JP2015522292A - 協働的プライマー、プローブ、およびそれらの用途 - Google Patents

Abstract

核酸の増幅および検出に関する組成物および方法が開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年７月１７日出願の米国仮特許出願第６１／６７２，３２９号および２０１２年１２月３日出願の同第６１／７３２，５３７号の利益を主張するものであり、それらは共に、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

開示される本発明は、概してその全体が、核酸増幅の分野におけるものである。

核酸試験は、続く試験を経るための十分な濃度および／または純度を実現するためにしばしば核酸の増幅を必要とする。核酸の増幅は、タンパク質等の非核酸の検出における代用として用いられることがある。核酸増幅／伸長反応の大半は、ポリメラーゼの存在下で伸長を可能にする３’末端における修飾または天然核酸から成るプライマーの存在に依存する。

そのような増幅反応における共通する問題は、プライマーダイマーの存在である。プライマーダイマーは、プライマーが標的核酸ではなく互いに伸長する場合に形成される。プライマーダイマーは、プライマーを使い果たし、反応中の不純物の存在を引き起こす。さらに悪いことに、場合によっては、プライマーダイマーは、偽陰性を引き起こすのに十分な程プライマーを使い果たすこともある。あるいは、プローブと相互作用している場合、プライマーダイマーは、偽陽性を引き起こし得る。

ポリメラーゼの蝋物質中への懸濁、抗体によるポリメラーゼの阻害、ポリメラーゼの化学修飾、プライマーの隔離、および様々な他の方法を含む、プライマーダイマーの課題に対処するための様々なホットスタートが開発されている。これらの方法のすべてにおける問題は、これらが増幅／伸長の第１のラウンドの前でのみ有効であることである。その後形成するあらゆるプライマーダイマーは、指数関数的な割合で増幅される。

プライマーダイマーに対処する他の方法には、ネステッドＰＣＲ等の方法が挙げられる。しかしながら、これは、２つの別々の反応を必要とし、混入の可能性を増加させる。

多くの増幅／伸長反応はまた、検出プローブを伴う。原理はしばしば、Ｔａｑｍａｎ等の標識された線形プローブまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ等の標識されたヘアピンプローブを中心に展開する。いくつかの方法は、Ｔｅｎｔａｃｌｅ Ｐｒｏｂｅｓ等の協働的に連結する２つのプローブの使用を通して、驚くべき特異性を実現する。しかしながら、これらのプローブに基づく方法のそれぞれは、野生型の高いバックグラウンドにおける変異体の検出において制限される。それらは一塩基変異多型および他の変異の全か無かの検出を実現することができるが、１０〜２０の野生型配列のバックグラウンドにおいて約１つの変異体しか抽出しない。これは、プライマーが野生型および変異体両方を増幅し、両方を検出することができないまま枯渇するせいである。ＡＲＭＳのような方法は、この問題をある程度克服するためにプローブ検出技術と組み合わされ得るが、１つより多い変異が同一の普遍的な領域で生じる場合、リアルタイム検出に対して効果的に多重化されない場合がある。

Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー、Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｘプライマー、およびＳｃｏｒｐｉｏｎプライマー等の検出機構を含むいくつかのプライマーが開発されている。最初の２つは、配列特異性でないため、プライマーダイマー問題からの偽陽性を特に起こしやすい。後者は、プローブが核酸鋳型ではなくプライマー伸長生成物に結合する、自己探索プライマーである。それが配列特異的プローブを有するため、偽陽性をもたらす可能性は低いが、依然としてプライマーダイマー関連の問題の対象である。

ａ）第１の核酸配列であって、標的核酸の第１の領域に実質的に相補的であり、その第１の核酸配列が３’末端上で伸長可能な第１の核酸配列と、ｂ）標的核酸の第２の領域に実質的に相補的である第２の核酸配列と、を含み、その第１および第２の核酸配列が互いに結合し、第２の核酸配列が第１の核酸配列の３’末端から下流の標的核酸配列にハイブリダイズする、協働的核酸分子が本明細書に開示される。

標的核酸を増幅するための方法であって、ａ）本明細書に開示される協働的核酸分子を提供することと、ｂ）標的核酸を提供することと、ｃ）増幅に適切な条件下で標的核酸を増幅し、それにより標的核酸を増幅することと、を含む、方法がさらに開示される。
試料中の核酸を検出するための方法であって、ａ）本明細書に開示される協働的核酸分子を提供することであって、その協働的核酸が検出可能な標識を含む、提供することと、ｂ）標的核酸を提供することと、ｃ）標的核酸を検出し、それにより標的核酸を検出することと、を含む方法もまた開示される。

キャプチャー配列の５’末端に結合するプライマーの内側へのリンカーを有する協働的プライマーの一実施形態を示す。キャプチャー配列は標的核酸に結合し、ハイブリダイズされたキャプチャー配列は、プライマーを標的の近くに保持する。次いで、プライマーは伸長し、キャプチャー配列を切断する。 プライマーの５’末端をキャプチャー配列の３’末端に結合するリンカーを有する協働的プライマーの別の実施形態を示す。キャプチャー配列は、標的核酸に結合する。ハイブリダイズされたキャプチャー配列は、プライマーを標的の近くに保持する。次いで、プライマーは伸長し、キャプチャー配列を切断する。 プライマーの５’末端に連結するキャプチャー配列の５’末端を有する協働的プライマーの好ましい実施形態を示す。キャプチャー配列は、標的核酸に結合する。ハイブリダイズされたキャプチャー配列は、プライマーを標的の近くに保持する。次いで、プライマーは伸長し、キャプチャー配列を切断する。 二重標識化プローブ、ヘアピンプローブ、および単一標識プローブが挙げられるが、これらに限定されないプライマーに連結され得るプローブの例を示す。 二重標識化プローブに連結される協働的プライマーを使用する核酸伸長の検出に対する好ましい実施形態を示す。プローブは標的核酸に結合し、ハイブリダイズされたプローブはプライマーを標的の近くに保持する。プライマーは伸長してプローブを切断し、蛍光の増加を生じる。 協働的プライマーおよび正常なプライマーのゲルを示す。正常なプライマーは、例えプライマーダイマー（Ｐ−Ｄ）が添加されない場合であっても、いくつかのＰ−Ｄ形成を有するが、しかしながら依然としてマラリアＤＮＡの６０個の開始コピーの増幅を有する。６００Ｐ−Ｄが添加される場合、マラリア増幅生成物は覆い隠され、Ｐ−Ｄのみが増幅される。対照的に、例え最大６００，０００のＰ−Ｄが添加される場合であっても、協働的プライマーはプライマーダイマー増幅を有さない。Ｐ−Ｄは、標的核酸の協働的プライマー増幅を妨げない。 協働的プライマーにおいて使用され得る検出機構を備えたプライマーのいくつかの例を示す。 一体化プローブを有する協働的プライマーを示す。５，０００，０００、５０，０００、５００、または０個のコピー熱帯熱マラリア原虫鋳型のリアルタイム検出に標識された協働的プライマーまたは正常なハイブリダイゼーションプローブを用いた。協働的プライマーの標識されたキャプチャー配列は、キャプチャー配列が反応温度を下回るＴｍを有したにもかかわらず、正常なハイブリダイゼーションプローブよりも２．５倍高い蛍光シグナルを有した。 協働的プライマーを用いたＳＮＰの差別化を示す。協働的プライマーは、キャプチャー配列下のＳＮＰを用いたプローブに基づく差別化（９Ａ）およびプライマーの３’末端下のＳＮＰを用いたＡＲＭＳに基づく方法（９Ｂ）を用いて、リファンピシン抵抗を生じるｒｐｏＢ Ｄ５１６Ｖ ＳＮＰを有するＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｃｏｍｐｌｅｘと、ＳＮＰを有さないＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｃｏｍｐｌｅｘとを差別化する。

開示される方法は、核酸配列および全ゲノムまたは他の非常に複雑な核酸試料の増幅を可能にするある特定の物質および手順を用いる。これらの物質および手順は、以下に詳細に記載される。

定義
特に別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明に関連する当業者に通常理解されるものと同一の意味を有する。以下の定義は当業者を捕捉し、本出願を対象とし、あらゆる関係のある、もしくは関係のない事例に、例えば、いかなる共同所有された特許または出願にも帰属しない。本明細書に記載のものと同様もしくは同等のあらゆる方法および物質を本発明の試験のための実践において使用することができるが、好ましい物質および方法がここに記載される。したがって、本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、制限するように意図されるものではない。

本明細書で使用する場合、「核酸配列」は、核酸の鎖に沿うヌクレオチドの順序または配列を指す。いくつかの場合において、これらのヌクレオチドの順序は、対応するポリペプチド鎖に沿うアミノ酸の順序を決定し得る。このようにして、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。核酸配列は、指定されるように、一本鎖または二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有する。核酸配列は、ゲノムおよびｃＤＮＡ両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドで構成され得、配列は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびにウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の任意の組み合わせを含む。それには、ロックド核酸、ペプチド核酸、および当業者に既知の他のものを含む修飾塩基を含み得る。

「オリゴヌクレオチド」.は、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマーである。ポリマーは、標識、クエンチャー、保護基等の非ヌクレオチド要素をさらに含むことができる。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、天然または非天然であってもよく、非置換、無修飾、置換、または修飾であってもよい。ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、またはホスホロチオエート結合、メチルホスホン酸結合、ボラノリン酸結合等によって連結され得る。

「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、２つ以上のペプチド核酸モノマーを含むポリマーである。ポリマーは、標識、クエンチャー、保護基等の要素をさらに含むことができる。ＰＮＡのモノマーは、非置換、無修飾、置換、または修飾であってもよい。

「協働的核酸」とは、第１の核酸配列および第２の核酸配列を最小限に組み込む核酸配列を意味し、第２の核酸配列は、第１の核酸配列の３’末端の下流の標的核酸にハイブリダイズする。核酸の３’末端は、本明細書の他の部分で考察されるように伸長可能であってもよい。１つの例において、第１の核酸はプライマーであり、第２の核酸はキャプチャー配列である。第１および第２の核酸配列は、例えば、リンカーによって分離され得る。

「プライマー」は、鋳型核酸鎖の領域に相補的である配列を含有する核酸であり、鋳型（またはその部分）に相補的である鎖の合成を刺激する。プライマーは、典型的には、比較的短い化学合成されたオリゴヌクレオチド（典型的には、デオキシリボヌクレオチド）であるが、そうである必要はない。増幅、例えばＰＣＲ増幅において、一対のプライマーは、典型的には、増幅される核酸標的の２つの相補鎖の５’末端を定義する。「協働的プライマー」または第１の核酸配列は、リンカーを介して、キャプチャー配列とも称される第２の核酸配列に結合するプライマーを意味する。第２の核酸配列またはキャプチャー配列は、プライマーの３’末端の下流の鋳型核酸または第１の核酸配列にハイブリダイズすることができる。「正常なプライマー」とは、リンカーを介してそれに結合するキャプチャー配列または第２の核酸配列を有さないプライマーを意味する。

本明細書において「第２の核酸配列」とも称される「キャプチャー配列」は、標的核酸にハイブリダイズし、第１の核酸配列またはプライマー配列を標的核酸の標的領域の近くにすることを可能にする配列を意味する。

「下流」とは、核酸合成または伸長の間のポリメラーゼの作用に対するものである。例えば、Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長する場合、それはプライマーの３’末端に塩基を追加し、「プライマーの３’末端から下流」の配列に近づく。

「標的領域」は、増幅されるか、検出されるか、またはその両方である標的核酸の領域である。

指定された条件下における核酸二重鎖の「Ｔｍ」（融解温度）とは、核酸配列の半分が結合されず、半分が結合する温度である。本明細書で使用する場合、「単独のＴｍ」は、協働的な対の中でない場合の、協働的核酸中の第１または第２の核酸配列のいずれかの個々の融解温度を指す。「有効なＴｍ」とは、共に連結される場合の、第１または第２の核酸のいずれかの結果として生じる融解温度を指す。

「リンカー」という用語は、第１および第２の核酸を互いに結合する組成物を意味する。リンカーは、少なくとも１つの非伸長可能部分を含むが、伸長可能な核酸も含み得、任意の長さであり得る。リンカーは、３’末端、５’末端に連結されてもよく、または第１および第２の核酸配列の両方の末端から１つ以上の塩基（「中間」）に連結されてもよい。連結は、共有結合、水素結合、イオン相互作用、疎水性相互作用等であり得る。「非伸長可能」という用語は、ネイティブなＴａｑポリメラーゼがある部分を認識できず、それにより核酸合成を継続できないことを言及する。様々な天然および修飾核酸塩基は、ポリメラーゼによって認識され、「伸長可能」である。非伸長可能な部分の例には、特に、フルオロフォア、クエンチャー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、および当業者に既知の他のものが挙げられる。いくつかの場合において、逆の配向（例えば、５’ＡＣＧＴ３’ ３’Ａ５’ ５’ＡＡＧＴ３’）を有する核酸塩基であっても、またはさもなければ、Ｔａｑポリメラーゼがそこを通して伸長できないようにされる核酸塩基が、「非伸長可能」であると考えられ得る。本明細書で使用する場合、「非核酸リンカー」という用語は、第１の核酸を第２の核酸に、またはより具体的にはプライマーをキャプチャー配列に共有結合することができる反応化学基を指す。好適な可動性リンカーは、典型的には、少なくとも１つまたは２つの原子の鎖、より典型的には１〜１２個の炭素原子（および／または他の骨格原子）の長さの有機ポリマー鎖における線状分子である。例となる可動性リンカーには、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル等が挙げられる。

本明細書で使用する場合、「相補的」または「相補性」は、ポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドが第２のポリヌクレオチド分子中の別のヌクレオチドと塩基対を形成する能力を指す。例えば、配列５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−３’は、配列３’−Ｔ−Ｇ−Ａ−５’に相補的である。相補性は、ヌクレオチドのうちのいくつかだけが塩基対合に従って一致する部分的なものであってもよく、すべてのヌクレオチドが塩基対合に従って一致する完全なものであってもよい。本発明の目的において、「実質的に相補的」とは、標的塩基対領域の長さにわたる９０％以上の同一性を指す。相補性はまた、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％相補的、またはこれらの量を下回るか、もしくはその間の任意の量であり得る。

