JP2006262777A - 夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法及び添加剤 - Google Patents

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良英 林崎
Yoichi Tanabe
陽一 田邉
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Abstract

【課題】 本発明は、夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法及び当該方法に使用するための添加剤を提供することを目的とする。
【解決手段】 本発明の方法は、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの添加剤を核酸合成反応液に添加することを含む。
【選択図】 なし

Description

本発明は、夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法及び当該方法に使用するための添加剤に関する。
ＤＮＡブック
ヒトゲノムの完全解読やマウスゲノムなど多数のゲノムの解読、さらに完全長ｃＤＮＡクローンが網羅的に収集されてきた。これにより遺伝子資源が整備され、本格的な遺伝子解析の時代に突入している。従来、ＤＮＡを長期的に安定して保存するためには、水溶液状態のものをそのまま冷凍するか、あるいはベクターにクローニングした状態でホストの菌ごと−８０℃でグリセロールストックするかのいずれかの方法が用いられていた。しかし、いずれの方法も、多数の完全長ｃＤＮＡの場合のように大量の核酸を保存するには非常に大量のスペースを必要とする。
さらに、これらの従来の方法で保存されたＤＮＡを配布等する場合には、ＤＮＡ水溶液の調製、マイクロチューブ内へのＤＮＡ水溶液の分注あるいはマイクロチューブ内へ分注されたＤＮＡ水溶液の乾燥などの、比較的長時間の作業時間を要する各種の作業工程を経る必要がある。特に扱うマイクロチューブの数が大量の場合には、作業量が膨大となり、多くの労力と時間を必要とし、事実上配布が困難になることがある、という問題点があった。同様の問題はＤＮＡのみだけでなく、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッド等その他の核酸に関しても存在する。
このような問題に対し、本発明の発明者らは収集したＤＮＡクローンを「ＤＮＡブック」（商標）という本の形にして遺伝子情報とともに収納、頒布する新たな方法を開発した。「ＤＮＡブック」は、所定の厚さのシート状の支持体にＤＮＡ溶液を付着させ、前記支持体に付着させたＤＮＡ溶液を乾燥させることによって、前記支持体に固定又は印字させたＤＮＡを有するＤＮＡ固定支持体である。「ＤＮＡブック」は、ＤＮＡを固定支持体に付着させることにより、従来の技術と比較して格段に狭いスペースでのＤＮＡの安定した保存を可能にし、配布も常温の通常の郵送ルートで可能である。また、固定支持体からＤＮＡを溶出回収し、例えばＰＣＲ等を用いて増幅して使用することが可能なため、保存されたＤＮＡの回収・利用も極めて簡便である。ＤＮＡブック作成の技術は、ＤＮＡのみだけでなく、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッド等その他の核酸に関しても適用可能である（特開２０００−１４６９５８、特許文献１）。
ＤＮＡ固定支持体としては、例えば、セルロースを主原料として製造された紙、具体的には一般のＰＰＣ用紙を使用することができる。ＤＮＡブックは、固定支持体からＤＮＡを溶出回収し、例えばＰＣＲ等を用いて増幅して使用することを想定しているため、ＤＮＡ固定支持体は好ましくは可溶性の用紙である。
「ＤＮＡブック」については、Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．３０２，Ｏｃｔｏｂｅｒ， ２００３、ｐ．２１７−２１８（非特許文献１）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、2003，ｐ．１４８８−１４９５（非特許文献２）等にも開示されている。非特許文献２は、ＤＮＡ固定支持体として６０ＭＤＰ（Ｍｉｓｈｉｍａ ｐａｐｅｒ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）が使用できる、と記載している。
このように「ＤＮＡブック」は、遺伝子資源の有効な利用を可能にした画期的なＤＮＡ保存技術である。ただし、固定支持体からＤＮＡを溶出回収し、核酸増幅反応等への利用を図る場合、溶出回収した核酸試料中にＤＮＡ固定支持体に由来する成分が、必然的に夾雑物として混在することとなる。例えばセルロース等の夾雑物は核酸増幅反応等の核酸合成反応において、核酸合成のための酵素の働きを阻害する恐れがある。
核酸合成反応
一般に、増幅しようとする核酸が存在する反応液の中に、核酸の増幅反応を阻害する夾雑物が存在することはよくあることである。これに対して、様々な試みがなされてきた。
しかし、いずれの先行技術文献も、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの添加剤を核酸合成反応液に添加する、という本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。そもそも、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、夾雑物により核酸合成反応が阻害される、という問題自体、提起すらされていない。
具体的には、特開２００３―１４４１６９（特許文献２）は、ＤＮＡ合成反応を促進する添加剤に関する。具体的には、ＤＮＡを合成する酵素反応において、シュウ酸イオン、マロン酸イオン、マレイン酸イオンなどの陰イオン物質を含有することを特徴とする反応液組成物を記載している。さらに、陰イオン物質以外に、ＤＮＡ合成反応の際に添加されうる物質として、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＴＷＥＥＮ２０、ＮＰ４０、エクトイン（ｅｃｔｏｉｎｅ）、ポリオール類、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ蛋白質、ファージＴ４遺伝子３２蛋白質、ＢＳＡ等が挙げられている。
しかし、特許文献２は、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの添加剤を核酸合成反応液に添加する、という本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。
また、特開２０００-４８７８（特許文献３）は、熱安定性酵素の可逆的修飾の方法に関する。特許文献３は、ＰＣＲにおける非特異的な伸長反応を回避するために、ベタイン、官能性ポリオール、アミド、アルカリ性アンモニウム塩、スルフォキシド、硫酸塩等から選択される添加剤を加えることを記載している。しかし、特許文献３は特許文献２と同様に、本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。
