JP4886298B2 - 核酸増幅 - Google Patents
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Description
A.標的配列
増幅の対象である標的配列は任意の核酸であることができる。標的配列は、全ゲノム増幅の場合のような複数の核酸分子、1つの核酸分子中の複数の部位,または1つの核酸分子の単一の領域を含みうる。複数鎖置換増幅については、一般的に標的配列は1つの核酸分子または核酸試料中の単一の領域である。全ゲノム増幅については、標的配列はゲノムまたは核酸試料全体である。標的配列は目的の任意の核酸試料に含まれうる。多数のそのような核酸試料の、起源、同一性、および調製物が既知である。増幅または検出法における使用のために既知であるかまたは同定されている核酸試料をここに記載の方法に用いるのが好ましい。核酸試料は、たとえば、1個以上の細胞、組織、または、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、または羊水といった体液、または、組織培養細胞、口腔塗抹、口腔洗浄液、糞便、組織切片、吸引生検といった他の生物学的試料、および骨またはミイラ化組織といった考古学的試料に由来する核酸試料であることができる。標的試料は、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚類、哺乳類、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物学的起源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検、針吸引生検、がん、腫瘍、組織、細胞、細胞溶解物、粗細胞溶解物、組織溶解物、組織培養細胞、口腔塗抹、口腔洗浄液、糞便、ミイラ化組織、法医学起源、検死、考古学的起源、感染、院内感染、製品起源、医薬調製物、生物学的分子製品、タンパク質調製物、脂質調製物、糖質調製物、無生物、空気、土壌、樹液、金属、化石、土砂、および/または他の地球上のまたは地球外の物質および起源を含むがそれらに限定されない任意の試料に由来することができる。試料はまた、1または複数の異なる起源に由来する物質の混合物を含みうる。たとえば、感染性細菌またはウイルスの核酸は、そのような感染した細胞または組織に由来する核酸が本開示の方法を用いて増幅される場合、ヒト核酸と共に増幅することができる。有用な標的試料の種類は、真核試料、植物試料、動物試料、脊椎動物試料、魚類試料、哺乳類試料、ヒト試料、非ヒト試料、細菌試料、微生物試料、ウイルス試料、生物学的試料、血清試料、血漿試料、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、組織溶解物試料、組織培養細胞試料、口腔塗抹試料、口腔洗浄液試料、糞便試料、ミイラ化組織試料、法医学試料、検死試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、無生物試料、空気試料、土壌試料、樹液試料、金属試料、化石試料、土砂試料、および/または他の地球上のまたは地球外の試料を含む。
核酸試料中の複数の部位を、同一のMSDA反応中に同時に増幅することができるが、簡単にするために、下記の考察は増幅する単一の目的核酸配列の性質に言及する。この配列を下記で標的配列と呼ぶ。MSDAのための標的配列は、2種類の標的領域、増幅標的およびハイブリダイゼーション標的を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーション標的は、一組のプライマーに含まれるプライマーと相補的である、標的配列中の配列を含む。増幅標的は、標的配列の増幅すべき部分である。このために、増幅標的は好ましくは、ハイブリダイゼーション標的の下流であるかまたはそれに隣接されている。標的配列を選択するためには、特異的配列または構造上の条件は必要ない。標的配列内のハイブリダイゼーション標的および増幅標的は、一組のプライマーに含まれるプライマーとの標的配列の関係によって定義される。プライマーは、選択された標的配列と適合するように設計されている。プライマーがハイブリダイズする部位の中およびその周囲の配列が増幅されるため、増幅すべき配列とプライマーのハイブリダイゼーション部位とは、別々であるのが好ましいがその必要はない。
本開示の増幅法における使用のための添加剤は、熱不安定性核酸ポリメラーゼがテンプレート依存性重合を高温にて行うことを可能にできる、任意の化合物、組成物、または組み合わせである。添加剤は一般的に、核酸ポリメラーゼに及ぼす熱安定化作用を有する。添加剤は、熱不安定性核酸ポリメラーゼを、そのポリメラーゼの通常の活性範囲を上回る温度で使用することを可能にする。有用な添加剤は、糖類、シャペロン、タンパク質、糖、アミノ酸、ポリアルコールおよびその誘導体、および他の浸透圧溶質を含む。有用な糖類はトレハロース、グルコースおよびスクロースを含む。有用な糖は、トレハロース、マルトース、グルコース、スクロース、ラクトース、キシロビオース、アガロビオース、セロビオース、レバンビオース、キトビオース、2−β−グルクロノシルグルクロン酸、アロース、アルトロース、ガラクトース、グロース、イドース、マンノース、タロース、ソルビトール、果糖、キシリトール、アラビトールといったオリゴ糖および多糖、および、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコールといったポリアルコールを含む。有用なアミノ酸およびその誘導体は、Ne−アセチル−β−リジン、アラニン、γ−アミノ酪酸、ベタイン、Nα−カルバモイル−L−グルタミン1−アミド、コリン、ジメチルテチン、エコチン(1,4,5,6−テトラヒドロ−2−メチル−4−ピリミジンカルボン酸)、グルタミン酸、β−グルタミン、グリシン、オクトピン、プロリン、サルコシン、タウリンおよびトリメチルアミンN−オキシド(TMAO)を含む。有用なシャペロンタンパク質は、好熱性細菌のシャペロンタンパク質、およびHSP90、HSP70およびHSP60といった熱ショックタンパク質を含む。他の有用な添加剤は、ソルビトール、マンノシルグリセラート、ジグリセロールリン酸、およびサイクリック−2、3−ジホスホグリセラートを含む。化合物および組成物の組み合わせを添加剤として用いることができる。
増幅の対象である核酸分子は、任意の起源に由来する任意の核酸であることができる。一般的に、本開示の方法は、増幅すべき核酸分子を含む(かまたは含むと見られる)試料を用いて実施される。核酸分子を含む(かまたは含むと見られる)試料はまた、核酸試料と呼ぶことができる。核酸試料といった試料は、標的配列を含みうる。細胞および組織試料は核酸試料の一種である。本開示の方法における使用のための試料はまた、核酸の存在について試験すべき試料であることができる(すなわち、核酸を含みうるかまたは含まない可能性がある試料)。全ゲノム増幅については、試料はゲノム全体の全部または相当な部分であることができる。ここでは、ゲノムの相当な部分とは、全ゲノム中に存在する配列の90%以上の存在をいう。ゲノムの相当な部分を含むかまたはそれを構成する、核酸試料またはゲノム核酸試料といった試料は、全ゲノム中に存在する配列の90%以上を含む試料をいう。ゲノム核酸試料とは、ゲノム核酸に由来しおよび全ゲノムのかなりの部分を含むかまたは構成する任意の試料をいう。ここでは、ゲノムのかなりの部分とは、全ゲノム中に存在する配列の20%以上の存在をいう。ゲノムのかなりの部分を含むかまたは構成する、核酸試料またはゲノム核酸試料といった試料は、全ゲノム中に存在する配列の20%以上を含む試料をいう。ここでは、ゲノムの大きな部分とは、全ゲノム中に存在する配列の50%以上の存在をいう。ゲノムの大きな部分を含むかまたは構成する、核酸試料またはゲノム核酸試料といった試料は、全ゲノム中に存在する配列の50%以上を含む試料をいう。ゲノム核酸試料は核酸試料の一種でありおよび試料の一種である。試料へのここでの言及は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、核酸試料およびゲノム試料を包含する核酸試料へのここでの言及は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、ゲノム核酸試料を包含する。
本開示の増幅法における使用のためのプライマーは、標的配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、プライマーの相補的部分という。プライマーの相補的部分は、プライマーと標的配列との間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを反応条件下で支持する任意の長さであることができる。一般的に、37℃での反応のためには、これは長さ10から35ヌクレオチドまたは長さ16から24ヌクレオチドであることができる。一般的に、30℃での反応のためには、これはたとえば、長さ5から20ヌクレオチドまたは長さ6から8ヌクレオチドであることができる。全ゲノム増幅のためには、プライマーは、たとえば、長さ2ないし60ヌクレオチドまたは長さ5から60ヌクレオチドであることができ、および特に、長さ2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、および/または20ヌクレオチドであることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも長さ2ヌクレオチド、少なくとも長さ3ヌクレオチド、少なくとも長さ4ヌクレオチド、少なくとも長さ5ヌクレオチド、少なくとも長さ6ヌクレオチド、少なくとも長さ7ヌクレオチド、および/または少なくとも長さ8ヌクレオチドでありうる。増幅反応において用いられるプライマーは、すべて同一の長さであることが好ましいが、そうである必要は無い。
全ゲノム鎖置換増幅の場合には、ランダムまたは部分的にランダムなヌクレオチド配列を有する一組のプライマーを用いることが好ましい。WGSDAのための好ましい標的配列である、顕著なまたは相当な複雑性の核酸試料では、試料中に存在する特定の核酸配列は既知である必要は無く、およびプライマーを特定の配列と相補的であるように設計する必要は無い。むしろ、核酸試料の複雑性は、ランダムまたは部分的にランダムな配列のさまざまなプライマーと相補的となる、試料中の多数の異なるハイブリダイゼーション標的配列を結果として生じる。WGSDAにおける使用のためのプライマーの相補的部分は、完全にランダム化することができ、一部だけをランダム化することができ、またはそうでなければ選択的にランダム化することができる。ランダムまたは部分的にランダムな配列を有するプライマーの組は、ランダム化すべき各位置で任意のヌクレオチドを付加させることによって、標準的技術を用いて合成することができる。また、そのプライマーの組は、同様の長さおよび/またはハイブリダイゼーション特性のプライマーから構成されることが好ましい。
複数鎖置換増幅の場合には、各プライマーの相補的部分は、標的配列中のハイブリダイゼーション標的と相補的になるように設計される。一組のプライマーでは、各プライマーの相補的部分は、標的配列の異なる部分と相補的であることが好ましい。その組に含まれるプライマーが、標的配列中の隣接する部位と相補的であることがより好ましい。また、標的配列中のそのような隣接する配列が、標的配列中の増幅標的とも隣接していることが好ましい。
プライマーの非相補的部分は、増幅した配列をさらに操作または分析するのに用いることができる配列を含みうる。そのような配列の一例が検出タグであり、これはプライマーの非相補的部分に存在する特異的ヌクレオチド配列である。検出タグは、検出プローブと相補的な配列を有する。検出タグは、それらの同族の検出プローブを用いて検出することができる。検出タグは、増幅された鎖の末端に組み込まれる。その結果は、検出プローブの相補的部分と相補的である検出タグ配列を有する、増幅されたDNAである。もしあれば、1つのプライマー上には1、2、3、または3より多数の検出タグが存在しうる。1つのプライマーは、1、2、3、または4個の検出タグを有することが好ましい。非常に好ましくは、1つのプライマーは1つの検出タグを有する。一般的に、1つのプライマーは10個以下の検出タグを有することが好ましい。1つのプライマー上に存在しうる検出タグの数に、プライマーの大きさ以外に原理的な限界は無い。複数の検出タグが存在する場合は、それらは同一の配列を有しうるかまたは、それらは異なる配列のそれぞれが異なる検出プローブと相補的である異なる配列を有しうる。プライマーは、すべてが単一の検出プローブと相補的となるように、同一の配列を有する検出タグを含むのが好ましい。一部の多重検出法については、プライマーは最大6個までの検出タグを含むのが好ましく、および、検出タグ部分のそれぞれが異なる検出プローブと相補的となるように、検出タグ部分は異なる配列を有するのが好ましい。同様の作用は、それぞれが単一の異なる検出タグを有する一組のプライマーを用いることによって達成することができる。検出タグはそれぞれ、検出タグと検出プローブとの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであることができる。このために、10ないし35ヌクレオチドの長さが好ましく、長さ15ないし20ヌクレオチドの検出タグ部分が非常に好ましい。