本明細書で使用する場合、「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）、増幅すること、増幅する（ａｍｐｌｉｆｉｅｓ）、増幅される、増幅」は、標的ＤＮＡの１つ以上の同一または相補的コピーの創造を指す。コピーは、一本鎖または二本鎖であり得る。増幅は、プライマーの伸長、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定、ローリングサークル増幅等のいくつかのプロセスの一部であってもよい。

本明細書で使用する場合、「精製される」とは、細胞残屑、例えば、高分子量ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質から分離されたポリヌクレオチド、例えば標的核酸配列を指す。これには、ＤＮＡを含む細胞残屑から分離されるだろう単離ＲＮＡ試料が含まれるだろう。これはまた、非ネイティブ、または天然に生じない核酸も意味し得る。

本明細書で使用する場合、「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は同義に使用され、アミノ酸ポリマーまたは１組の２つ以上の相互作用する、もしくは結合されたアミノ酸ポリマーを意味する。

本明細書で使用する場合、「ストリンジェンシー」は、ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが生じる条件、すなわち、温度、イオン強度、溶媒等を指す。増幅プロセスのアニーリングステップ中にプライマーと鋳型ＤＮＡとの間で生じるプロセスである、ハイブリダイゼーション。

様々な追加の用語が、本明細書で定義ないしは特徴付けられる。

物質および方法
本発明は、プライマーおよびプローブ等の協働的核酸に関する。協働的核酸は、第２のオリゴヌクレオチドに連結されるオリゴヌクレオチドプライマーを含み、それはプライマーの３’末端から下流の鋳型の領域に相補的である（例えば、図１に見られる）。この第２のオリゴヌクレオチドは、キャプチャー配列として作用する。いくつかの実施形態において、これは、低融解温度（「Ｔｍ」）を有するプライマーが標的に効率的にハイブリダイズすることを可能にする。

キャプチャー配列はプライマーを鋳型の近くに保持し、低Ｔｍであっても伸長／増幅が生じることを可能にする。しかしながら、プライマーダイマー等のキャプチャー配列に対する相補的配列を有さない非特異的配列は、効率的に伸長されない。キャプチャー配列はプライマーの３’末端から下流に独特にハイブリダイズするので、増幅の特異性は全サイクルにおいて実現される。これは、第１のサイクル後にその特異性が徐々に消えていく従来のホットスタート方法と対照的である。

これはまた、二重特異性プライマー等の概念（米国特許公開第２０１２０１３５４７３号、二重特異性プライマーに関するその教示に対するその全体が参照により本明細書に組み込まれる）とは対照的である。二重特異性プライマーはイノシン残基を介して短いプライマーに連結されるキャプチャー配列を有し、ここではキャプチャー配列はプライマーの５’側の標的にハイブリダイズする。その結果、二重特異性プライマーが増幅の第１のラウンドにおいて高い特異性を有する。しかしながら、二重特異性プライマーが互いに増幅する場合、ポリメラーゼは、５’末端の初めから終わりまでを伸長し、その後のすべてのラウンドにおいて増殖される高Ｔｍのプライマーダイマーを作り出す。これは、キャプチャー配列がプライマーの３’側の標的にハイブリダイズし、それが、プライマーダイマーの増殖を可能にするのに必要な順序でプライマーダイマー中に組み込まれることを防ぐ協働的核酸とは対照的である。

協働的核酸およびそれらを使用する方法はまた、「パドロックプローブ」（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９４：“Ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅｓ：ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５（５１８１）：２０８５-２０８８）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ（ＭＩＰ）（Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ ｅｔ ａｌ ２００３：“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ”．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（６）：６７３−６７８）、およびＣｏｎｎｅｃｔｏｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ（ＣＩＰ）（Ａｋｈｒａｓ ｅｔ ａｌ．２００７：Ｈａｌｌ，Ｎｅｉｌ．ｅｄ．“Ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｏｎｅ−ｐｒｉｍｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（９）：ｅ１９５）と異なる。例えば、本明細書に開示されるプローブは、少なくとも１つの非伸長可能な部分を有するリンカーを有してもよい。さらに、本明細書に開示される分子はプライマーであるのに対して、「パドロックプローブ」は連結され、また連結されていないパドロックプローブは消化されるか、またはさもなければ増幅の前に除去され、プライマーとして使用することはできない。

パドロックプローブは、４０ヌクレオチド長のリンカー配列によって連結される標的に相補的な２つの２０ヌクレオチド長のセグメントを有する一本鎖ＤＮＡ分子である。標的相補的領域がＤＮＡ標的にハイブリダイズされる際、パドロックプローブもまた環状化になる。しかしながら、ＭＩＰと異なり、パドロックプローブは、標的相補的領域がハイブリダイゼーション時に間隙を残さずすべての標的領域にまたがるように設計される。このため、パドロックプローブは、既知の配列を有するＤＮＡ分子の検出においてのみ有用である。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎプローブは、ＳＮＰ遺伝子型判定を実施するために開発され、それは、プローブがゲノム標的にハイブリダイズされる際、ＳＮＰ位置に間隙が存在するような修飾されたパドロックプローブである。ＳＮＰ部位においてヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを用いた間隙充填は、多型の同一性を決定する。この設計は、従来のパドロックプローブ技術よりも多数の利益をもたらす。妥当なＳＮＰに特異的な複数のパドロックプローブの使用は、所与の遺伝子座におけるＳＮＰ数が適切に正規化されることを確実にするため、これらの対立遺伝子特異的プローブの濃度を慎重に平衡を保つことを必要とする。

Ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅは、ハイブリダイズされたプローブ末端によって区切られた間隙を伸長することによる、ＭＩＰの修正された設計を使用し、その設計は、Ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ（ＣＩＰ）と名付けられる。間隙は、捕捉される目的とするゲノム領域（例えば、エクソン）に対応する。間隙充填反応は、全４つのヌクレオチドを使用するＤＮＡポリメラーゼによって実現される。補捉される領域の同定は、次いで、プローブの標的相補的末端のうちの１つに位置する遺伝子座特異的プライマーを使用してそれらを配列決定することによって行われ得る。

「プライマーダイマー」（ＰＤ）は、ＰＣＲ中の潜在的な副生成物である。その名前に暗示されるように、ＰＤは、プライマー中の何本もの相補的塩基列により、または他の非特異的相互作用を通して、互いに結合した（ハイブリダイズした）プライマー分子から成る。結果として、ＤＮＡポリメラーゼはＰＤを増幅し、ＰＣＲ試薬の競争を引き起こし、このため、ＰＣＲ増幅に対して標的とされるＤＮＡ配列の増幅を阻害する可能性がある。リアルタイムＰＣＲにおいて、ＰＤは、シグナル弱体化（ｄａｍｐｅｎｉｎｇ）、偽陰性、偽陽性等を通して正確な定量化を妨げ得る。

本発明はまた、プローブも含む協働的に連結される核酸に関する。この修飾プライマー／プローブは協働的核酸と類似しているが、キャプチャー配列またはプライマーのいずれかに対する１つ以上の検出可能な標識をさらに有して、プローブに変化している。協働的プライマー／プローブの伸長は検出可能であるため、ＡＲＭＳに基づく手段を使用するＳＮＰの差別化を必要とする多重化用途を含む様々な用途において有用であり得る。いくつかの実施形態において、プライマーおよびプローブの両方は、プライマーがプローブ結合なしで増幅せず、またプローブがプローブ結合なしでシグナルを有さないように、増幅反応において使用される融解温度を下回るＴｍを有するように設計される。これは、同一のプライマー／プローブの組み合わせにおいて特異性の２つのポイントを作る。

本発明のプライマーおよびプローブ等の協働的核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅、核酸配列決定、およびその他が挙げられるが、これらに限定されない当業者に既知の様々なプライマー伸長／増幅反応において有用である。本発明の協働的プライマーおよびプローブはまた、ある配列とのハイブリダイゼーション等の伸長／増幅後ステップを有する用途においても使用され得る。本発明における協働的プライマー／プローブはプライマーダイマーを実質的に減少させるため、それらは多重および高度多重反応において特に使用される。

協働的核酸の使用は、存在するプライマーダイマーの量を正常なプライマー（非協働的核酸）が使用される場合に存在するプライマーダイマーの量と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント減少し得る。

したがって、ａ）第１の核酸配列であって、標的核酸の第１の領域に実質的に相補的であり、その第１の核酸配列が３’末端上で伸長可能な第１の核酸配列と、ｂ）標的核酸の第２の領域に実質的に相補的である第２の核酸配列と、を含み、その第１および第２の核酸配列が互いに結合し、第２の核酸配列が第１の核酸配列の３’末端から下流の標的核酸配列にハイブリダイズし、第１の核酸分子の有効な融解温度（Ｔｍ）が、第２の核酸配列がそれに結合しない場合、第１の核酸配列の単独のＴｍと比較して少なくとも１℃上昇する、協働的核酸分子が本明細書に開示される。

協働的核酸は、線状であってもまたは環状化されていてもよい。

「３’末端上で伸長可能」とは、増幅または伸長されるために、第１の核酸がこの末端上で遊離していることを意味する。これは、他の技術の中でも特にＬｅｂｅｄｅｖらに説明されるもの等の熱活性化可能なプライマーを含むことを意味する。

第１の核酸配列はプライマーであり、第２の核酸配列は、代替として「キャプチャー核酸配列」と称される。第１または第２の配列のいずれかが検出可能な標識を有し得るか、あるいは第３の配列が検出可能な標識を有し得る。第１および第２の核酸配列は、非核酸配列であり得るリンカーを介して結合され得る。１つの例において、リンカーは、第１の核酸配列の５’末端を第２の核酸配列の３’末端に結合することができる。これは、例えば、図２において見ることができる。あるいは、第１の核酸配列は、第１の核酸配列の５’末端が第２の核酸配列の５’末端に結合するように反転される。これは、例えば、図３において見ることができる。さらに別の例において、図１において見られるように、第２の核酸配列の５’末端が、配列の中央で第１の核酸配列に連結され得る。「配列の中央」とは、リンカーが核酸の５’末端または３’末端のいずれかで第１の核酸配列に結合されるのではなく、むしろ、５’および３’末端上のヌクレオチドの内側のヌクレオチドに結合することを意味することに留意されたい。

１つの例において、協働的核酸は、同一の配向において７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、またはそれ未満の連続するヌクレオチドを含む。言い換えると、これは、単一の、壊れていない核酸配列の一部であり、同じ５’から３’への方向、または３’から５’への方向に方向付けられたヌクレオチドの数である。例として、リンカーが核酸配列である場合は、リンカー中のヌクレオチドが、それが直接連結される第１または第２の核酸配列のいずれかと同じ配向である場合、リンカーを含むことができる。

リンカーは、核酸、非核酸、または両方のいくつかの組み合わせから構成され得る。リンカーが核酸で構成される場合、それは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ヌクレオチド以上の長さ、またはその間の任意の数であり得る。リンカーの型は、本明細書の他の部分で考察される。リンカーは任意の長さであってよく、第１および第２の核酸配列を組み合わせた長さよりも長いもしくは短いか、第１の核酸配列のみよりも長いもしくは短いか、または第２の核酸配列よりも長いもしくは短くてもよい。

さらに、第１の核酸配列および第２の核酸配列がハイブリダイズする標的核酸上の空間が存在し得る。言い換えると、一方が第１の核酸配列とハイブリダイズし、他方が第２の核酸配列にハイブリダイズする標的核酸上の２つのはっきりと異なる領域が存在する。標的上の第１の領域と第２の領域との間の距離は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド以上の長さであり得る。

本明細書に開示される協働的核酸分子をその使用のための説明書と共に含むキットもまた本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、追加の協働的核酸分子が、キット中に提供される。さらにその他では、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液等の伸長を実施するための試薬が含まれる。いくつかの実施形態において、陽性および陰性対照が含まれ得る。そのような実施形態において、試薬は、すべて別々にパッケージ化され得るか、または単一の管もしくは容器中で混合され得る。

標的核酸を増幅するための方法であって、ａ）本明細書に開示される協働的核酸分子を提供することと、ｂ）標的核酸を提供することと、ｃ）増幅に適切な条件下で標的核酸を増幅することと、を含み、第１の核酸分子の有効なＴｍが、第２の核酸配列がそれに結合しない場合、第１の核酸配列の単独のＴｍと比較して少なくとも１℃上昇し、それにより標的核酸を増幅する方法がさらに開示される。

本明細書の他の部分で増幅方法が開示される。１つより多い協働的核酸分子が提供されてもよく、それらは同じか、または異なる配列を有し得る。例えば、異なる配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または１００以上の核酸分子が提供され得る。

プライマー設計
いくつかの実施形態において、本明細書において第１の核酸配列とも称されるプライマーの単独の融解温度「Ｔｍ」は、ＰＣＲのアニーリング期またはアニーリング期を伴わない反応の伸長期の間に使用される反応温度を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０度以上下回る。ゆえに、プライマー配列の融解温度は、ＰＣＲ反応において使用される反応温度を約１℃〜４０℃、約３℃〜２０℃、約５℃〜１５℃下回る。好ましい実施形態において、単独のＴｍは、反応温度を約７℃〜１２℃下回る。これは、単離されたプライマーにハイブリダイズされる鋳型の５０％未満、およびより好ましくは２０％未満を提供する。

当業者であれば、長さ等の多くの因子に基づく所与の融解温度で、および増加するＧＣ含量でプライマーを設計することができる。（Ｔｍ）を算出するための単純な公式は以下の通りである。

さらに、当業者であれば、実際のＴｍは、Ｍｇ²⁺、Ｋ⁺、および共溶媒の濃度に影響されることを理解するだろう。プライマー設計を支援する多数のコンピュータプログラムが存在する。

所望の融解温度を実現するために、第１の核酸配列またはプライマーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０塩基長であり得る。例えば、プライマーは、ＧＣ含量に応じて約５〜２６、約７〜２２、約９〜１７塩基長であり得る。

異なるヌクレオチド配列の任意の所望の数のプライマーが使用され得るが、１つまたは少数のプライマーの使用が好ましい。増幅反応は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個のプライマーを用いて実施され得る。さらなるプライマーが使用されてもよい。使用され得るプライマーの数に対する根本的な上限はない。しかしながら、より少ないプライマーの使用が好ましい。複数のプライマーが使用される場合、プライマーはそれぞれ、異なる特異的なヌクレオチド配列を有するべきである。

