuando la sonda se escinde o se digiere (normalmente por la actividad de exonucleasa en los extremos 5'-3' de una polimerasa durante la amplificación), el resto donante ya no se encuentra próximo al marcador fluorescente aceptor y la fluorescencia del aceptor disminuye. Si el resto donante es en sí mismo un marcador fluorescente, puede liberar energía como fluorescencia (normalmente a una longitud de onda distinta que la fluorescencia del aceptor) cuando no se encuentra en la proximidad de un aceptor. El efecto general sería entonces una reducción de la fluorescencia del aceptor y un aumento de la fluorescencia del donante. La fluorescencia del donante en el caso de las sondas inactivadas por escisión es equivalente a la fluorescencia generada por sondas activadas por escisión, con el aceptor como resto de inactivación y el donante como marcador fluorescente. Las sondas FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) que se pueden escindir son un ejemplo de sondas inactivadas por escisión.

Las sondas activadas fluorescentes son sondas o pares de sondas en las que la fluorescencia aumenta o se altera mediante hibridación de la sonda con una secuencia diana. Las sondas activadas fluorescentes pueden incluir un marcador fluorescente aceptor y un resto donante de manera que cuando el aceptor y el donante se encuentren próximos (cuando las sondas se hibridan con una secuencia diana), la transferencia de energía de resonancia fluorescente del donante al aceptor cause que el aceptor se torne fluorescente. Las sondas activadas fluorescentes son normalmente pares de sondas diseñadas para hibridarse con secuencias contiguas, de manera que el aceptor y el donante se aproximen. Las sondas activadas fluorescentes también pueden ser sondas únicas que contengan tanto un donante como un aceptor en las que, cuando la sonda no híbrida con una secuencia diana, el donante y el aceptor no se encuentran próximos, pero en las que el donante y el aceptor se aproximan cuando la sonda híbrida con una secuencia diana. Esto se puede lograr, por ejemplo, al colocar el donante y el aceptor en extremos opuestos de la sonda y al colocar secuencias de complemento dianas en cada extremo de la sonda, en la que las secuencias de complemento dianas son complementarias para secuencias contiguas en una secuencia diana. Si el resto donante de una sonda activada fluorescente es en sí mismo un marcador fluorescente, puede liberar energía como fluorescencia (normalmente a una longitud de onda distinta que la fluorescencia del aceptor) cuando no se encuentra en la proximidad de un aceptor (es decir, cuando las sondas no están hibridadas con la secuencia diana). Cuando las sondas se hibridan con una secuencia diana, el efecto general sería entonces una reducción de la fluorescencia del donante y un aumento en la fluorescencia del aceptor. Las sondas FRET son un ejemplo de sondas activadas fluorescentes.

Los cebadores de vástago inactivados son cebadores que cuando no se hibridan con una secuencia complementaria forman una estructura de vástago (ya sea una estructura de vástago intramolecular o una estructura de vástago intermolecular) que aproxima un marcador fluorescente y un resto de inactivación, de manera que la fluorescencia del marcador sea inactivada. Cuando el cebador se une a una secuencia complementaria, se interrumpe el vástago, el resto de inactivación ya no se encuentra en la proximidad del marcador fluorescente y aumenta la fluorescencia. En el método que se describió, los cebadores de vástago inactivados se utilizan como cebadores para la síntesis de ácido nucleico y, por lo tanto, se incorporan al ácido nucleico sintetizado o amplificado. Los ejemplos de cebadores de vástago inactivados son cebadores de horquilla inactivados y cebadores de ácidos péptidonucleicos inactivados.

Los cebadores de ácidos péptidonucleicos inactivados son cebadores asociados a un inactivador de ácido péptidonucleico o un flúor de ácido péptidonucleico para formar una estructura de vástago. El cebador contiene un marcador fluorescente o un resto inactivador y se encuentra asociado ya sea con un inactivador de ácido péptidonucleico o un flúor de ácido péptidonucleico, respectivamente. Esto coloca el marcador fluorescente en la proximidad del resto inactivador. Cuando el cebador se multiplica, el ácido péptidonucleico se desplaza, lo que permite que el marcador fluorescente produzca una señal fluorescente.

Los cebadores de horquilla inactivados son cebadores que, cuando no se hibridan con una secuencia complementaria, forman una estructura de horquilla (y, normalmente, un lazo) que aproxima un marcador fluorescente y un resto de inactivación de manera que la fluorescencia del marcador sea inactivada. Cuando el cebador se une a una secuencia complementaria, se interrumpe el vástago, el resto de inactivación ya no se encuentra en la proximidad del marcador fluorescente y aumenta la fluorescencia.

Normalmente, los cebadores de horquilla inactivados se utilizan como cebadores para la síntesis de ácido nucleico y, por lo tanto, se incorporan al ácido nucleico sintetizado o amplificado. Los ejemplos de cebadores de horquilla inactivados son los cebadores Amplifluor (Nazerenko et á/., Nucleic Acids Res. 25:2516-2521 (1997)) y los cebadores Scorpion (Thelwell et él., Nucleic Acids Res. 28(19):3752-3761 (2000)).

Los cebadores activados por escisión son similares a las sondas activadas por escisión, salvo por el hecho de que existen cebadores incorporados en las cadenas de replicación y que posteriormente son escindidos. Little et á/., Clin. Chem. 45:777-784 (1999), describe el uso de cebadores activados por escisión.

Multiplexado con ARMS En algunas modalidades, se desea la detección de múltiples polimorfismos, inserciones, eliminaciones u otras mutaciones. En algunas modalidades, el cebador es diseñado de manera que la base en el extremo 3' se encuentre sobre la mutación. En algunas modalidades, se diseñan polimorfismos adicionales intencionales en el cebador. En una modalidad, la presencia de una sonda unida al cebador permite la detección en tiempo real específica del alelo de múltiples polimorfismos en la misma ubicación.

Diferenciación de mutaciones con la sonda En algunas modalidades, se logra la diferenciación de polimorfismos mediante el uso de la secuencia de captura unida al cebador. En algunas modalidades, la secuencia de captura presenta mutaciones adicionales agregadas intencionalmente para mejorar la diferenciación. En algunas modalidades, la secuencia de captura no se unirá cuando se encuentre presente un polimorfismo, lo cual previene la amplificación eficaz una y otra vez. En algunas modalidades en las que la secuencia de captura presenta un marcador detectable, incluso si ocurre cierta amplificación, la secuencia de captura no se une lo suficiente como para generar una señal detectable.

ARN y otras reacciones En algunas modalidades, se utiliza una polimerasa distinta a la ADN polimerasa. Los expertos en la téenica conocen una variedad de polimerasas y enzimas capaces de agregar una o más bases a una plantilla de ácido nucleico. En algunas modalidades, se desea la transcripción inversa. En algunas modalidades, la sonda tiene una temperatura de fusión lo suficientemente baja como para que la polimerasa se pueda extender abajo de ella. En otras modalidades, un aumento en la temperatura luego de un tiempo para la polimerización inicial elimina la secuencia de captura de la plantilla y permite que la polimerasa se extienda. En otras modalidades, se utilizan secuencias cebadoras adicionales que no presentan una secuencia de captura, lo cual permite que la polimerasa genere copias de forma desinhibida a temperaturas de reacción inferiores.

Moleculas diana de ácido nucleico Las moléculas de ácido nucleico, que son objeto de amplificación, pueden ser cualquier ácido nucleico de cualquier fuente. En general, el método que se describió se lleva a cabo con una muestra de ácido nucleico que contiene (o se sospecha que contiene) moléculas de ácido nucleico a ser amplificadas.