プライマーの非相補的部分に含むことができる配列の別の一例がアドレスタグである。アドレスタグは、アドレスプローブと相補的である配列を有する。アドレスタグは、増幅された鎖の末端に組み込まれる。その結果は、アドレスプローブの相補的部分と相補的であるアドレスタグ配列を有する、増幅されたDNAである。もしあれば、1つのプライマー上には1つの、または2つ以上の、アドレスタグが存在しうる。1つのプライマーは、1または2個のアドレスタグを有することが好ましい。非常に好ましくは、1つのプライマーは1つのアドレスタグを有する。一般的に、1つのプライマーは10個以下のアドレスタグを有することが好ましい。1つのプライマー上に存在しうるアドレスタグの数に、プライマーの大きさ以外に原理的な限界は無い。複数の複数のアドレスタグが存在する場合は、それらは同一の配列を有しうるかまたは、それらは異なる配列のそれぞれが異なるアドレスプローブと相補的である異なる配列を有しうる。プライマーは、すべてが単一のアドレスプローブと相補的となるように、同一の配列を有するアドレスタグを含むのが好ましい。アドレスタグ部分は、アドレスタグとアドレスプローブとの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであることができる。このために、長さ10ないし35ヌクレオチドの長さが好ましく、長さ15ないし20ヌクレオチドのアドレスタグ部分が非常に好ましい。
蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーとは、プローブまたはプライマーおよび検出、測定または複製すべき核酸の、形態または立体構造における変化に基づく、蛍光強度または波長の変化が関与するすべてのプローブおよびプライマーをいう。蛍光変化プローブおよびプライマーの例は、分子ビーコン、アンプリフロール(Amplifluor)、FRETプローブ、切断可FRETプローブ、TaqManプローブ、スコーピオン(scorpion)・プライマー、蛍光三重オリゴ、蛍光水溶性結合ポリマー、PNAプローブおよびQPNAプローブを含む。
本開示の方法では、細胞を溶解溶液と混合することによって、細胞をアルカリ性条件に曝露することができる。溶解溶液は一般的に、細胞溶解を引き起こすように細胞溶液のpHを十分に上げることができる溶液である。変性溶液が溶解溶液に必要な作用を有しうる限りは、変性溶液を溶解溶液として用いることができる。一部の実施形態では、溶解溶液は塩基水溶液といった塩基を含みうる。有用な塩基は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、アニリン、ベンジルアミン、n−ブチルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、メチルアミン、N−メチルアニリン、モルホリン、ピリジン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、水酸化アルミニウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウム、およびDBU(1,8−ジアゾビシクロ[5,4,0]ウンデカ−7−エン)を含む。有用な溶解溶液の処方は、400mM KOHを含む溶解溶液、400mM KOHおよび10mM EDTAを含む溶解溶液、400mM KOH、100mMジチオスレイトール、および10mM EDTAを含む溶解溶液、および400mM KOH、100mMジチオスレイトール、および10mM EDTAを含む溶解溶液を含む。他の有用な溶解溶液の処方は、100mM KOHを含む溶解溶液、100mM KOHおよび2.5mM EDTAを含む溶解溶液、100mM KOH、25mMジチオスレイトール、および2.5mM EDTAを含む溶解溶液、および100mM KOH、25mMジチオスレイトール、および2.5mM EDTAから成る溶解溶液を含む。有用な溶解溶液はpH8を有しうる。溶解溶液は使用前に希釈しうる。そのような場合には、反応に加える溶解溶液の量は一般的に、比例的に増加させることができる。
本開示の方法では、細胞溶解物または試料のpHは、安定化したかまたは中性化した細胞溶解物、または安定化したかまたは中性化した試料を生じるために低下させることができる。安定化溶液は一般的に、ここで別に記載した通り、アルカリ性条件に曝露された細胞溶解物または試料のpHを低下させることのできる溶液である。一部の実施形態では、安定化溶液は酸を含みうる。有用な酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、アセチルサリチル酸、アスコルビン酸、炭酸、クエン酸、ギ酸、硝酸、過塩素酸、HF、HBr、HI、H2S、HCN、HSCN、HClO、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、および任意のカルボン酸(エタン酸、プロパン酸、ブタン酸、など、直鎖または分枝鎖カルボン酸の両方を含む)。一部の実施形態では、安定化溶液は緩衝剤を含みうる。有用な緩衝剤は、トリス−HCl、HEPES、「グッド(Good)」緩衝剤(たとえばBES、BICINE、CAPS、EPPS、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TAPS、TES、およびTRICINE)、カコジル酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸トリエチルアンモニウム、重炭酸トリエチルアンモニウム、トリス、ビス−トリス、およびビス−トリスプロパンを含む。有用な安定化溶液の処方は、800mMトリス−HClを含む安定化溶液;800mMトリス−HClを含むpH4.1の安定化溶液、および800mMトリス−HCl、pH4.1から成る安定化溶液を含む。有用な安定化溶液の処方は、800mMトリス−HClを含むpH4の安定化溶液、および800mMトリス−HCI、pH4から成る安定化溶液を含む。他の有用な安定化溶液の処方は、160mMトリス−HClを含む安定化溶液;160mMトリス−HClを含むpH4.1の安定化溶液、および160mMトリス−HCl、pH4.1から成る安定化溶液を含む。他の有用な安定化溶液の処方は、160mMトリス−HClを含む安定化溶液;160mMトリス−HClを含むpH4の安定化溶液、および160mMトリス−HCl、pH4から成る安定化溶液を含む。安定化溶液は使用前に希釈しうる。そのような場合には、反応に加える安定化溶液の量は一般的に、比例的に増加させることができる。
本開示の方法の一部の形式では、試料を変性溶液と混合することによって、DNA試料を変性条件に曝露することができる。変性溶液は一般的に、加熱といった他の条件と組み合わせて、DNA試料中のDNAの相当な変性を引き起こすように試料のpHを十分に上げることができる溶液である。相当な変性とは、試料中のDNA分子の90%以上におけるヌクレオチドの90%以上の変性をいう。この場合、ヌクレオチドの変性とは、物理的に処理によって変性したかまたは試料中で既に対形成していなかった、対形成していないヌクレオチドをいう。溶解溶液が変性溶液に必要な作用を有しうる限りは、溶解溶液を変性溶液として用いることができる。
本開示の方法は、核酸の複雑な試料の核酸フィンガープリントの役割を果たす複製された鎖を作成するのに用いることができる。そのような核酸フィンガープリントは、他の、同様に調製された、他の核酸試料の核酸フィンガープリントと比較して、試料間の差の便利な検出を可能にするために用いることができる。核酸フィンガープリントは、関連する核酸試料の検出、および、核酸試料の比較の両方に用いることができる。たとえば、特定の生物の存在または同定は、その被験生物の核酸フィンガープリントを作製し、および結果として生じる核酸フィンガープリントを、既知の生物から調製された参照核酸フィンガープリントと比較することによって検出できる。遺伝子発現パターンにおける変化および差異はまた、異なる細胞試料に由来するmRNAの核酸フィンガープリントを調製し、および、その核酸フィンガープリントを比較することによって検出できる。複製された鎖はまた核酸試料の起源に特異的である一組のプローブまたはプライマーを作製するのに用いることができる。複製された鎖はまた、試料中に存在する核酸配列のライブラリとして用いることができる。核酸フィンガープリントは、試料の関係する核酸内容全体が実質的に表現するように、試料の全ゲノム増幅から成るかまたはそれに由来するか、または、試料中の選択された標的配列の複数鎖置換増幅に由来することができる。
固相検出器とは、アドレスプローブまたは検出分子を結合してある基材または担体である。好ましい種類の固相検出器はアレイ検出器である。アレイ検出器とは、複数の異なるアドレスプローブまたは検出分子をアレイ、格子、または他の組織化されたパターンで結合してある固相検出器である。
固相試料とは、標的配列またはMDA産物(すなわち、複製された鎖)を結合または付着させてある基材または担体である。標的配列は好ましくは標的試料または測定試料中で送られる。固相試料の好ましい一形態はアレイ試料である。アレイ試料とは、複数個の異なる標的配列を、アレイ、グリッド、または他の組織化されたパターンで結合または付着してある固相試料である。
本開示の方法を用いて増幅した核酸の検出および定量を助けるために、検出標識を、増幅された核酸に直接組み込むことができ、または検出分子と結合させることができる。ここでは、検出標識とは、増幅された核酸と直接にまたは間接に結合させることができ、および直接にまたは間接に測定可能な検出可能なシグナルを結果として生じる、任意の分子である。核酸への組み込みまたは核酸プローブとの結合のための多数のそのような標識が当業者に既知である。本開示の方法における使用に適した検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
検出プローブは、増幅された核酸上の検出タグと相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的部分は、検出プローブと検出タグの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さでありうる。このために、10ないし35ヌクレオチドの長さが好ましく、検出プローブの相補的部分は長さ16ないし20ヌクレオチドが非常に好ましい。検出プローブは上記の検出標識のうち任意のものを含むことができる。好ましい標識はビオチンおよび蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは分子ビーコンである。分子ビーコンとは、蛍光部分で標識化された検出プローブであり、ここでその蛍光部分は検出プローブがハイブリダイズした場合のみ蛍光を発する(チャギ(Tyagi)およびクレーマー(Kramer),Nature Biotechnol.14: 303−309(1995))。ハイブリダイズしなかった検出プローブはシグナルを生じないため、そのようなプローブの使用は、標識検出の前の、ハイブリダイズしなかったプローブの除去の必要性を無くす。このことは多重測定法において特に有用である。
アドレスプローブとは、プライマー上のアドレスタグと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的部分は、アドレスプローブとアドレスタグの間の特異的および安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さでありうる。このために、10ないし35ヌクレオチドの長さが好ましく、アドレスプローブの相補的部分は長さ12ないし18ヌクレオチドが非常に好ましい。アドレスプローブは単一の相補的部分または複数の相補的部分を含みうる。好ましくは,アドレスプローブは直接的にまたはスペーサー分子を介して、固相担体と結合している。アドレスプローブと固相担体のそのような組み合わせは、固相 検出器の好ましい一形式である。
プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、および任意の他のオリゴヌクレオチドは、確立されたオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドを製造または合成するための方法は本分野でよく知られている。そのような方法は標準的な酵素消化に続くヌクレオチド断片単離(たとえば、サムブルック(Sambrook)他,『分子クローニング:実験の手引き』第二版(Molecular Cloning : A Laboratory Manual,2nd Edition)(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor,N.Y.),1989)第5,6章を参照)から、たとえばシアノエチルホスホアミダイト法といった純粋に合成的な方法にわたることができる。DNA断片の固相化学合成は、保護ヌクレオシドであるシアノエチルホスホアミダイトを用いて定型的に実施されている(S.L.ビューケージ(Beaucage)他 (1981) Tetrahedron Lett.22: 1859)。この手法では、最初の5'−保護ヌクレオシドの3'−水酸基がまずポリマー担体に共有付加される (R.C.プレス(Pless)他 (1975) Nucleic Acids Res.2: 773 (1975))。オリゴヌクレオチドの合成は次いで、付加されたヌクレオシドの5'−水酸基の脱保護、その後の次のヌクレオシド−3'−ホスホアミダイトの脱保護された水酸基への結合によって進行する(M.D.マテウッチ(Matteucci)他 (1981) J.Am.Chem.Soc.103: 3185)。 結果として生じる亜リン酸トリエステルは最後に酸化されてリン酸トリエステルとなり、ヌクレオシド間結合を完成する(R.L.レツィンジャー (Letsinger)他 (1976) J.Am.Chem.Soc.9: 3655)。代替的に、ホスホロチオエート 結合の合成を亜リン酸トリエステルの硫化によって実施することができる。この反応を行うためにはいくつかの化学物質を用いることができ、その中に,3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン,1,1−ジオキシドがある(R.P.アイヤル(Iyer),W.イーガン(Egan),J.B.レーガン(Regan),およびS.L.ビューケージ(Beaucage),J.Am.Chem.Soc.,1990,112,1253−1254)。脱保護、結合、および酸化の段階は、希望の長さおよび配列のオリゴヌクレオチドが得られるまで反復される。H−ホスホナート法(Hall et al,(1957) J.Chem.Soc.,3291−3296) またはイクタ(Ikuta)他,Ann.Rev.Biochem.53: 323−356 (1984)(リン酸トリエステルおよび亜リン酸トリエステル法)およびナラング(Narang)他,Methods Enzymol.,65: 610−620 (1980)(リン酸トリエステル法)に記載された通りのリン酸トリエステル法といった、オリゴヌクレオチドを作製するための他の方法が存在する。タンパク質核酸分子は、ニールセン(Nielsen)他,Bioconjug.Chem.5:3−7(1994)によって記載されたもののような既知の方法を用いて作製することができる。オリゴヌクレオチド合成のその他の形が、米国特許第6,294,664号明細書および米国特許第6,291,669号明細書に記載されている。
複数置換増幅に有用なDNAポリメラーゼは、単独でまたは対応する鎖置換因子と組み合わせて、複製中に遭遇したハイブリダイズした鎖を置換する能力がなければならない。そのようなポリメラーゼをここでは鎖置換DNAポリメラーゼという。鎖置換DNAポリメラーゼは5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性を欠くことが好ましい。鎖置換は、標的配列の複数コピーの合成を結果として生じるために必要である。5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性は、もしあれば、合成された鎖の破壊を結果として生じうる。また、本開示の方法における使用のためのDNAポリメラーゼは、高度に連続性であることが好ましい。本開示の方法における使用のためのDNAポリメラーゼの適切性は、それの鎖置換複製を実施する能力を評価することによって容易に判定することができる。好ましい鎖置換DNAポリメラーゼは、バクテリオファージ29DNAポリメラーゼ(ブランコ(Blanco)他への米国特許第5,198,543号および第5,001,050号)、Bst大断片DNAポリメラーゼ(エキソ(−)Bst;アリオッタ(Aliotta)他,Genet.Anal.(オランダ) 12: 185−195 (1996) )およびエキソ(−)BcaDNAポリメラーゼ(ウォーカー(Walker)およびリン(Linn),Clinical Chemistry 42: 1604−1608(1996))である。他の有用なポリメラーゼは、ファージM2DNAポリメラーゼ(マツモト(Matsumoto)他,Gene 84: 247 (1989) )、ファージfPRD1 DNAポリメラーゼ(ユング(Jung)他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 8287 (1987) )、エキソ(−)VENT(登録商標)DNAポリメラーゼ(コング(Kong)他,J.Biol.Chem.268: 1965−1975 (1993))、DNAポリメラーゼIのクレノー断片(ジェイコブセン(Jacobsen)他,Eur.J.Biochem.45: 623−627 (1974))、 T5 DNA ポリメラーゼ(チャタジー(Chatterjee)他,Gene 97: 13−19(1991))、シークエナーゼ(U.S.バイオケミカルズ(U.S.Biochemicals))、PRD1 DNA ポリメラーゼ (ツー(Zhu)およびイトー(Ito),Biochim.Biophys.Acta.1219: 267−276 (1994))、およびT4 DNA ポリメラーゼホロ酵素(カボード(Kaboord)およびベンコビク(Benkovic),Ctirr.Biol.5: 149−157 (1995))を含む。29DNAポリメラーゼが非常に好ましい.
上記の材料は、本開示の方法を実施するために有用なキットとして、任意の適当な組み合わせで同梱することができる。任意のキットのキット構成要素は、本開示の方法における一緒の使用のために設計および適応させることができる。たとえば、ゲノムDNAを増幅するためのキットであって、溶解溶液、安定化溶液、一組のプライマー、およびDNAポリメラーゼを含むキットが開示される。そのようなキットの構成要素はここに別に記載する。キットの一部の形式では、溶解溶液は水酸化カリウム、たとえば、400mM KOHを含みうる。溶解 溶液の一部の有用な形式は、400 mM KOH、100 mM ジチオスレイトール、および10 mM EDTAを含みうる。キットの一部の形式では、安定化溶液はpH4.1のトリス−HClを含みうる。安定化溶液の一部の有用な形式は800mMトリス−HCI、pH4.1を含みうる。キットの一部の形式では、プライマーの組はランダム六量体プライマーを含みうる。キットの一部の形式では、DNAポリメラーゼはφ29DNAポリメラーゼでありうる。キットの一部の形式では、キットはさらにデオキシヌクレオチド三リン酸を含みうる。キットの一部の形式では、キットはさらに1種類以上の検出プローブを含みうる。検出プローブはここに別に記載する。キットの一部の形式では、検出プローブは相補的部分を含むことができ、ここでその相補的部分は目的の核酸配列と相補的である。キットの一部の形式では、キットはさらに変性溶液を含みうる。キットの一部の形式では、キットはさらに反応混合物を含みうる。また、核酸試料の増幅のためのキットであって、単一のプライマーおよびφ29DNAポリメラーゼを含むキットが開示される。キットはまた、ヌクレオチド、緩衝剤、検出プローブ、蛍光変化プローブ、溶解溶液、安定化溶液、変性溶液、または組み合わせを含みうる。
本開示の方法の任意の形式を実施することによって形成されたかまたは実施の過程で形成された混合物が開示される。たとえば、たとえば細胞および溶解溶液;細胞溶解物および安定化溶液;安定化した細胞溶解物および1種類以上のプライマー;安定化した細胞溶解物およびDNAポリメラーゼ;安定化した細胞溶解物、1種類以上のプライマー、およびDNAポリメラーゼ;安定化した細胞溶解物および複製された鎖;安定化した細胞溶解物、1種類以上のプライマー、および複製された鎖;安定化した細胞溶解物、DNAポリメラーゼ、および複製された鎖;安定化した細胞溶解物、1種類以上のプライマー、DNAポリメラーゼ、および複製された鎖;安定化した細胞溶解物および1種類以上の検出プローブ;安定化した細胞溶解物、1種類以上のプライマー、1種類以上の検出プローブ、および複製された鎖;安定化した細胞溶解物、DNAポリメラーゼ、1種類以上の検出プローブ、および複製された鎖;安定化した細胞溶解物、1種類以上のプライマー、DNAポリメラーゼ、1種類以上の検出プローブ、および複製された鎖、試料および溶解溶液;試料および安定化溶液;安定化した試料および1種類以上のプライマー;安定化した試料およびDNAポリメラーゼ;安定化した試料、1種類以上のプライマー、およびDNAポリメラーゼ;安定化した試料および複製された鎖;安定化した試料、1種類以上のプライマー、および複製された鎖;安定化した試料、DNAポリメラーゼ、および複製された鎖;安定化した試料、1種類以上のプライマー、DNAポリメラーゼ、および複製された鎖;安定化した試料および1種類以上の検出プローブ;安定化した試料、1種類以上のプライマー、1種類以上の検出プローブ、および複製された鎖;安定化した試料、DNAポリメラーゼ、1種類以上の検出プローブ、および複製された鎖;および安定化した試料、1種類以上のプライマー、DNAポリメラーゼ、1種類以上の検出プローブ、および複製された鎖を含む混合物が開示される。
本開示の方法を実施するために、またはその実施を助けるために、有用な系が開示される。系は一般的に構造物、機械、装置、などといった製品、および組成物、化合物、材料、などの組み合わせを構成する。開示されるかまたは本開示から明らかであるそのような組み合わせを検討する。たとえば、固相担体およびプライマー、核酸試料、検出プローブ、蛍光変化プローブ、または組み合わせを含む系が開示および検討される。
本開示の方法で用いられる、それによって生じる、またはそこから作製される、データ構造が開示される。データ構造とは一般的に、構成物または媒体中で、回収、組織、保存、および/または具体化された任意の形のデータ、情報、および/または対象である。RAMまたは保存ディスクといった電子形式で保存された核酸ライブラリは一種のデータ構造である。
本開示の方法および組成物は、細胞中に存在する核酸の分析(たとえば、細胞中のゲノムDNAの分析)、疾患検出、突然変異検出、遺伝子発見、遺伝子マッピング(分子ハプロタイプ分析)、および農業研究を含むがそれらに限定されない多数の分野に応用可能である。特に有用なのは全ゲノム増幅である。他の用途は、たとえば、細胞中およびゲノムDNAアレイ上の核酸の検出;分子ハプロタイプ分析;突然変異検出;嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、糖尿病、血友病、鎌状赤血球貧血といった遺伝病の検出;前立腺がん、乳がん、肺がん、大腸がん、卵巣がん、精巣がん、膵臓がんといったがんについての素因の評価を含む。
核酸を増幅する方法が開示される。 特に、低い増幅、偏り、および/または増幅産物の品質の他の指標を有する増幅産物を作製するための方法が開示される。増幅反応は、閾量のまたはそれを上回る量の核酸について、および/または、閾濃度のまたはそれを下回る濃度の核酸について実施するならば、低い増幅偏りといった高品質の増幅産物を生じることができることが見出されている。閾量および閾濃度は、増幅する核酸の性質および起源、および使用する増幅反応の種類に応じて変化しうる目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる、核酸の閾量および/または閾濃度を決定する方法が開示される。増幅反応は、核酸の閾量および/または濃度未満で、低い偏りの増幅産物といった高品質の増幅産物を生じることができるため、そのような閾量および/または濃度未満を用いることができる。したがって、選択された増幅偏り(または増幅された核酸の品質の他の指標)よりも小さい増幅産物を作製するために、目的の核酸試料について目的の増幅反応において使用することができる、核酸の量および/または濃度を決定する方法もまた開示される。本開示の方法によって作製される増幅産物の品質は任意の望ましい基準によって測定することができ、および目的の基準によって測定される品質の希望のレベルを達成するための閾量(または上回る)および/または閾濃度(または下回る)は、本開示の方法によって決定することができおよび本開示の方法に用いることができる。