特開平７―２５５４８２（特許文献４）は、遺伝子増幅方法に関する。特許文献４には、ＰＣＲにおいて、鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリング効率を増加させるために、両親媒性高分子を添加することにより反応溶液の粘性を高めて、浮遊する鋳型ＤＮＡやプライマーのブラウン運動を適度に押さえ、会合性を高めてアニーリングに適した条件を整える旨の記載がある。
しかし、特許文献４も本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。また、単に核酸増幅反応液の粘度を増加させるだけでは、本発明の効果、即ち、夾雑物、特にセルロース、および／またはセルロース誘導体が及ぼす核酸の増幅反応の阻害を低減する、という効果が得られないことは、本発明者らが明らかにした。
特開２０００―３４２２８７（特許文献５）は、リボ核酸類からの核酸類の精製及び増幅に関する。特許文献５には、ＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）における添加剤として、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＴＷＥＥＮ２０、ＮＰ４０、エクトイン（ｅｃｔｏｉｎｅ）、ポリオール類、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ蛋白質、ファージＴ４遺伝子３２蛋白質、ＢＳＡが挙げられている。しかし、特許文献５も本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。
特表平１１―５１２６０２（特許文献６）は、ＰＣＲのための対照、即ち、ＰＣＲ法のポジティブコントロール試薬に関する。特許文献６は、ＰＣＲにおける酵素の安定剤としてトレハロースを使用することを記載している。しかし、トレハロースは酵素の安定化剤として添加されており、特許文献６も本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。
特開平８−９９９７（特許文献７）は、核酸合成法およびそれに用いる核酸キットに関する。特許文献７は、動物体液、植物由来の試料、環境試料から目的の遺伝子を増幅する核酸合成法において、反応溶液中にポリアミンを添加することを開示している。しかし、特許文献７も本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。
さらに、Ｗａｌｅｅｄ Ａｂｕ Ａｌ−Ｓｏｕｄらは、“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒｓ ｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＰＣＲ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ， Ｆｅｃｅｓ， ａｎｄ Ｍｅａｔ”（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３８（１２），２０００，ｐ．４４６３−４４７０、非特許文献３）の中で、ＰＣＲ反応液の中に血液、便、肉などの夾雑物が存在する場合、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加するとＰＣＲへのこれらの夾雑物の阻害効果が回避されることを述べている。しかし、非特許文献における夾雑物は、血液、便、肉などの生体物質に由来するものであり、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物に関する、本発明とは明白に相違する。よって、非特許文献３も本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。
以上、核酸増幅反応において増幅反応の効率を促進するために添加剤が利用されてきた。そして、核酸の増幅反応を阻害する夾雑物による阻害効果を低減しようとする試みもなされてきた。しかし、いずれの先行技術文献も、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの添加剤を核酸合成反応液に添加する、という本発明の技術的思想について記載も示唆もしていない。そもそも、本発明前は、「ＤＮＡブック」を利用した試料の核酸合成方法において、試料中に、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物が含まれること、そして、夾雑物により核酸合成反応が阻害される可能性があること、という問題自体、提起すらされていなかった。
しかし、本発明者は、今後「ＤＮＡブック」の有効利用をより促進するために、将来的に問題となりうる課題について解決策が提示されていることが望ましい。
特開２０００−１４６９５８公報 特開２００３―１４４１６９公報 特開２０００―４８７８公報 特開平７―２５５４８２公報 特開２０００―３４２２８７公報 特表平１１―５１２６０２公報 特開平８−９９９７公報 Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．３０２，Ｏｃｔｏｂｅｒ， ２００３、ｐ．２１７−２１８ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、2003，ｐ．１４８８−１４９５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００， Ｖｏｌ．３８， Ｎｏ．１２， ｐ．４４６３−４４７０， "Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒｓ ｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＰＣＲ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ， Ｆｅｃｅｓ， ａｎｄ Ｍｅａｔ"
本発明は、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法を提供する。本発明の方法は、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの添加剤を核酸合成反応液に添加することを含む。本発明は特に、上記添加剤により夾雑物による核酸合成反応への阻害効果が低減されることを特徴とする。
本発明の方法において添加剤として使用されうる非イオン性界面活性剤は、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はショ糖脂肪酸エステルから選択される。
添加剤として使用されうるアミド類は、好ましくはホルムアミドである。
添加剤として使用されうる広義の糖類は、好ましくは狭義の糖類及び多価アルコール類から選択される。狭義の糖類は、好ましくはトレハロース又はスクロースである。多価アルコール類は、好ましくは、グリセリン又はソルビトールである。あるいは、多価アルコール類は、好ましくはポリエチレングリコールを含むグリコール類である。
本発明の一態様において、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料は、核酸ブックに由来する。
本発明の核酸合成反応は、好ましくは核酸の増幅反応、複製反応、転写反応又は逆転写反応である。
本発明はまた、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法における核酸合成反応液への添加剤を提供することを目的とする。本発明の添加剤は、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの物質を含む。
