JP7093121B2 - 水溶紙を含むサンプル調製用材料およびそれを用いるサンプル調製方法 - Google Patents
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Description
(項目1) 水溶紙またはその成分を含む、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの血液またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料。
(項目2) 前記ポリメラーゼはTaq DNAポリメラーゼである、項目1に記載の抑制剤または抑制材料。
(項目3) 前記水溶紙は、水溶性セルロース誘導体を含む、項目1または2に記載の抑制剤または抑制材料。
(項目4) 前記水溶紙は、カルボキシメチルセルロースを含む、項目1~3のいずれか1項に記載の抑制剤または抑制材料。
(項目5) 項目1~4のいずれか1項に記載の抑制剤または抑制材料を含むキット。
(項目6) 遺伝子増幅のためのサンプルを調製するための、項目5に記載のキット。
(項目7) 遺伝子分析に用いるための、項目5または6に記載のキット。
(項目8) 前記遺伝子分析が遺伝子型の検査である、項目7に記載のキット。
(項目9) 前記遺伝子型の検査が、薬物代謝酵素遺伝子の遺伝子型の検査である、項目8に記載のキット。
(項目10) 水溶紙またはその成分を含む、吸光度測定で用いるサンプル調製のためのサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目11) 前記吸光度測定は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-紫外線吸収(UV)分析で行われるものである、項目10に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目12) 前記水溶紙は、水溶性セルロース誘導体を含む、項目10または11に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目13) 前記水溶紙は、カルボキシメチルセルロースを含む、項目10~12のいずれか1項に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目14) 前記サンプル調製が、乾燥血スポット(DBS)サンプルの調製である、項目10~13のいずれか1項に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目15) 項目10~14のいずれか1項に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料を含むキット。
(項目16) 治療薬物モニタリングに用いるための、項目15に記載のキット。
(項目17) 水溶紙またはその成分を含む、吸光度測定および核酸増幅による遺伝子分析のためのサンプルを同一のサンプルから調製するためのサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目18) 前記遺伝子分析はTaqman(TM)分析である、項目17に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目19) 前記吸光度測定は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-紫外線吸収(UV)分析で行われるものである、項目17または18に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目20) 前記水溶紙は、水溶性セルロース誘導体を含む、項目17~19のいずれか1項に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目21) 前記水溶紙は、カルボキシメチルセルロースを含む、項目17~20のいずれか1項に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目22) 前記吸光度測定のためのサンプルが、乾燥血スポット(DBS)サンプルである、項目17~21のいずれか1項に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目23) 項目17~22のいずれか1項に記載のサンプリング剤またはサンプリング材料を含むキット。
(項目24) 薬物代謝酵素遺伝子の遺伝子型の検査と、治療薬物モニタリングとを同一のサンプルに対して行うための、項目23に記載のキット。