1.増幅前のゲノムDNAテンプレートの変性。溶液Aを1:4にH2Oを用いて希釈することによって溶解溶液を調製する(たとえば100μLの溶液Aを300μLのH2O中へ)。溶液Bを1:5にH2Oを用いて希釈することによって安定化緩衝液を調製する(たとえば、100μLの溶液Aを400μLのH2O中へ)。溶解溶液および安定化溶液の両方は、新しい実験ごとに用時調製すべきである。使用後は、CO2からの中性化を避けるため、溶液Aの入った瓶は直ちに再密栓する。
溶液Aの有効使用期限は6ヶ月である。6ヶ月を超えて保存した場合は新しい溶液Aを調製する。
溶液A:400mMKOH、10mMEDTA、pH8
溶液B:800mMトリス塩酸、pH4
2.2.5μLの溶解溶液を、氷上にて2.5μLのゲノムDNAを入れた0.2mLサーモサイクラーチューブのそれぞれに加える。ピペットで5回吸引上下することによってよく混合する。チューブまたはプレートを氷上で3分間インキュベートする。
3.変性反応を3分後に、5μLの安定化緩衝液を各試料および対照に加えることによって停止する。チューブを氷から取り出す。直ちに増幅反応へ進む。
4.段階3からのチューブに、終容量50μlで下記を加える:
必要な量のゲノムDNA、
0.3Mトレハロース、
10mMMgCl2、
37.5mMトリス/HClpH:7、
50mMKCl、
20mM硫酸アンモニウム、
1mMdNTP、
50μMエキソヌクレアーゼ耐性ランダム六量体オリゴヌクレオチド、
40ユニットのファイ29DNAポリメラーゼ。
40℃にて6〜16時間インキュベートする。
本開示の方法は、高いレベルの増幅を生じることができる。たとえば、本開示の方法は、10,000倍以上の増幅を生じることができる。増幅倍数とは、増幅されているテンプレートの、生じたコピー数をいう。たとえば、1ugのDNAが1ngのテンプレートから生じた場合、増幅のレベルは1,000倍である。本開示の方法は、たとえば、約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約11倍、約12倍、約14倍、約16倍、約20倍、約24倍、約30倍、約35倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍、約1,000倍、約10,000倍、約100,000倍、約1,000,000倍、約10,000,000倍、または約100,000,000倍の増幅を生じることができる。
本開示の方法における使用のためのプライマーは、高品質の増幅産物を生じる能力に関して選択することができる。そのようなプライマーは、本開示の方法において特に有用である。本開示の方法で1種類以上のプライマーが用いられる場合、プライマーの全部が選択プライマーでありうるかまたは、プライマーの一部が選択プライマーでありうる。プライマー選択には任意の有用な基準を用いることができる。有用な基準は、遺伝子座表現、配列表現および増幅偏りといった増幅産物の品質、および、増幅アーティファクトの産生の欠如または最小化といった、負の性質が無いことを含む。所定の複数の選択基準(または1つの選択基準)を満たすプライマーを、ここでは(それらの選択基準についての)選択プライマーという。所定の複数の選択基準(または1つの選択基準)を満たさないプライマーを、ここでは(それらの選択基準についての)非選択プライマーという。選択プライマーの使用が好ましいが、選択および非選択プライマーの両方を、本開示の方法において一緒に使用することができる。
全ゲノム鎖置換増幅(WGSDA)といわれる、本方法の一形式では、ランダムまたは部分的にランダムな組のプライマーが、ゲノム核酸の試料(または他の高度な複雑性の核酸の試料)をランダムにプライミングするために用いられる。ランダムまたは大部分ランダムな配列のプライマーの十分に大きな組を選択することによって、その組に含まれるプライマーは、合計としておよびランダムに、試料中の核酸全体に渡って分布する核酸配列に相補的となる。増幅は、連続性ポリメラーゼを用いた、各プライマーで開始しおよび自発終止まで連続する複製によって進行する。本方法の重要な特性は、複製中のポリメラーゼによる介在プライマーの置換である。このようにして、ゲノム全体の複数の重なり合うコピーを短時間に合成することができる。
複数鎖置換増幅(MSDA)といわれる、本方法の好ましい一形式では、右組および左組の、二組のプライマーが用いられる。プライマーの右組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列の一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有し、およびプライマーの左組に含まれるプライマーはそれぞれ、標的ヌクレオチド配列のもう一方の側に隣接するヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。右組に含まれるプライマーは標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子の一方の鎖と相補的であり、および左組に含まれるプライマーは反対側の鎖と相補的である。両方の組のプライマーの5'末端は、プライマーが核酸分子中の隣接配列とハイブリダイズされる際、目的の核酸配列の遠位側である。好ましくは、各組のそれぞれのメンバーは、標的ヌクレオチド配列に隣接する、別々のおよび重なり合わないヌクレオチド配列と相補的な部分を有する。増幅は、各プライマーで開始されおよび標的核酸配列を通じて継続する複製によって進行する。この方法の重要な特性は複製中の介在プライマーの置換である。プライマーの右組から伸長した核酸鎖が、プライマーの左組がハイブリダイズする核酸分子の領域に一旦達すると、および逆の場合も同様に、もう一回のプライミングおよび複製が起こる。このことは、標的核酸配列の入れ子化した組の複数コピーが短時間に合成されることを可能にする。
連結されたDNAの複数鎖置換増幅(MSDA−CD)といわれる、本方法の別の一形式では、連結されたDNAが増幅される。連結されたDNAの好ましい種類は、連結されたcDNAである。連結されたDNAは、WGSDAの場合のようにランダムまたは部分的にランダムな組のプライマーを用いて、または、連結されたDNA中の特異的ハイブリダイゼーション標的と相補的な特異的プライマーを用いて増幅することができる。MSDA−CDは、相対的に短い核酸試料(すなわち、一般的に100ないし6,000ヌクレオチドの範囲の断片)の複雑な混合物または試料の増幅に好ましい。メッセンジャーRNAは、そのような複雑な混合物の最も重要な例である。MSDA−CDは、細胞中のすべてのcDNAを等しい方法で増幅するための手段を提供する。連結されたcDNAは最大5,000倍まで増幅することができるため、MSDA−CDは、数個の細胞だけに基づくRNAプロファイリング分析を可能にする。MSDA−CDを実施するためには、DNAを最初に連結段階に供しなければならない。RNA試料(たとえばmRNA)を増幅すべき場合は、RNAをまず標準的方法を用いて二本鎖cDNAに変換する。そのcDNA、または増幅すべきDNA断片の任意の他の組を、次いでDNA連結体へ、好ましくはリンカーの組み込みを伴って変換する。
本開示の方法の別の形式は、損傷DNAの増幅および修復を含みうる。損傷DNAの増幅は、困難でありおよび信頼性の低い結果を与えることの両方でありうる。たとえば、分解または断片化されたDNAの増幅は、短縮された産物を生じ、および対立遺伝子欠落を結果として生じうる。特にゲノムDNA試料の調製は、ゲノムDNAへの損傷を結果として生じうる(たとえば、分解および断片化)。損傷DNAおよび損傷DNA試料は、損傷DNAを増幅する本開示の方法で増幅および修復することができる。本方法は一般的に、損傷DNA試料中の一部のDNA分子の末端を、試料中の相補的配列にハイブリダイズさせることによって機能する。新しく結合した末端を提供するDNA分子は異なる位置に損傷を有するため、アニーリングした末端からプライミングすることは、より完全な断片の複製を結果として生じることができ、および損傷DNAの修復を媒介しうる(損傷がより少ないかまたは損傷していない複製された鎖の形で)。その損傷していない複製された鎖の、継続した複数置換増幅による複製は、損傷がより少ないかまたは損傷していない増幅された核酸を生じる。
臨床および保健科学研究は、DNA中の多型部位の多パラメータ測定に関するインプットとして働く大量のゲノムDNAへの容易なアクセスを必要とし、その測定の複合した結果は貴重な予後および診断情報を提供する。しかし、大部分の生検法は組織または細胞の微量しか与えないため、これらの研究はDNAの適当な供給の深刻な不足によって妨げられている。試料調製段階は、細胞分画中の損失のために、これらの細胞から回収された量をさらに減少させ、それによって、インプットとして単離されたゲノムDNAを用いて調べることができる試料当たりの染色体遺伝子座の数を制限する。本発明の方法は、多パラメータ分析のためのDNAの適当なおよび再生可能な供給を提供することによってこれらの不足を克服することを目指す。
(G*RC)/PER
ここでGはゲノムの大きさ(または核酸の複雑性)であり、RCは増幅における複製の平均回数であり、およびPERはポリメラーゼエラー率(すなわち、ヌクレオチドの誤組み込みの率)である。
本開示の方法は、核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を結果として生じることができる。ここでは、核酸試料中の核酸分子の相当な部分とは、核酸試料中に存在する核酸分子(または核酸配列)の90%以上をいう。ここでは、核酸試料中の核酸分子の大きな部分とは、核酸試料中に存在する核酸分子(または核酸配列)の50%以上をいう。ここでは、核酸試料中の核酸分子のかなりの部分とは、核酸試料中に存在する核酸分子(または核酸配列)の20%以上をいう。
増幅のための核酸はしばしば細胞試料から得られる。このことは一般的に、細胞の破壊(核酸を接触可能にするため)および核酸の精製を増幅の前に必要とする。このことはまた、一般的に、ヌクレアーゼといったDNAを分解できるタンパク質因子の、またはヒストンといったDNA鎖と結合してそのポリメラーゼによるDNA合成のテンプレートとしての利用を妨げることができる因子の、不活性化を必要とする。超音波処理、細胞壁の酵素消化、加熱、および溶解条件への曝露といった、細胞を壊して開くのに用いられるさまざまな技術がある。溶解条件は典型的には、非生理的pHおよび/または溶媒の使用を含む。多数の溶解技術は、たとえば、ゲノムDNAの切断を含む、細胞中の核酸への損傷を結果として生じうる。特に、細胞を溶解するための加熱の使用は、ゲノムDNAを損傷しおよびゲノムDNAの増幅産物の量および品質を低下させうる。アルカリ性溶解は、ゲノムDNAに与える損傷がより小さくなりうること、およびしたがって結果としてより高品質の増幅結果を生じうることが見出されている。アルカリ性溶解はまた、ヌクレアーゼといったタンパク質因子、ヒストン、または試料中のDNAの増幅を妨げうる他の因子を不活性化する。加えて、pHを低下させることはタンパク質因子を再活性化させず、そのようなタンパク質因子は溶液のpHが中性範囲内に戻される際に不活性化されたままに留まることは、アルカリ性溶解の有用な特性である。
増幅の産物は、任意の核酸検出技術を用いて検出することができる。リアルタイム検出については、増幅産物および増幅の進行が増幅中に検出される。リアルタイム検出は、1種類以上の、または1または組み合わせの、蛍光変化プローブおよび蛍光変化プライマーを用いることによって有用に達成される。他の検出技術を、単独で、または、リアルタイム検出および/または検出蛍光変化プローブおよびプライマーを含む検出と組み合わせて使用することができる。核酸の検出については多数の技術が既知である。増幅された配列のヌクレオチド配列もまた、任意の適当な技術を用いて決定することができる。
1.増幅産物の検出
増幅産物は、たとえば、下記に示す通り、一次標識化または二次標識化によって直接検出することができる。