本発明者らは上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、核酸以外に、セルロース及び／又はセルロース誘導体の夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、特定の添加剤を加えると合成反応の効率が向上することを見出し、本発明を想到した。
核酸合成方法
本発明は、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法を提供する。本発明の方法は、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの添加剤を核酸合成反応液に添加することを含む。本発明は特に、上記添加剤により夾雑物による核酸合成反応への阻害効果を低減し、該夾雑物が反応溶液中に存在しても核酸を安定して、効率よく合成することを可能にする。
１）添加剤
１−ａ）非イオン性界面活性剤
本明細書において、「非イオン性界面活性剤」とは、少量で界面又は表面の諸性質を変化させる性質を有する物質であり、その分子内に親水性原子団と疎水性原子団を有し、水に溶解したときイオンに解離しない物質を意味する。
本発明の方法において添加剤として使用される非イオン性界面活性剤は、特に限定されず、公知の任意の非イオン性界面活性剤を含む。例えば、限定されるわけではないが、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル、アシルソルビタン、アルキルグルコシド、Ｂｒｉｊ系界面活性剤等を含む。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はショ糖脂肪酸エステルから選択される。
Ｔｗｅｅｎ２０は、例えばＳＩＧＭＡ社等から入手することができる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、例えばＳＩＧＭＡ社等から入手することができる。
ショ糖脂肪酸エステルは特に限定されないが、好ましくは、例えば、ショ糖と炭素数１１ないし１７の直鎖若しくは分岐鎖の、修飾若しくは未修飾の脂肪酸とのエステルを意味する。より好ましくは、脂肪酸としてはステアリン酸が選択される。ショ糖脂肪酸エステルは、例えば、三菱化学フーズ株式会社製のＳ−１６７０（商標）、ＨＬＢ１６（商標）が選択される。
本発明の方法において使用する非イオン性界面活性剤の濃度は、本明細書の開示に基づき、使用する非イオン性界面活性剤の種類等に応じて、当業者は適宜選択可能である。例えば、限定されるわけではないが、Ｔｗｅｅｎ２０は、好ましくは終濃度０．０１％から５％、より好ましくは０．１％から２％、最も好ましくは２％で添加される。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、好ましくは終濃度０．０１％から５％、より好ましくは０．１％から２％、最も好ましくは１％で添加される。ショ糖脂肪酸エステルは、好ましくは終濃度０．０１％から５％、より好ましくは０．１２５％から１％、最も好ましくは１％で添加される。
１−ｂ）アミド類
本明細書において、「アミド類」とは、アンモニア又はアミンの水素がアシル基によって置換された構造をもつ化合物を意味する。
本発明の方法において添加剤として使用されるアミド類は特に限定されず、公知の任意のアミド類を含む。例えば、限定されるわけではないが、ホルムアミド、アセトアミド等を含む。好ましくはホルムアミドである。ホルムアミドは例えば、和光純薬工業株式会社から入手することができる。
本発明の方法において使用するアミド類の濃度は、本明細書の開示に基づき、使用するアミド類の種類等に応じて、当業者は適宜選択可能である。例えば、限定されるわけではないが、ホルムアミドは、好ましくは終濃度０．０１％から１０％、より好ましくは０．６％から３％、最も好ましくは２．５％で添加される。
１−ｃ）広義の糖類
「糖類」は、糖質ともいい、単糖類とこれが複数個縮合した少糖類（オリゴ糖類）や多糖類の総称である。元来、「糖類」はＣｎ（Ｈ２Ｏ）ｍの一般式で表される化合物を意味してきたが、今日ではこの定義が拡大され、多価アルコール類のアルデヒド、ケトン、酸、さらに多価アルコール自身やそれらの誘導体、縮合体なども含めて糖質又は炭水化物と総称している。
よって本明細書において、「広義の糖類」とは、上述した多価アルコール類のアルデヒド、ケトン、酸、さらに多価アルコール類自身やそれらの誘導体、縮合体なども含めた糖質又は炭水化物の総称を意味する。「広義の糖類」は、好ましくは、従来の「狭義の糖類」、即ち、Ｃｎ（Ｈ２Ｏ）ｍの一般式で表される化合物、並びに「多価アルコール類」を含む。糖類の代表的なグループである単糖類にもデオキシリボースＣ５Ｈ１０Ｏ４、ラムノースＣ６Ｈ１２Ｏ５、ソルビトールＣ６Ｈ１４Ｏ６などのようにＣｎ（Ｈ２Ｏ）ｍの一般式にあてはまらない化合物があるが、これらも「広義の糖類」に含まれる。
本明細書において、「狭義の糖類」は、Ｃｎ（Ｈ２Ｏ）ｍの一般式で表される化合物を意味する。本発明の方法において添加剤として使用される狭義の糖類は特に限定されず、公知の任意の糖類を含む。例えば、限定されるわけではないが、トレハロースＣ１２（Ｈ２Ｏ）１１、スクロースＣ１２（Ｈ２Ｏ）１１等を含む。ただしＣｎ（Ｈ２Ｏ）ｍの一般式で表される化合物であっても、例外的に、酢酸Ｃ２Ｈ４Ｏ２や乳酸Ｃ３Ｈ６Ｏ３などは糖類に含まれない。なお、例外的に糖類に含まれない化合物は、本明細書の開示及び技術常識に基づいて、当業者は容易に認識することが可能である。
トレハロースは、例えば「Ｄ−トレハロース」（ＦＬＵＫＡ社製）等を使用することができる。スクロースは、例えば、和光純薬工業株式会社等から入手することができる。
本発明の方法において使用する狭義の糖類の濃度は、本明細書の開示に基づき、使用する糖類の種類等に応じて当業者は適宜選択可能である。例えば、限定されるわけではないが、トレハロースは、好ましくは終濃度０．０１Ｍから１Ｍ、より好ましくは０．２Ｍから０．８Ｍ、最も好ましくは０．６Ｍで添加される。スクロースは、好ましくは終濃度０．０１Ｍから１Ｍ、より好ましくは０．２Ｍから０．８Ｍ、最も好ましくは０．６Ｍで添加される。
本明細書において、「広義の糖類」に含まれる「多価アルコール類」とは、２個以上のヒドロキシル基を有するアルコールを意味する。本発明の方法において添加剤として使用される多価アルコール類は特に限定されず、公知の任意の多価アルコール類を含む。ヒドロキシル基の数は特に限定されないが、好ましくは２個ないし１０個である。例えば、限定されるわけではないが、グリセリン（「グリセロール」とも呼称される）Ｃ３Ｈ８Ｏ３、ソルビトール（「グリシトール」とも呼称される）Ｃ６Ｈ１４Ｏ６等が含まれる。
グリセリンは例えば、和光純薬工業株式会社等から入手することができる。ソルビトールは、例えば「Ｄ−ソルビトール」（ＦＬＵＫＡ社製）等を使用することができる。
本発明の方法において多価アルコール類の濃度は、本明細書の開示に基づき、使用する多価アルコール類の種類等に応じて、当業者は適宜選択可能である。例えば、限定されるわけではないが、グリセリンは、好ましくは終濃度１％から３０％、より好ましくは１０％から２０％、最も好ましくは２０％で添加される。ソルビトールは、好ましくは終濃度０．０１Ｍから１Ｍ、より好ましくは０．２Ｍから０．８Ｍ、最も好ましくは０．６Ｍで添加される。