(項目25) 吸光度測定および核酸増幅による遺伝子分析のためのサンプルを同一のサンプルから調製する方法であって、
サンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)がスポットされた水溶紙を液体に溶解させる工程と、
該水溶紙を溶解させた液体の一部から核酸増幅による遺伝子分析のためのサンプルを調製する工程と、
該水溶紙を溶解させた液体の他の一部から吸光度測定のためのサンプルを調製する工程と
を含む、方法。
(項目26) 前記水溶紙は、水溶性セルロース誘導体を含む、項目25に記載の方法。
(項目27) 前記水溶紙は、カルボキシメチルセルロースを含む、項目25または26に記載の方法。
(項目28) サンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)中またはその成分中の遺伝子または遺伝子産物の検出、測定または同定方法であって、該方法は:(A)サンプルまたはその成分を提供する工程;(B)該サンプルまたはその成分に水溶紙またはその成分を接触させる工程;(C)接触後の該サンプルまたはその成分を5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて該遺伝子または遺伝子産物に関する遺伝子増幅反応に供する工程;および(D)該増幅反応の結果に基づいて該遺伝子または遺伝子産物の検出、測定または同定を行う工程を包含する、方法。
(項目29) 前記遺伝子増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、項目28に記載の方法。
(項目30) 前記検出、測定または同定を行う工程は、遺伝子型の分析を含む、項目28または29に記載の方法。
(項目31) 項目1~9のいずれかまたは複数の項目に記載される特徴をさらに含む、請求項28~30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32) サンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)中またはその成分中の遺伝子または遺伝子産物の検出、測定または同定するためのキットであって、該キットは:(a)水溶紙またはその成分;および(b)5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含む、遺伝子増幅反応のための試薬を含む、キット。
(項目33) 前記遺伝子増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、項目32に記載のキット。
(項目34) 前記検出、測定または同定は、遺伝子型の分析を含む、項目32または33に記載のキット。
(項目35) 項目1~9のいずれかまたは複数の項目に記載される特徴をさらに含む、請求項32~34のいずれか1項に記載のキット。
(項目36) 同一のサンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)に基づいて吸光度測定および核酸増幅を含む分析を行う方法であって、該方法は、水溶紙またはその成分に該サンプルを接触させる工程;該水溶紙またはその成分に有機溶媒を接触させて有機画分を抽出する工程;該水溶紙またはその成分に水または水含有溶媒を接触させて水性画分を抽出する工程;ならびに該有機画分を用いて核酸増幅を含む分析を行い、該有機画分を用いて吸光度測定を行う工程を含む、方法。
(項目37) 前記吸光度測定はHPLCまたはLC-MSを含む、項目36に記載の方法。
(項目38) 項目1~27のいずれかまたは複数の項目に記載される特徴をさらに含む、請求項36または37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39) 同一のサンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)を用いて吸光度測定および核酸増幅を含む分析を行う方法であって、該方法は、該サンプルがスポットされた水溶紙を液体に溶解させる工程と、該水溶紙を溶解させた液体の一部から核酸増幅による分析のためのサンプルを調製する工程と、該水溶紙を溶解させた液体の他の一部から吸光度測定のためのサンプルを調製する工程と、該核酸増幅のためのサンプルを用いて核酸増幅を含む分析を行う工程と、該吸光度測定のためのサンプルを用いて該吸光度測定を行う工程とを含む、方法。
(項目40) 前記吸光度測定はHPLCまたはLC-MSを含む、項目39に記載の方法。