増幅反応は、単一のプライマーを用いて、ならびに例えば、追加のプライマーを用いずに、１個の追加のプライマーを用いて、２個の追加のプライマーを用いて、３個の追加のプライマーを用いて、４個の追加のプライマーを用いて、５個の追加のプライマーを用いて、６個の追加のプライマーを用いて、７個の追加のプライマーを用いて、８個の追加のプライマーを用いて、９個の追加のプライマーを用いて、１０個の追加のプライマーを用いて、１１個の追加のプライマーを用いて、１２個の追加のプライマーを用いて、１３個の追加のプライマーを用いて、１４個の追加のプライマーを用いて、１５個の追加のプライマーを用いて、１６個の追加のプライマーを用いて、１７個の追加のプライマーを用いて、１８個の追加のプライマーを用いて、１９個の追加のプライマーを用いて、２０個の追加のプライマーを用いて、２１個の追加のプライマーを用いて、２２個の追加のプライマーを用いて、２３個の追加のプライマーを用いて、２４個の追加のプライマーを用いて、２５個の追加のプライマーを用いて、２６個の追加のプライマーを用いて、２７個の追加のプライマーを用いて、２８個の追加のプライマーを用いて、２９個の追加のプライマーを用いて、３０個の追加のプライマーを用いて、３１個の追加のプライマーを用いて、３２個の追加のプライマーを用いて、３３個の追加のプライマーを用いて、３４個の追加のプライマーを用いて、３５個の追加のプライマーを用いて、３６個の追加のプライマーを用いて、３７個の追加のプライマーを用いて、３８個の追加のプライマーを用いて、３９個の追加のプライマーを用いて、４０個の追加のプライマーを用いて、４１個の追加のプライマーを用いて、４２個の追加のプライマーを用いて、４３個の追加のプライマーを用いて、４４個の追加のプライマーを用いて、４５個の追加のプライマーを用いて、４６個の追加のプライマーを用いて、４７個の追加のプライマーを用いて、４８個の追加のプライマーを用いて、４９個の追加のプライマーを用いて、５０個の追加のプライマーを用いて、５１個の追加のプライマーを用いて、５２個の追加のプライマーを用いて、５３個の追加のプライマーを用いて、５４個の追加のプライマーを用いて、５５個の追加のプライマーを用いて、５６個の追加のプライマーを用いて、５７個の追加のプライマーを用いて、５８個の追加のプライマーを用いて、５９個の追加のプライマーを用いて、６０個の追加のプライマーを用いて、６１個の追加のプライマーを用いて、６２個の追加のプライマーを用いて、６３個の追加のプライマーを用いて、６４個の追加のプライマーを用いて、６５個の追加のプライマーを用いて、６６個の追加のプライマーを用いて、６７個の追加のプライマーを用いて、６８個の追加のプライマーを用いて、６９個の追加のプライマーを用いて、７０個の追加のプライマーを用いて、７１個の追加のプライマーを用いて、７２個の追加のプライマーを用いて、７３個の追加のプライマーを用いて、７４個の追加のプライマーを用いて、７５個の追加のプライマーを用いて、７６個の追加のプライマーを用いて、７７個の追加のプライマーを用いて、７８個の追加のプライマーを用いて、７９個の追加のプライマーを用いて、８０個の追加のプライマーを用いて、８１個の追加のプライマーを用いて、８２個の追加のプライマーを用いて、８３個の追加のプライマーを用いて、８４個の追加のプライマーを用いて、８５個の追加のプライマーを用いて、８６個の追加のプライマーを用いて、８７個の追加のプライマーを用いて、８８個の追加のプライマーを用いて、８９個の追加のプライマーを用いて、９０個の追加のプライマーを用いて、９１個の追加のプライマーを用いて、９２個の追加のプライマーを用いて、９３個の追加のプライマーを用いて、９４個の追加のプライマーを用いて、９５個の追加のプライマーを用いて、９６個の追加のプライマーを用いて、９７個の追加のプライマーを用いて、９８個の追加のプライマーを用いて、９９個の追加のプライマーを用いて、１００個の追加のプライマーを用いて、１１０個の追加のプライマーを用いて、１２０個の追加のプライマーを用いて、１３０個の追加のプライマーを用いて、１４０個の追加のプライマーを用いて、１５０個の追加のプライマーを用いて、１６０個の追加のプライマーを用いて、１７０個の追加のプライマーを用いて、１８０個の追加のプライマーを用いて、１９０個の追加のプライマーを用いて、２００個の追加のプライマーを用いて、２１０個の追加のプライマーを用いて、２２０個の追加のプライマーを用いて、２３０個の追加のプライマーを用いて、２４０個の追加のプライマーを用いて、２５０個の追加のプライマーを用いて、２６０個の追加のプライマーを用いて、２７０個の追加のプライマーを用いて、２８０個の追加のプライマーを用いて、２９０個の追加のプライマーを用いて、３００個の追加のプライマーを用いて、３１０個の追加のプライマーを用いて、３２０個の追加のプライマーを用いて、３３０個の追加のプライマーを用いて、３４０個の追加のプライマーを用いて、３５０個の追加のプライマーを用いて、３６０個の追加のプライマーを用いて、３７０個の追加のプライマーを用いて、３８０個の追加のプライマーを用いて、３９０個の追加のプライマーを用いて、４００個の追加のプライマーを用いて、４１０個の追加のプライマーを用いて、４２０個の追加のプライマーを用いて、４３０個の追加のプライマーを用いて、４４０個の追加のプライマーを用いて、４５０個の追加のプライマーを用いて、４６０個の追加のプライマーを用いて、４７０個の追加のプライマーを用いて、４８０個の追加のプライマーを用いて、４９０個の追加のプライマーを用いて、５００個の追加のプライマーを用いて、５５０個の追加のプライマーを用いて、６００個の追加のプライマーを用いて、６５０個の追加のプライマーを用いて、７００個の追加のプライマーを用いて、７５０個の追加のプライマーを用いて、８００個の追加のプライマーを用いて、８５０個の追加のプライマーを用いて、９００個の追加のプライマーを用いて、９５０個の追加のプライマーを用いて、１，０００個の追加のプライマーを用いて、１，１００個の追加のプライマーを用いて、１，２００個の追加のプライマーを用いて、１，３００個の追加のプライマーを用いて、１，４００個の追加のプライマーを用いて、１，５００個の追加のプライマーを用いて、１，６００個の追加のプライマーを用いて、１，７００個の追加のプライマーを用いて、１，８００個の追加のプライマーを用いて、１，９００個の追加のプライマーを用いて、２，０００個の追加のプライマーを用いて、２，１００個の追加のプライマーを用いて、２，２００個の追加のプライマーを用いて、２，３００個の追加のプライマーを用いて、２，４００個の追加のプライマーを用いて、２，５００個の追加のプライマーを用いて、２，６００個の追加のプライマーを用いて、２，７００個の追加のプライマーを用いて、２，８００個の追加のプライマーを用いて、２，９００個の追加のプライマーを用いて、３，０００個の追加のプライマーを用いて、３，５００個の追加のプライマーを用いて、または４，０００個の追加のプライマーを用いて、実施され得る。

増幅反応は、単一のプライマーを用いて、ならびに例えば、追加のプライマーを用いずに、２個未満の追加のプライマーを用いて、３個未満の追加のプライマーを用いて、４個未満の追加のプライマーを用いて、５個未満の追加のプライマーを用いて、６個未満の追加のプライマーを用いて、７個未満の追加のプライマーを用いて、８個未満の追加のプライマーを用いて、９個未満の追加のプライマーを用いて、１０個未満の追加のプライマーを用いて、１１個未満の追加のプライマーを用いて、１２個未満の追加のプライマーを用いて、１３個未満の追加のプライマーを用いて、１４個未満の追加のプライマーを用いて、１５個未満の追加のプライマーを用いて、１６個未満の追加のプライマーを用いて、１７個未満の追加のプライマーを用いて、１８個未満の追加のプライマーを用いて、１９個未満の追加のプライマーを用いて、２０個未満の追加のプライマーを用いて、２１個未満の追加のプライマーを用いて、２２個未満の追加のプライマーを用いて、２３個未満の追加のプライマーを用いて、２４個未満の追加のプライマーを用いて、２５個未満の追加のプライマーを用いて、２６個未満の追加のプライマーを用いて、２７個未満の追加のプライマーを用いて、２８個未満の追加のプライマーを用いて、２９個未満の追加のプライマーを用いて、３０個未満の追加のプライマーを用いて、３１個未満の追加のプライマーを用いて、３２個未満の追加のプライマーを用いて、３３個未満の追加のプライマーを用いて、３４個未満の追加のプライマーを用いて、３５個未満の追加のプライマーを用いて、３６個未満の追加のプライマーを用いて、３７個未満の追加のプライマーを用いて、３８個未満の追加のプライマーを用いて、３９個未満の追加のプライマーを用いて、４０個未満の追加のプライマーを用いて、４１個未満の追加のプライマーを用いて、４２個未満の追加のプライマーを用いて、４３個未満の追加のプライマーを用いて、４４個未満の追加のプライマーを用いて、４５個未満の追加のプライマーを用いて、４６個未満の追加のプライマーを用いて、４７個未満の追加のプライマーを用いて、４８個未満の追加のプライマーを用いて、４９個未満の追加のプライマーを用いて、５０個未満の追加のプライマーを用いて、５１個未満の追加のプライマーを用いて、５２個未満の追加のプライマーを用いて、５３個未満の追加のプライマーを用いて、５４個未満の追加のプライマーを用いて、５５個未満の追加のプライマーを用いて、５６個未満の追加のプライマーを用いて、５７個未満の追加のプライマーを用いて、５８個未満の追加のプライマーを用いて、５９個未満の追加のプライマーを用いて、６０個未満の追加のプライマーを用いて、６１個未満の追加のプライマーを用いて、６２個未満の追加のプライマーを用いて、６３個未満の追加のプライマーを用いて、６４個未満の追加のプライマーを用いて、６５個未満の追加のプライマーを用いて、６６個未満の追加のプライマーを用いて、６７個未満の追加のプライマーを用いて、６８個未満の追加のプライマーを用いて、６９個未満の追加のプライマーを用いて、７０個未満の追加のプライマーを用いて、７１個未満の追加のプライマーを用いて、７２個未満の追加のプライマーを用いて、７３個未満の追加のプライマーを用いて、７４個未満の追加のプライマーを用いて、７５個未満の追加のプライマーを用いて、７６個未満の追加のプライマーを用いて、７７個未満の追加のプライマーを用いて、７８個未満の追加のプライマーを用いて、７９個未満の追加のプライマーを用いて、８０個未満の追加のプライマーを用いて、８１個未満の追加のプライマーを用いて、８２個未満の追加のプライマーを用いて、８３個未満の追加のプライマーを用いて、８４個未満の追加のプライマーを用いて、８５個未満の追加のプライマーを用いて、８６個未満の追加のプライマーを用いて、８７個未満の追加のプライマーを用いて、８８個未満の追加のプライマーを用いて、８９個未満の追加のプライマーを用いて、９０個未満の追加のプライマーを用いて、９１個未満の追加のプライマーを用いて、９２個未満の追加のプライマーを用いて、９３個未満の追加のプライマーを用いて、９４個未満の追加のプライマーを用いて、９５個未満の追加のプライマーを用いて、９６個未満の追加のプライマーを用いて、９７個未満の追加のプライマーを用いて、９８個未満の追加のプライマーを用いて、９９個未満の追加のプライマーを用いて、１００個未満の追加のプライマーを用いて、１１０個未満の追加のプライマーを用いて、１２０個未満の追加のプライマーを用いて、１３０個未満の追加のプライマーを用いて、１４０個未満の追加のプライマーを用いて、１５０個未満の追加のプライマーを用いて、１６０個未満の追加のプライマーを用いて、１７０個未満の追加のプライマーを用いて、１８０個未満の追加のプライマーを用いて、１９０個未満の追加のプライマーを用いて、２００個未満の追加のプライマーを用いて、２１０個未満の追加のプライマーを用いて、２２０個未満の追加のプライマーを用いて、２３０個未満の追加のプライマーを用いて、２４０個未満の追加のプライマーを用いて、２５０個未満の追加のプライマーを用いて、２６０個未満の追加のプライマーを用いて、２７０個未満の追加のプライマーを用いて、２８０個未満の追加のプライマーを用いて、２９０個未満の追加のプライマーを用いて、３００個未満の追加のプライマーを用いて、３１０個未満の追加のプライマーを用いて、３２０個未満の追加のプライマーを用いて、３３０個未満の追加のプライマーを用いて、３４０個未満の追加のプライマーを用いて、３５０個未満の追加のプライマーを用いて、３６０個未満の追加のプライマーを用いて、３７０個未満の追加のプライマーを用いて、３８０個未満の追加のプライマーを用いて、３９０個未満の追加のプライマーを用いて、４００個未満の追加のプライマーを用いて、４１０個未満の追加のプライマーを用いて、４２０個未満の追加のプライマーを用いて、４３０個未満の追加のプライマーを用いて、４４０個未満の追加のプライマーを用いて、４５０個未満の追加のプライマーを用いて、４６０個未満の追加のプライマーを用いて、４７０個未満の追加のプライマーを用いて、４８０個未満の追加のプライマーを用いて、４９０個未満の追加のプライマーを用いて、５００個未満の追加のプライマーを用いて、５５０個未満の追加のプライマーを用いて、６００個未満の追加のプライマーを用いて、６５０個未満の追加のプライマーを用いて、７００個未満の追加のプライマーを用いて、７５０個未満の追加のプライマーを用いて、８００個未満の追加のプライマーを用いて、８５０個未満の追加のプライマーを用いて、９００個未満の追加のプライマーを用いて、９５０個未満の追加のプライマーを用いて、１，０００個未満の追加のプライマーを用いて、１，１００個未満の追加のプライマーを用いて、１，２００個未満の追加のプライマーを用いて、１，３００個未満の追加のプライマーを用いて、１，４００個未満の追加のプライマーを用いて、１，５００個未満の追加のプライマーを用いて、１，６００個未満の追加のプライマーを用いて、１，７００個未満の追加のプライマーを用いて、１，８００個未満の追加のプライマーを用いて、１，９００個未満の追加のプライマーを用いて、２，０００個未満の追加のプライマーを用いて、２，１００個未満の追加のプライマーを用いて、２，２００個未満の追加のプライマーを用いて、２，３００個未満の追加のプライマーを用いて、２，４００個未満の追加のプライマーを用いて、２，５００個未満の追加のプライマーを用いて、２，６００個未満の追加のプライマーを用いて、２，７００個未満の追加のプライマーを用いて、２，８００個未満の追加のプライマーを用いて、２，９００個未満の追加のプライマーを用いて、３，０００個未満の追加のプライマーを用いて、３，５００個未満の追加のプライマーを用いて、または４，０００個未満の追加のプライマーを用いて、実施され得る。