一次標識化は、蛍光ヌクレオチド、ビオチニル化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、またはブロモデオキシウリジンといった標識化部分を、鎖置換複製中に組み込むことから成る。たとえば、シアニン色素デオキシウリジンアナログ(ユー(Yu)他,Nucleic Acids Res.,22: 3226−3232(1994))を、100ヌクレオチド毎に4アナログの頻度で組み込むことができる。in situ増幅された核酸を検出するための好ましい方法は、DNAを増幅中にBrdUrdで標識化すること、続いてビオチニル化抗BrdU抗体(ザイメッド・ラブズ社(Zymed Labs)、カリフォルニア州サンフランシスコ)を用いた組み込まれたBrdUの結合、その後にストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ(ライフサイエンス社(Life Sciences,Inc.))を用いたビオチン部分の結合、および最後にフルオレセイン−チラミド(デュポンデヌムール社医療品部門(DuPont de Nemours & Co.,Medical Products Dept.))を用いた蛍光の発色である。in situ増幅された核酸を検出するための他の方法は、DNAを増幅中に5−メチルシトシンで標識化し、その後の抗体を用いた組み込まれた5−メチルシトシンの結合(サノ(Sano)他,Biochim.Biophys.Acta 951: 157−165 (1988) )、またはDNAを増幅中にアミノアリル−デオキシウリジンで標識化し、その後のオレゴングリーン(登録商標)色素(モレキュラー・プローブズ社(Molecular Probes)オレゴン州ユージーン(Eugene))を用いた組み込まれたアミノアリル−デオキシウリジンの結合(ヘネガリウ(Henegariu)他,Nature Biotechnology 18: 345−348 (2000))を含む。
二次標識化は、増幅された核酸を検出するための、検出プローブと呼ばれる適当な分子プローブの使用から成る。たとえば、プライマーは、非相補的部分に、検出タグと呼ばれる既知の任意の配列を含むように設計することができる。第2のハイブリダイゼーション段階を用いて、検出プローブをこれらの検出タグへ結合させることができる。検出プローブは、たとえば、酵素、蛍光部分、または放射性同位体を用いて上記の通り標識化することができる。プライマー当たり3個の検出タグ、および各検出プローブ当たり4個の蛍光部分を用いることによって、複製された鎖のそれぞれについて合計12の蛍光シグナルを得ることができる。検出プローブは、通常のワトソン−クリック塩基対形成(または関連する代替法)を介したハイブリダイゼーションまたはアニーリングによって相互作用することができ、または、2本鎖標的と相互作用して三重らせんを形成しうる。そのような三重鎖形成検出プローブを、蛍光変化プローブの形でのような、他の検出プローブと同じ方法で使用することができる。
増幅された核酸の検出は、各組が異なる標的配列を増幅するために設計された異なるプライマーの組を用いることによって、多重化することができる。標的を見つけることができるプライマーだけが増幅産物を生じる。所定の増幅された核酸を固相検出器中の固定された位置に捕捉するためには2つの選択肢がある。1つはプライマーの非相補的部分内に独自のアドレスタグ配列を、それぞれ独自の組のプライマーについて含めることである。所定の組のプライマーを用いて増幅された核酸はその結果、特異的アドレスタグ配列に対応する配列を含む。第2のおよび好ましい選択肢は、標的配列中に存在する配列をアドレスタグとして用いることである。本開示の方法は、たとえば、異なる標的配列に向けられる異なる検出プローブの組を用いることによって、容易に多重化できる。異なる検出プローブを伴う異なる蛍光標識の使用は、異なる標的配列の特異的検出を可能にする。
多重化、検出の一形式は、異なる波長で蛍光を発するかまたは色が異なる標識の組み合わせの使用を含む。ハイブリダイゼーションプローブの検出のための蛍光の長所の1つは、同一の試料中でいくつかの標的を同時に可視化できることである。組み合わせ戦略を用いて、分光学的に分離可能な蛍光団の数よりもずっと多くの標的を識別することができる。プローブ 蛍光物質は全く無い (−)かまたは単位量で存在する(+)ため、組み合わせ標識化は、プローブを多重化方法で標識化する最も簡単な方法を提供する;画像分析はしたがって、より自動化に適しており、および、蛍光物質の光褪色の差および励起源出力スペクトルの変更の作用といったいくつかの実験アーティファクトが回避される。組み合わせ標識化は、蛍光変化 プローブおよびプライマーと共に用いることができる。
標識化ヌクレオチドの組み込みによって標識化された増幅された核酸は、確立された酵素結合検出系を用いて検出することができる。たとえば、ビオチン−16−UTP(ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社(Roche Molecular Biochemicals))を用いたビオチンの組み込みによって標識化された増幅された核酸は、下記の通り検出することができる。核酸を、増幅された核酸中に存在する標的配列(またはその相補鎖)と相補的である相補的DNAオリゴヌクレオチド(アドレスプローブ)とのハイブリダイゼーションによって、固相ガラス表面上に固定化する。ハイブリダイゼーション後に、そのスライドガラスを洗浄し、およびアルカリ性ホスファターゼ−ストレプトアビジン複合体(トロピックス社(Tropix,Inc.)、マサチューセッツ州ベッドフォード(Bedford))と接触させる。この酵素−ストレプトアビジン複合体は、増幅された核酸上のビオチン部分と結合する。スライドを再び洗浄して過剰の酵素複合体を除去し、および化学発光基質CSPD(トロピックス社)を加え、およびカバーグラス片で覆う。スライドを次いでバイオラッド蛍光画像処理装置(Biorad Fluorimager)で画像化する。
標的配列のリニア増幅を結果として生じる、複数鎖置換増幅の一改変形式を実施することができる。この改変法はリニア鎖置換増幅(LSDA)と呼ばれ、および、すべてのプライマーが標的配列の同一の鎖と相補的である一組のプライマーを用いることによって達成される。LSDAでは、MSDAと同様に、プライマーの組が標的配列とハイブリダイズし、および鎖置換増幅が起こる。しかし、標的配列の鎖のうち一方だけが複製される。LSDAは、新しい組のプライマーを標的配列へハイブリダイズさせるために、複製の各回の間に熱サイクル反応を必要とする。そのような熱サイクル反応はPCRに用いられるものと同様である。リニア、または単一プライマーの、PCRとは異なり、しかし、LSDAにおける複製の各回は標的配列の複数コピーを結果として生じる。使用する各プライマーについて1コピーが作られる。したがって、20種類のプライマーがLSDAに用いられる場合、標的配列の20コピーが複製の各サイクルに作られる。
複数置換増幅を、RNAについて、またはRNAから逆転写されたDNA鎖について実施することができる。逆転写複数置換増幅(RT−MDA)と呼ばれる、本開示の方法の有用な一形式は、RNAを逆転写すること、そのRNAの除去(好ましくは、RNAseHのようなRNA特異的ヌクレアーゼを用いたヌクレアーゼ消化によって)、および逆転写されたDNAの複数置換増幅を含む。RT−MDAは、2本鎖cDNAのどちらかを用いて、または第1のcDNA鎖だけを用いて、実施することができる。後者の場合には、第2のcDNA鎖を合成する必要は無く、および好ましくは合成しない。RT−MDAは、mRNAの定量的分析、または任意の他の目的のためのmRNA配列の一般的増幅に有用である。
本開示の複数置換増幅操作はまた、連続的に組み合わせることができる。たとえば、MDAの産物はそれ自体を別の複数置換増幅で増幅することができる。これをここでは反復複数置換増幅(RMDA)という。これは、たとえば、MDA後に複製された鎖を希釈し、および、それらを新しいMDAに供することによって達成できる。これを1回以上反復することができる。MDAの各回は増幅を増大させる。WGSDAおよび特定の配列に対するMSDAといった異なる形式のMDAを組み合わせることができる。一般的に、反復MDAは、まず一組のプライマー、DNAポリメラーゼ、および標的試料を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下で標的試料をインキュベートすることによって達成できる。標的配列の複製は結果として複製された鎖を生じ、ここで複製中に、複製された鎖のうち少なくとも一方が、別の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される;次いで、複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、DNAポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートする。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも一方が、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。本方法のこの形式は、下記の操作を1回以上実施することによって延長できる:追加の複製された鎖を希釈し、一組のプライマー、DNAポリメラーゼ、および希釈した複製された鎖を接触させ、および標的配列の複製を促進する条件下でその複製された鎖をインキュベートする。標的配列の複製は、追加の複製された鎖を結果として生じ、ここで複製中に、追加の複製された鎖のうち少なくとも一方が、別の追加の複製された鎖の鎖置換複製によって標的配列から置換される。
本開示の方法を用いて作製された核酸は、任意の目的に用いることができる。たとえば、増幅された核酸を分析して(たとえば配列決定またはプローブハイブリダイゼーションによって)、増幅された配列の特徴または特定の配列の存在または非存在を決定することができる。増幅された核酸はまた、測定または他の方法のための試薬として用いることができる。たとえば、本開示の方法で作製された核酸を、基材へ結合または接着することができる。結果として生じる固定化核酸は、試料中の配列のプローブまたはインデックスとして用いることができる。本開示の方法で作製された核酸は、任意の適当な方法で、基材へ結合または接着することができる。たとえば、修飾ヌクレオチドを、鎖置換複製によって作製された核酸の3’末端へ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて付加し、およびその修飾ヌクレオチドを基材または担体と反応させ、それによって核酸を基材または担体へ結合させることにより、複数鎖置換によって生成された核酸を結合させることができる。
ゲノムを増幅する方法であって単一のプライマー、DNAポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、および、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含む方法が開示される。プライマーは特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料はゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じる。
(a)一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートすること、および
(b)DNAポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
(a)一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと,および
(b)DNAポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
(a)一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと,および
(b)DNAポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
(a)一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと,および
(b)DNAポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
(a)一組のプライマーを標的試料と混合して、プライマー−標的試料混合物を生じ、およびプライマー−標的試料混合物中のプライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でプライマー−標的試料混合物をインキュベートし、ここでプライマー−標的試料は変性条件に供されないこと、および