Una muestra de ácido nucleico puede ser cualquier muestra de ácido nucleico de interés. Se conoce la fuente, la identidad y la preparación de muchas de estas muestras de ácido nucleico. Se prefiere que las muestras de ácido nucleico conocidas o identificadas para su uso en los métodos de amplificación o detección sean utilizadas para el método que se describió en la presente. La muestra de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una muestra de ácido nucleico de una o más células, tejidos o fluidos corporales como sangre, orina, semen, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo o líquido amniótico u otras muestras biológicas tales como células de cultivo tisular, exudados bucales, enjuagues bucales, heces, cortes tlsulares, biopsia aspirativa y muestras arqueológicas tales como tejido óseo o momificado. Los tipos de muestras de ácido nucleico útiles incluyen muestras de sangre, muestras de orina, muestras de semen, muestras de líquido linfático, muestras de líquido cefalorraquídeo, muestras de líquido amniótico, muestras de biopsia, muestras de biopsia aspirativa con aguja, muestras de cáncer, muestras de tumores, muestras de tejidos, muestras de células, muestras de lisados de células, muestras de lisados de células en bruto, muestras forenses, muestras arqueológicas, muestras de infecciones, muestras de infecciones hospitalarias, muestras de producción, muestras de preparación de fármacos, muestras de producción de moléculas biológicas, muestras de preparación de proteínas, muestras de preparación de lípidos y/o muestras de preparación de carbohidratos.

Para la amplificación de genomas completos, las muestras de ácido nucleico preferidas son las muestras de ácido nucleico de una única célula. Las muestras de ácido nucleico a ser utilizadas en el método que se describió son preferentemente moléculas de ácido nucleico y muestras complejas y no repetitivas. En el caso en que la muestra de ácido nucleico es una muestra de ácido nucleico genómico, el genoma puede ser el genoma de cualquier organismo de interés. Por ejemplo, el genoma puede ser un genoma viral, un genoma bacteriano, un genoma eubacteriano, un genoma bacteriano archae, un genoma fúngico, un genoma microbiano, un genoma eucariota, un genoma vegetal, un genoma animal, un genoma de vertebrado, un genoma de invertebrado, un genoma de insecto, un genoma de mamífero o un genoma humano. El genoma diana es preferentemente puro o sustancialmente puro, pero esto no es necesario. Por ejemplo, una muestra genómica de una fuente animal puede incluir ácido nucleico de organismos que contaminan o infectan.

La muestra de ácido nucleico puede ser, o puede derivar de, por ejemplo, uno o más genomas completos del mismo o distintos organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más genomas parciales del mismo o distintos organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más cromosomas completos del mismo o distintos organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más cromosomas parciales del mismo o distintos organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más fragmentos de cromosoma del mismo o distintos organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más cromosomas artificiales; uno o más cromosomas artificiales de levadura; uno o más cromosomas artificiales de bacterias; uno o más cósmidos; o cualquier combinación de estos.

Síntesis de oligonucleótidos Se puede sintetizar cebadores, sondas de detección, sondas de dirección y cualquier otro oligonucleótido mediante métodos establecidos de síntesis de oligonucleótidos. En la téenica se conocen métodos para producir o sintetizar oligonucleótidos. Dichos métodos pueden variar de digestión enzimática estándar seguida de aislamiento del fragmento de nucleótido (véase por ejemplo, Sambrook et á/., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a Edición (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989) Capítulos 5, 6) a métodos estrictamente sintéticos, por ejemplo, con el método de cianoetil fosforamidita. De forma rutinaria se realiza la síntesis química de fase sólida de fragmentos de ADN y se utiliza cianoetil fosforam iditas de nucleósido protegido (S. L. Beaucage et ál. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859). En este enfoque, el grupo 3’-hidroxilo de un nucleósido protegido en 5' inicial, primero se une en forma covalente al soporte del polímero (R. C. Pless et ál. (1975) Nucleic Acids Res. 2:773 (1975)). Luego, la síntesis del oligonucleótido procede a la desprotección del grupo 5'-hidroxilo del nucleósido unido, seguido por el acoplamiento de un nucleósido-3'-fosforamidita que ingresa al grupo hidroxilo desprotegido ( . D. Matteucci et ál. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185). Finalmente, el triéster de fosfito se oxida con un fosforotriéster para completar el enlace internucleótido (R. L. Letsinger et ál. (1976) J. Am. Chem. Soc. 9:3655). De manera alternativa, se puede llevar a cabo la síntesis de enlaces de fosforotioato mediante sulfuración del triéster de fosfito. Para realizar dicha reacción se pueden utilizar varios químicos, entre ellos 3H-1 ,2-benzoditiol-3-ona, 1 ,1 -dióxido (R.P. lyer, W. Egan, J.B. Regan y S.L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 1253-1254). Se repiten las etapas de desprotección, acoplamiento y oxidación hasta que se obtenga un oligonucleótido de extensión y secuencia deseadas. Existen otros métodos para generar oligonucleótidos tales como el método H-fosfonato (Hall et ál., (1957) J. Chem. Soc., 3291-3296) o el método de fosfotriéster tal como lo describieron Ikuta et ál., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (métodos con fosfotriéster y triéster de fosfito), y Narang et ál., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (método de fosfotriéster). Se pueden elaborar moléculas de proteínas de ácido nucleico mediante métodos conocidos tales como los que describieron Nielsen et ál., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994). En la patente estadounidense N.° 6294664 y en la patente estadounidense N.° 6291 669 se describieron otras formas de síntesis de oligonucleótidos.

Generalmente, la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido es determinada por el orden secuencial en el que las subunidades de bloques de subunidades se agregan, durante la síntesis, a la cadena de oligonucleótidos. Cada ronda de adición puede implicar un precursor de nucleótidos específico diferente o una mezcla de uno o más precursores de nucleótidos distintos. Para los cebadores de secuencia específica que se describieron, se agregarían precursores de nucleótidos específicos en forma secuencial.

Muchos de los oligonucleótidos que se describieron en la presente son diseñados para ser complementarios de determinadas partes de otros oligonucleótidos o ácidos nucleicos de manera que puedan formarse híbridos estables entre ellos. Se puede calcular la estabilidad de dichos híbridos mediante métodos tales como los que describieron Lesnick y Freier, Biochemistry 34:10807-10815 (1995), McGraw et ál., Biotechniques 8:674-678 (1990), y Rychlik etál., Nucleic Acids Res. 18:6409-6412 (1990).

Mientras que conserven su función principal, los cebadores, las sondas de detección, las sondas de dirección y cualquier otro oligonucleótido pueden estar hechos de nucleótidos modificados (análogos de nucleótidos) o incluirlos. Se conocen muchos nucleótidos modificados y se pueden utilizar en oligonucleótidos, y estos se describen en otra parte de la presente memoria.

Kits Los materiales que se describieron anteriormente, así como otros materiales, pueden ser envasados juntos en cualquier combinación adecuada como un kit útil para llevar a cabo el método que se describió o asistir en su puesta en práctica. Es útil que los componentes del kit en un kit dado estén diseñados y adaptados para su uso conjunto en el método que se describió. Por ejemplo, se describieron kits para la amplificación de muestras de ácido nucleico y el kit comprende ácidos nucleicos cooperativos y una ADN polimerasa. Los kits también pueden contener nucleótidos, soluciones amortiguadoras, sondas de detección, sondas de cambio fluorescente, soluciones de lisis, soluciones de estabilización, soluciones de desnaturalización o una combinación.

Usos El método y las composiciones que se describieron son aplicables en varias áreas que incluyen, de modo no taxativo, análisis de ácidos nucleicos presentes en las células (por ejemplo, análisis de ADN genómico en las células), detección de enfermedades, detección de mutaciones, descubrimiento de genes, mapeo de genes (haplotipos moleculares) e investigación agrícola. La amplificación genómica es particularmente útil. Otros usos incluyen, por ejemplo, la detección de ácidos nucleicos en células y en matrices de ADN genómico; haplotipos moleculares; detección de mutaciones, detección de enfermedades hereditarias tales como fibrosis cística, distrofia muscular, diabetes, hemofilia, anemia falciforme; evaluación de la predisposición a cánceres como el cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de páncreas.