(項目41) 項目1~27のいずれかまたは複数の項目に記載される特徴をさらに含む、請求項39または40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42) 同一のサンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)に基づいて吸光度測定および核酸増幅を含む分析を行うシステムであって、該システムは、水溶紙またはその成分;該水溶紙またはその成分に有機溶媒を接触させて有機画分を抽出する手段;該水溶紙またはその成分に水または水含有溶媒を接触させて水性画分を抽出する手段;核酸増幅を含む分析を行う手段;および吸光度測定を行う手段を含む、システム。
(項目43) 前記吸光度測定を行う手段はHPLCまたはLC-MSを実施する機器を含む、項目42に記載のシステム。
(項目44) 項目1~27のいずれかまたは複数の項目に記載される特徴をさらに含む、請求項42または43のいずれか1項に記載のシステム。
(項目45) 同一のサンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)を用いて吸光度測定および核酸増幅を含む分析を行うシステムであって、該システムは、必要に応じて予め該サンプルがスポットされた水溶紙;水溶紙を溶解する液体(例えば、水、水含有溶媒等);核酸増幅試薬;および吸光度測定のための手段を含む、システム。
(項目46) 前記吸光度測定を行う手段はHPLCまたはLC-MSを実施する機器を含む、項目45に記載のシステム。
(項目47) 項目1~27のいずれかまたは複数の項目に記載される特徴をさらに含む、請求項45または46のいずれか1項に記載のシステム。
(項目48) 水溶紙またはその成分を含む、吸光度測定および核酸増幅による遺伝子分析のためのサンプルを同一のサンプルから調製するためのサンプリング剤またはサンプリング材料であって、該吸光度測定は、超臨界流体クロマトグラフィーによるものであり、該遺伝子分析のためのサンプルは、該超臨界流体クロマトグラフィーの抽出残渣である、サンプリング剤またはサンプリング材料。
(項目49) 吸光度測定および核酸増幅による遺伝子分析のためのサンプルを同一のサンプルから調製する方法であって、
サンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)がスポットされた水溶紙(例えば、にDBSまたはDSS)を超臨界抽出に供して吸光度測定のためのサンプルを調製する工程と、
該超臨界抽出した水溶紙の残渣から、核酸増幅による遺伝子分析のためのサンプルを調製する(例えば、蒸留水(DW)に溶解する)工程と、
を含む、方法。
(項目50) 前記遺伝子分析が、定量的分析である、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目51) 前記定量的分析が、コピー数多型の検査である、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目52) 前記コピー数多型の検査が、リアルタイムPCRを用いて行われる、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目53) 前記コピー数多型の検査が、ヒトRNase Pを標準として用いて行われる、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目54) 前記遺伝子分析において、核酸の抽出または精製が行われない、前記項目のいずれかに記載のキット。
(項目55) 血液サンプルの遺伝子分析を行う方法であって、
血液サンプルを水溶紙またはその成分に接触させる工程と、
該担体の一定面積を採取し、該血液サンプルを担持した該担体を反応液中に添加し、遺伝子増幅反応を行う工程と
を含み、核酸の抽出または精製を行わないことを特徴とする、方法。
(項目56) 前記項目のいずれか1つまたは複数の項目に記載される特徴をさらに含む、前記項目に記載の方法。
(項目57) 前記遺伝子分析が、定量的分析である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目58) 前記定量的分析が、コピー数多型の検査である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目59) 前記コピー数多型の検査が、リアルタイムPCRを用いて行われる、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目60) 前記コピー数多型の検査が、ヒトRNase Pを標準として用いて行われる、前記項目のいずれかに記載の方法。