本明細書における「多価アルコール類」はさらに、２価のアルコール類である「グリコール類」を含む。本発明の方法において添加剤として使用されるグリコール類は特に限定されず、任意の公知のグリコール類を含む。例えば、限定されるわけではないが、好ましくはポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは、好ましくは分子量１０００から８０００、より好ましくは４０００から７０００、最も好ましくは約６０００である。
ポリエチレングリコールは、例えば、和光純薬工業株式会社製の「ポリエチレングリコール６０００」（商標）等から選択される。
本発明の方法において使用するグリコール類の濃度は、本明細書の開示に基づき、使用するグリコール類の種類、核酸合成に用いる酵素の種類等に応じて、当業者は適宜選択可能である。例えば、限定されるわけではないが、ポリエチレングリコールは、好ましくは終濃度０．１％から２０％、より好ましくは１％から１５％、最も好ましくは１５％で添加される。ただし、核酸合成酵素に用いるＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤ（東洋紡績株式会社製）の場合は、最も好ましい終濃度は５％である。
限定されるわけではないが、本発明の方法の好ましい態様において、下記（ａ）ないし（ｉ）の１種類又はそれより多くの物質が、下記の終濃度で添加される；
（ａ）Ｔｗｅｅｎ２０：終濃度０．０１％から５％；
（ｂ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：終濃度０．０１％から５％；
（ｃ）ショ糖脂肪酸エステル：終濃度０．０１％から５％；
（ｄ）ポリエチレングリコール：分子量１０００から８０００、終濃度は０．１％から２０％；
（ｅ）トレハロース：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
（ｆ）スクロース：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
（ｇ）ソルビトール：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
（ｈ）ホルムアミド：終濃度０．０１％から１５％；又は
（ｉ）グリセリン：終濃度１％から３０％。
本発明の方法において上記添加剤は、１種類でもよくあるいは１種類より多くの添加剤を併用してもよい。
２）夾雑物を含む試料
本発明は、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、上記添加剤を添加することを特徴とする。
本明細書で「夾雑物」とは、核酸合成反応、例えばＰＣＲ反応液中に不可避的に混雑した不純物で、特に核酸の合成反応を阻害する物質を言う。本発明においては、特にセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの物質を意味する。
本明細書において、「セルロース」は二糖セロビオースが重合した多糖であり、分子量は特に限定されない。「セルロース誘導体」は、セロビオース残基の６員環の２位、３位又は６位の水酸基が、直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−Ｃ１０アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１（Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキルである）、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２ＯＲ３（Ｒ２は及びＲ２は各々独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキルである）で置換されていてもよい、セルロースの誘導体である。
限定されるわけではないが、セルロース誘導体は、好ましくは、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース又はカルボキシプロピルメチルセルロースから選択される。
本発明の方法において、セルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物が、試料中に０．７５％以上の濃度、より好ましくは４．５％以上の濃度で含まれていても、核酸合成反応を行うことが可能である。
本発明において試料に含まれる核酸は、ＤＮＡ，ＲＮＡ、あるいはこれらのハイブリッド、キメラでもよい。試料中の、鋳型となる核酸は極微量でもよく、反応液に終濃度好ましくは０．００４ｎｇ／μｌ以上、より好ましくは０．０８ｎｇ／μｌ以上、含まれていれば、本発明の方法によって効率よく増幅、複製、転写、逆転写することが可能である。
限定されるわけではないが、本発明の好ましい一態様において、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料は、核酸ブックに由来する。本明細書において、「核酸ブック」は、所定の厚さのシート状の支持体に核酸溶液を付着させ、前記支持体に付着させた核酸溶液を乾燥させることによって、前記支持体にＤＮＡを固体又は印字させた核酸を有する核酸固定支持体、を意味する。核酸ブックは、「ＤＮＡブック」、「ＲＮＡブック」、両者のコンビネーションを含む。
核酸固定支体としては、例えば、セルロースを主原料を製造された紙、具体的には一般のＰＰＣ用紙を使用することができる。核酸固定支持体は好ましくは可溶性の用紙である。核酸固定支持体として１２０ＭＤＰ、６０ＭＤＰ（Ｍｉｓｈｉｍａ ｐａｐｅｒ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）等が含まれる。本発明の一態様において、「セルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物」は、このような核酸固定支持体に由来する夾雑物を意味する。
３）核酸合成反応
本発明は、核酸の他に夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、特定の添加剤を含むことを特徴とする。核酸反応は特に限定されないが、核酸の増幅反応、複製反応、転写反応又は逆転写反応を含みうる。核酸の増幅反応、複製反応、転写反応又は逆転写反応のための一般的な方法は当業者に周知である。本発明の方法は、このような反応において核酸の他に夾雑物を含む試料を含む場合に、特定の添加剤の添加により反応を効率よく行わせるものである。
限定されるものではないが、核酸合成に用いる酵素は、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む）から選択される。