Amplificación Los métodos de amplificación adecuados para su uso con los presentes métodos incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa (PCR), PCR de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), reacción de amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), reacción de amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA), amplificación de ADN boomerang (BDA), replicación Q-beta o amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico isotérmica. En la téenica se conocen estos métodos de amplificación y cada uno de ellos se describe brevemente a continuación.

La PCR es una técnica para realizar muchas copias de una plantilla de secuencia de ADN específica. La reacción consiste en múltiples ciclos de amplificación e inicia con un par de oligonucleótidos cebadores que se hibridan con los extremos 5' y 3' de la secuencia a ser copiada. El ciclo de amplificación incluye una desnaturalización inicial y hasta 50 ciclos de alineación, alargamiento (o extensión) de la cadena y separación (desnaturalización) de la cadena. En cada ciclo de la reacción se copia la secuencia de ADN entre los cebadores. Los cebadores se pueden unir al ADN copiado así como a la secuencia de la plantilla original para que la cantidad total de copias aumente exponencialmente con el tiempo. La PCR se puede llevar a cabo según lo estipulado por Whelan et ál., 10urnal of Clinical Microbiology, 33(3):556-561 (1995). En resumen, una mezcla de reacción de PCR incluye dos cebadores específicos, dNTP, polimerasa Taq y 1X solución amortiguadora para PCR, que se amplifica con un ciclador térmico. Los parámetros de ciclado pueden variar en función de, por ejemplo, la temperatura de fusión del cebador o la extensión de ácidos nucleicos a ser extendida. El experto en la técnica es capaz de diseñar y preparar cebadores que son adecuados para amplificar una secuencia diana. La extensión de los cebadores de amplificación a ser utilizados en la presente invención depende de varios factores que incluyen la identidad de la secuencia de nucleótidos y la temperatura a la que tales ácidos nucleicos se hibridan o se utilizan durante la amplificación de ácidos nucleicos ¡n vitro. Un experto en la téenica conoce las consideraciones necesarias para determinar una extensión preferida para un cebador de amplificación con una identidad de secuencia particular e incluyen las consideraciones que se describen en la presente. Por ejemplo, la extensión de un ácido nucleico u oligonucleótido corto puede hacer referencia a su especificidad o selectividad de hibridación.

La PCR en tiempo real es un método de amplificación basado en PCR en el que los productos de PCR son detectados en tiempo real, es decir, se puede determinar la acumulación de productos de PCR en cada ciclo. Un ejemplo de PCR en tiempo real se lleva a cabo con sondas TaqMan en combinación con una amplificación/analizador adecuado tal como el Sistema de detección de secuencias Prism 7900HT Applied Biosystems (ABI), el que es un sistema PCR en tiempo real de alto rendimiento. En resumen, la reacción de amplificación de PCR incluye sondas TaqMan específicas para la secuencia diana amplificada. Estas sondas contienen un marcador indicador en el extremo 5' y un marcador inactivador en el extremo 3'. Las sondas que se hibridan a secuencias dianas distintas están conjugadas con un marcador indicador fluorescente distinto. De esta manera, se puede evaluar más de una secuencia diana en el mismo recipiente de reacción. Durante la PCR, las sondas marcadas por fluorescencia se unen específicamente a sus respectivas secuencias diana; y la actividad nucleasa en 5' de Taq polimerasa escinde el marcador reportero de la sonda y genera una señal fluorescente. El aumento en la señal de fluorescencia se detecta únicamente si la secuencia diana es complementaria a la sonda y se amplifica durante la PCR. Un mal apareamiento entre sonda y diana reduce en gran medida la eficacia de hibridación y escisión de la sonda. Los sistemas de detección de secuencias ABI Prism 7700HT o 7900HT miden el aumento de fluorescencia durante el cielado térmico de PCR y proveen una detección en «tiempo real» de la acumulación del producto de PCR. La detección en tiempo real en los Detectores de secuencias ABI Prism 7900HT o 7900HT controla la fluorescencia y calcula Rn durante cada ciclo de PCR. El ciclo umbral o valor Ct es el ciclo en el que la fluorescencia se intersecta con el valor umbral. El valor umbral es determinado por el software del sistema de detección de secuencias o de forma manual.

«RT-PCR» tal como se usa en la presente hace referencia a la combinación de transcripción inversa y PCR en un único ensayo. La «transcripción inversa» es un proceso por el cual una plantilla de ARN se transcribe a una molécula de ADN mediante una enzima de transcriptasa inversa. Por lo tanto, «transcriptasa inversa» describe una clase de polimerasa caracterizada como ADN polimerasa dependiente de ARN, es decir, dichas polimerasas utilizan una plantilla de ARN para sintetizar una molécula de ADN. Históricamente, las transcriptasas inversas han sido utilizadas para transcribir en forma inversa ARNm en ADNc. Sin embargo, las transriptasas inversas se pueden utilizar para transcribir en forma inversa otros tipos de ARN tal como ARN genómico viral o ARN subgenómico viral. Las transcriptasas inversas estándar incluyen la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloncy (MoMuLV RT) y el virus de la mieloblastosis aviar (AMV). Estas enzimas presentan actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN 5,->3‘, actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN 5'->3' y actividad de RNasa H. Sin embargo, a diferencia de muchas ADN polimerasas dependientes de ADN, estas enzimas carecen de la actividad exonucleasa 3'->5' necesaria para «editar» (es decir, corregir errores cometidos durante la transcripción). Después de que se haya preparado una copia de ADN de un ARN, se puede someter la copia de ADN a varios métodos de amplificación de ADN tal como PCR.

LCR es un método de amplificación de ADN similar a PCR, excepto porque utiliza cuatro cebadores en vez de dos y utiliza la enzima ligasa para vincular o unir dos segmentos de ADN. La LCR se puede llevar a cabo según lo estipulado por Moore et á/., 10urnal of Clinical Microbiology, 36(4): 1028-1031 (1998). En resumen, una mezcla de reacción de LCR contiene dos pares de cebadores, dNTP, ADN ligasa y ADN polimerasa que representa alrededor de 90 ml, a los que se agregan 100 mI de ácido nucleico aislado del organismo diana. La amplificación se lleva a cabo en un cielador térmico (por ejemplo, LCx de Abbott Labs, North Chicago, III.).

TAS es un sistema de amplificación de ácido nucleico en el que cada ciclo comprende una etapa de síntesis de ADNc y una etapa de transcripción de ARN. En la etapa de síntesis de ADNc, se inserta una secuencia reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN (es decir, una secuencia de unión de la polimerasa o PBS) en la copia de ADNc posteriormente a la secuencia marcadora o diana a ser amplificada mediante un cebador oligonucleótido de dos dominios. En la segunda etapa, se utiliza una ARN polimerasa para sintetizar múltiples copias de ARN de la plantilla de ADNc. La amplificación que utiliza TAS requiere únicamente unos pocos ciclos debido a que la transcripción de ARN dependiente de ADN puede resultar en 10-1000 copias por cada copia de la plantilla de ADNc. TAS se puede llevar a cabo conforme a lo dispuesto por Kwoh et ai, PNAS 86:1173-7 (1989). En resumen, se combina el ARN extraído con la solución amortiguadora de amplificación de TAS y albúmina de suero bovino, dNTP, NTP y dos cebadores oligonucleótidos, uno de los cuales contiene un PBS.