(b)DNAポリメラーゼをプライマー−標的試料混合物と混合して、ポリメラーゼ−標的試料混合物を生じ、および標的配列の複製を促進する条件下でポリメラーゼ−標的試料混合物をインキュベートすること
を含む方法もまた開示される。
下記は本開示の方法の一部の具体的態様を例証する。
高温MDA手順例
試薬組成
溶液A:400mM KOH,10mM EDTA,pH8
溶液B:800mMトリス塩酸,pH4
1.増幅前のゲノムDNAテンプレートの変性。
a.変性溶液 溶液Aを1:4にH2Oを用いて希釈する(たとえば100μLの溶液Aを300μLのH2O中へ)。
b.安定化溶液 溶液を1:5にH2Oを用いて希釈する(たとえば、100μLの溶液Bを400μLのH2O中へ)。
注:変性溶液および安定化溶液は使用前に新しく希釈する。溶液Aの入った瓶は密栓して保存する。
2.2.5μLの変性溶液を、氷上にて2.5μLのゲノムDNAを入れた0.2mLサーモサイクラーチューブのそれぞれに加える。ピペットで5回吸引上下することによってよく混合する。チューブまたはプレートを氷上で3分間インキュベートする。
3.変性反応を3分後に、5μLの安定化溶液を各試料および対照に加えることによって停止する。チューブを氷から取り出す。直ちに増幅手順へ進む。
4.複数置換増幅
必要な量のゲノムDNA、
0.3Mトレハロース、
10mM MgCl2、
37.5mMトリス/HClpH:7、
50mM KCl、
20mM硫酸アンモニウム、
1mMdNTP、
50μMエキソヌクレアーゼ耐性ランダム六量体オリゴヌクレオチド、
40ユニットのファイ29DNAポリメラーゼ。
40℃にて6〜16時間インキュベートする。
A.試薬
4X混合物
DNAポリメラーゼ混合物
対照gDNAテンプレート(10ng/μL)
ストック溶解または変性溶液
安定化溶液
1Xリン酸緩衝生理食塩水(pH7.5)
1Mジチオスレイトール(DTT)
滅菌蒸留/脱イオン水(H2O)
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム−2H2O(EDTA)
水酸化カリウム(KOH)、ペレット
1XTE緩衝液(10mMトリス、pH8.0;1mM EDTA、pH8.0)
30℃および65℃インキュベーターまたは熱サイクル制御装置
0.5μLから1000μLマイクロピペッター
1.5mLポリプロピレン微量遠心チューブ
0.2mLサーマルサイクラーチューブ、または96ウェルサーマルサイクラープレート
疎水性フィルター付きピペットチップ
冷凍した試薬および組成物を−70℃以下で保存する。活性の損失が無いことを確実にするため、ストック溶解溶液および変性溶液は新しく調製すべきでありおよび室温(20〜25℃)にて約1週間保存しうる(下記参照)。
1.ストック溶解溶液の調製
5mLバイアルのストック溶解溶液−0.4M KOH,10mM EDTA(pH8.0)−細胞溶解にまたは精製gDNA変性における使用のために一週間以内に使用のため、ストック溶液から新しく調製(下記参照)。
ストック5M KOHを、28gのKOHペレットおよび終容量100mLとするのに十分なH2Oを加えることによって調製する。KOHペレットが乾燥していて(塊になっていない)および溶解前に空気にできるかぎり短く曝されることを確実にする。
i.組織培養細胞からの迅速ゲノムDNA抽出:
反応は氷上に準備して実施する。
反応は氷上に準備して実施する。
すべての反応は室温に準備して実施する。
単離されたgDNAまたは溶解した血液および細胞のための増幅反応
増幅産物のQC分析
下記の手順は増幅産物の品質を試験するのに用いることができる。
本実施例は本開示の方法のいくつかの実施形態の実証および結果の分析および比較を記載する。例示される方法は本開示の、特異的配列を有する六量体(6ヌクレオチド)プライマーを用いた全ゲノム増幅の複数置換増幅形式である。異なるプライマー、および異なる数のプライマー、をさまざまな反応において使用した。これらのすべての例は、ヒト全ゲノムを効率的に増幅するために、特異的ヌクレオチド配列の1または少数のプライマーだけを用いる。
本開示の方法の一実施形態の一例では、0.2mlチューブ中に集められた100μl反応(3連で)は、10ngのヒトゲノムDNA、37mMトリス−HCl、pH7.5、50mM KCl、10mM MgCl2、5mM(NH4)2SO4、1.0mMdATP、dTTP、dCTP、およびdGTP、50μMエキソヌクレアーゼ耐性六量体、および800ユニット/mlファイ29DNAポリメラーゼを含んだ。反応は16時間30℃にてインキュベートし、および65℃への3分間の加熱によって終了した。MDA反応収率はピコグリーン(PicoGreen)定量化によってラムダDNA標準曲線(モレキュラー・プローブズ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン(Eugene))を用いて決定した。
増幅されたDNAの品質はTaqMan分析を用いて評価した。TaqMan分析はABI7700および7000配列検出系の両方を用いて取扱説明書(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)、カリフォルニア州フォスターシティ(Foster City))に従って実施した。TaqMan反応は50μlの1xプラチナTaqポリメラーゼ緩衝液、5mM MgCl2、1mMの各dNTP、1μlのROXリファレンス色素(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社(Invitrogen Life Technologies)、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad))、1ユニットのプラチナTaqポリメラーゼ(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社(Invitrogen Life Technologies)、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad)))、各0.3μMの順方向および逆方向PCRプライマー、0.25μMのFAM/TAMRA蛍光/消光プローブ、および1μgのMDA増幅されたDNAから成る。精製されたヒトゲノムDNA(gDNA)(プロメガ社(Promega)、ウィスコンシン州マディソン(Madison))を用いて0、0.001、0.01、0.1、および1μgのgDNAの標準曲線を作成し、MDA増幅されたDNAを定量化した。遺伝子座表現(MDA/gDNA)はパーセントとして記録し、および100(遺伝子座コピー数/μgMDA産物)/(遺伝子座コピー数/μg gDNA)として導いた。100%の値は、増幅されたDNAに関する遺伝子座コピー数が、増幅されていないゲノムDNAに関する遺伝子座コピー数と等しいことを示す。
ヒトゲノムDNAを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでTaqMan遺伝子座分析を行った。単一の6ヌクレオチドAlu特異的プライマー(すなわち、その配列はAlu反復配列に由来した)であるAluR11(AGCGAG)をMDA反応に使用した。計47遺伝子座を分析した(染色体当たり2遺伝子座、およびY染色体から1遺伝子座)。図1に示す通り、AluR11は遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
2種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムDNAを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでTaqMan遺伝子座分析を行った。2種類のプライマー配列はAGTGGGおよびAGAGAGであった。計47遺伝子座を分析した(染色体当たり2遺伝子座、およびY染色体から1遺伝子座)。図2に示す通り、2種類の6ヌクレオチドプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
3種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムDNAを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでTaqMan遺伝子座分析を行った。プライマーは、配列AGCCGG、AGTAGG、およびAGTTGG.を有する6ヌクレオチド非Aluプライマー(すなわち、その配列はAlu反復配列に由来しなかった)であった。計47遺伝子座を分析した(染色体当たり2遺伝子座、およびY染色体から1遺伝子座)。図3に示す通り、3種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
4種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムDNAを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでTaqMan遺伝子座分析を行った。プライマーは配列AGGCGG、AGTGGG、AGGGAG、およびAGTGAG.を有する6ヌクレオチドプライマーであった。計47遺伝子座を分析した(染色体当たり2遺伝子座、およびY染色体から1遺伝子座)。図4に示す通り、4種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
5種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムDNAを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでTaqMan遺伝子座分析を行った。最初の例では、プライマーは配列AGTGGG、AGCCAG、AGTTAG、AGTCAG、およびAGACAGを有する6ヌクレオチドプライマーであった。計47遺伝子座を分析した(染色体当たり2遺伝子座、およびY染色体から1遺伝子座)。図5に示す通り、これらの5種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
9種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムDNAを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでTaqMan遺伝子座分析を行った。プライマーは、AluR9Hと呼ばれる6ヌクレオチドAlu特異的プライマーであった。9種類すべてのAlu特異的プライマーの名称および配列を表2に示す。星印はホスホチオエート結合を示す。計10遺伝子座を分析した。図9に示す通り、9種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
12種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムDNAを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでTaqMan遺伝子座分析を行った。プライマーは、AluR12Hと呼ばれる6ヌクレオチドAlu特異的プライマーであった。12種類すべてのAlu特異的プライマーの名称および配列を表3に示す。星印はホスホチオエート結合を示す。計47遺伝子座を分析した(染色体当たり2遺伝子座、およびY染色体から1遺伝子座)。図10に示す通り、12種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。
MDA反応を30℃にて添加剤無しで、または40℃にて0.3Mトレハロースありで、原則的に高温MDAに関して上に記載した手順を用いて実施した。インプットテンプレートの量は0ng、0.3ng、3ng、または30ngのどれかであった。記載の温度でのMDA反応の16時間後に、総DNA合成をピコグリーン測定法を用いて定量した。結果を図11に示す。
MDA反応を40℃にて、添加剤無しで、または0.3Mトレハロースまたは0.4Mスクロースまたは0.4Mグルコースの存在下で、原則的に高温MDAに関して上に記載した手順を用いて実施した。インプットテンプレートの量は0ngまたは0.003ngまたは0.03ngまたは0.3ngまたは3ngまたは30ngのどれかであった。MDA反応の16時間後に、総DNA合成をピコグリーン測定法を用いて定量した。結果を図12に示す。