増幅反応は、例えば、２個未満のプライマーを用いて、３個未満のプライマーを用いて、４個未満のプライマーを用いて、５個未満のプライマーを用いて、６個未満のプライマーを用いて、７個未満のプライマーを用いて、８個未満のプライマーを用いて、９個未満のプライマーを用いて、１０個未満のプライマーを用いて、１１個未満のプライマーを用いて、１２個未満のプライマーを用いて、１３個未満のプライマーを用いて、１４個未満のプライマーを用いて、１５個未満のプライマーを用いて、１６個未満のプライマーを用いて、１７個未満のプライマーを用いて、１８個未満のプライマーを用いて、１９個未満のプライマーを用いて、２０個未満のプライマーを用いて、２１個未満のプライマーを用いて、２２個未満のプライマーを用いて、２３個未満のプライマーを用いて、２４個未満のプライマーを用いて、２５個未満のプライマーを用いて、２６個未満のプライマーを用いて、２７個未満のプライマーを用いて、２８個未満のプライマーを用いて、２９個未満のプライマーを用いて、３０個未満のプライマーを用いて、３１個未満のプライマーを用いて、３２個未満のプライマーを用いて、３３個未満のプライマーを用いて、３４個未満のプライマーを用いて、３５個未満のプライマーを用いて、３６個未満のプライマーを用いて、３７個未満のプライマーを用いて、３８個未満のプライマーを用いて、３９個未満のプライマーを用いて、４０個未満のプライマーを用いて、４１個未満のプライマーを用いて、４２個未満のプライマーを用いて、４３個未満のプライマーを用いて、４４個未満のプライマーを用いて、４５個未満のプライマーを用いて、４６個未満のプライマーを用いて、４７個未満のプライマーを用いて、４８個未満のプライマーを用いて、４９個未満のプライマーを用いて、５０個未満のプライマーを用いて、５１個未満のプライマーを用いて、５２個未満のプライマーを用いて、５３個未満のプライマーを用いて、５４個未満のプライマーを用いて、５５個未満のプライマーを用いて、５６個未満のプライマーを用いて、５７個未満のプライマーを用いて、５８個未満のプライマーを用いて、５９個未満のプライマーを用いて、６０個未満のプライマーを用いて、６１個未満のプライマーを用いて、６２個未満のプライマーを用いて、６３個未満のプライマーを用いて、６４個未満のプライマーを用いて、６５個未満のプライマーを用いて、６６個未満のプライマーを用いて、６７個未満のプライマーを用いて、６８個未満のプライマーを用いて、６９個未満のプライマーを用いて、７０個未満のプライマーを用いて、７１個未満のプライマーを用いて、７２個未満のプライマーを用いて、７３個未満のプライマーを用いて、７４個未満のプライマーを用いて、７５個未満のプライマーを用いて、７６個未満のプライマーを用いて、７７個未満のプライマーを用いて、７８個未満のプライマーを用いて、７９個未満のプライマーを用いて、８０個未満のプライマーを用いて、８１個未満のプライマーを用いて、８２個未満のプライマーを用いて、８３個未満のプライマーを用いて、８４個未満のプライマーを用いて、８５個未満のプライマーを用いて、８６個未満のプライマーを用いて、８７個未満のプライマーを用いて、８８個未満のプライマーを用いて、８９個未満のプライマーを用いて、９０個未満のプライマーを用いて、９１個未満のプライマーを用いて、９２個未満のプライマーを用いて、９３個未満のプライマーを用いて、９４個未満のプライマーを用いて、９５個未満のプライマーを用いて、９６個未満のプライマーを用いて、９７個未満のプライマーを用いて、９８個未満のプライマーを用いて、９９個未満のプライマーを用いて、１００個未満のプライマーを用いて、１１０個未満のプライマーを用いて、１２０個未満のプライマーを用いて、１３０個未満のプライマーを用いて、１４０個未満のプライマーを用いて、１５０個未満のプライマーを用いて、１６０個未満のプライマーを用いて、１７０個未満のプライマーを用いて、１８０個未満のプライマーを用いて、１９０個未満のプライマーを用いて、２００個未満のプライマーを用いて、２１０個未満のプライマーを用いて、２２０個未満のプライマーを用いて、２３０個未満のプライマーを用いて、２４０個未満のプライマーを用いて、２５０個未満のプライマーを用いて、２６０個未満のプライマーを用いて、２７０個未満のプライマーを用いて、２８０個未満のプライマーを用いて、２９０個未満のプライマーを用いて、３００個未満のプライマーを用いて、３１０個未満のプライマーを用いて、３２０個未満のプライマーを用いて、３３０個未満のプライマーを用いて、３４０個未満のプライマーを用いて、３５０個未満のプライマーを用いて、３６０個未満のプライマーを用いて、３７０個未満のプライマーを用いて、３８０個未満のプライマーを用いて、３９０個未満のプライマーを用いて、４００個未満のプライマーを用いて、４１０個未満のプライマーを用いて、４２０個未満のプライマーを用いて、４３０個未満のプライマーを用いて、４４０個未満のプライマーを用いて、４５０個未満のプライマーを用いて、４６０個未満のプライマーを用いて、４７０個未満のプライマーを用いて、４８０個未満のプライマーを用いて、４９０個未満のプライマーを用いて、５００個未満のプライマーを用いて、５５０個未満のプライマーを用いて、６００個未満のプライマーを用いて、６５０個未満のプライマーを用いて、７００個未満のプライマーを用いて、７５０個未満のプライマーを用いて、８００個未満のプライマーを用いて、８５０個未満のプライマーを用いて、９００個未満のプライマーを用いて、９５０個未満のプライマーを用いて、１，０００個未満のプライマーを用いて、１，１００個未満のプライマーを用いて、１，２００個未満のプライマーを用いて、１，３００個未満のプライマーを用いて、１，４００個未満のプライマーを用いて、１，５００個未満のプライマーを用いて、１，６００個未満のプライマーを用いて、１，７００個未満のプライマーを用いて、１，８００個未満のプライマーを用いて、１，９００個未満のプライマーを用いて、２，０００個未満のプライマーを用いて、２，１００個未満のプライマーを用いて、２，２００個未満のプライマーを用いて、２，３００個未満のプライマーを用いて、２，４００個未満のプライマーを用いて、２，５００個未満のプライマーを用いて、２，６００個未満のプライマーを用いて、２，７００個未満のプライマーを用いて、２，８００個未満のプライマーを用いて、２，９００個未満のプライマーを用いて、３，０００個未満のプライマーを用いて、３，５００個未満のプライマーを用いて、または４，０００個未満のプライマーを用いて、実施され得る。

開示されるプライマーは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。そのようなプライマーは、本明細書において修飾プライマーと称される。キメラプライマーもまた使用され得る。キメラプライマーは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方、リボヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、２つ以上の種類の修飾ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび２つ以上の異なる種類の修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび２つ以上の異なる種類の修飾ヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および２つ以上の異なる種類の修飾ヌクレオチド等の少なくとも２つの種類のヌクレオチドを有するプライマーである。キメラプライマーの１つの形態は、ペプチド核酸／核酸プライマーである。例えば、５’−ＰＮＡ−ＤＮＡ−３’または５’−ＰＮＡ−ＲＮＡ−３’プライマーが、より効率的な鎖侵入および重合侵入のために使用され得る。キメラプライマーの他の形態は、例えば、５’−（２’−Ｏ−メチル）ＲＮＡ−ＲＮＡ−３’または５’−（２’−Ｏ−メチル）ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’である。

多くの修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド類似体）が既知であり、オリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、またはリン酸塩部分のいずれかに対するある種類の修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、ならびにウラシル−５−イル、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ）−９−イル（Ｉ）、および２−アミノアデニン−９−イル等の異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成修飾を含むだろう。修飾塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル、ならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３において見ることができる。２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン等のある特定のヌクレオチド類似体。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を上昇することができる。他の修飾塩基は、ユニバーサル塩基として機能するものである。ユニバーサル塩基には、３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールが挙げられる。ユニバーサル塩基は、正常な塩基の代わりをするが、塩基対合における偏りを有さない。つまり、ユニバーサル塩基は、任意の他の塩基と塩基対合し得る。１つ以上のユニバーサル塩基を有するプライマーは、特異的配列を有するプライマーであるとは考えられない。

塩基修飾はしばしば、上昇した二重鎖安定性等の独特の特性を実現するために、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖等の糖修飾と組み合わされてもよい。様々な塩基修飾を詳細に記載する、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号等の多数の米国特許が存在する。これらの特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

ヌクレオチド類似体はまた、糖部分の修飾を含む。糖部分に対する修飾には、リボースおよびデオキシリボースの天然修飾、ならびに合成修飾を含むだろう。糖修飾には、２’位における以下の修飾が挙げられるが、これらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。２’糖修飾にはまた、−Ｏ［（ＣＨ₂）ｎＯ］ｍＣＨ₃、−Ｏ（ＣＨ₂）ｎＯＣＨ₃、−Ｏ（ＣＨ₂）ｎＮＨ₂、−Ｏ（ＣＨ₂）ｎＣＨ₃、−Ｏ（ＣＨ₂）ｎ−ＯＮＨ₂、および−Ｏ（ＣＨ₂）ｎＯＮ［（ＣＨ₂）ｎＣＨ₃）］₂（式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である）が挙げられるが、これらに限定されない。

２’位における他の修飾には、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似の特性を有する他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない。また同様の修飾を、糖上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’連結オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、およびの５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。また修飾糖には、ＣＨ₂およびＳ等の架橋環酸素での修飾を含有するものが挙げられるだろう。ヌクレオチド糖類似体は、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖擬態を有することもできる。そのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号等の、そのような修飾糖構造の調製を教示する多数の米国特許が存在する。

ヌクレオチド類似体はまた、リン酸塩部分において修飾され得る。修飾リン酸塩部分には、２つのヌクレオチド間の結合が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３′−アルキレンホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ならびにキラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートを含むホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノリン酸を含有するように修飾され得るものが挙げられるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸塩または修飾リン酸塩結合は、３’−５’結合または２’−５’結合を介することができ、結合は、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’等の反転した方向性を含有することができることを理解する。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が修飾リン酸塩を含有するヌクレオチドをどのように作製し、使用するかを教示しており、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号（そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。

ヌクレオチド類似体は単一の修飾しか含有する必要はないが、部分のうちの１つの中にまたは異なる部分の間に、複数の修飾も含有し得ることを理解する。

ヌクレオチド置換体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等のヌクレオチドと同様の機能特性を有するが、リン酸塩部分を含有しない分子である。ヌクレオチド置換体は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で相補核酸を認識し、ハイブリダイズする分子であるが、リン酸部分以外の部分を通して共に連結される。ヌクレオチド置換体は、適切な核酸分子と相互作用する場合、二重らせん型構造に適合することができる。

ヌクレオチド置換体は、リン酸塩部分および／または糖部分が置き換えられたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド置換体は、標準的なリン原子を含有しない。リン酸塩の置換体は、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合であり得る。これらは、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）モルホリノ結合、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成要素を有する他のものを有するものを含む。多数の米国特許がこれらの種類のリン酸塩置換をどのように作製し、使用するかを開示しており、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号（そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。

またヌクレオチド置換体において、ヌクレオチドの糖およびリン酸塩の部分の両方が、例えばアミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）で置き換えられ得ることが理解される。米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子をどのように作製し、使用するかを教示しており、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００（１９９１）も参照されたい）。

プライマーは、ヌクレオチドから構成され得、異なる種類のヌクレオチドまたは同一の種類のヌクレオチドから構成されてもよい。例えば、プライマー中のヌクレオチドのうちの１つ以上が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物であってもよく、ヌクレオチドの約１０％〜約５０％が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物であってもよく、ヌクレオチドの約５０％以上が、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物であってもよく、またはヌクレオチドのすべてが、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの混合物である。ヌクレオチドは、塩基（すなわち、ヌクレオチドの塩基部分）から構成され得、異なる種類の塩基を含んでもよい（通常は含む）。

キャプチャー配列設計
本明細書において「第２の核酸配列」とも称されるキャプチャー配列は、プライマーの３’末端から下流の標的核酸分子にハイブリダイズするように鋳型に相補的である。いくつかの実施形態において、標的核酸の変異に対する抵抗が望ましく、キャプチャー配列は反応温度よりも高い融解温度で設計される。これらの実施形態において、キャプチャー配列は、反応温度を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０度以上上回る単独のＴｍで設計される。例えば、キャプチャー配列または第２の配列は、反応温度を約０℃〜４０℃、約５℃〜３０℃、約７℃〜２５℃上回る。いくつかの実施形態において、キャプチャー配列の予測される融解温度もまた、予期された変異体について設定される。これらの実施形態において、予期された変異体に対するキャプチャー配列の単独のＴｍは、反応温度を摂氏約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ １６、１７、１８、１９、２０度、もしくはそれ以上下回るか、または反応温度を摂氏１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０度以上上回る温度の間である。例えば、それは反応温度を１０℃下回り、および反応温度を３０℃上回り、反応温度を約３℃下回る温度と反応温度を約１０℃上回る温度との間であり得る。

これらの融解温度を実現するために、キャプチャー配列の長さは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５塩基長以上であり得る。例えば、それは、約２０〜約５０、約２２〜約４０、約２３〜約３７塩基であり得る。