La muestra se calienta para desnaturalizar la plantilla de ARN y se enfría a la temperatura de alineación del cebador. Se agrega la transcriptasa inversa (RT) a la muestra incubada a la temperatura adecuada para permitir el alargamiento del ADNc. Posteriormente, se agrega ARN pol T7 y la muestra se incuba a 37 °C durante aproximadamente 25 minutos para la síntesis de ARN. Luego se repiten las etapas anteriores. De manera alternativa, luego de la síntesis de ADNc inicial, se agregan tanto RT como ARN polimerasa luego de la desnaturalización de 1 minuto a 100 °C, seguida de un alargamiento de ARN de aproximadamente 30 minutos a 37 °C. TAS también se puede llevar a cabo en fase sólida conforme a Wylie et ál., 10urnal of Clinical Microbiology, 36(12):3488-3491 (1998). En este método, las dianas de ácido nucleico son capturadas con microesferas magnéticas que contienen cebadores de captura específicos. Las microesferas con dianas capturadas se lavan y se sedimentan antes de agregar los reactivos de amplificación que contienen cebadores de amplificación, dNTP, NTP, 2500 U de transcriptasa inversa y 2500 U de ARN polimerasa T7. Se colocan 100 mI de una mezcla de reacción TMA en un tubo, se agregan 200 mI de reactivo de aceite y se logra la amplificación mediante incubación a 42 °C en un baño de agua durante una hora.

NASBA es un método de amplificación basada en la transcripción que amplifica ARN ya sea de ADN o ARN diana. NASBA es un método utilizado para la amplificación continua de ácidos nucleicos en una única mezcla a una temperatura. Por ejemplo, para la amplificación de ARN, se utilizan la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), RNasa H y ARN polimerasa T7. Este método se puede llevar a cabo de conformidad con Heim et ál., Nucleic Acids Res., 26(9):2250-2251 (1998). En resumen, una mezcla de reacción de NASBA contiene dos cebadores específicos, dNTP, NTP, 6,4 U de transcriptasa inversa del AMV, 0,08 U de Rnasa H de Escherichia coli y 32 U de ARN polimerasa T7. La amplificación se lleva a cabo durante 120 minutos a 41 °C en un volumen total de 201.

En un método relacionado, la reacción de replicación de secuencia autosostenida (3SR), la amplificación isotérmica ¡n vitro de secuencias de ADN o ARN dianas mediante tres actividades enzimáticas: transcriptasa inversa, ARN polimerasa dependiente de ADN y ribonucleasa H de Escherichia coli. Este método puede ser modificado de un sistema de 3 enzimas a un sistema de 2 enzimas mediante el uso de la transcriptasa inversa del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) 1 en lugar de la transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviar (AMV) para permitir la amplificación con ARN polimerasa T7 pero sin la ribonucleasa H de E. coli.

En 3SR de 2 enzimas se obtiene el ARN amplificado en una forma más pura en comparación con 3SR de 3 enzimas (Gebinoga & Oehlenschlager, European 10urnal of Biochemistry, 235:256-261 , 1996).

SDA es un método de amplificación de ácido nucleico isotérmico. Un cebador que contiene un sitio de restricción se encuentra alineado con la plantilla. Luego, los cebadores de amplificación se alinean con las secuencias contiguas en 5' (forman un corte) y la amplificación comienza a una temperatura fija. Las cadenas de ADN recientemente sintetizadas son cortadas por una enzima de restricción y la amplificación de la polimerasa comienza nuevamente y desplaza las cadenas recientemente sintetizadas.

TAS se puede llevar a cabo conforme a lo dispuesto por Walker et ál., PNAS 89:392-6 (1992). En resumen, una mezcla de reacción SDA contiene cuatro cebadores SDA, dGTP, dCTP, TTP, dATP, 150 U de Hiñe II y 5 U de un gran fragmento de ADN polimerasa I de E. coli con deficiencia de exonucleasa (exo. sup. polimerasa de Klenow). La mezcla de muestra se calienta a 95 °C durante 4 minutos para desnaturalizar el ADN diana antes de agregar las enzimas. Después de agregar las dos enzimas, la amplificación se lleva a cabo durante 120 minutos a 37 °C en un volumen total de 50 mI. Luego, la reacción culmina al calentarse durante 2 minutos a 95 °C.

La amplificación del ADN boomerang (BDA) es un método en que la polimerasa comienza a extenderse de un sitio de unión al cebador único y luego hace un bucle alrededor de la otra cadena, y finalmente regresa al sitio cebador original en el ADN. BDA se diferencia de PCR al utilizar un único cebador. Este método implica una digestión de endonucleasas de un ADN de muestra que produce fragmentos de ADN discretos con extremos pegajosos que vinculan los fragmentos con polinucleótidos «adaptadores» (que consisten en un extremo vinculable y una primera y una segunda secuencia autocomplementaria separadas por una secuencia espaciadora) y por lo tanto, forman dúplex vinculados. Los dúplex vinculados se desnaturalizan para formar plantillas con las que se alinea un oligonucleótido cebador en una secuencia específica en la secuencia diana o marcadora de interés. El cebador se extiende con una ADN polimerasa para formar productos dúplex, seguido de la desnaturalización de los productos dúplex. Se realizan múltiples ciclos posteriores de alineamiento, extensión y desnaturalización para lograr el grado deseado de amplificación (patente estadounidense N.° 5 470724).

El sistema de replicación Q-beta utiliza ARN como plantilla. La replicasa Q-beta sintetiza el genoma de ARN de cadena única del colifago Ob. La escisión de ARN y la vinculación con un ácido nucleico de interés permite la replicación de esta secuencia cuando el ARN se replica mediante Q-beta replicasa (Kramer & Lizardi, Trends Biotechnol. 1991 9(2):53-8, 1991).

En la téenica se conoce una variedad de enzimas de amplificación e incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa, Q-beta replicasa, ADN termoestable y ARN polimerasas. Debido a que estas y otras reacciones de amplificación son catalizadas por enzimas en un ensayo de una única etapa, los reactivos que liberan ácido nucleico y los reactivos de detección no deberían ser inhibidores potenciales de enzimas de amplificación si la detección final ha de basarse en la amplificación.

La amplificación de las moléculas de ácido nucleico en una muestra de ácido nucleico puede resultar en la replicación de al menos 0,01 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 0,1 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 1 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 5 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 10 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 20 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 30 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 40 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 50 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 60 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 70 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 80 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 90 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 95 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 96 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 97 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 98 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico o al menos 99 % de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico.

Las distintas representaciones de secuencias que se describieron anteriormente y en otra sección de ia presente pueden ser, por ejemplo, para 1 secuencia diana, 2 secuencias dianas, 3 secuencias dianas, 4 secuencias dianas, 5 secuencias dianas, 6 secuencias dianas, 7 secuencias dianas, 8 secuencias dianas, 9 secuencias dianas, 10 secuencias dianas, 11 secuencias dianas, 12 secuencias dianas, 13 secuencias dianas, 14 secuencias dianas, 15 secuencias dianas, 16 secuencias dianas, 17 secuencias dianas, 18 secuencias dianas, 19 secuencias dianas, 20 secuencias dianas, 25 secuencias dianas, 30 secuencias dianas, 40 secuencias dianas, 50 secuencias dianas, 75 secuencias dianas o 100 secuencias dianas. La representación de secuencias puede ser, por ejemplo, para al menos 1 secuencia diana, al menos 2 secuencias dianas, al menos 3 secuencias dianas, al menos 4 secuencias dianas, al menos 5 secuencias dianas, al menos 6 secuencias dianas, al menos 7 secuencias dianas, al menos 8 secuencias dianas, al menos 9 secuencias dianas, al menos 10 secuencias dianas, al menos 11 secuencias dianas, al menos 12 secuencias dianas, al menos 13 secuencias dianas, al menos 14 secuencias dianas, al menos 15 secuencias dianas, al menos 16 secuencias dianas, al menos 17 secuencias dianas, al menos 18 secuencias dianas, al menos 19 secuencias dianas, al menos 20 secuencias dianas, al menos 25 secuencias dianas, al menos 30 secuencias dianas, al menos 40 secuencias dianas, al menos 50 secuencias dianas, al menos 75 secuencias dianas o al menos 100 secuencias dianas.