本実施例は本開示の方法の一実施形態の実証および結果の分析および比較を記載する。例示される方法は本開示の、ヌクレアーゼ耐性ランダム六量体プライマーを用いた全ゲノム増幅の複数置換増幅形式である。本実施例中の一部の反応は、本開示の方法の好ましい一形式で、試料を変性条件に供せずに実施した。他の反応では、テンプレートDNAを増幅前に変性に供した。MDAはφ29DNAポリメラーゼを用いて実施した。
i.DNAおよび酵素。
ヒトゲノムDNA試料群であるヒト変異群・コーカサス系100人群(参照番号HD100CAU)は、コリエル研究所細胞バンク(Coriell Cell Repositories)から入手した。ヒトゲノムDNAはまたプロメガ社(Promega Corp.)からも入手した。チオリン酸修飾ランダム六量体(5'−NpNpNpNpsNpsN−3')はモレキュラー・ステージング社(Molecular Staging)で合成され、φ29DNAポリメラーゼはアマシャム・ファルマシア・バイオテク社(Amersham Pharmacia Biotech)からであり、および酵母ピロホスファターゼはベーリンガー・マンハイム社(Boehringer−Mannheim)からであった。DNAサイズマーカー(100bpDNAラダー、1kbDNAラダー)はギブコBRL(GibcoBRL)からであった。
ヒトゲノムDNA(300ngないし0.03ng、表示の通り)を総容量50μlで0.2mlチューブに入れ、25mMトリス−HCl、pH7.5、50mM KCl、10mM MgCl2、および100μMエキソヌクレアーゼ耐性六量体の終濃度を与えた。プライマーアニーリングを増加させるための熱処理段階(すなわち、変性条件への曝露)は、個々の実験について、表示の通り含めたかまたは省略した。アニーリング反応は、PCRシステムサーモサイクラー(パーキン・エルマー社(Perkin Elmer))内で95℃へ3分間加熱しおよび4℃へ冷却した。反応を次いで、37mMトリス−HCl、pH8.0、50mM KCl、10mM MgCl2、5mM(NH4)2SO4、1.0mMdNTPs、1ユニット/mlの酵母ピロホスファターゼ、50μMエキソヌクレアーゼ耐性六量体、および800ユニット/mlのφ29DNAポリメラーゼの終濃度を含む終容量100μlとした。放射性標識したα−[32P]dCTP、約60cpm/pmolの総dNTP、を表記の通り加えた。反応は18時間30℃にてインキュベートした。酸沈澱可能な放射性デオキシリボヌクレオチド産物の組み込みはグラスファイバーフィルターを用いて判定した。反応を終止させた後、3μlの部分標本を、制限エンドヌクレアーゼAluIを用いて切断し、およびトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液中で1.0%アガロースゲルを通じた電気泳動によって、GelStar(モレキュラー・プローブズ社(MolecularProbes))またはSYBRグリーン(モレキュラー・プローブズ社(MolecularProbes))で染色して分析し、およびストーム860蛍光画像処理装置(APB)を用いて撮影した。変性ゲル分析を30mM NaOH、1mM EDTA中で1.0%アガロースゲルを通じた電気泳動によって実施した。乾燥ゲル中の放射性産物をストーム860蛍光画像処理装置を用いて可視化した。
10μgの全ゲノム増幅DNAまたはヒトゲノムDNA対照を、withEcoRI制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、および1xTBE緩衝液中で1%アガロースゲルを通じて分離した。標準サザン分析手順(サザン(Southern)、ゲル電気泳動によって分離したDNA断片中の特異的配列の検出(Detection of specific sequence among DNA fragments separated by gel electrophoresis.)JMolBiol.98: 503−517(1975)) を、Hybond−N+メンブレン(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社(Amersham Pharmacia Biotech)、ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway))を用いて実施した。副甲状腺ホルモン(p20.36)のエキソン断片プローブおよび、D13S12(p9D11)およびチログロブリン(pCHT.16/8)遺伝子座に対するRFLPマーカープローブはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から入手した。プローブはNEBlotランダムプライマー標識化法(ニュー・イングランド・バイオラブズ社、マサチューセッツ州ビバリー(Beverly))を用いて放射性標識した。メンブレンはメンブレンハイブリダイゼーション緩衝液(アマシャム・ファルマシア・バイオテク社(Amersham Pharmacia Biotech)、ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway))中で1時間プレハイブリダイズし、および放射性標識化プローブと一夜ハイブリダイズした。ハイブリダイズしたメンブレンは2xSSCおよび0.1%SDS中で2回5分間室温にて、1xSSCおよび0.1%SDSで15分間42℃にて、および0.1xSSCで2回15分間65℃にて洗浄した。メンブレンを次いで一夜露光しおよびストーム860蛍光画像処理装置を用いて分析した。
TaqMan分析は、ABI7700を取扱説明書(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)、カリフォルニア州フォスターシティ(Foster City))に従って用いて、1μgの増幅されたDNAをテンプレートとして用いて実施した。試験した8遺伝子座に対するTaqMan測定試薬はABIから入手した。8遺伝子座およびそれらの染色体位置は、酸性リボソームタンパク質(1p36.13);コネキシン40(1q21.1);ケモカイン(C−Cモチーフ)受容体1(3p21);ケモカイン(C−Cモチーフ)受容体6(6q27);ケモカイン(C−C)受容体7(17q21);CXCR5バーキットリンパ腫受容体1(chr.11);c−Jun(1p32−p31);およびMKP1二重特異性ホスファターゼ1(5q34)であった。コネキシン40はセントロメアの近くに位置し、およびケモカイン(C−Cモチーフ)受容体6はテロメアの近くに位置する。インプットテンプレートについての標準曲線を、ゲノムDNA中の遺伝子座コピー数と比較した、増幅されたDNA中の遺伝子座コピー数を決定するために作製した。標準曲線は0、0.001、0.01、0.1、0.5、および1μgのゲノムDNAから作製した。
ヒトゲノムDNA(300ngないし0.03ngの範囲にわたる)を記載の通り増幅した(テレニウス(Telenius)他,Genomics.13: 718−725(1992))。放射性標識したα−[32P]dCTP、約60cpm/pmolの総dNTPを、PCR産物収率の定量のために反応へ加えた。TaqDNAポリメラーゼはインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社(Invitrogen Life Technologies)、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad)からであった。DOP−PCR増幅はGeneAmp9700PCRシステムズサーモサイクラー(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)、カリフォルニア州フォスターシティ(FosterCity))を用いて実施した。DOP−PCR産物中の遺伝子座表現を、TaqMan測定法(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社(Invitrogen Life Technologies)、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad))を用いて定量的に分析した。
ヒトゲノムDNA(300ngないし0.03ngの範囲にわたる)を総容量60μlで0.2mlチューブに入れ、終濃度33μMのPEPランダムプライマー(5'−NNN NNN NNN NNN NNN−3')を記載の通りに(チャン(Zhang)他,単一の細胞からの全ゲノム増幅:遺伝子分析への示唆(Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis.)ProcNatl Acad Sci USA.89: 5847−5851 (1992))与えた。放射性標識したα−[32P]dCTP、約60cpm/pmolの総dNTPを、PCR産物収率の定量のために反応へ加えた。PEP反応はGeneAmp9700PCRシステムズサーモサイクラー(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)、カリフォルニア州フォスターシティ(FosterCity))を用いて実施した。PEP産物中の遺伝子座表現を、TaqMan測定法(インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社(Invitrogen Life Technologies)、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad))を用いて定量的に分析した。
ここで分析したSNPは下記の染色体位置を有した;1822、251、および221、13q32;465、458、および474、19q13;VCAM、1p31;IL−8、4q13;PDK2−2、17p;SNP21、不明。測定はファルキ(Faruqi)他、ローリング・サークル増幅を用いた一塩基多型の高処理量遺伝子型分析(High−Throughput Genotyping of Single Nucleotide Polymorphisms with Rolling・Circle Amplification.)BMCGerzomics,2: 4 (2001)によって記載された通りに実施した。要約すると、DNA変性、アニーリングおよびライゲーション反応をエッペンドルフ・マスター・サイクラー(エッペンドルフ・サイエンティフィク社(Eppendorf Scientific)、ドイツ)内で実施した。指数RCA反応はリアルタイムABI7700配列検出器(パーキン・エルマー社(Perkin Elmer))で実施した。リガーゼを欠く2つの対照もまた各SNPについて実施し、測定の特異性を確認した。DNA試料は、ライゲーション反応においてテンプレートとして使用する前に、制限エンドヌクレアーゼAluIを用いて消化した。ライゲーション反応は、96ウェルマイクロアンプ・オプティカルプレート(パーキン・エルマー社(Perkin Elmer))中に、1ユニットのAmpリガーゼ(エピセンター・テクノロジーズ社(Epicentre Technologies))、20mMトリス−HCl(pH8.3)、25mM KCl、10mM MgCl2、0.5mMNAD、および0.01%トリトン(登録商標)X−100を含む10μl反応容量で準備した。標準の反応は、0.5pM開環パッドロックおよび100ngのAluI消化ゲノムDNAを含んだ。DNAは、反応を95℃にて3分間加熱し、その後アニーリングおよびライゲーションを60℃にて20分間実施することによって変性した。20μlのERCA混合物を10μlライゲーション反応へ加えた。ERCA混合物は、5%TMAシュウ酸、400μMdNTP混合物、各1μMの2種類のプライマー、8ユニットのBstポリメラーゼ(ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)、マサチューセッツ州)、および20mMトリス−HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4および0.1%トリトン(登録商標)X−100を含む1X修飾ThermoPolII反応緩衝液を含んだ。
ゲノムDNA調製物をニック翻訳し、増幅された試料についてはビオチンで、または増幅していない対照試料についてはジゴキシゲニンで修飾したヌクレオチドを組み込んだ。等モル量の増幅されたおよび増幅していないDNAを、反復DNAクロスハイブリダイゼーションを抑制するために、CotI DNAの存在下および非存在下で同時ハイブリダイズした。特異的ハイブリダイゼーションシグナルを、アビジン−FITCおよび抗ジゴキシゲニンローダミンによって検出した。中期染色体の取り込み画像を、アプライド・イメージングCGHソフトウェアプログラムを用いて分析し、および蛍光プロファイルを作製した。対照として、異なる標識化をした増幅されたかまたは増幅していないDNAを、上記に概説した通りに混合し、ハイブリダイズし、検出し、および比率分析に供した。