市販品としては、ＤＮＡポリメラーゼは、非限定的に、東洋紡績株式会社製ＫＯＤシリーズ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑシリーズ、ＴａＫａＲａ Ｔａｑシリーズ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑシリーズ、ＴａＫａＲａ Ｌａ Ｔａｑシリーズ、ＴａＫａＲａ Ｚ―Ｔａｑシリーズ、インビトロジェン株式会社製アキュプライム ＴａｑＤＮＡポリメラーゼシリーズ、アキュプライム ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼシリーズ、プラチナ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼシリーズ、プラチナ ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼシリーズ、プラチナ ゲノタイプＴｓｐＤＮＡポリメラーゼシリーズ、プラチナＰＣＲスーパーミックスシリーズ、プラチナ ブルーシリーズ、ディスカバーズシリーズ、アキュプライム ＧＣリッチシリーズ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ｐｆｕシリーズ、ＴａｑＰｌｕｓシリーズ、ＭＪ ＧＥＮＥ Ｗｏｒｋｓ ，Ｉｎｃ社製ＤｙＮＡｍｏシリーズ、ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ シリーズ、Ａｄｖａｎｔａｇｅシリーズ、ＫｌｅｎＴａｑシリーズなどが挙げられる。
ＲＮＡポリメラーゼとしては、非限定的に、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、真核生物由来のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩなどが挙げられる。
逆転写酵素としては、非限定的に、ＡＭＶ−リバーストランスクリプターゼ、Ｍ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ、Ｉｍ−ｐｒｏｍ−ＩＩＴＭ リバーストランスクリプターゼなどの他、好熱菌由来の逆転写酵素が挙げられる。
一般に、例えばＤＮＡポリメラーゼを利用するＰＣＲ法を含め核酸の増幅反応は、次の工程を含む。
１）反応液を調製する
２）反応液の中に鋳型ＤＮＡを添加する
３）温度と時間を設定し、反応させる。
４）反応生成物を回収する。
本発明の方法は、上記の「１.反応液の調整」において１種類又はそれより多くの添加剤を添加することで、核酸合成反応への、セルロース、セルロース誘導体のうちから1種類以上含有する夾雑物の阻害効果を低減する。
本発明の方法により、添加剤の使用によりＤＮＡブックからの切り出し断片を直接ＰＣＲに利用可能となった。具体的には、セルロース上に滴下されたＤＮＡ溶液を乾燥させたもの（「ＤＮＡブック」）を切り出し、直接ＰＣＲ反応液の中に投入し、そこで再びＤＮＡを溶出させ、ＰＣＲ法で効率よく核酸の増幅ができるようになった。さらに、該セルロースがセルロース誘導体を混合したものであるときにもＰＣＲ法で効率よく核酸の増幅ができるようになった。
添加剤
本発明はさらに、核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法における核酸合成反応液への添加剤を提供する。本発明の添加剤は、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの物質を含む、ことを特徴とする。
本発明の添加剤は、例えばＰＣＲの「反応液の調整」において添加され、夾雑物による核酸合成反応への阻害効果を低減する。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１ Ｔｗｅｅｎ２０の核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例１として非イオン性界面活性剤の例としてＴｗｅｅｎ２０を使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、Ｔｗｅｅｎ２０の核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は、下記の表１及び表２の通りである。なお、Ｔｗｅｅｎ２０はＳＩＧＭＡ社製を用いた。
鋳型ＤＮＡはｐＦＬＣ１ベクターに組み込まれた、マウスｃＤＮＡクローン（アクセッションＮＯ．ＡＫ０２９０９４）を使用した。
Ｔｗｅｅｎ２０の添加量は終濃度が０％、０．１％、０．５％、１．０％、２．０％とし、それぞれの濃度で、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。
また、ＥＸ Ｔａｑに対してはそれぞれの濃度で（１）６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを１枚混入したもの、（２）６０ＭＤＰ紙を直径１．２ｍｍに切り出したものを２枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。
使用した紙、１２０ＭＤＰ紙及び６０ＭＤＰ紙は三島製紙社製であり、この紙にはセルロース、カルボキシメチルセルロースが含まれている。ＰＣＲ反応サイクルは次の通りである。
ＫＯＤ）
９４℃ ２分 −１）
９４℃ ３０秒 −２）
６０℃ １分 −３）
６８℃ ２分 ―４）
２）−４）を３０サイクル
Ｅｘ−Ｔａｑ）
９４℃ ２分 −１）
９４℃ ３０秒 −２）
６０℃ １分 −３）
７２℃ ２分 −４）
２）−４）を３０サイクル
ＰＣＲ後、１％アガロースゲルで２００Ｖ、１５０ｍＡ、３０分電気泳動した。結果を、ＫＯＤを使用したものを図１ａに、Ｅｘ Ｔａｑを使用したものを図１ｂに示す。図１ａ及び図１ｂ中のＮ．Ａ．はＴｗｅｅｎ２０をＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
各濃度では図１ａにおいては左側から（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものの結果であり、図１ｂにおいては左側から（１）６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを１枚混入したもの、（２）６０ＭＤＰ紙を直径１．２ｍｍに切り出したものを２枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものの結果である。
図１から分かるように、Ｔｗｅｅｎ２０を添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。これに対し、Ｔｗｅｅｎ２０の添加により、核酸の増幅が行われる。例えば、ＫＯＤを使用したものは、Ｔｗｅｅｎ２０を加えたものはいずれの濃度でも増幅が行われ、特に２％付近で最もよく増幅した。Ｅｘ Ｔａｑに関しても２．０％の濃度で増幅が行われた。
実施例２ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例２として非イオン性界面活性剤の例としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は下記の表３の通りである。なお、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００はＳＩＧＭＡ社製を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加量は終濃度が０％、０．１％、０．５％、１．０％、２．０％とし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。使用した紙は実施例１と同様である。
ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図２に示す。図２中のＮ．Ａ．はＴｒｉｔｏｎＸ−１００をＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