本明細書において「水溶紙」とは、水と接触することによって分解し、水に溶解または分散する性質(水解性)を有する紙を指す。なお、水解性であるか否かは、たとえば10μlの水(反応液)に、0.05~0.1mgの水溶紙を接触させた後、その水(反応液)の660nmにおける濁度をBio-RAD社製のSmart Spec(商標)3000を用いて測定した場合に0.4以下である場合に水解性を有するものとする。このような水溶紙として、具体的には、60MDP(日本製紙パピリア社製)、30MDP(日本製紙パピリア社製)、120MDP(日本製紙パピリア社製)、30MDP-S(日本製紙パピリア社製)、60MDP-S(日本製紙パピリア社製)などのMDPシリーズの製品、30CD-2(日本製紙パピリア社製)、60CD-2(日本製紙パピリア社製)、120CD-2(日本製紙パピリア社製)などのCD-2シリーズなどの水解性紙、水解紙(株式会社TTトレーディング(旧特種紙商事株式会社)より入手可能)などが挙げられる。水溶紙は、遺伝子増幅、あるいは、特定の遺伝子検出に用いる反応液中で、反応中に均一に分散し、さらに沈降し、物理的操作や光学的検出に干渉しにくい状態になるため好ましい。また、別の好ましい実施形態では、光学的検出を許容するものが好ましい。本明細書では「水溶紙」は「水解紙」とも称することがあり、両者は同じ意味で用いられる。
本明細書において、「遺伝子分析」とは生体サンプル中の核酸(DNA、RNA等)の状態を調べることをいう。1つの実施形態では、遺伝子分析は、核酸増幅反応を利用するものを挙げることができる。これらを含め、遺伝子分析の例としては、配列決定、遺伝子型判定・多型分析(SNP分析、コピー数多型、制限酵素断片長多型、リピート数多型)、発現解析、蛍光消光プローブ(Quenching Probe:Q-Probe)、SYBR green法、融解曲線分析、リアルタイムPCR、定量RT-PCRなどを挙げることができる。遺伝子分析の1つの例は、TaqManプローブ法による遺伝子型の判定である。蛍光消光プローブ法については、https://www.aist.go.jp/Portals/0/resource_images/aist_j/aistinfo/aist_today/vol08_02/vol08_02_p18_p19.pdf等に記載されている。
本発明の一つの実施形態で使用され得る核酸増幅反応においては、核酸ポリメラーゼが用いられる。1つの実施形態では、遺伝子分析に用いられるDNAポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼに代表される、プライマー付加による核酸を合成する耐熱性に優れたポリメラーゼであれば特に制限なく用いることができる。本発明で特に利用される核酸増幅反応は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いるものである。理論に束縛されることを望まないが、KODポリメラーゼを用いると、増幅方法が異なるため、Taqman DNAポリメラーゼのように標識で検出できず、制限酵素での切断パターンでの解析を余儀なくされるため、煩雑な手法であるがTaq DNAポリメラーゼのような5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いることで、簡便な解析を実現することができるからである。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼには、Family A(Pol I型)のDNAポリメラーゼが含まれる。
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
1つの局面では、本発明は、水溶紙またはその成分を含む、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの血液またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料を提供する。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、Taqman法に代表されるこのエキソヌクレアーゼ活性を用いた定量的解析に利用されるため有用である。利用されるポリメラーゼはTaq DNAポリメラーゼまたはTth DNAポリメラーゼが代表例として挙げられ、好ましくは、Taq DNAポリメラーゼが使用される。