いくつかの実施形態において、標的配列における変異に対するさらに高い抵抗が望まれる。これらの実施形態において、反応温度を約０℃〜４０℃上回る単独のＴｍを有するキャプチャー配列に加えて、協働的プライマーは、反応温度の約７℃未満〜約２０℃超、約５℃未満〜約１０℃超、約３℃未満〜約３℃超の単独のＴｍを有するように設計される。プライマーとキャプチャー配列との間の協働的な相互作用は、協働的プライマーに対するさらに高い有効なＴｍをもたらし、配列における変異にほぼ影響を受けないようにする。比較として、正常なプライマーは、標的配列における変異に対する同等の抵抗を有するためにさらなる５〜３０塩基長でなければならない可能性があり、またその結果として、プライマーダイマー形成の影響をより受けやすいだろう。

他の実施形態において、プライマーダイマーに対するより高い抵抗が好ましく、単独のキャプチャーまたは第２の核酸配列の融解温度は、反応温度未満であるように設計される。例えば、キャプチャーまたは第２の核酸配列は、ＰＣＲの反応温度またはアニーリング期を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０度以上下回る。好ましい実施形態において、単独のキャプチャーまたは第２の核酸配列のＴｍは、反応温度を約０℃〜１２℃、約１℃〜８℃、約２℃〜５℃下回る。これらの低融解温度を実現するために、キャプチャー配列の長さは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０塩基長以上であり得る。例えば、キャプチャーまたは第２の核酸配列は、約５〜３０、約８〜２５、および約１０〜２２塩基であり得る。

いくつかの実施形態において、ポリメラーゼがキャプチャー配列の下を伸長でき、キャプチャー配列を無傷で残すように、キャプチャー配列は標的配列に結合し、すぐに放出する。いくつかの実施形態において、これは、キャプチャー配列の５’末端に結合するリンカーを有する協働的プライマーを使用して強化される。好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、伸長の間にキャプチャー配列を切断することができる。好ましい実施形態において、これは、キャプチャー配列の３’末端に結合するリンカーを有する協働的プライマーを使用して強化される。

リンカー
鋳型における第１の核酸またはプライマー配列の３’末端と第２の核酸またはキャプチャー配列ハイブリダイゼーション部位の５’末端との間の塩基の数は、重要である。いくつかの実施形態において、プライマーとキャプチャー配列との間の塩基の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個である。例えば、それらは、約０〜３０、約０〜２０、約０〜１０塩基であり得る。

キャプチャー配列の切断が望まれる場合、２つの部位の間により多くの塩基があればあるほど、リンカーがますます長くなる必要がある。リンカーが長ければ長いほど、システム中に進入するエントロピーが増え、それは協働的結合の効果を低下させる。これは、以下の方程式において表される。

Ｋｅｆｆが有効または協働的な平衡定数である場合、Ｋプライマーは孤立したプライマーの平衡定数であり、Ｋキャプチャーは平衡状態にあるキャプチャー配列の平衡定数であり、Ｌｃは以下に定義される局所濃度である。

式中、ｒは、デシメートルでのリンカー長である。これは、プライマーとプローブとの間の協働的相互作用によるモル濃度での有効な局所濃度を提供する。したがって、リンカー長は、有効平衡定数に対する協働的寄与（Ｌ_cＫ_{プライマー}Ｋ_{キャプチャー}）を直接決定する。

当業者に既知である最近傍または他の計算を用いて、プライマーおよびキャプチャー配列に対するエンタルピーおよびエントロピー値を得ることによって、Ｋ_{プライマー}およびＫ_{キャプチャー}を計算することができる。

プライマーによって結合される鋳型の総量を、以下の通りに計算することができる。

式中、Ｔプライマーはプライマーによって結合される鋳型であり、Ｔ_oは鋳型の総量であり、Ｐ_oは開始時の協働的プライマー濃度である。Ｌ_cＫ_{プライマー}Ｋ_{キャプチャー}がＫ_{プライマー}よりもはるかに大きい場合、協働的効果が最大であることが分かる。これを生じるために、リンカー長は可能な限り短くあるべきである。

この計算は、リンカー長が可能な限り短くあるべきであることを示すが、リンカーが実際にどれだけ短くなることができるかに対するいくつかの制限が存在する。キャプチャー配列およびプローブが鋳型に結合する際、それらは、強固な二重らせん体を形成する。リンカー長は、この構造に適応するのに十分でなければならない。

いくつかの実施形態において、リンカーは、プライマーの５’末端をキャプチャー配列の３’末端に結合させる（図２）。この実施形態において、リンカーは、プライマーとキャプチャー配列とを組み合わせた長さよりも長い。リンカーがキャプチャー配列の３’末端に結合する好ましい実施形態において、リンカーは、６ヘキサエチレングリコールを含む。別の実施形態において、プライマーは、プライマーの５’末端がキャプチャー配列の５’末端に結合されるように反転される（図３）。この実施形態において、リンカーは、プライマーよりも長い。リンカーがキャプチャー配列の５’末端に結合する好ましい実施形態において、リンカーは、３ヘキサエチレングリコールを含む。さらに別の実施形態において、キャプチャー配列の３’末端は、プライマーの中央に連結される（図１）。この事例において、リンカーは、プライマーの長さよりも短くてもよい。

様々なリンカーの型および組成が当業者に既知である。例には、ポリエチレングリコールおよび炭素リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは、共有結合、イオン結合、水素結合、極性会合、磁性会合、およびファンデルワールス会合が挙げられるが、これらに限定されない様々な方法を通して結合され得る。好ましい方法は、標準的なＤＮＡ合成法を介した共有結合である。

ポリエチレングリコールリンカーの長さは、１モノマー当たり約０．３４ｎｍである。いくつかの実施形態において、ポリエチレングリコールリンカーの長さは、約１〜９０、約２〜５０、約３〜３０モノマーである（約１〜１０ｎｍ完全に伸長される）。

プローブとしてのキャプチャー配列の使用
いくつかの実施形態において、プローブとしても働くキャプチャー配列を有することが好ましい。いくつかの実施形態において、これは、１つ以上の標識をキャプチャー配列に追加することによって行われる。好ましい実施形態において、標識には、ＦＲＥＴ対が挙げられる。

種々の核酸プローブ構築物は、当業者に既知である。これらには、二重標識化プローブ、ヘアピンプローブ、および単一標識プローブが挙げられるが、これらに限定されない（図４を参照されたい）。

いくつかの実施形態において、高いシグナル対雑音比に関して低バックグラウンドシグナルが望まれる。いくつかの実施形態において、ヘアピンプローブを用いて、高いシグナル対雑音の提供を支援するための増大した接触反応停止を提供する。

他の実施形態において、プライマー−プローブダイマーを最小化するためにより短いプローブが望まれる。より短いプローブを必要とするいくつかの実施形態において、二重標識化プローブが用いられる。偽（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）伸長生成物の減少にさらなる重点を置くことを必要とする実施形態において、単離されたプローブ標的複合体の融解温度は、反応温度よりも低い。

標識化プローブからシグナルを検出するための様々な方法が、当業者に既知である。いくつかの実施形態において、プローブを切断するポリメラーゼを用いて、シグナルを変更する標識を放出する。他の実施形態において、プローブを切断しないポリメラーゼを用いる。むしろ、シグナルは、プローブの鋳型へのハイブリダイゼーションによって修飾される。

検出機構を備えたプライマーの使用
いくつかの実施形態において、プライマーは、検出機構を備えている。いくつかの実施形態において、検出機構は、１つ以上の検出可能な標識を含む。好ましい実施形態において、検出機構は、ＦＲＥＴ対を含む。検出機構を備えたプライマーの例には、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー、Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｘプライマー、および当業者に既知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。この一例は、図７に見られる。

検出機構を備えた協働的核酸は、検出機構を備えた非協働的核酸（正常なプライマー）よりもアッセイの設計者により有用であり得る。理論に束縛されるものではないが、これは、協働的核酸がプライマーダイマー等の非特異的生成物からシグナルを生成しにくいためである。

いくつかの実施形態において、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等の核酸結合色素を使用して、増幅反応の進行を監視する。

蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーとは、検出、アッセイ、もしくは複製されるプローブまたはプライマーおよび核酸の形態または立体構造の変化に基づく蛍光強度または波長の変化に関与するすべてのプローブおよびプライマーを指す。蛍光変化プローブおよびプライマーの例には、分子ビーコン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ、ＦＲＥＴプローブ、切断可能ＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重オリゴ、蛍光水溶性複合ポリマー、ＰＮＡプローブ、およびＱＰＮＡプローブが挙げられる。

蛍光変化プローブおよびプライマーは、それらの構造および／または機能に従って分類され得る。蛍光変化プローブには、ヘアピン反応停止プローブ（ｈａｉｒｐｉｎ ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｐｒｏｂｅ）、切断反応停止プローブ（ｃｌｅａｖａｇｅ ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｐｒｏｂｅ）、切断活性化プローブ、および蛍光活性化プローブが挙げられる。蛍光変化プライマーには、幹状部反応停止（ｓｔｅｍ ｑｕｅｎｃｈｅｄ）プライマーおよびヘアピン反応停止プライマーが挙げられる。いくつかの種類の蛍光変化プローブおよびプライマーの使用が、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）において概説されている。Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２７２−８２７７（２０００）は、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイを用いた蛍光変化プローブの使用を説明する。

ヘアピン反応停止プローブは、標的配列に結合されない場合、標識からの蛍光が反応停止されるように蛍光標識および反応停止部分を近接させるヘアピン構造（および典型的には、ループ）を形成するプローブである。このプローブが標的配列に結合する際、幹状部は破壊され、反応停止部分はもはや蛍光標識の近くにはなく、蛍光が増大する。ヘアピン反応停止プローブの例は、分子ビーコン、蛍光三重オリゴ、およびＱＰＮＡプローブである。

切断活性化プローブは、プローブの切断によって蛍光が増大するプローブである。切断活性化プローブには、標識からの蛍光が反応停止するように蛍光標識および反応停止部分を近接して含み得る。プローブが切り取られるか、または消化される場合（典型的には、増幅の間のポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による）、反応停止部分はもはや蛍光標識の近くにはなく、蛍光が増大する。ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０（１９９１））は、切断活性化プローブの一例である。

切断反応停止プローブは、プローブの切断によって蛍光が減少するか、または変化するプローブである。切断反応停止プローブは、アクセプター蛍光標識およびドナー部分を含むことができ、アクセプターおよびドナーが近接するときに、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動がアクセプターに蛍光を発させるようにする。このため、プローブは、標的配列にハイブリダイズされる際に蛍光性である。プローブが切り取られるか、または消化される場合（典型的には、増幅の間のポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による）、ドナー部分はもはやアクセプター蛍光標識の近くにはなく、アクセプターからの蛍光が減少する。ドナー部分自体が蛍光標識である場合、それは、アクセプターに近接しないとき、（典型的には、アクセプターの蛍光と異なる波長で）蛍光としてエネルギーを放出することができる。その結果、全体的な効果は、アクセプター蛍光の減少およびドナー蛍光の増加となるだろう。切断反応停止プローブの場合のドナー蛍光は、反応停止部分であるアクセプターおよび蛍光標識であるドナーを有する切断活性化プローブによって生成される蛍光と同等である。切断可能ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）プローブは、切断反応停止プローブの一例である。

蛍光活性化プローブは、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションによって蛍光が増大するか、または変化するプローブまたはプローブの対である。蛍光活性化プローブは、アクセプター蛍光標識およびドナー部分を含むことができ、アクセプターおよびドナーが近接するとき（プローブが標的配列にハイブリダイズされるとき）に、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動がアクセプターに蛍光を発させるようにする。蛍光活性化プローブは、典型的には、アクセプターおよびドナーを近接させるように隣接配列にハイブリダイズするように設計されたプローブの対である。蛍光活性化プローブはまた、ドナーおよびアクセプターの両方を含有する単一のプローブであってもよく、プローブが標的配列にハイブリダイズされないときは、ドナーおよびアクセプターは近接しないが、プローブが標的配列にハイブリダイズされるとき、ドナーおよびアクセプターが近接させられる。これは、例えば、ドナーおよびアクセプターをプローブの反対の端に配置することによって、および標的相補配列を、標的相補配列が標的配列中の隣接配列に相補的であるプローブの各端に配置することによって達成され得る。蛍光活性化プローブのドナー部分自体が蛍光標識である場合、それは、アクセプターに近接しないとき（つまり、プローブが標的配列にハイブリダイズされないとき）、（典型的には、アクセプターの蛍光と異なる波長で）蛍光としてエネルギーを放出することができる。プローブが標的配列にハイブリダイズする場合、結果、全体的な効果は、ドナー蛍光の減少およびアクセプター蛍光の増加となるだろう。ＦＲＥＴプローブは、蛍光活性化プローブの一例である。

幹状部反応停止プライマーは、相補的配列にハイブリダイズされない場合、標識からの蛍光が反応停止されるように蛍光標識および反応停止部分を近接させる幹状部構造（分子内の幹状部構造または分子間の幹状部構造のいずれか）を形成するプライマーである。プライマーが相補的配列に結合する際、幹状部は破壊され、反応停止部分はもはや蛍光標識の近くにはなく、蛍光が増大する。開示される方法において、幹状部反応停止プライマーを核酸合成のためのプライマーとして使用し、このため、合成されるか、または増幅される核酸内に取り込まれる。幹状部反応停止プライマーの例は、ペプチド核酸反応停止プライマーおよびヘアピン反応停止プライマーである。

ペプチド核酸反応停止プライマーは、幹状部構造を形成するためにペプチド核酸クエンチャーまたはペプチド核酸蛍光体（ｆｌｕｏｒ）と会合するプライマーである。プライマーは、蛍光標識または反応停止部分を含有し、それぞれ、ペプチド核酸クエンチャーまたはペプチド核酸蛍光体のいずれかと会合する。これは、蛍光標識を反応停止部分の近くにおく。プライマーが複製される際、ペプチド核酸は置き換えられ、このため、蛍光標識が蛍光シグナルを生成することを可能にする。

ヘアピン反応停止プライマーは、相補的配列にハイブリダイズされない場合、標識からの蛍光が反応停止されるように蛍光標識および反応停止部分を近接させるヘアピン構造（および典型的には、ループ）を形成するプライマーである。プライマーが相補的配列に結合する際、幹状部は破壊され、反応停止部分はもはや蛍光標識の近くにはなく、蛍光が増大する。ヘアピン反応停止プライマーは、典型的には、核酸合成のためのプライマーとして使用され、このため、合成されるか、または増幅される核酸内に取り込まれる。ヘアピン反応停止プライマーの例は、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー（Ｎａｚｅｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１（１９９７））およびスコーピオンプライマー（Ｔｈｅｌｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１９）：３７５２−３７６１（２０００））である。