各濃度では図２において左側から（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものの結果である。
図２から分かるように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。これに対し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加により、いずれの濃度でも増幅が行われ、特に１％付近で最もよく増幅した。
実施例３ ポリエチレングリコールの核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例３としてグリコール類の例としてポリエチレングリコールを使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、ポリエチレングリコールの核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は下記の表４及び表５の通りである。なお、ポリエチレングリコールは和光純薬工業株式会社製「ポリエチレングリコール６０００」を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
ポリエチレングリコールの添加量は終濃度が０％、１％、５％、１０％、１５％とし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。
また、ＥＸ Ｔａｑに対してはそれぞれの濃度で（１）６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを１枚混入したもの、（２）６０ＭＤＰ紙を直径１．２ｍｍに切り出したものを２枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。
使用した紙は実施例１と同様である。ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図３ａに、Ｅｘ Ｔａｑを使用したものを図３ｂに示す。図中のＮ．Ａ．はポリエチレングリコールをＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
各濃度では図３ａにおいては左側から（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものの結果であり、図３ｂにおいては左側から（１）６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを１枚混入したもの、（２）６０ＭＤＰ紙を直径１．２ｍｍに切り出したものを２枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものの結果である。
図３から分かるように、ポリエチレングリコールを添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。
これに対し、ポリエチレングリコールの添加により、核酸の増幅が行われる。例えば、ＫＯＤを使用したものは、ポリエチレングリコールを加えたものは濃度が１％から５％で核酸の増幅が行われ、特に５％付近で最もよく増幅した。Ｅｘ Ｔａｑに関しても、濃度が１０％から１５％で増幅が行われており、特に１５％付近で最もよく増幅した。
実施例４ トレハロースの核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例４として狭義の糖類の例としてトレハロースを使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、トレハロースの核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の下記の表６の通りである。なお、トレハロースはＦＬＵＫＡ社製「Ｄ−トレハロース」を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
トレハロースの添加量は終濃度が０Ｍ、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍとし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。使用した紙は実施例１と同様である。
ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図４に示す。図４中のＮ．Ａ．はトレハロースをＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
図４から分かるように、トレハロースを添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。これに対し、トレハロースの添加により、いずれの濃度でも増幅が行われ、特に０．６Ｍ付近で最もよく増幅した。
実施例５ スクロースの核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例５として狭義の糖類の例としてスクロースを使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、スクロースの核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は下記の表７の通りである。なお、スクロースは和光純薬工業株式会社製を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
スクロースの添加量は終濃度が０Ｍ、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍとし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。使用した紙は実施例１と同様である。
ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図５に示す。図５中のＮ．Ａ．はスクロースをＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
図５から分かるように、スクロースを添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。これに対し、スクロースの添加により、いずれの濃度でも増幅が行われ、特に０．６Ｍ付近で最もよく増幅した。
実施例６ ソルビトールの核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例６として多価アルコール類の例としてソルビトールを使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、ソルビトールの核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は下記の表８の通りである。なお、ソルビトールはＦＬＵＫＡ社製「Ｄ−ソルビトール」を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
ソルビトールの添加量は終濃度が０Ｍ、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍとし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。使用した紙は実施例１と同様である。
ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図６に示す。図６中のＮ．Ａ．はソルビトールをＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
図６から分かるように、ソルビトールを添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。これに対し、ソルビトールの添加により、いずれの濃度でも増幅が行われ、特に０．８Ｍ付近で最もよく増幅した。
実施例７ ホルムアミドの核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例７としてアミド類の例としてホルムアミドを使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、ホルムアミドの核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は下記の表９及び表１０の通りである。なお、ホルムアミドは和光純薬工業株式会社製を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
ホルムアミドの添加量は終濃度が０％、０．６％、２．５％、１０％、４０％とし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。
また、ＥＸ Ｔａｑに対してはそれぞれの濃度で（１）６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを１枚混入したもの、（２）６０ＭＤＰ紙を直径１．２ｍｍに切り出したものを２枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。使用した紙は実施例１と同様である。
ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図７ａに、Ｅｘ Ｔａｑを使用したものを図７ｂに示す。図７中のＮ．Ａ．はホルムアミドをＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
各濃度では図７ａにおいては左側から（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものの結果であり、図７ｂにおいては左側から（１）６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを１枚混入したもの、（２）６０ＭＤＰ紙を直径１．２ｍｍに切り出したものを２枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものの結果である。
図７から分かるように、ホルムアミドを添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。
これに対し、ホルムアミドの添加により、核酸の増幅が行われる。例えば、ＫＯＤを使用したものは、ホルムアミド濃度が特に２．５％で核酸の増幅が行われた。Ｅｘ Ｔａｑに関しても濃度が特に２．５％で増幅が行われた。
実施例８ グルセリンの核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例８として多価アルコール類の例としてグリセリンを使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、グリセリンの核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は下記の表１０の通りである。なお、グリセリンは和光純薬工業株式会社製を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
グリセリンの添加量は終濃度が０％、５％、１０％、２０％、４０％とし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。使用した紙は実施例１と同様である。
ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図８に示す。図８中のＮ．Ａ．はグリセリンをＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
図８から分かるように、グルセリンを添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。これに対し、グルセリンの添加によりいずれの濃度でも増幅が行われ、特に、濃度が１０％から２０％で、中でも特に２０％付近で最もよく増幅した。
実施例９ ショ糖脂肪酸エステルの核酸増幅反応における添加剤としての使用
以下、実施例９として非イオン性界面活性剤の例としてショ糖脂肪酸エステルを使用した例を示す。本実施例の目的は各酵素において夾雑物としてのセルロースおよびセルロース誘導体（本実施例ではカルボキシメチルセルロース）の核酸増幅阻害効果と、ショ糖脂肪酸エステルの核酸増幅阻害の低減効果を合わせ見ることである。
ＰＣＲ反応液の構成は下記の表１２の通りである。なお、ショ糖脂肪酸エステルは三菱化学フーズ株式会社製、商品名Ｓ−１６７０、ＨＬＢ１６を用いた。
ＰＣＲ反応サイクルは実施例１と同様である。鋳型ＤＮＡは実施例１と同様のものを使用した。
ショ糖脂肪酸エステルの添加量は終濃度が０％、０．１２５％、０．２５％、０．５％、１％とし、ＫＯＤに対して（１）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの３枚混入したもの、（２）１２０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したものを２枚、６０ＭＤＰ紙を直径２ｍｍに切り出したもの１枚混入したもの、（３）セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えないものを用意した。使用した紙は実施例１と同様である。
ＰＣＲサイクル、電気泳動条件は実施例１と同様である。結果を、ＫＯＤを使用したものを図９に示す。図９中のＮ．Ａ．はショ糖脂肪酸エステルをＰＣＲ反応液に混入しないものを表す。
図９から分かるように、ショ糖脂肪酸エステルを添加しないものはセルロース、カルボキシメチルセルロースの影響で増幅が阻害された（Ｎ．Ａ．（１）、（２））。同一条件で、セルロース、カルボキシメチルセルロースを加えない場合には、増幅が行われた（Ｎ．Ａ．（３））。これに対し、ショ糖脂肪酸エステルの添加によりいずれの濃度でも増幅が行われ、特に、濃度が０．１２５％から１％で、中でも特に１％付近で最もよく増幅した。
Ｔｗｅｅｎ２０の核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 ポリエチレングリコールの核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 トレハロースの核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 スクロースの核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 ソルビトールの核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 ホルムアミドの核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 グルセリンの核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。 ショ糖脂肪酸エステルの核酸増幅反応における添加剤としての使用の効果を示す。