したがって、1つの局面では、本発明は、サンプル中またはその成分中の遺伝子または遺伝子産物の検出、測定または同定方法を提供する。この方法は:(A)サンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)またはその成分を提供する工程;(B)該生体サンプルまたはその成分に水溶紙またはその成分を接触させる工程;(C)接触後の該生体サンプルまたはその成分を5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いて該遺伝子または遺伝子産物に関する遺伝子増幅反応に供する工程;および(D)該増幅反応の結果に基づいて該遺伝子または遺伝子産物の検出、測定または同定を行う工程を包含する。
別の局面において、本発明は、水溶紙またはその成分を含む、吸光度測定で用いるサンプル調製(のためのサンプリング剤またはサンプリング材料を提供する。本発明のサンプリング技術を用いると、吸光度測定におけるノイズが予想外に低減され、従来使用されている他の紙媒体(例えば、FTAカード、GEヘルスケアより入手可能)を用いたアッセイより正確なアッセイを達成することができる。サンプル調製は、吸光度測定を予定するのであれば、どのような形態でもよく、乾燥血スポット(DBS)サンプル調製などが代表的である。
別の局面では、本発明は、本発明のサンプリング剤またはサンプリング材料を含むキットを提供する。このキットは、薬理学的モニタリング、治療薬物モニタリングなどに用いることができる。本発明のキットは、モニタリングのためのサンプルを調製するための手段を含みうる。
別の局面において、本発明は、水溶紙またはその成分を含む、吸光度測定および核酸増幅による遺伝子分析のためのサンプルを同一のサンプルから調製するためのサンプリング剤またはサンプリング材料を提供する。サンプルは例えば、乾燥血スポット(DBS)サンプルなどでありうる。このような二重または多重のアッセイのためのサンプリングは、水溶紙またはその成分を用いた場合の特徴の一つである。本発明のアッセイで実施される遺伝子分析はTaqman(TM)分析などの核酸増幅を伴う任意のアッセイであり得、吸光度測定は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)-紫外線吸収(UV)分析、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)-紫外線吸収(UV)分析などの、クロマトグラフィーを伴う方法または直接吸光度を測定する方法などを挙げることができる。本発明のこの局面で利用され得る水溶紙は、目的を達成し得る限りどのようなものでもよく、そのような紙としては本明細書において記載される任意のものを例示することができ、(ポリメラーゼの増幅活性阻害効果の抑制)および(吸光度測定用のサンプリング)において説明されるものも使用することができる。
1つの局面において、本発明は、同一のサンプル(例えば、血液サンプルなどの生体サンプル)に基づいて吸光度測定および核酸増幅を含む分析を行う方法を提供する。この方法は、水溶紙またはその成分に該サンプルを接触させる工程;該水溶紙またはその成分に有機溶媒を接触させて有機画分を抽出する工程;該水溶紙またはその成分に水または水含有溶媒を接触させて水性画分を抽出する工程;ならびに該有機画分を用いて核酸増幅を含む分析を行い、該有機画分を用いて吸光度測定を行う工程を含む。ここで利用される吸光度測定はHPLCまたはLC-MSを含みうる。本発明のこの局面で利用され得る水溶紙は、目的を達成し得る限りどのようなものでもよく、そのような紙としては本明細書において記載される任意のものを挙げることができ、(ポリメラーゼの増幅活性阻害効果の抑制)、(ポリメラーゼの増幅活性阻害効果の抑制を用いる核酸増幅および分析)、(吸光度測定用のサンプリング)において説明されるものも使用することができる。
1つの局面において、本発明は、超臨界抽出または超臨界流体クロマトグラフィーのためのサンプル調製のためのサンプリング剤またはサンプリング材料を提供する。超臨界抽出または超臨界流体クロマトグラフィーは、以下に記載されるような薬物動態分析のために行うものであり得る。1つの実施形態では、水溶紙を含むサンプリング剤またはサンプリング材料から超臨界抽出を行い、超臨界流体相をクロマトグラフィーに供することができる。また、超臨界抽出後の水溶紙の残渣をさらに水に溶解させ、残留する成分(例えば、核酸)の分析のためのサンプルとして利用することができる。
1つの局面において、本発明は、薬物動態分析のためのサンプル調製のためのサンプリング剤またはサンプリング材料を提供する。薬物動態分析は、吸光度測定を含むものであり得る。好ましい実施形態では、薬物動態分析は治療薬物モニタリング(TDM)であり得る。本発明のこの局面でもまた、目的を達成し得る限り本明細書において記載される任意の特徴を採用することを挙げることができ、(ポリメラーゼの増幅活性阻害効果の抑制)、(ポリメラーゼの増幅活性阻害効果の抑制を用いる核酸増幅および分析)、(吸光度測定用のサンプリング)、(同一サンプルから2以上のアッセイを行うためのサンプリング)、および(同一サンプルを用いた多重アッセイ)において説明されるものも使用することができる。