本開示の方法の実施形態を用いて、30pg(約9ゲノムコピー)のヒトゲノムDNAが約30μgへ4時間以内に増幅された。平均断片長は10kbより大であった。増幅されたヒトDNAは10個の一塩基多型(SNP)に関して正常の表現を示した。8染色体遺伝子座中の最大偏りは、PCRを基礎とするWGA法についての4から6桁と対照的に、3倍未満であった。本開示の方法を用いて増幅されたヒトDNAは、一塩基多型(SNP)の遺伝子型分析、染色体染色、サザンブロッティングおよびRFLP分析、サブクローニング、およびDNA配列決定を含む遺伝子分析の一般的な方法について有用である。
本実施例は、顕著なテンプレートDNA鎖切断が95℃(典型的な増幅反応においてDNAを変性させるために用いられる)でのインキュベートによって生じること、および熱処理の持続時間を減少させることによって鎖切断が減少することを実証する。大部分の核酸増幅技術と同様に、開始DNAテンプレートの完全性が、増幅産生の速度および収率に重要な作用を有しうる。増幅すべき核酸が分解されている反応では、増幅産物の収率は品質および量の両方で低下しうる。本実施例は、95℃でのインキュベート時間を減少させることによるテンプレートDNA鎖切断の減少を実証する。
本実施例は、95℃(典型的な増幅反応においてDNAを変性させるために用いられる)でのテンプレートDNAインキュベートの時間の増加が、DNAがMDAによって増幅される速度および収率の両方における低下を引き起こすことを実証する。95℃でのDNAテンプレートインキュベートの省略は、DNA増幅の最大の速度および収率を結果として生じる。
本実施例は、95℃(典型的な増幅反応においてDNAを変性させるために用いられる)でのテンプレートDNAインキュベートの時間の増加が、MDAによって増幅されたDNA産物の長さの低下を引き起こすことを実証する。95℃でのDNAテンプレートインキュベートの省略は、DNA増幅産物の最大のサイズを結果として生じる。
本実施例は、95℃(典型的な増幅反応においてDNAを変性させるために用いられる)でのテンプレートDNAインキュベートの省略が、MDAによって増幅されたDNA産物における8個のランダムに選択された遺伝子座の表現の損失を結果として生じなかったことを実証する。95℃でのDNAテンプレートインキュベートの省略は実際、テンプレートゲノムDNAと比較してDNA増幅産物の遺伝子座表現における増加を結果として生じる。
本実施例は、100、1,000、および10,000倍にMDA増幅されたDNAについて、95℃(典型的な増幅反応においてDNAを変性させるために用いられる)でのテンプレートDNAインキュベートの省略が、DNA産物における8個のランダムに選択された遺伝子座の表現の低い偏りを結果として生じることを実証する。対照的に、PCRを基礎とする2種類の全ゲノム増幅(WGA)法であるDOP−PCRおよびPEPは2〜6桁の増幅偏りを示す。
本実施例は、DNA配列の複雑な混合物に由来する特異的DNA領域の、φ29DNAポリメラーゼを使用し配列特異的ネステッドプライマーを用いる増幅を実証する。
本実施例は、ゲノムDNAをMDAを用いて直接に全血からまたは組織培養細胞から増幅できること、および、その遺伝子座表現は精製されたゲノムDNAテンプレートから増幅されたDNAについてと実質的に同じであることを実証する。本実施例は、アルカリ性条件へ供することによる(溶解溶液の添加による)熱による溶解を伴わない溶解、細胞溶解物の安定化(安定化溶液の添加による)、および安定化された細胞溶解物中のゲノムDNAの複数置換増幅を説明する。安定化された細胞溶解物は、ゲノムDNAの精製無しの増幅に用いられる。対照として、添加テンプレートの非存在下で増幅されたDNAを試験し、およびこれらの遺伝子座に関して検出可能な配列表現を含まなかった。
本実施例は、ゲノムDNAをMDAを用いてAAdUTP(5−(3−アミノアリル)−2'−デオキシウリジン5'−三リン酸、シグマ・アルドリッチ社(Sigma−AldrichCo.))を含む反応で増幅できること、およびその遺伝子座表現はdTTPだけを含む反応で増幅されたDNAについてと実質的に同一であることを実証する。
本実施例は、本開示の方法の一実施形態および結果として生じるDNA産物の分析を記載する。例示される方法は本開示の、ヌクレアーゼ耐性配列特異的プライマーおよび環状化されたDNAテンプレートを用いる、複数鎖置換増幅の遺伝子特異的複数置換増幅形式である。
本実施例は、損傷ゲノムDNAを、15mM NaOHの存在下で70℃加熱を用いて変性し、トリス−HClpH4.0および元の試料を変性した試料に加えて戻し,その後ゆっくり冷却して損傷DNAをハイブリダイズさせることによる修復法で前処理した場合、WGAにおいて増幅されたDNAの品質が向上することを実証する。損傷gDNAは、未変性ゲノムDNAを超音波処理して平均長1kbとすることによって作製した。この分解試料を次いで修復法を用いて前処理し、および複数置換増幅反応に用いた。増幅産物の品質は、1μgの増幅産物の染色体上の特定の遺伝子座の表現を、1μgの増幅されていない標準ゲノムDNAと比較する、Taqman測定法によって評価した。本実施例は、修復処理ありの損傷ゲノムDNAは、修復法無しの損傷ゲノムDNAの増幅産物と比較して、増幅産物の遺伝子座表現に3倍の改善を有することを実証する。
本実施例は、長期保存によって損傷されたゲノムDNA試料の複数置換増幅による増幅産物の品質が、修復法によって改善されたことを実証する。
本実施例は、イオン強度、熱およびNaOHが、損傷DNAを修復および増幅する本開示の方法における変性段階に有用であることを実証する。損傷DNA試料を下記の通り調製した:DNA試料をdH2Oで5ng/μlに希釈し、および70℃へ5分間加熱し、それは試料をより小さい断片へ分解する。加熱したDNA試料をゆっくり冷却しおよび複数置換増幅をこれらの試料に対して実施した。加熱したDNA基質に由来する増幅産物のTaqman分析は、イオン溶液の使用がDNAのさらなる分解に繋がり、最終的にこれらの試料の低い増幅に繋がったことを示した。
本実施例は、修復法の中性化が増幅産物の品質の向上に重要であることを実証する。損傷DNA試料を下記の通り調製した:DNA試料をdH2Oで10ng/μMに希釈し、および70℃へ5分間加熱して損傷DNA試料を作製した。加熱したDNA試料を5ng/μlにTEで希釈し、25ngの損傷DNAを終濃度25mM NaOHへ加え、70℃へ3分間加熱し、および、トリス−HClpH4.0を用いてpH8.0へ中性化しおよびゆっくり冷却したか、または、中性化無しでゆっくり冷却した。これらの試料の増幅反応を実施し、および産物の品質をTaqman分析によって分析した。中性化を用いる修復は、修復無しおよび中性化処理無しの修復よりも良好な遺伝子座表現を与えた。
Claims (21)
- ゲノムを増幅する方法であって、
単一のプライマー、DNAポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、
プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、かつ、プライマーが3'−5'エキソヌクレアーゼに耐性となるように少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含み、
DNAポリメラーゼがφ29DNAポリメラーゼであり
ゲノム核酸試料がゲノムの90%以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の90%以上の複製を生じ、
核酸分子の複製を促進する条件が実質的に等温であることを特徴とする方法。 - ゲノムが真核ゲノムであることを特徴とする請求項1の方法。
- ゲノムが微生物ゲノムまたはウイルスゲノムであることを特徴とする請求項1の方法。
- ゲノムが細菌ゲノム、真正細菌ゲノム、古細菌ゲノム、および真菌ゲノムから選択されることを特徴とする請求項1の方法。
- プライマーが3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、または30ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項の方法。
- プライマーが配列CGGTGG、TCACGC、CGAGCG、GCGTGG、ACTCGG、AATCGC、CGGAGG、CCGAGA、GATCGC、AGAGCG、AGCGAG、またはACTCCGのうち1つを有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項の方法。
- プライマーが反復配列中の配列と相補的であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項の方法。
- 反復配列がマイクロサテライト配列、ミニサテライト配列、サテライト配列、トランスポゾン配列、リボソームRNA配列、短い核散在配列(short interspersed nuclear element (SINE))、または長い核散在配列(long interspersed nuclear element)(LINE)であることを特徴とする請求項7の方法。
- プライマーが機能共通配列中の配列と相補的であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項の方法。
- 機能共通配列がプロモーター配列、エンハンサー配列、サイレンサー配列、上流調節配列、転写終止部位配列、トランスポゾン調節配列、リボソームRNA調節配列、またはポリアデニル化部位配列であることを特徴とする請求項9の方法。
- 機能共通配列が微生物プロモーター配列、微生物エンハンサー配列、微生物サイレンサー配列、微生物上流調節配列、微生物転写終止部位配列、微生物トランスポゾン調節配列、微生物リボソームRNA調節配列、または微生物ポリアデニル化部位配列であることを特徴とする請求項10の方法。
- プライマーが広カバー率プライマーであることを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項の方法。
- プライマーが、平均して、5,000ヌクレオチド以下毎、4,000ヌクレオチド以下毎、3,000ヌクレオチド以下毎、2,500ヌクレオチド以下毎、2,000ヌクレオチド以下毎、1,500ヌクレオチド以下毎、1,000ヌクレオチド以下毎、900ヌクレオチド以下毎、800ヌクレオチド以下毎、700ヌクレオチド以下毎、600ヌクレオチド以下毎、500ヌクレオチド以下毎、400ヌクレオチド以下毎、300ヌクレオチド以下毎、200ヌクレオチド以下毎、100ヌクレオチド以下毎、または50ヌクレオチド以下毎に、ゲノム核酸試料の核酸分子中に存在する配列と相補的であることを特徴とする請求項12の方法。
- プライマーが核酸試料の非存在下で顕著な複製産物を生じないことを特徴とする請求項1〜13のいずれか一項の方法。
- ゲノム核酸試料が変性条件に供されないことを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項の方法。
- ゲノム核酸試料が変性条件に供されることを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項の方法。
- ゲノム核酸試料中の核酸がゲノム核酸試料中の他の物質から分離されないことを特徴とする請求項1〜16のいずれか一項の方法。
- ゲノム核酸試料が粗細胞溶解物であることを特徴とする請求項1〜17のいずれか一項の方法。
- ゲノム核酸試料が、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物が全ゲノムを含み、および細胞溶解物のpHを低下させて安定化した細胞溶解物を生じることによって調製されることを特徴とする請求項1〜18のいずれか一項の方法。
- 細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、または両方が、インキュベート前に部分精製に供されることを特徴とする請求項19の方法。
- ゲノム核酸試料が血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであることを特徴とする請求項1〜20のいずれか一項の方法。
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