Claims (28)

  1. 核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法において、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの添加剤を核酸合成反応液に添加することを含む、前記核酸合成方法。
  2. 添加剤により夾雑物による核酸合成反応への阻害効果が低減される、請求項１の方法。
  3. 非イオン性界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はショ糖脂肪酸エステルから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. アミド類がホルムアミドである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 広義の糖類が、狭義の糖類及び多価アルコール類から選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 狭義の糖類が、トレハロース又はスクロースである、請求項５に記載の方法。
  7. 多価アルコール類がグリセリン又はソルビトールである、請求項５に記載の方法。
  8. 多価アルコール類がグリコール類である、請求項５に記載の方法。
  9. グリコール類がポリエチレングリコールである、請求項８に記載の方法。
  10. 下記（ａ）ないし（ｉ）の１種類又はそれより多くの物質が、下記の終濃度で添加される、請求項１ないし７に添加される、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法；
    （ａ）Ｔｗｅｅｎ２０：終濃度０．０１％から５％；
    （ｂ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：終濃度０．０１％から５％；
    （ｃ）ショ糖脂肪酸エステル：終濃度０．０１％から５％；
    （ｄ）ポリエチレングリコール：分子量１０００から８０００、終濃度は０．１％から２０％；
    （ｅ）トレハロース：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
    （ｆ）スクロース：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
    （ｇ）ソルビトール：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
    （ｈ）ホルムアミド：終濃度０．０１％から１５％；又は
    （ｉ）グリセリン：終濃度１％から３０％。
  11. セルロース誘導体が、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース又はカルボキシプロピルメチルセルロースから選択される、請求項1ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料が、核酸ブックに由来する、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 核酸合成反応が、核酸の増幅反応、複製反応、転写反応又は逆転写反応である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 核酸合成に用いる酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素から選択される、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料を用いた核酸合成方法における核酸合成反応液への添加剤であって、非イオン性界面活性剤、アミド類、及び広義の糖類からなるグループから選択される１種類又はそれより多くの物質を含む、前記添加剤。
  16. 夾雑物による核酸合成反応への阻害効果を低減するための、請求項１５の添加剤。
  17. 非イオン性界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はショ糖脂肪酸エステルから選択される、請求項１５又は１６に記載の添加剤。
  18. アミド類がホルムアミドである、請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の添加剤。
  19. 広義の糖類が、狭義の糖類及び多価アルコール類から選択される、請求項１５ないし１８のいずれか１項に記載の添加剤。
  20. 狭義の糖類が、トレハロース又はスクロースである、請求項１９に記載の添加剤。
  21. 多価アルコール類がグリセリン又はソルビトールである、請求項１９に記載の添加剤。
  22. 多価アルコール類がグリコール類である、請求項１９に記載の添加剤。
  23. グリコール類がポリエチレングリコールである、請求項２２に記載の添加剤。
  24. 下記（ａ）ないし（ｉ）の１種類又はそれより多くの物質を、下記の終濃度になるように含む、請求項１５ないし２３のいずれか１項に記載の添加剤；
    （ａ）Ｔｗｅｅｎ２０：終濃度０．０１％から５％；
    （ｂ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：終濃度０．０１％から５％；
    （ｃ）ショ糖脂肪酸エステル：終濃度０．０１％から５％；
    （ｄ）ポリエチレングリコール：分子量１０００から８０００、終濃度は０．１％から２０％；
    （ｅ）トレハロース：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
    （ｆ）スクロース：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
    （ｇ）ソルビトール：終濃度０．０１Ｍから１Ｍ；
    （ｈ）ホルムアミド：終濃度０．０１％から１５％；又は
    （ｉ）グリセリン：終濃度１％から３０％。
  25. セルロース誘導体が、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシプロピルセルロース又はカルボキシプロピルメチルセルロースから選択される、請求項１５ないし２４のいずれか１項に記載の添加剤。
  26. 核酸、並びにセルロース、セルロース誘導体から選択される1種類又はそれより多くの夾雑物を含む試料が、核酸ブックに由来する、請求項１５ないし２５のいずれか１項に記載の添加剤。
  27. 核酸合成反応が、核酸の増幅反応、複製反応、転写反応又は逆転写反応である、請求項１５ないし２６のいずれか１項に記載の添加剤。
  28. 核酸合成に用いる酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素から選択される、請求項１５ないし２７のいずれか１項に記載の添加剤。
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