(一般技術)
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J. et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
[目的]
本実施例では、血液サンプル中の核酸の増幅において、血液サンプル中に含まれる物質の増幅阻害作用を水溶紙によって抑制することができることを実証する。
(サンプル調製)
被験体から血液サンプルを採取した。
X10:全血10μL(100000コピー)をDW90μLで10倍希釈した。
X100:X10希釈血10μL(10000コピー)をDW90μLで10倍希釈した。
X1000:X100希釈血10μL(1000コピー)をDW90μLで10倍希釈した。
X1:100000コピー/200μL=500コピー/μLx4μL=2000コピー
X10:10000コピー/200μL=50コピー/μL/x4μL=200コピー
X100:1000コピー/200μL=5コピー/μL/x4μL=20コピー
のゲノムDNAが含まれることとなる。
以下の手順で、アルコール脱水素酵素遺伝子の遺伝子多型の検出をリアルタイムPCR装置ABI7300(Applied Biosystems社製)を用いてTaqMan(登録商標)プローブ法により行なった。
アルコール脱水素酵素遺伝子ADH1Bを対象として、ゲノムDNAを以下のようにTaqMan PCRにおいて増幅した。
反応試薬として、東洋紡リアルタイムPCRマスターミックス Thunderbird qPCR Mixを使用した。Thunderbird qPCR Mixは、DNA合成のためのポリメラーゼとして、Taq DNA polymeraseを含んでいる。本実施例では、KOD FX Neoバッファーを使用しなかった。これまでの実験方法の開発過程から、全血の乾燥水溶紙片を直接PCR反応液にしない場合には、KOD FX Neoバッファー(10%)を用いずにPCR反応を行うことが可能であると考えられたためである。
ポジティブコントロールとして、ADH1B(A/G)の遺伝子領域をプラスミドDNAに組み込んだリコンビナント(組み換え)DNAを溶解した水溶液を用いてPCR反応を行った(図1~3の●)。ネガティブコントロールとしては、蒸留水を用いた(図1~3の■)。
(ADH1BのFTAと水溶紙(パンチ径の差)の比較実験)
G/Gホモは、FTAと水溶紙(60、120MDP)に差があるように見えるが、サンプリング位置による全血液量の僅かなばらつきが反映されている。増幅曲線のCtからは、数倍程度の差と考えられる。A/AホモはG/Aホモはほぼ同等の感度で観察されている。この結果より、水溶紙の4mmΦおよび2mmΦパンチの差は、全くないと考えられる。FTAと水溶紙の感度差は観察されないが、希釈倍率からゲノムDNA回収率は、FTAは水溶紙の1/10と見積もられる。3回の水洗工程、4mmΦパンチディスクの膨張など水溶紙に比べ、デメリットは大きい。
被験体から採取した血液を、水溶紙(120 MDP)およびWhatman(登録商標) 903 Protein saver cardに滴下して乾燥させ、4mmΦのパンチ片を切り抜いたものからサンプルを調製し、上記のとおり遺伝子の増幅反応を行った結果を図1Aに示す。図1Bには、当該増幅反応における増幅曲線を示す。
[目的]
本実施例では、水溶紙を用いるとFTAカード(GE Healthcare)よりも簡便なプロトコールで、血液中の核酸増幅阻害物質の作用を抑制し、効率よく反応を行うことができることを示す。
全血を塗布したFTAおよび水溶紙(60MDP)のサンプル処理を、以下の表5に示されるように行った。
増幅反応は、上記実施例1におけるものと同様に行い、それぞれの方法で調製したサンプルについて、遺伝子増幅シグナルが検出されるかどうかを調べた。ただし、ALDH2遺伝子について遺伝子型を検出した場合には、プローブはALDH2に対するものを使用した。
結果を図5~図12に示した。
[目的]
本実施例では、唾液を用いてサンプリングした場合と、水溶紙を用いて血液からサンプルを調製した場合の結果を比較する。