La representación de secuencias puede ser, por ejemplo, para 1 secuencia diana, 2 secuencias dianas distintas, 3 secuencias dianas distintas, 4 secuencias dianas distintas, 5 secuencias dianas distintas, 6 secuencias dianas distintas, 7 secuencias dianas distintas, 8 secuencias dianas distintas, 9 secuencias dianas distintas, 10 secuencias dianas distintas, 11 secuencias dianas distintas, 12 secuencias dianas distintas, 13 secuencias dianas distintas, 14 secuencias dianas distintas, 15 secuencias dianas distintas, 16 secuencias dianas distintas, 17 secuencias dianas distintas, 18 secuencias dianas distintas, 19 secuencias dianas distintas, 20 secuencias dianas distintas, 25 secuencias dianas distintas, 30 secuencias dianas distintas, 40 secuencias dianas distintas, 50 secuencias dianas distintas, 75 secuencias dianas distintas o 100 secuencias dianas distintas. La representación de secuencias puede ser, por ejemplo, para al menos 1 secuencia diana, al menos 2 secuencias dianas distintas, ai menos 3 secuencias dianas distintas, al menos 4 secuencias dianas distintas, al menos 5 secuencias dianas distintas, al menos 6 secuencias dianas distintas, al menos 7 secuencias dianas distintas, al menos 8 secuencias dianas distintas, al menos 9 secuencias dianas distintas, al menos 10 secuencias dianas distintas, al menos 11 secuencias dianas distintas, al menos 12 secuencias dianas distintas, al menos 13 secuencias dianas distintas, al menos 14 secuencias dianas distintas, al menos 15 secuencias dianas distintas, al menos 16 secuencias dianas distintas, al menos 17 secuencias dianas distintas, al menos 18 secuencias dianas distintas, al menos 19 secuencias dianas distintas, al menos 20 secuencias dianas distintas, al menos 25 secuencias dianas distintas, al menos 30 secuencias dianas distintas, al menos 40 secuencias dianas distintas, al menos 50 secuencias dianas distintas, al menos 75 secuencias dianas distintas o al menos 100 secuencias dianas distintas.

Detección Los productos de amplificación se pueden detectar mediante el uso de cualquier téenica de detección de ácidos nucleicos. Para la detección en tiempo real, los productos de la amplificación y el avance de la amplificación son detectados durante la amplificación. La detección en tiempo real se logra en forma útil con uno o más o uno o una combinación de sondas de cambio fluorescente y cebadores de cambio fluorescente. Se pueden utilizar otras técnicas de detección, ya sea solas o en combinación con la detección en tiempo real y/o la detección que implica cebadores y sondas de cambio fluorescente. Se conocen muchas técnicas para detectar ácidos nucleicos. La secuencia de nucleótidos de las secuencias amplificadas también se puede determinar mediante cualquier técnica adecuada.

Por ejemplo, se puede detectar un producto de ácido nucleico mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos, por ejemplo, electroforesis (por ejemplo, electroforesis en gel o electroforesis capilar). Los fragmentos amplificados pueden someterse a métodos adicionales de detección, por ejemplo, secuencias variantes (por ejemplo, polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP)). Un método de ejemplo es una extensión de cebador de nucleótido único (Lindblad-Toh et ál., «Large-scale discovery and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse». Nature Genet. Abril de 2000; 24(4):381-6). En esta reacción, se diseña un cebador oligonucleótido para que tenga un extremo 3' que sea un nucleótido 5' respecto a un sitio de mutación específico. En algunas modalidades, los cebadores de extensión están marcados con una etiqueta o un miembro de un par de unión para permitir la captura del cebador en la fase sólida. En modalidades particulares, los cebadores pueden ser etiquetados con extensiones variantes de polinucleótidos no específicos (por ejemplo, poli-GACT) para permitir la detección mediante multiplex de preferentemente 2 o más, más preferentemente 3 o más, 4 o más, 5 o más, incluso 10 o más mutaciones diferentes (polimorfismos) en una única reacción. El cebador se híbrida con el amplicón de PCR en presencia de uno o más ddNTP etiquetados y una ADN polimerasa. La polimerasa extiende el cebador en un nucleótido y agrega un único ddNTP etiquetado en el extremo 3' del cebador de extensión. La adición de un didesoxinucleótido termina el alargamiento de la cadena. Si se utiliza más de un didesoxinucleótido (por ejemplo, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddUTP, etc.) en una reacción, se puede marcar uno o más. Si se utilizan múltiples marcadores, estos se pueden distinguir, por ejemplo, cada uno está marcado con un marcador de color fluorescente diferente. Los productos son oligonucleótidos marcados, cada uno de los cuales se puede detectar con base en su marca. Otros métodos de detección de secuencias variantes incluyen el sistema de genotipado de SNP READIT (Promega Corporation, Madison, Wis.) y ensayos de vinculación de oligonucleótidos.

Ejemplos Ejemplo I: Cebadores para la malaria Las secuencias de captura fueron diseñadas con una Tm de 2 a 5 °C por debajo de la temperatura de reacción de 55 °C. Las secuencias de cebadores fueron diseñadas con una Tm de alrededor de 10 °C por debajo de la temperatura de reacción. Se utilizaron los enlazadores que unen el extremo 5' del cebador al extremo 5' de la sonda (ver Figura 5). 3' TCGCTACGCA 5' (SEQ ID NO: 1) [Espadadora 18] [Espadadora 18] [Espadadora 18] 5' [T(FAM)] ACGGTGAACTCTCA [DABCYL] 3' (SEQ ID NO: 2) 3‘ TCGCTACGCA 5' (SEQ ID NO: 3) [Espadadora 18] [Espadadora 18] [Espadadora 18][Espaciadora 18] 5' (T(FAM)] ACGGTGAACTCTCA [DABCYL] 3' (SEQ ID NO: 4) 3' TCGCTACGCA 5' (SEQ ID NO: 5) [Espadadora 18] [Espadadora 18] [Espadadora 18] [Espadadora 18] 5' [G (FAM)] TCTAACGGTGAACTC [DABCYL] 3' (SEQ ID NO: 6) Se utilizó un cebador normal como cebador inverso y un control con un solo cebador normal como cebador directo, y se utilizó una sonda rápida para la detección. Los cebadores se procesaron en una reacción de PCR en tiempo real con la mezcla maestra de ADN GoTaq y una concentración final de MgCI2 de 5 mM. La concentración final de cebadores fue de 250 nM. Las condiciones de reacción fueron 95 °C durante 20 s, seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 1 s y 55 °C durante 20 s.

Los tres cebadores cooperativos generaron un amplicón detectable y presentaron una señal detectable de la secuencia de captura marcada. El cebador cooperativo sin distancia que separe el cebador y la secuencia de captura se amplificó en forma menos eficaz que los demás.

Se repitió la misma reacción de PCR en tiempo real con una temperatura de alineamiento/extensión de 50 °C. La señal generada por la secuencia de captura marcada fue mayor para los tres cebadores cooperativos. La eficacia de PCR en tiempo real no pareció mejorar a la temperatura más baja.

Ejemplo 2: Secuencias de captura de Tm elevada Las secuencias de captura marcadas fueron diseñadas con una Tm de 7 a 10 °C por encima de la temperatura de reacción de 55 °C. El cebador cooperativo inverso fue elaborado con una secuencia de captura no marcada con una Tm de alrededor de 2 °C menos que la temperatura de reacción. Las secuencias de cebador fueron diseñadas con una Tm de alrededor de 7 a 10 °C por debajo de la temperatura de reacción. 3' TCGCTACGCA 5' (SEQ ID NO: 7) [Espadadora 18] [Espadadora 18] [Espadadora 18] 5' \T (FAM)] ACGGT G AACT CT CATT CCA [DABCYL] 3' (SEQ ID NO: 8) 3' TCGCTACGCA 5' (SEQ ID NO: 9) [Espadadora 18] [Espadadora 18] [Espadadora 18] 5' U(FAM)] ACG GTG AACT CT CATT CCA CCG [DABCYL] 3' (SEQ ID NO: 10) 3' ATTGACATACCTGC 5‘(SEQ ID NO: 11) [Espadadora 18] [Espadadora 18] [Espadadora 18] 5' AGCAAGTGGAATGTT [Phos] 3' (SEQ ID NO: 12) Los cebadores se procesaron en una reacción de POR en tiempo real con la mezcla maestra de ADN GoTaq y una concentración final de gCI2 de 5 mM. La concentración final de cebadores fue de 250 nM. Las condiciones de reacción fueron 95 °C durante 20 s, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 1 s y 55 °C durante 20 s. La POR en tiempo real también se repitió con una etapa de extensión de 40 s.