切断活性化プライマーは、複製鎖に組み込まれ、次いで、その後に切断されるプライマーであることを除いて切断活性化プローブと類似している。Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７−７８４（１９９９）は、切断活性化プライマーの使用を説明する。

ＡＲＭＳを用いる多重化
いくつかの実施形態において、複数の多型、挿入、欠失、または他の変異の検出が望まれる。いくつかの実施形態において、プライマーは、３’末端上の塩基が変異を超えるように設計される。いくつかの実施形態において、追加の意図的な多型が、プライマー中に設計される。１つの実施形態において、プライマーに結合しているプローブの存在は、同一の部位における複数の多型の対立遺伝子特異的リアルタイム検出を可能にする。

プローブを用いた変異の差別化
いくつかの実施形態において、多型の差別化は、プライマーに結合しているキャプチャー配列を用いて達成される。いくつかの実施形態において、キャプチャー配列は、差別化を改良するために意図的に追加されたさらなる変異を有する。いくつかの実施形態において、キャプチャー配列は、多型が存在するときは結合せず、効率的な増幅を次々に妨げる。キャプチャー配列が検出可能な標識を有するいくつかの実施形態において、いくつかの増幅が生じるとしても、キャプチャー配列は検出可能なシグナルを生成するほどには結合しない。

ＲＮＡおよび他の反応
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ以外のポリメラーゼが使用される。１つ以上の塩基を核酸鋳型に追加することのできる様々なポリメラーゼおよび酵素が、当業者に既知である。いくつかの実施形態において、逆転写が望まれる。いくつかの実施形態において、プローブは、ポリメラーゼがその下で伸長できるほど十分な低融解温度を有する。他の実施形態において、重合初期後の温度の上昇は、鋳型からキャプチャー配列を取り除き、ポリメラーゼが伸長することを可能にする。他の実施形態において、キャプチャー配列を有さない追加のプライマー配列が使用され、ポリメラーゼが、より低い反応温度で制約されない様式においてコピーを作製することを可能にする。

標的核酸分子
増幅の対象である核酸分子は、任意の源からの任意の核酸であり得る。一般的に、開示される方法は、増幅される核酸分子を含有する（または、含有すると思われる）核酸試料を使用して実施される。

核酸試料は、目的とする任意の核酸試料であり得る。多くのそのような核酸試料の源、同一性、および調製が既知である。増幅または検出方法における使用のための既知の、または確認される核酸試料が本明細書に記載される方法に対して使用されることが好ましい。核酸試料は、例えば、１つ以上の細胞、組織、または血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、もしくは羊水等の体液からの核酸試料、または組織培養細胞、頬側のスワブ、口腔洗浄剤、便、組織切片、吸引生検等の他の生体試料、および骨もしくはミイラ化した組織等の考古学的試料であり得る。有用な核酸試料の種類には、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針穿刺吸引生検試料、癌試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞可溶化物試料、粗細胞可溶化物試料、法医学的試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、生成試料、薬物調製試料、生体分子生成試料、タンパク質調製試料、脂質調製試料、および／または炭水化物調製試料が挙げられる。

全ゲノム増幅において、好ましい核酸試料は、単一細胞からの核酸試料である。開示される方法において使用する核酸試料は、複合および非反復の核酸分子および試料であることが好ましい。核酸試料がゲノム核酸試料である場合、ゲノムは、目的とする任意の生物からのゲノムであり得る。例えば、ゲノムは、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真正細菌ゲノム、古細菌ゲノム、真菌ゲノム、微生物ゲノム、真核生物ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、脊椎動物ゲノム、無脊椎動物ゲノム、昆虫ゲノム、哺乳動物ゲノム、またはヒトゲノムであり得る。標的ゲノムは、純粋または実質的に純粋であることが好ましいが、これは必須ではない。例えば、動物源からのゲノム試料には、汚染したまたは感染した生物からの核酸が含まれてもよい。

核酸試料は、例えば、同一もしくは異なる生物、組織、細胞、もしくは組み合わせからの１つ以上の全ゲノム、同一もしくは異なる生物、組織、細胞、もしくは組み合わせからの１つ以上の部分ゲノム、同一もしくは異なる生物、組織、細胞、もしくは組み合わせからの１つ以上の全染色体、同一もしくは異なる生物、組織、細胞、もしくは組み合わせからの１つ以上の部分染色体、同一もしくは異なる生物、組織、細胞、もしくは組み合わせからの１つ以上の染色体断片、１つ以上の人工染色体、１つ以上の酵母人工染色体、１つ以上の細菌人工染色体、１つ以上のコスミド、またはこれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらから生じ得る。

オリゴヌクレオチド合成
確立されたオリゴヌクレオチド合成法を使用して、プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、および任意の他のオリゴヌクレオチドを合成することができる。オリゴヌクレオチドを生成するまたは合成するための方法は、当該技術分野において周知である。そのような方法は、ヌクレオチド断片単離が続く標準的な酵素消化（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ５，６を参照されたい）から純粋な合成方法、例えば、シアノエチルホスホラミダイト法によるものまで様々であり得る。ＤＮＡ断片の固相化学合成は、保護されたヌクレオシドシアノエチルホスホラミダイトを用いて日常的に実施される（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９）。この手法において、初期５’−保護ヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基は、まず、ポリマー支持体に共有結合される（Ｒ．Ｃ．Ｐｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２：７７３（１９７５））。次いで、オリゴヌクレオチドの合成は、結合したヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基の脱保護によって進行し、入ってきたヌクレオシド−３’−ホスホラミダイトの脱保護されたヒドロキシル基へのカップリングが続く（Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５）。結果として生じる亜リン酸塩トリエステルは、ヌクレオチド間結合を完了するために最終的にホスホロトリエステルに酸化される（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９：３６５５）。代替として、ホスホロチオエート結合の合成は、亜リン酸塩トリエステルの硫化によって行われることができる。いくつかの化学物質、特に３Ｈ−１，２−ベンゾジチオーレ（ｂｅｎｚｏｄｉｔｈｉｏｌｅ）−３−オン、１，１−ジオキシドを使用して、この反応を実施することができる（Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｗ．Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｂ．Ｒｅｇａｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１２５３−１２５４）。脱保護、カップリング、および酸化のステップは、所望の長さおよび配列のオリゴヌクレオチドが得られるまで繰り返される。Ｈ−ホスホネート法（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ，（１９５７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３２９１−３２９６）またはＩｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（ホスホトリエステルおよび亜リン酸塩−トリエステル法）およびＮａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０）（ホスホトリエステル法）によって説明されるホスホトリエステル法等のオリゴヌクレオチドを生成するための他の方法が現存する。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって説明されるもの等の既知の方法を使用して作製されてもよい。オリゴヌクレオチド合成の他の形態は、米国特許第６，２９４，６６４号および米国特許第６，２９１，６６９号に記載されている。

オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、概して、合成の間にサブユニットブロックのサブユニットがオリゴヌクレオチド鎖に追加される順序によって決定される。追加の各ラウンドは、異なる特異的ヌクレオチド前駆体、または１つ以上の異なるヌクレオチド前駆体の混合物を含み得る。特異的配列の開示されるプライマーに関して、特異的ヌクレオチド前駆体が順次追加されるだろう。

本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの多くは、安定したハイブリッドがそれらの間に形成され得るように、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある特定の部分に相補的であるように設計される。これらのハイブリッドの安定性を、Ｌｅｓｎｉｃｋ ａｎｄ Ｆｒｅｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０８０７−１０８１５（１９９５），ＭｃＧｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：６７４−６７８（１９９０）、およびＲｙｃｈｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６４０９−６４１２（１９９０）に記載されるもの等の既知の方法を使用して計算することができる。

それらの関連機能が維持される限り、プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、および任意の他のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド類似体）から構成されるか、または修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド類似体）を含み得る。多くの修飾ヌクレオチドが既知であり、オリゴヌクレオチドにおいて使用され得、本明細書の他の部分で開示される。

キット
上述の物質ならびに他の物質を、開示される方法を実施する、またはその実施を補助するために有用なキットとして任意の好適な組み合わせで共にパッケージ化してもよい。所与のキット中のキット構成要素が、開示される方法において共に使用するために設計され、適応されることは有用である。例えば、協働的核酸およびＤＮＡポリメラーゼを含む核酸試料の増幅のためのキットが開示される。キットはまた、ヌクレオチド、緩衝液、検出プローブ、蛍光変化プローブ、溶解液、安定化溶液、変性溶液、または組み合わせも含有することができる。

用途
開示される方法および組成物は、細胞中に存在する核酸の分析（例えば、細胞中のゲノムＤＮＡの分析）、疾患検出、変異検出、遺伝子発見、遺伝子マッピング（分子ハプロタイピング）、および農業研究が挙げられるが、これらに限定されない多数の分野に応用することができる。特に有用なのは、全ゲノム増幅である。他の用途には、例えば、細胞中およびゲノムＤＮＡアレイ上の核酸の検出、分子ハプロタイピング、変異検出、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、糖尿病、血友病、鎌状赤血球貧血等の遺伝性疾患の検出、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、精巣癌、膵臓癌等の癌の素因の評価が挙げられる。

増幅
本方法との使用に適した増幅方法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）反応、自己持続性配列複製（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応、ブーメランＤＮＡ増幅（ＢＤＡ）、Ｑ−ベータ複製、または等温核酸配列に基づく増幅が挙げられる。増幅のこれらの方法はそれぞれ以下に簡単に説明され、また当該技術分野において周知である。

ＰＣＲは、特異的な鋳型ＤＮＡ配列の多くのコピーを作製するための技法である。この反応は複数の増幅サイクルから成り、コピーされる配列の５’および３’末端にハイブリダイズする一対のプライマーオリゴヌクレオチドを使用して開始される。増幅サイクルには、初期変性ならびに最大５０サイクルのアニーリング、鎖延長（または伸長）、および鎖分離（変性）を含む。反応の各サイクルにおいて、プライマー間のＤＮＡ配列がコピーされる。コピーの総数が時間と共に指数関数的に増加するように、プライマーはコピーされたＤＮＡならびに元の鋳型配列に結合することができる。Ｗｈｅｌａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３３（３）：５５６−５６１（１９９５）に従って、ＰＣＲを実施することができる。簡潔に、サーマルサイクラーを使用して増幅されるＰＣＲ反応混合物は、２つの特異的プライマー、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、および１ＸＰＣＲ緩衝液を含む。サイクリングパラメータは、例えば、プライマーの融解温度または伸長される核酸の長さに応じて異なってもよい。当業者であれば、標的配列の増幅に適切なプライマーを設計し、調製することができる。本発明において使用するための増幅プライマーの長さは、ヌクレオチド配列同一性およびこれらの核酸がインビトロでの核酸増幅の間にハイブリダイズされるか、または使用される温度を含むいくつかの因子に左右される。特定の配列同一性の増幅プライマーに対する好ましい長さを決定するのに必要な検討材料は当業者に周知であり、本明細書に記載される検討材料を含む。例えば、短い核酸またはオリゴヌクレオチドの長さは、そのハイブリダイゼーション特異性または選択性に関わり得る。

リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ生成物がリアルタイムで検出される、つまり、ＰＣＲ生成物の蓄積が各サイクルで決定され得るＰＣＲに基づく増幅方法である。リアルタイムＰＣＲの一例は、高処理リアルタイムＰＣＲシステムであるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ等の好適な増幅／分析器と組み合わせてＴａｑＭａｎプローブを使用して実施される。簡潔に、増幅される標的配列に特異的なＴａｑＭａｎプローブが、ＰＣＲ増幅反応に含まれる。これらのプローブは、５’末端にレポーター色素および３’末端にクエンチャー色素を含有する。異なる標的配列にハイブリダイズするプローブは、異なる蛍光レポーター色素と結合する。このようにして、１つより多い標的配列が同一の反応器中に対してアッセイされ得る。ＰＣＲの間、蛍光標識化プローブは、それらのそれぞれの標的配列に特異的に結合する。Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性はプローブからのレポーター色素を切断し、蛍光シグナルが生成される。標的配列がプローブに相補的であり、ＰＣＲの間に増幅される場合のみ、蛍光シグナルの増加が検出される。プローブと標的との間のミスマッチは、プローブハイブリダイゼーションおよび切断の効率を大きく減少させる。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ＨＴまたは７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍは、ＰＣＲサーマルサイクリングの間の蛍光の増加を測定し、ＰＣＲ生成物蓄積の「リアルタイム」検出を提供する。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴまたは７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ上のリアルタイム検出は、各ＰＣＲサイクルの間の蛍光を監視し、Ｒｎを計算する。閾サイクルまたはＣｔ値は、蛍光が閾値と交わるサイクルである。閾値は、配列検出システムソフトウェアによって、または手作業で決定される。

本明細書で使用する場合、「ＲＴ−ＰＣＲ」は、単一のアッセイにおける逆転写およびＰＣＲの組み合わせを指す。「逆転写」は、ＲＮＡ鋳型が逆転写酵素によってＤＮＡ分子中に転写されるプロセスである。このため、「逆転写酵素」は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして特徴付けられるポリメラーゼのクラスを記述する、つまり、そのようなポリメラーゼはＲＮＡ鋳型を用いてＤＮＡ分子を合成する。歴史的に、逆転写酵素は、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために使用されている。しかしながら、逆転写酵素は、ウイルスゲノムＲＮＡまたはウイルス亜ゲノムＲＮＡ等の他の種類のＲＮＡを逆転写するために使用することができる。標準的な逆転写酵素には、マロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭｏＭｕＬＶ ＲＴ）およびニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）が挙げられる。これらの酵素は、５’から３’方向のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、５’から３’方向のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する。しかしながら、多くのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと異なり、これらの酵素は、「プルーフリーディング」（すなわち、転写の間に作製されたエラーを校正する）に必須の３’から５’方向のエキソヌクレアーゼ活性を欠く。ＲＮＡのＤＮＡコピーが調製された後、ＤＮＡコピーは、ＰＣＲ等の種々のＤＮＡ増幅方法に供され得る。