被験体の口腔粘膜からスワブによって唾液サンプルを採取し、図13Aに示すように、担体に転移操作を行い、遺伝子分析のためのサンプルを調製した。水溶紙の材質(厚さ、製法など)の違いのある4種類(120MDP、60MDP、120CD2、 60CD2)の水溶紙を担体として用いて比較実験を行った。スワブから水溶紙に転写後、スワブのポリウレタンスポンジ部を取り外し、DW100mLを加え、加熱処理した上清をPCR反応液に滴加して残留口腔粘膜細胞数を概算した。
結果を図13Bに示す。全てのサンプルにおいて、遺伝子型を判定するに十分なシグナルが得られている。水溶紙を用いて血液をサンプリングすることで、他の方法よりも簡便に遺伝子分析のためのサンプルを調製することができたことが示される。
[目的]
本実施例では、水溶紙によるHPLC-UVにおけるノイズ低減効果を実証することを目的とする。
末梢血サンプルに、カフェインを10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/mlを添加したものと、カフェイン添加無しの末梢血とを測定用のサンプルとして用いた。
[結果]
水溶紙による、カフェイン添加末梢血サンプルからのカフェインの検出結果を図15に示す。R2=0.99913と、非常に直線性が高く検出されていることが理解される。
生体サンプルは複数の分析手法によって分析することが可能である(図19)。
本実施例では、コピー数多型(CNV)レファレンス(Copy Number Reference Assay, human, RNase P)を使用してリアルタイムPCRによる遺伝子増幅の検査を行った。
検査対象(被検者3名)からの末梢血及び唾液(ヒト口腔粘膜細胞を含む)の採取は、以下のマニュアルに従って行った。
(1)乾燥末梢血サンプル(Dried Blood Spot)は、BD社マイクロティナ セーフティ ランセットを片方の手に持ち、先端をもう片方の手の、例えば、中指の先に押し当て穿刺して、採血した。指先の血液は120MDPを固定したサンプリングキットに接触させ、サンプリングシート(水溶紙120MDPを貼り付けた自作キット:図21参照)を三つ折に戻し、30分以上乾燥した。他人の飛沫する唾がサンプルに付かないように注意して乾燥した(図22および23参照)。
(2)コントロールの乾燥唾液サンプル(3)(口腔内粘膜細胞:Dried Saliva Spot)は、スワブスティックを持ち、スポンジの片面で歯茎の外側・内側、頬の内側を、10回ほどこすった。もう片面で同様に10回ほどこすった。スワブ両面を唾液で湿らせた。次いで、スティックの根元を持ち、サンプリングシートの水溶紙部にスポンジの片面を押し当て、表紙部をかぶせて約5秒間挟み込んだ(図24参照)。使用済みのスワブは元の袋に戻して破棄した。サンプリングシートは三つ折に戻し、30分以上乾燥した。
TaqMan(登録商標)PCR法によるコピー数多型(Copy Number Variations, CNVs) 解析で使用される内部コントロールとなるTaqMan (登録商標) Copy Number Reference Assay, human, RNase Pを用いて、リアルタイムPCR装置にて血液サンプル中のゲノムDNAの遺伝子増幅が出来ることを確認した。乾燥血液スポットの小片(直径1.2mmパンチ片)を直接TaqMan PCR反応液に入れた場合((1):図22参照)と小片(直径1.2mmパンチ片)を蒸留水100μLに浸漬、95℃で5分間、処理した上清4μLをTaqMan PCR反応液に添加した場合((2):図23参照)を比較した。また、乾燥唾液スポットの小片(直径1.2mmパンチ片)を直接TaqMan PCR反応液に入れた場合((3):図25参照)と小片(直径2mmパンチ片)を蒸留水100μLに浸漬、95℃で5分間、処理した上清4μLをTaqMan PCR反応液に添加した条件をコントロールとした((4):図26参照)。
3)乾燥唾液スポット(3)の直径1.2mmパンチ片、TaqPath (登録商標) ProAmp (登録商標) Master Mix 2x (Thermo Fisher Scientific Inc.):5μL、20×TaqMan(登録商標) Copy Number Reference Assay, human, RNase P(Thermo Fisher Scientific Inc.):0.5μL、滅菌精製水:4.5μLを加え全量10μLとした。
4)乾燥唾液スポット(4)のPCR反応液の組成は、乾燥唾液スポットの直径2mmパンチ片を蒸留水100μLで処理した被検試料調製液:4μL、TaqPath (登録商標) ProAmp (登録商標) Master Mix 2x (Thermo Fisher Scientific Inc.):5μL、20×TaqMan (登録商標) Copy Number Reference Assay, human, RNase P(Thermo Fisher Scientific Inc.):0.5μL、滅菌精製水:0.5μLを加え全量10μLとした。