Los cebadores cooperativos con secuencias de captura con Tm elevada tuvieron una eficacia de amplificación similar y cambio en fluorescencia a las secuencias de captura con Tm baja del Ejemplo 1. El aumento del tiempo de extensión no pareció aumentar la eficacia de amplificación.

Ejemplo 3: Eliminación de dímeros cebadores Los dímeros cebadores se sintetizaron para obtener los cebadores cooperativos y los cebadores normales. Se agregaron 0, 600, 6000 o 600 000 dímeros cebadores a una reacción que contiene 60 copias de ADN de Malaria. Los cebadores se procesaron en una reacción de PCR en tiempo real con la mezcla maestra de ADN GoTaq y una concentración final de MgCI2 de 5 mM. La concentración final de cebadores fue de 250 nM. Las condiciones de reacción fueron 95 °C durante 20 s, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 1 s y 55 °C durante 20 s.

El control con cebadores normales presentó positivos fácilmente visibles cuando no se agregaron dímeros cebadores. Sin embargo, al agregarse apenas 600 dímeros cebadores, la señal desapareció y dio como resultado falsos negativos. Por el contrario, los cebadores cooperativos no presentaron disminución de la señal o pérdida del producto de amplificación incluso al agregarse tantos como 600000 dímeros cebadores.

Cuando se procesó 2,2 % de flashgel de Lonza con los productos de PCR, el gel confirmó el hecho de que no se amplificó dímero cebador alguno para los cebadores cooperativos. Sin embargo, los cebadores normales claramente amplificaron los dímeros cebadores en lugar del ADN de Malaria, lo cual resulta en falsos negativos.

Ejemplo 4: Cebadores cooperativos con mecanismo de detección en el cebador Se produjeron cebadores cooperativos con un mecanismo de detección en el cebador: 3' [Espaciadora 3] TTGTAAGGTGAACGA 5' (SEQ ID NO: 13) 5' [Espadadora 18][T(FAM)] actgtatgg [T(BHQ-1)][Espaciadora 9] CGTCCATACAGTTA 3' (SEQ ID NO: 14) 3' [Espadadora 3] TTGTAAGGTGAACGA 5' (SEQ ID NO: 15) 5' [Espadadora 9] [Espadadora 18][T(FAM)] atggacg [T(BHQ-1)][Espaciadora 9] CGTCCATACAGTTA 3' (SEQ ID NO: 16) 3' [Espadadora 3] TTGTAAGGTGAACGA 5' (SEQ ID NO: 17) 5' U(FAM)] [Espaciadora 3] taactgtatg |T(BHQ-1)][Espac¡adora 18] CGTCCATACAGTTA 3' (SEQ ID NO: 18) 3' [Espadadora 3] TTGTAAGGTGAACGA 5' (SEQ ID NO: 19) [Espadadora 9][T(FAM)] actgtatgg U(BHQ-1)] [Espaciadora 18] CGTCCATACAGTTA 3' (SEQ ID NO: 20) 3' [Espaciadora 3] AGATTGTAAGGTGAACGA 5' (SEQ ID NO: 21) 5' [Espadadora 18][T(FAM)] actgtatgg |T(BHQ-1)][Espaciadora 9] CGTCCATACAGTTA 3' (SEQ ID NO: 22) 3' [Espaciadora 3] TTGTAAGGTGAACGA 5' (SEQ ID NO: 23) 5' [Espaciadora 18][T(FAM)] actgtatgg [T(BHQ-1)][Espaciadora 9] CGTCCATACAGTTAT 3' (SEQ ID NO: 24) Ejemplo 5: Marcado de la secuencia de captura La PCR en tiempo real de P. falciparum se procesó al realizar una mezcla con una concentración final de 250 nM de cada cebador (ya sea PfcF inv, PfcF inv62, PfcF ¡nv62HP o PfcF con PfcR), una concentración final de 5 mM de MgCI2 y 0,25 U/reacción adicionales de GoTaq polimerasa (Promega) en la mezcla maestra incolora GoTaq (Promega). Se agregaron 5000000, 600000, 50000, 500 o 0 copias de la plantilla a cada reacción. La reacción se procesó en ABI StepOne e incluyó una etapa de desnaturalización de 20 s a 95 °C, seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 1 s y 55 °C durante 20 s. Cada reacción se llevó a cabo en duplicado.

Tras demostrar que los cebadores cooperativos son capaces de amplificación eficaz y que pueden eliminar la interferencia de dímeros cebadores, se intentó incorporar una sonda al cebador. Esto se realizó mediante la marcación de la secuencia de captura. En primer lugar, los cebadores inversos se unieron al extremo 5' de las secuencias de captura con ambas Tm por debajo y por encima de la temperatura de reacción, lo que incluye secuencias de captura con formación de horquilla para incentivar una mayor inactivación del fluoróforo (Pf cF inv, Pf cF inv 62 y Pf cF inv 62HP).

Sin embargo, se observó muy poca señal de estos cebadores y los geles electroforéticos mostraron que muy pocos de los cebadores escindían la secuencia de captura (Figura 8 - bandas apenas visibles debajo del amplicón de los cebadores cooperativos).

Se supuso que la cepa conformacional del enlazador elevaba el extremo 5‘ de la secuencia de captura y causaba que la polimerasa desplazara la secuencia en lugar de escindirla. En consecuencia, al desplazarse la cepa del extremo 5' al extremo 3' (por ejemplo, al cambiar el lugar donde se une el enlazador), la polimerasa puede escindir la secuencia de captura con mayor eficacia. Tras probar dicha hipótesis, la señal fluorescente aumentó drásticamente (Figura 8). Aunque la secuencia de captura marcada tenía una Tm por debajo de la temperatura de reacción, la señal todavía era 2,5 veces más elevada que la señal de sondas de hibridación normales.

Ejemplo 6: Diferenciación de SNP La PCR en tiempo real de M. tuberculosis para la mutación D516V en el gen rpoB que confiere resistencia a rifampicina se procesó al realizar una mezcla maestra con una concentración final de 250 nM de cada cebador/sonda (MTb cF, MTb P, y uno de MTb cR1 , MTb cR2, MTb cR3, MTb cR4, MTb cR5, MTb cR6, MTb cR7, MTb cR8 o MTb cR9), una concentración final de 5 mM de MgCI2 y 0,25 U/reacción adicionales de GoTaq polimerasa (Promega) en la mezcla maestra incolora GoTaq (Promega). Se agregaron 50 000 copias de la plantilla (MTb WT o MTb D516V) a cada reacción. Cada reacción se procesó por duplicado. La reacción se procesó en el ABI 7500 e incluyó una etapa de desnaturalización de 20 s a 95 °C, seguida de 45 ciclos a 95 °C durante 3 s y 55 °C durante 3 s. Los Ct se determinaron automáticamente con una máquina con un umbral de 10000 y el ARn se tomó del ciclo 45 de los datos exportados.