ＬＣＲは、２個の代わりに４個のプライマーを使用し、酵素リガーゼを使用してＤＮＡの２つのセグメントを連結するか、または結合することを除いて、ＰＣＲと同様のＤＮＡ増幅の方法である。Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３６（４）１０２８−１０３１（１９９８）に従って、ＬＣＲを実施することができる。簡潔に、ＬＣＲ反応混合物は、２対のプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡリガーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼを含有し、約９０μｌを示し、そこに１００μｌの標的生物からの単離核酸が添加される。増幅は、サーマルサイクラー（例えば、ＬＣｘ ｏｆ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ）中で実施される。

ＴＡＳは、各サイクルが、ｃＤＮＡ合成ステップおよびＲＮＡ転写ステップから成る核酸増幅のシステムである。ｃＤＮＡ合成ステップにおいて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、ポリメラーゼ結合配列またはＰＢＳ）によって認識された配列は、２ドメインオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される標的またはマーカー配列の下流のｃＤＮＡコピーに挿入される。第２のステップにおいて、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｃＤＮＡ鋳型からＲＮＡの複数のコピーを合成する。ＴＡＳを使用する増幅は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写はｃＤＮＡ鋳型の各コピーに関して１０〜１０００個のコピーをもたらすことができるため、少数のサイクルのみを必要とする。Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８６：１１７３−７（１９８９）に従って、ＴＡＳを実施することができる。簡潔に、抽出されたＲＮＡは、ＴＡＳ増幅緩衝液ならびにウシ血清アルブミン、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、およびそのうちの１つがＰＢＳを含有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせられる。試料をＲＮＡ鋳型が変性されるように加熱し、プライマーアニーリング温度まで冷却する。逆転写酵素（ＲＴ）が、ｃＤＮＡ延長を可能にする適切な温度でインキュベートされた試料に添加される。その後に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが添加され、試料はＲＮＡの合成のために３７℃でおよそ２５分インキュベートされる。次いで、上記のステップが繰り返される。代替として、初期のｃＤＮＡ合成後、１分かけた１００℃変性に続いてＲＴおよびＲＮＡポリメラーゼの両方が添加され、その後、３７℃でおよそ３０分のＲＮＡ延長が続く。また、Ｗｙｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３６（１２）：３４８８−３４９１（１９９８）に従って、固相上でＴＡＳを実施することもできる。この方法において、核酸標的は、特異的キャプチャープライマーを含有する磁気ビーズを用いて補捉される。補捉される標的を伴うビーズは、増幅プライマー、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、２５００Ｕの逆転写酵素、および２５００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する増幅試薬を添加する前に洗浄され、ペレット状にされる。１００μｌのＴＭＡ反応混合物を管の中に配置し、２００μｌの油試薬を添加し、水浴中で、４２℃で１時間のインキュベーションによって増幅が達成される。

ＮＡＳＢＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡ標的のいずれかからのＲＮＡを増幅する転写に基づく増幅方法である。ＮＡＳＢＡは、１つの温度での単一の混合物中における核酸の連続増幅のために用いられる方法である。例えば、ＲＮＡ増幅に対して、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ＲＮａｓｅ Ｈ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが使用される。Ｈｅｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６（９）：２２５０−２２５１（１９９８）に従って、この方法を実施することができる。簡潔に、ＮＡＳＢＡ反応混合物は、２つの特異的プライマー、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、６．４ＵのＡＭＶ逆転写酵素、０．０８Ｕの大腸菌Ｒｎａｓｅ Ｈ、および３２ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する。増幅は、２０１の総体積で、４１℃で１２０分かけて行われる。

関連する方法では、自己持続性配列複製（３ＳＲ）反応、３つの酵素活性（逆転写酵素、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および大腸菌リボヌクレアーゼＨ）を使用するインビトロでの標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の等温増幅。この方法は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるが、大腸菌リボヌクレアーゼＨを用いない増幅を可能にするために、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の代わりにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１逆転写酵素を用いて３酵素システムから２酵素システムに変更されてもよい。２酵素３ＳＲでは、増幅されるＲＮＡは、３酵素３ＳＲと比較して純粋な形態で得られる（Ｇｅｂｉｎｏｇａ＆Ｏｅｈｌｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３５：２５６−２６１，１９９６）。

ＳＤＡは、等温核酸増幅方法である。制限部位を含有するプライマーは、鋳型にアニールされる。次いで、増幅プライマーは５’隣接配列にアニールされ（切れ目を形成する）、増幅を固定温度で開始する。新たに合成されるＤＮＡ鎖は制限酵素によって切れ目が入っており、ポリメラーゼ増幅が再び開始され、新たに合成される鎖を置き換える。Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：３９２−６（１９９２）に従って、ＳＤＡを実施することができる。簡潔に、ＳＤＡ反応混合物は、４つのＳＤＡプライマー、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、ｄＡＴＰ、１５０ＵのＨｉｎｃ ＩＩ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｅｘｏ．ｓｕｐ．−Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ）の５Ｕのエキソヌクレアーゼ欠乏性の大きな断片を含有する。試料混合物は、９５℃に４分かけて加熱され、酵素の添加前に標的ＤＮＡを変性させる。２つの酵素の添加後、増幅は、５０μｌの総体積で、３７℃で１２０分かけて行われる。次いで、反応は、９５℃で２分間の加熱によって終結する。

ブーメランＤＮＡ増幅（ＢＤＡ）は、ポリメラーゼが単一のプライマー結合部位からの伸長を開始し、次いで、他の鎖までループを作製し、最終的には、ＤＮＡ上の元のプライミング部位に戻る方法である。ＢＤＡは、それが単一のプライマーの使用を介すことで、ＰＣＲとは異なる。この方法は、試料ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ消化に関与し、付着末端を有する分離したＤＮＡ断片を生成し、断片を「アダプター」ポリヌクレオチド（連結可能末端ならびにスペーサー配列によって分離される第１および第２の自己相補的配列から成る）に連結し、それにより連結された二重鎖を形成する。連結された二重鎖は、オリゴヌクレオチドプライマーが目的とする標的またはマーカー配列内の特異的配列でアニールする鋳型を形成するように変性される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長され、二重鎖生成物を形成し、その後、二重鎖生成物の変性が続く。その後のアニーリング、伸長、および変性の複数のサイクルが実施され、所望の増幅の程度を実現する（米国特許第５，４７０，７２４号）。

Ｑ−ベータ複製システムは、鋳型としてＲＮＡを使用する。Ｑ−ベータレプリカーゼは、大腸菌ファージＱβの一本鎖ＲＮＡゲノムを合成する。ＲＮＡの切断および目的とする核酸内での連結は、ＲＮＡがＱ−ベータレプリカーゼによって複製される場合、その配列の複製を可能にする（Ｋｒａｍｅｒ＆Ｌｉｚａｒｄｉ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１ ９（２）：５３−８，１９９１）。

様々な増幅酵素が当該技術分野で周知であり、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｑ−ベータレプリカーゼ、熱安定性ＤＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらのおよび他の増幅反応は酵素によって触媒されるので、最終的な検出が増幅に基づくものである場合、単一ステップアッセイにおいて、核酸放出試薬および検出試薬が潜在的に増幅酵素の阻害物質であるべきではない。

核酸試料中での核酸分子の増幅は、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．０１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、または核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製をもたらすことができる。

上述の、および本明細書の他の部分に記載の種々の配列表現は、例えば、１つの標的配列、２つの標的配列、３つの標的配列、４つの標的配列、５つの標的配列、６つの標的配列、７つの標的配列、８つの標的配列、９つの標的配列、１０個の標的配列、１１個の標的配列、１２個の標的配列、１３個の標的配列、１４個の標的配列、１５個の標的配列、１６個の標的配列、１７個の標的配列、１８個の標的配列、１９個の標的配列、２０個の標的配列、２５個の標的配列、３０個の標的配列、４０個の標的配列、５０個の標的配列、７５個の標的配列、または１００個の標的配列に対するものであり得る。配列表現は、例えば、少なくとも１つの標的配列、少なくとも２つの標的配列、少なくとも３つの標的配列、少なくとも４つの標的配列、少なくとも５つの標的配列、少なくとも６つの標的配列、少なくとも７つの標的配列、少なくとも８つの標的配列、少なくとも９つの標的配列、少なくとも１０個の標的配列、少なくとも１１個の標的配列、少なくとも１２個の標的配列、少なくとも１３個の標的配列、少なくとも１４個の標的配列、少なくとも１５個の標的配列、少なくとも１６個の標的配列、少なくとも１７個の標的配列、少なくとも１８個の標的配列、少なくとも１９個の標的配列、少なくとも２０個の標的配列、少なくとも２５個の標的配列、少なくとも３０個の標的配列、少なくとも４０個の標的配列、少なくとも５０個の標的配列、少なくとも７５個の標的配列、または少なくとも１００個の標的配列に対するものであり得る。

配列表現は、例えば、１つの標的配列、２つの異なる標的配列、３つの異なる標的配列、４つの異なる標的配列、５つの異なる標的配列、６つの異なる標的配列、７つの異なる標的配列、８つの異なる標的配列、９つの異なる標的配列、１０個の異なる標的配列、１１個の異なる標的配列、１２個の異なる標的配列、１３個の異なる標的配列、１４個の異なる標的配列、１５個の異なる標的配列、１６個の異なる標的配列、１７個の異なる標的配列、１８個の異なる標的配列、１９個の異なる標的配列、２０個の異なる標的配列、２５個の異なる標的配列、３０個の異なる標的配列、４０個の異なる標的配列、５０個の異なる標的配列、７５個の異なる標的配列、または１００個の異なる標的配列に対するものであり得る。配列表現は、例えば、少なくとも１つの標的配列、少なくとも２つの異なる標的配列、少なくとも３つの異なる標的配列、少なくとも４つの異なる標的配列、少なくとも５つの異なる標的配列、少なくとも６つの異なる標的配列、少なくとも７つの異なる標的配列、少なくとも８つの異なる標的配列、少なくとも９つの異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に対するものであり得る。

検出
任意の核酸検出技術を使用して増幅の生成物を検出することができる。リアルタイム検出では、増幅の間に増幅生成物および増幅の進行を検出する。リアルタイム検出は、蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーのうちの１つ以上または１つ、またはその組み合わせを使用して有用に達成される。他の検出技術は、単体で、またはリアルタイマー検出ならびに／または蛍光変化プローブおよびプライマーに関与する検出と組み合わせてのいずれかで使用することができる。核酸を検出するための多くの技術が既知である。増幅される配列のヌクレオチド配列もまた、任意の好適な技術を使用して決定され得る。

例えば、核酸生成物は、様々な周知の方法のいずれか、例えば、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動）によって検出され得る。増幅される断片は、例えば、変異体配列（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））を検出するさらなる方法に供され得る。一例となる方法は、単一ヌクレオチドプライマー伸長である（Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２０００ Ａｐｒｉｌ；２４（４）：３８１−６）。この反応において、オリゴヌクレオチドプライマーは、５’から特異的変異部位までが１つのヌクレオチドである３’末端を有するように設計される。いくつかの実施形態において、伸長プライマーは、固相上のプライマーの捕捉を可能にするために、結合する対のタグまたはメンバーで標識される。特定の実施形態において、プライマーは、単一の反応において好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、４つ以上、５つ以上、さらには１０個以上の異なる変異（多型性）の多重検出を可能にするために、様々な長さの非特異的ポリヌクレオチド（例えば、ポリＧＡＣＴ）でタグを付けられてもよい。プライマーは、１つ以上の標識されたｄｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＰＣＲ増幅産物にハイブリダイズする。ポリメラーゼは、１つのヌクレオチド分プライマーを伸長し、単一の標識されたｄｄＮＴＰを伸長プライマーの３’末端に追加する。ジデオキシヌクレオチドの添加は、鎖延長を終結する。１つより多いジデオキシヌクレオチド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＵＴＰ等）を反応に用いる場合、１つ以上が標識され得る。複数の標識を用いる場合、標識は区別可能であってもよく、例えば、それぞれが異なる蛍光有色色素で標識される。生成物は標識されたオリゴヌクレオチドであり、その１つ１つがその標識に基づいて検出され得る。変異体配列を検出するさらなる方法には、ＲＥＡＤＩＴ ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）およびオリゴヌクレオチド連結アッセイが挙げられる。
実施例

マラリアのためのプライマー

５５℃の反応温度を２〜５℃下回るＴｍを有するキャプチャー配列を設計した。反応温度１０℃前後下回るＴｍを有するプライマー配列を設計した。プライマーの５’末端をプローブの５’末端に結合するリンカーを使用した（図５を参照されたい）。

通常のプライマーを逆方向プライマーに対して使用し、対照は順方向プライマーに対して通常のプライマーを使用し、検出にはＲａｐｉｄ Ｐｒｏｂｅを使用した。５ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度を有するＧｏＴａｑ ＤＮＡマスターミックスを用いるリアルタイムＰＣＲ反応にプライマーを流した。最終プライマー濃度は２５０ｎＭであった。反応条件は、９５℃で２０秒、その後９５℃で１秒の４５サイクルが続いて、５５℃で２０秒である。

全３つの協働的プライマーは検出可能な増幅産物を生成し、標識されたキャプチャー配列からの検出可能なシグナルを有した。プライマーとキャプチャー配列との間に距離のない協働的プライマーは、その他よりも非効率的に増幅された。

５０℃のアニーリング／伸長温度で同一のリアルタイムＰＣＲ反応を繰り返した。標識されたキャプチャー配列から生成されたシグナルは、全３つの協働的プライマーについてより大きかった。リアルタイムＰＣＲ効率は、より低温で改善するようには見えなかった。

高Ｔｍキャプチャー配列

５５℃の反応温度を７〜１０℃上回るＴｍを有する標識されたキャプチャー配列を設計した。反応温度よりも約２℃低いＴｍを有する非標識されていないキャプチャー配列を有する逆方向協働的プライマーを作製した。反応温度を７〜１０℃前後下回るＴｍを有するプライマー配列を設計した。

５ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度を有するＧｏＴａｑ ＤＮＡマスターミックスを用いるリアルタイムＰＣＲ反応にプライマーを流した。最終プライマー濃度は２５０ｎＭであった。反応条件は、９５℃で２０秒、その後９５℃で１秒の５０サイクルが続いて、５５℃で２０秒である。また、４０秒の伸長ステップを伴うリアルタイムＰＣＲを繰り返した。

高Ｔｍキャプチャー配列を有する協働的プライマーは、実施例１からの低Ｔｍキャプチャー配列と同様の増幅効率および蛍光の変化を有した。伸長時間の増加は、増幅効率を上昇するようには見えなかった。

プライマーダイマーの排除

協働的プライマーおよび正常なプライマーに対するプライマーダイマーを合成した。０、６００、６，０００、または６００，０００個のいずれかのプライマーダイマーをマラリアＤＮＡの６０個のコピーを含有する反応に添加した。５ｍＭの最終ＭｇＣｌ₂濃度を有するＧｏＴａｑ ＤＮＡマスターミックスを用いるリアルタイムＰＣＲ反応にプライマーを流した。最終プライマー濃度は２５０ｎＭであった。反応条件は、９５℃で２０秒、その後９５℃で１秒の５０サイクルが続いて、５５℃で２０秒である。

正常なプライマーを有する対照は、プライマーダイマーを添加しなかった場合、容易に見ることができる陽性を有した。しかしながら、わずか６００個のプライマーダイマーを添加した場合、シグナルは消失し、偽陰性をもたらした。対照的に、例え６００，０００個ものプライマーダイマーを添加した場合であっても、協働的プライマーは、増幅生成物を抑えるかまたは損失するシグナルは有さなかった。

２．２％ Ｌｏｎｚａ ｆｌａｓｈｇｅｌをＰＣＲ生成物を流して作動させたとき、協働的プライマーに対してプライマーダイマーが一切増幅されなかったという事実をそのゲルにより確認した。しかしながら、正常なプライマーは、マラリアＤＮＡではなくプライマーダイマーを明白に増幅し、偽陰性をもたらした。

プライマー上に検出機構を有する協働的プライマー

プライマー上に検出機構を有する協働的プライマーを作製した：

キャプチャー配列の標識化

熱帯熱マラリア原虫リアルタイムＰＣＲを、ＧｏＴａｑ Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に２５０ｎＭの最終濃度の各プライマー（ＰｆｃＦ ｉｎｖ、ＰｆｃＦ ｉｎｖ６２、ＰｆｃＦ ｉｎｖ６２ＨＰ、またはＰｆｃＲを有するＰｆｃＦのいずれか）、５ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ₂、および追加の０．２５Ｕ／反応のＧｏＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を有するマスターミックスを作製することによって実施した。鋳型の５，０００，０００、６００，０００、５０，０００、５００、または０個のコピーを各反応に添加した。反応はＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅ上で実施され、９５℃で２０秒の変性ステップ、続いて９５℃で１秒の４５サイクル、および５５℃で２０秒を含んだ。各反応を２連で行った。

協働的プライマーは効率的な増幅が可能であり、かつプライマーダイマーからの干渉を排除することができることを実証してきたので、本発明者らはプローブをプライマー中に組み込むことを試みた。これは、キャプチャー配列の標識化によって行った。まず、逆プライマーは、反応温度を下回る、および上回る両方のＴｍを有するキャプチャー配列の５’末端に結合され、これにはフルオロフォアのより大きな反応停止を促すヘアピン形成を持つキャプチャー配列を含んだ（Ｐｆ ｃＦ ｉｎｖ、Ｐｆ ｃＦ ｉｎｖ ６２、およびＰｆ ｃＦ ｉｎｖ ６２ＨＰ）。しかしながら、これらのプライマーからはごく少量のシグナルしか観察されず、電気泳動ゲルは、プライマーがほとんどキャプチャー配列を切断していないことを示した（図８−協働的プライマーの増幅産物の下のほとんど見ることができない帯）。

リンカーからの立体構造的染色がキャプチャー配列の５’末端を持ち上げ、ポリメラーゼが配列を切断するのではなくむしろ置き換えるようにすると考えられた。したがって、（例えば、リンカーが結合される場所を変えることによって）そのストレインを５’末端から３’末端に移動すると、ポリメラーゼはより効率的にキャプチャー配列を切断し得る。この仮説の試験において、蛍光シグナルは劇的に上昇した（図８）。標識されたキャプチャー配列が反応温度を下回るＴｍを有したにもかかわらず、シグナルは依然として、正常なハイブリダイゼーションプローブからのシグナルよりも２．５倍高かった。

ＳＮＰの差別化

リファンピシン抵抗を付与したｒｐｏＢ遺伝子中のＤ５１６Ｖ変異に対する結核菌リアルタイムＰＣＲを、ＧｏＴａｑ Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に２５０ｎＭの最終濃度の各プライマー／プローブ（ＭＴｂ ｃＦ、ＭＴｂ Ｐ、およびＭＴｂ ｃＲ１、ＭＴｂ ｃＲ２、ＭＴｂ ｃＲ３、ＭＴｂ ｃＲ４、ＭＴｂ ｃＲ５、ＭＴｂ ｃＲ６、ＭＴｂ ｃＲ７、ＭＴｂ ｃＲ８、またはＭＴｂ ｃＲ９のうちの１つ）、５ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ₂、ならびに追加の０．２５Ｕ／反応のＧｏＴａｑ ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を有するマスターミックスを作製することによって実施した。鋳型（ＭＴｂ 野生型またはＭＴｂ Ｄ５１６Ｖ）の５０，０００個のコピーを各反応に追加した。各反応を２連で行った。反応はＡＢＩ ７５００上で実施され、９５℃で２０秒の変性ステップ、続いて９５℃で３秒の４５サイクル、および５５℃で３秒を含んだ。Ｃｔは、１０，０００の閾値で機械によって自動的に決定され、ΔＲｎは出力されたデータのサイクル４５から出した。

最後に、ＳＮＰを差別化するため、これらの効率的なプライマーダイマー遊離型協働的プライマーの能力を分析した。インドでの最大７．４％のリファンピシン抵抗結核菌分離株中に存在するｒｐｏＢ遺伝子Ｄ５１６Ｖ変異に対して協働的プライマーを設計した。２つの異なる戦略を用いた：１）ＡＲＭＳ法および２）標識されたキャプチャー配列の差別化。両方の方法が、標準的なプライマーおよびプローブに類似のＳＮＰを差別化する能力をもたらした（図９および表１のデータ要約）。

プローブに基づく方法に関して、協働的プライマーＭＴｂ ｃＲ６は、変異体と野生型ストレインとの間の蛍光シグナルの最良の比率を示した。ＡＲＭＳに基づく方法に関して、ＭＴｂ ｃＲ８は、Ｃｔ値において最良の差異を示した。両方が、図９に示される。

表１は、ＳＮＰ差別化法の要約を示す。各プライマーを、ＡＲＭＳまたはプローブ（標識されたキャプチャー配列）に基づく差別化を使用したかどうか、プライマーまたはプローブに対する予測されるＴｍが反応温度を上回るか、または下回る度数（反応温度を下回る値は赤字、括弧付である）、変異体と野生型Ｃｔ値との間の差、ならびに変異体および野生型蛍光の比率と共に列挙する。

開示される方法および組成物は、記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬が変化し得るため、これらに制限されないことを理解する。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限するとは意図されないことも理解される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「あるプライマー（ａ ｐｒｉｍｅｒ）」への言及は、複数のそのようなプライマーを含み、「そのプライマー（ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ）」とは、１つ以上のプライマーおよび当業者に既知のその同等物への言及等である。

「任意の」または「任意に」は、その後に説明される現象、状況、または物質が生じてもよく、もしくは生じなくてもよく、または存在してもよく、もしくは存在しなくてもよく、その説明は、現象、状況、または物質が生じるか、もしくは存在する事例ならびにそれらが生じないか、もしくは存在しない事例を含むことを意味する。

範囲は、「およそ」一方の特定の値から、および／または「およそ」他方の特定の値までとして、本明細書で表現され得る。そのような範囲が表現される場合、文脈が別途具体的に示さない限り、ある特定の値から、および／または他の特定の値までの範囲もまた、具体的に企図され、開示されるとみなされる。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似値として表現される場合、文脈が別途具体的に示さない限り、その特定の値は、開示されたとみなされるべきである別の具体的に企図される実施形態を形成することが理解されるだろう。文脈が別途具体的に示さない限り、範囲のそれぞれの終点は、一方の終点と関連して、かつ他方の終点とは切り離して意味を成すことがさらに理解されるだろう。最後に、文脈が別途具体的に示さない限り、明白に開示される範囲内に含有される個別の値のすべておよび値の部分領域はまた、具体的に企図され、かつ開示されたとみなされるべきであることを理解されたい。特定の場合において、これらの実施形態のいくつか、またはすべてが明白に開示されるかどうかにかかわらず、前述の内容は適用される。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および化学用語は、開示される方法および組成物が属する当業者が一般に理解するものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似の任意の方法および物質またはそれらの同等物を本方法および組成物の実践および試験において用いることができるが、特に有用な方法、機器、および物質は、記載されたものである。本明細書に引用される出版物およびそれらが引用される資料は、参照により具体的に組み込まれる。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような開示に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。

当業者であれば、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される方法および組成物の具体的な実施形態に対する多くの同等物を理解するか、または確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されると意図される。

Claims (20)

1. 協働的核酸分子であって、
   ａ． 第１の核酸配列であって、前記第１の核酸配列が標的核酸の第１の領域に相補的であり、前記第１の核酸が３’末端上で伸長可能である、第１の核酸配列と、
   ｂ． 第２の核酸配列であって、前記第２の核酸配列が、前記標的核酸の存在下で、前記第１の核酸配列の３’末端から下流の前記標的核酸にハイブリダイズするように、前記標的核酸の第２の領域に相補的である、第２の核酸配列と、
   ｃ． 前記第１および第２の核酸配列の両方が同時に前記標的にハイブリダイズすることを可能にする様式で、前記第１と第２の核酸配列とを連結するリンカーと、を含む、協働的核酸分子。
2. 前記第２の核酸分子が前記標的にハイブリダイズしない場合、前記第１の核酸分子が前記標的にハイブリダイズしない、請求項１に記載の協働的核酸分子。
3. 前記第１の核酸分子が前記標的にハイブリダイズしない場合、前記第２の核酸分子が前記標的にハイブリダイズしない、請求項１に記載の協働的核酸分子。
4. 他方が前記標的にハイブリダイズしない場合、前記第１も前記第２の核酸分子もいずれも前記標的にハイブリダイズしない、請求項１に記載の協働的核酸分子。
5. 前記第１の核酸分子の有効な融解温度（Ｔｍ）が、前記第２の核酸配列がそれに結合しない場合、前記第１の核酸配列の単独のＴｍと比較して少なくとも１℃上昇する、請求項１に記載の協働的核酸分子。
6. 前記協働的核酸分子が、標識を含む、請求項１に記載の協働的核酸分子。
7. 前記第２の核酸配列が、標識を含む、請求項６に記載の核酸。
8. 核酸を合成するための方法であって、
   ａ． 標的核酸を協働的核酸分子と接触させることであって、
   ｂ． 前記協働的核酸分子が、
   ｉ． 第１の核酸配列であって、前記第１の核酸配列が標的核酸の第１の領域に相補的であり、前記第１の核酸が３’末端上で伸長可能である、第１の核酸配列と、
   ｉｉ． 第２の核酸配列であって、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列の３’末端から下流の前記標的核酸にハイブリダイズするように、前記標的核酸の第２の領域に相補的である、第２の核酸配列と、
   ｉｉｉ． 前記第１および第２の核酸配列の両方が同時に前記標的にハイブリダイズすることを可能にする様式で、前記第１と第２の核酸配列とを連結するリンカーと、を含む、接触させることと、
   ｃ． 核酸合成に適切な条件を提供し、それにより核酸を合成することと、を含む、方法。
9. 前記協働的核酸分子が、標識を含む、請求項８に記載の方法。
10. 異なる配列を有する１つより多い協働的核酸分子が提供される、請求項８に記載の方法。
11. 標的核酸を検出するための方法であって、
    ａ． 前記標的核酸を含有する試料を協働的核酸分子と接触させることであって、
    ｂ． 前記協働的核酸分子が、
    ｉ． 第１の核酸配列であって、前記第１の核酸配列が標的核酸の第１の領域に相補的であり、前記第１の核酸が３’末端上で伸長可能である、第１の核酸配列と、
    ｉｉ． 第２の核酸配列であって、前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列の３’末端から下流の前記標的核酸にハイブリダイズするように、前記標的核酸の第２の領域に相補的である、第２の核酸配列と、
    ｉｉｉ． 前記第１および第２の核酸配列の両方が同時に前記標的にハイブリダイズすることを可能にする様式で、前記第１と第２の核酸配列とを連結するリンカーと、を含む、接触させることと、
    ｃ． 標的分析物を検出することと、を含む、方法。
12. 前記標識が前記第２の核酸配列に結合している、請求項１１に記載の方法。
13. シグナルの変化が、前記第２の核酸配列のヌクレアーゼ切断によるシグナルの変化から生じる、請求項１２に記載の方法。
14. 標的核酸を増幅するための方法であって、
    ａ）請求項１に記載の協働的核酸分子を提供することと、
    ｂ）標的核酸を提供することと、
    ｃ）増幅に適切な条件下で前記標的核酸を増幅することと、を含む、方法。
    前記第１の核酸配列が、プライマーである、請求項１４に記載の方法。
15. 前記第２の核酸配列が、プローブである、請求項１４に記載の方法。
16. 異なる配列を有する１つより多い協働的核酸分子が提供される、請求項１４に記載の方法。
17. 前記第１の核酸配列が、前記第２の核酸配列がそれに結合しない場合、正常なプライマーである、請求項１４に記載の方法。
18. 核酸を検出するための方法であって、
    ａ）請求項１に記載の協働的核酸分子を提供することであって、前記協働的核酸が検出可能な標識を含む、提供することと、
    ｂ）標的核酸を提供することと、
    ｃ）前記標的核酸を検出することと、を含む、方法。
19. 前記検出可能な標識が、前記第１の核酸配列に結合している、請求項１８に記載の方法。
20. 前記検出可能な標識が、前記第２の核酸配列に結合している、請求項１８に記載の方法。