熱変性:50°C、2分→95°C、10分、 95°C、15秒→60°C、1分を40サイクル。
TaqMan (登録商標) PCRによるRNase Pの遺伝子増幅の結果を示す(図28、29、30および31参照)。示されるように、いずれの場合も、反応液に投入された水溶紙120MDPが測定装置ABI PRISM (登録商標) QuantStudioTM 12K Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc.)の光路阻害することなく、明確にRNase P遺伝子の増幅曲線が観察できるところである。そのCt値は、乾燥血液スポット(1):平均Ct値:27.6±0.4サイクル、乾燥血液スポット(2):平均Ct値:33.5±0.1サイクルであった。(1)と(2)の差は約6サイクルであり、鋳型DNA量の差は理論的に(1)は(2)の64倍ではある。サンプル調製法から換算出来る実質的な差は100μL/4μL=25倍であるが、操作誤差などを加味すると妥当な相違と考えられる。乾燥血液スポット(1)小片をTaqMan (登録商標) PCR反応液に直接投入して遺伝子検査を行える最大のメリットは、操作の簡略化とコンタミネーションリスク低減の効果がある。更には、血液と共に水溶紙がPCR反応液に混入しても反応阻害は観察されない。一方で、コントロールの乾燥唾液スポット(3)を鋳型DNAとして遺伝子増幅反応は、その増幅曲線の平均Ct値は31.3±1.6サイクル、乾燥唾液スポット(4)は28.0±1.4サイクルであった。(3)と(4)の差は約3サイクル(23=8)であり、それぞれサンプル間のCt値が血液に比べばらつきが観察される。鋳型DNA量の差は理論的に(3)は(4)の9倍ではあり、PCR反応系に導入されたゲノムDNA量の理論量から換算されるCt値の差は約3サイクルで、実測値のCt差(3サイクル)と一致する。従って、水溶紙を直接PCR反応液に添加したことによる阻害は観察されない(図30および31参照)。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、特願2017-70962の優先権の利益を主張し、この内容はその全体が本明細書において参考として援用される。
Claims (12)
- 血液サンプルのコピー数多型を検出するための定量的分析用のサンプルを調製するための、一定面積の水溶紙を含む、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの血液またはその成分による増幅活性阻害効果の抑制剤または抑制材料であって、該定量的分析において、核酸の抽出または精製が行われないことを特徴とする、抑制剤または抑制材料。
- 前記ポリメラーゼはTaq DNAポリメラーゼである、請求項1に記載の抑制剤または抑制材料。
- 前記水溶紙は、水溶性セルロース誘導体を含む、請求項1または2に記載の抑制剤または抑制材料。
- 前記水溶紙は、カルボキシメチルセルロースを含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の抑制剤または抑制材料。
- 血液サンプルのコピー数多型の検査の定量的分析に用いるための、請求項1~4のいずれか1項に記載の抑制剤または抑制材料を含むキットであって、該定量的分析において、核酸の抽出または精製が行われないことを特徴とする、キット。
- さらに、遺伝子増幅のためのサンプルを調製するための、請求項5に記載のキット。
- さらに、遺伝子分析に用いるための、請求項5または6に記載のキット。
- 前記遺伝子分析が遺伝子型の検査である、請求項7に記載のキット。
- 前記遺伝子型の検査が、薬物代謝酵素遺伝子の遺伝子型の検査である、請求項8に記載のキット。
- 前記コピー数多型の検査が、リアルタイムPCRを用いて行われる、請求項5~9のいずれか1項に記載のキット。
- 血液サンプルのコピー数多型の検査の定量的分析を行う方法であって、
血液サンプルを水溶紙に接触させる工程と、
該水溶紙の一定面積を採取し、該血液サンプルを担持した該水溶紙を反応液中に添加し、遺伝子増幅反応を行う工程と
を含み、核酸の抽出または精製を行わないことを特徴とする、方法。 - 前記コピー数多型の検査が、リアルタイムPCRを用いて行われる、請求項11に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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