Por último, se analizó la capacidad de dichos cebadores cooperativos eficaces y sin dímeros cebadores para diferenciar los SNP. Los cebadores cooperativos fueron diseñados para la mutación D516V del gen rpoB que se encuentra presente en hasta 7,4 % de aislados de M. tuberculosis resistentes a rifampicina en India. Se emplearon dos estrategias diferentes: 1) el método ARMS y 2) la diferenciación de secuencia de captura marcada. Ambos métodos resultaron en la capacidad de diferenciar los SNP similares a sondas y cebadores estándar (Figura 9 y resumen de datos en la Tabla 1).

Para el método basado en sondas, el cebador cooperativo MTb cR6 obtuvo la mejor relación de señales fluorescentes entre las cepas mutante y de tipo salvaje. Para el método basado en ARMS, MTb cR8 obtuvo la mejor diferencia en valores Ct. Ambos se muestran en la Figura 9.

TABLA 1 Nombre del Método ATm ATm ACt ARnVar/ARnWT cebador cebador sonda D516V MTb cR1 Sonda (4,1) 4,5 1,68 3,01 MTb cR2 Sonda (4,1) (2,5) 4,79 3,35 MTb cR5 Sonda (6,6) (2,5) 4.83 1,89 MTb cR6 Sonda (4,1) (7,1) 3.83 3,67 MTb cR7 Sonda (4,1) (11,7) 5,30 3,62 MTb cR3 ARMS (6,3) 4,3 4,43 n/a MTb cR4 ARMS (10,2) 4,3 5,99 n/a MTb cR8 ARMS (20,2) 4,3 7,57 n/a MTb cR9 ARMS (25,5) 4,3 7,13 n/a La Tabla 1 muestra un resumen de los métodos de diferenciación de SNP. Cada cebador se menciona junto con información sobre si utiliza diferenciación basada en ARMS o una sonda (secuencia de captura marcada), la cantidad de grados en que la Tm predicha para el 5 cebador o la sonda se encuentra por encima o por debajo de la temperatura de reacción (los valores por debajo de la temperatura de reacción se encuentran en fuente roja y entre paréntesis), la diferencia entre valores Ct de mutante y tipo salvaje, y la relación de la fluorescencia mutante y de tipo salvaje. 0 Secuencias 5' a 3' Beta Actina (Eficacia de amplificación) Sondas/Cebadores normales [FAM] TGTGGCCGAGGACTTTGAcggc [BHQ1] (SEQ ID b-act P NO: 25) Cebadores ^ cooperativos 3' AGTGGCAAGGTC 5' (SEQ ID NO: 26)[Esp18][Esp18][Esp18] b-act cF 5' GGTGACAGCAGTC [Esp3] 3'(SEQ ID NO: 27) 3' TAGGATTTTCGGTG 5' (SEQ ID NO: 28)[Esp18][Esp18][Esp18] b-act cR 5' GCAAGGGACTTCC [Esp3] 3’ (SEQ ID NO: 29) 0 Plantillas Beta actina AG G ATTT AAAAACT G G AACG GT G AAG GT G AC AG C AGT CGGTTGG AGCGAGCATCCCCCAAAGTTCACAATGTGGCCGAGGA CTTTGATTG CACATTGTTGT l i l i l í AATAGT CATT CCAAAT AT GAGA TGCGTTGTT ACAGG AAGTCCCTT G CCAT CCT AAAAG CCACCCCA (SEQ ID NO: 30) P. Falciparum (impacto de selección de sondas y dímeros cebadores) Sondas/Cebadores normales Pf nF CG CAT CGCTT CT AACG GT G A (SEQ ID NO: 31) Pf nR GAAGCAAACACTAGCGGTGGAA (SEQ ID NO: 32) Pf P [FAM] ACT CT CATT C C AAT G G AACCTT GTT C AAGTT C AAAccatt ggaa [DABC] (SEQ ID NO: 33) Sondas/Cebadores cooperativos Pf cF ¡nv 3' TCGCTACGCA (SEQ ID NO: 34) 5' [Esp18][Esp18][Esp18] 5' [FAM] ACGGTGAACTCTCA [DABC] 3' (SEQ ID NO: 35) Pf cF inv 3' TCGCTACGCA 5' (SEQ ID NO: 36) [Esp18][Esp18][Esp18] 5' [T(FAM)] 62 ACG GT G AACT CT CATT CCA [DABC] 3' (SEQ ID NO: 37) Pf cF inv 3' TCGCTACGCA 5' (SEQ ID NO: 38) [Esp18][Esp18][Esp18] 5' [T (FAM)] ACG GT G AACT CT CATT CCA ccg [DABC] 3‘ 62HP (SEQ ID NO: 39) Pf CF [FAM] ACGGT G AACT CT CA[DABC] [Esp 18][Esp18][Esp18][Esp 18] [Esp18][Esp18] ACGCATCGCT (SEQ ID NO: 40) Pf cR inv 3' ATTGACATACCTGC 5' [Esp18][Esp18][Esp18] 5' AGCAAGTGGAATGTT [Phos] 3' (SEQ ID NO: 41) Cebadores con Tm baja menos Secuencia de captura Pf Tm baja F ACGCATCGCT (SEQ ID NO: 42) Pf Tm baja R CGTCCATACAGTTA (SEQ ID NO: 43) Plantillas Dímero G AAG CAAACACT AGCGGTG G AAT CACCGTT AG AAGC cebador GATGCG normal (SEQ ID NO: 44) Dímero CGTCCATACAGTTA AGCGATGCGT (SEQ ID NO: 45) cebador cooperativo P. Falciparum CCAG CT CACGCAT CGCTT CT AACG GT G AACT CT CATT CCAATGGAA CCTTGTT CAAGTT CAAAT AGATTGGTAAGGT AT AGT G TTTACTATC AAATGAAACAATGTGTTCCACCGCTAGTGTTTGCTCT AACATTCCAC TT G CTT AT AACT GT AT G G ACG (SEQ ID NO: 50) M. Tuberculosis (Diferenciación de SNP) Sondas/Cebadores normales MTb P [FAM] CGCCGCGATCAAGGAGTTCgcg [BHQ1] (SEQ ID NO: 51) Sondas/Cebadores cooperativos MTb cF 3' ACACTAGCGGAG 5' (SEQ ID NO: 52) [Esp 18] [Esp 18] [Esp 18] 5‘ CGCAGACGTT GAT [Phos] 3’(SEQ ID NO: 53) MTb cR1 [CF 560] TGGaCCATGAATTGGCT [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18]CAGCGGGTTGTT (SEQ ID NO: 54) MTb cR2 [CF 560] TGGaCCATGAATTGG [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18]CAGCGGGTTGTT (SEQ ID NO: 55) MTb cR3 [CF 560] CATGAATTGGCTCAGCTG [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18] GGGTTGTTCTGGa (SEQ ID NO: 56) MTb cR4 [CF 560] CATGAATTGGCTCAGCTG [BHQ1] [Esp 18] [Esp18] [Esp 18] [Esp 18] [Esp18][Esp18]CGGGTTGTTCTaGa (SEQ ID NO: 57) MTb cR5 [CF 560] TGGaCCATGAATTGG [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18] AGCGGGTTGTT (SEQ ID NO: 58) MTb cR6 [CF 560] TGGaCCATGAATTG [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18] CAGCGGGTTGTT (SEQ ID NO: 59) MTb cR7 [CF 560] TGGaCCATGAATT [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18][Esp18] CAGCGGGTTGTT (SEQ ID NO: 60) MTb cR8 [CF 560] CATGAATTGGCTCAGCTG [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18] GGGTTGTTCTcGa (SEQ ID NO: 61) MTb CR9 [CF 560] CATGAATTGGCTCAGCTG [BHQ1] [Esp18][Esp18][Esp18][Esp18] [Esp18][Esp18] GGGTTcTTCTGGa(SEQ ID NO: 62) Plantillas MTbWT CGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTTGATCAACATCC GGCCGGTGGT CGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGA GCCAATTCAT GG ACCAG AACAACCCG CTGTCGGG GTTGACCCACAAG C GCCGACTGTC GGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCC GGGCTGGAGGT CCGCGA (SEQ ID NO: 63) MTb CGTG GAGG CG AT CACACCG CAG ACGTT G AT CAACAT CC D516V GGCCGGTGGT CGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGA GCCAATTCA TG GT CCAG AACAACCCGCT GTCGG G GTT GACCCACAAG CGCCGACTGT CGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGC CGGGCTGGAGG TCCGCGA (SEQ ID NO: 64) Se entiende que el método y las composiciones que se describieron no se encuentran limitadas a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares que se describieron, ya que estos pueden variar. También ha de entenderse que la terminología empleada en la presente sólo tiene el fin de describir modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Debe observarse que, tal como se utilizan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares «un», «una» y «el» o «la» incluyen los referentes plurales, salvo que en el contexto indique claramente lo contrario. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a «un cebador» incluye una pluralidad de dichos cebadores y la referencia a «el cebador» incluye la referencia a uno o más cebadores y equivalentes de ellos conocidos por los expertos en la téenica, y así sucesivamente.

«Opcional» u «opcionalmente» significan que el evento o circunstancia que se describe posteriormente puede ocurrir o no o el material puede encontrarse presente o no, y que la descripción incluye instancias en las que el evento o la circunstancia ocurre o el material se encuentra presente e instancias en las que no ocurre o no se encuentra presente.

Los intervalos se pueden expresar en la presente como de «alrededor de» un valor particular y/o a «alrededor de» otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, también se contempla específicamente y se considera divulgado el intervalo de un valor específico y/o a otro valor específico, salvo que el contexto indique específicamente lo contrario. De manera similar, cuando los valores son expresados como aproximaciones mediante el uso del antecedente «alrededor de», se entenderá que el valor específico forma otra modalidad específicamente contemplada que debería considerarse divulgada, salvo que el contexto indique específicamente lo contrario. Se entenderá además que los extremos de cada uno de los intervalos son importantes tanto en relación con el otro extremo como independientemente del otro extremo, salvo que el contexto indique específicamente lo contrario. Por último, deberá entenderse que todos los valores individuales y subintervalos de valores contenidos en un intervalo divulgado en forma explícita están también específicamente contemplados y deberían considerarse divulgados salvo que el contexto indique específicamente lo contrario. Se aplica lo que precede independientemente de que en casos particulares se divulguen explícitamente algunas o todas de estas modalidades.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que los que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenecen el método y las composiciones que se describieron. Si bien en la práctica o evaluación del método y las composiciones de la presente se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, los métodos, dispositivos y materiales particularmente útiles son tal como se describieron. Las publicaciones citadas en la presente y el material con respecto a los que fueron citadas se incorporan específicamente mediante esta referencia. Ningún contenido de la presente debe interpretarse como admisión de que la presente invención no tiene derecho a preceder a dicha divulgación en virtud de invención previa.

Los expertos en la téenica reconocerán o podrán determinar únicamente mediante experimentación de rutina muchos equivalentes de las modalidades específicas del método y las composiciones que se describieron en la presente. Se pretende que tales equivalentes sean abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico cooperativo que comprende: a. una primera secuencia de ácido nucleico en la que la primera secuencia de ácido nucleico es complementaria a una primera región de un ácido nucleico diana y en la que el primer ácido nucleico es extensible en el extremo 3', b. una segunda secuencia de ácido nucleico en la que la segunda secuencia de ácido nucleico es complementaria a una segunda región del ácido nucleico diana, de manera que en presencia del ácido nucleico diana se híbrida con el ácido nucleico diana posteriormente al extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, c. un enlazador que conecta dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico de manera que permite que tanto la primera como la segunda de dichas secuencias de ácido nucleico se hibriden con la diana al mismo tiempo.

2. La molécula de ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1, en la que la primera molécula de ácido nucleico no se hibridará con la diana sin que la segunda molécula de ácido nucleico se hibride con la diana.

3. La molécula de ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1 , en la que la segunda molécula de ácido nucleico no se hibridará con la diana sin que la primera molécula de ácido nucleico se hibride con la diana.

4. La molecula de ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1 , en la que ni la primera ni la segunda molécula de ácido nucleico se hibridará con la diana sin que la otra se hibride con la diana.

5. La molécula de ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1 , en la que la temperatura de fusión (Tm) efectiva de la primera molécula de ácido nucleico aumenta en al menos 1 °C en comparación con la Tm aislada de la primera secuencia de ácido nucleico sin que la segunda secuencia de ácido nucleico se encuentre unida a ella.

6. La molécula de ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico cooperativo comprende una marca.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 6, en el que la segunda secuencia de ácido nucleico comprende una marca.

8. Un método para sintetizar un ácido nucleico, dicho método comprende: a. poner un ácido nucleico diana en contacto con b. una molécula de ácido nucleico cooperativo que comprende: i. una primera secuencia de ácido nucleico en la que la primera secuencia de ácido nucleico es complementaria a una primera región de un ácido nucleico diana y en la que el primer ácido nucleico es extensible en el extremo 3', ii. una segunda secuencia de ácido nucleico en la que la segunda secuencia de ácido nucleico es complementaria a una segunda región del ácido nucleico diana, de manera que se híbrida con el ácido nucleico diana posteriormente al extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, iii. un enlazador que conecta dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico de manera que permite que tanto la primera como la segunda de dichas secuencias de ácido nucleico se hibriden con la diana al mismo tiempo, c. y proveer condiciones adecuadas para la síntesis de ácido nucleico, de forma que se sintetiza un ácido nucleico.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la molécula de ácido nucleico cooperativo comprende una marca.

10. El método de la reivindicación 8, en el que se provee más de una molécula de ácido nucleico cooperativo con distintas secuencias.

11. Un método para detectar un ácido nucleico diana, dicho método comprende: a. poner una muestra que contiene el ácido nucleico diana en contacto con b. una molécula de ácido nucleico cooperativo que comprende: i. una primera secuencia de ácido nucleico en la que la primera secuencia de ácido nucleico es complementaria a una primera región de un ácido nucleico diana y en la que el primer ácido nucleico extensible en el extremo 3', ii. una segunda secuencia de ácido nucleico en la que la segunda secuencia de ácido nucleico es complementaria a una segunda región del ácido nucleico diana, de manera que se híbrida con el ácido nucleico diana posteriormente al extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, iii. un enlazador que conecta dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico de manera que permite que tanto la primera como la segunda de dichas secuencias de ácido nucleico se hibriden con la diana al mismo tiempo, c. y detectar el analito diana.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el marcador se encuentra unido a dicha segunda secuencia de ácido nucleico.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el cambio en la señal deriva del cambio en la señal debido a la escisión de nucleasas de la segunda secuencia de ácido nucleico.

14. Un método para amplificar un ácido nucleico diana, dicho método comprende: a) proveer la molécula de ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1 , b) proveer un ácido nucleico diana y c) amplificar el ácido nucleico diana en condiciones adecuadas para la amplificación. El método de la reivindicación 14, en el que la primera secuencia de ácido nucleico es un cebador.

15. El método de la reivindicación 14, en el que la segunda secuencia de ácido nucleico es una sonda.

16. El método de la reivindicación 14, en el que se provee más de una molécula de ácido nucleico cooperativo con distintas secuencias.

17. El método de la reivindicación 14, en el que la primera secuencia de ácido nucleico, sin que la segunda secuencia de ácido nucleico se encuentre unida a ella, es un cebador normal.

18. Un método para detectar un ácido nucleico, dicho método comprende: a) proveer la molécula de ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1 , en la que el ácido nucleico cooperativo comprende un marcador detectable, b) proveer un ácido nucleico diana y c) detectar el ácido nucleico diana.

19. El método de la reivindicación 18, en el que el marcador detectable se encuentra unido a la primera secuencia de ácido nucleico.

20. El método de la reivindicación 18, en el que el marcador detectable se encuentra unido a la segunda secuencia de ácido nucleico.