JP5911495B2 - 同じ反応容器内での細胞溶解およびpcrのための方法 - Google Patents
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Description
a)1個以上の生細胞を含む第1の量を有する液体試料を容器の中に移し、
b)前記の容器に第2の量を有するPCR反応緩衝液を添加し、一方で前記の第2の量は前記の第1の量の少なくとも2倍の大きさであり、
c)前記の1個以上の生細胞を前記の容器内で、少なくとも90℃で少なくとも30秒間の保温により溶解させ、
d)前記の標的を、中間の精製工程を実施せずに熱安定性DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する;
を含み、工程a)〜d)が同じ容器内で実施されることを特徴とする、標的核酸の増幅のための方法を提供する。
前記の容器は、例えばマイクロタイタープレートのウェルであってよい。前記のマイクロタイタープレートの前記のウェルは、PCR増幅プライマーの乾燥組成物を含んでいてよい。さらに、前記の乾燥組成物は、少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかを含んでいてよい。加えて、前記の乾燥組成物は、追加で熱安定性DNAポリメラーゼおよびdNTPを含んでいていてよい。
あるいは、前記の容器は毛細管または反応チューブの細長いチューブである。
好ましくは、前記の工程a)の生細胞の数の、その中で工程d)のポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率は、2細胞/μLより大きくない。
別の観点において、本発明は以下:
−サーマルサイクラー機器の中に取りつけられるように設計された複数の反応容器
−PCRを実施することが可能な熱安定性DNAポリメラーゼおよびdNTPを含むPCR反応緩衝液
を含むキットを提供する。
前記の反応容器は、少なくとも一対のPCR増幅プライマーおよび場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかの乾燥組成物を含む。
a)1個以上の生細胞を含む第1の量を有する液体試料を容器の中に移し、
b)前記の容器に第2の量を有するPCR反応緩衝液を添加し、一方で前記の第2の量は前記の第1の量の少なくとも2倍の大きさであり、
c)前記の1個以上の生細胞を前記の容器内で、少なくとも90℃で少なくとも30秒間の保温により溶解させ、
d)前記の標的核酸を、中間の精製工程を実施せずに熱安定性DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。
その標的核酸はDNA、すなわちゲノムDNAの特定の部分であってよい。この場合、そのポリメラーゼ連鎖反応はDNA依存性DNAポリメラーゼ、例えばTaqDNAポリメラーゼまたは同様のものを用いて実施されるであろう。あらゆるタイプのゲノムのバリエーション、例えば一塩基多型等を同定するために、そのDNAの特定の部分を増幅することができる。
工程a)に従う1個以上の生細胞は、好ましくはヒト、動物または植物由来の真核細胞である。その細胞は、細胞株または生検由来のものであってよい。
本発明の文脈において、本発明の工程b)において添加される“PCR反応緩衝液”という用語は、その中でその試料に対して後で一切の中間の精製工程なしでPCR反応を行うことができるあらゆる液体として理解される。前記の添加されるPCR反応緩衝液の第2の量は、その第1の量の少なくとも2倍(2×)の大きさ、好ましくは5倍(5×)の大きさであるべきである。これは、それに続くPCR反応の間のその標的核酸の効率的な増幅を可能にするであろう。
本発明によれば、その細胞の溶解は、当技術において従来法で用いられる特定の溶解工程試薬を一切事前添加せずに、PCR反応緩衝液内で起こる。むしろ、その1個以上の生細胞の溶解は、その試料を少なくとも90℃において少なくとも60秒の期間の間保温することにより起こる。通常、30秒の期間の高温での保温は中程度の数の細胞(64個より多くない細胞)の完全な溶解に十分であり、それはそれに続く単一コピー遺伝子の増幅および検出を可能にする。しかし、前記の期間が30分の期間まで、しかし好ましくは15分より長くない期間まで、最も好ましくは3分より長くない期間まで延長される場合も、本発明の範囲内である。前記の期間が少なくとも1分である場合、優秀な結果は得られた最低の条件である。
実施例により明示されるように、PCR反応はその溶解物を中間の精製工程なしで直接用いて実施することができる。しかし、態様次第で、前記のPCR反応に必要な追加の化合物がその溶解の後にその試料に添加される場合は、本発明の範囲内である。
−TaqMan加水分解プローブ形式:
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを2種類の構成要素で標識する。第1構成要素が適切な波長の光で励起された際に、吸収されたエネルギーが第2構成要素(いわゆるクエンチャー)に、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って移動する。そのPCR反応のアニーリング工程の間に、そのハイブリダイゼーションプローブが標的DNAに結合し、それに続く伸長段階の間にTaqポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、その励起された蛍光構成要素およびクエンチャーが空間的に互いから分離され、そうして第1構成要素の蛍光放射を測定することができる。TaqManプローブアッセイは、米国特許第5,210,015号、米国特許第5,538,848号、および米国特許第5,487,972号において詳細に開示されている。TaqManハイブリダイゼーションプローブおよび化合物の混合物は、米国特許第5,804,375号において開示されている。
これらのハイブリダイゼーションプローブも第1構成要素およびクエンチャーで標識されており、その標識は好ましくはそのプローブの両端に位置している。そのプローブの二次構造の結果として、両方の構成要素は溶液中で空間的に近くにある。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、両方の構成要素は、適切な波長の光による励起後にその第1構成要素の蛍光放射を測定することができるように、互いから分離される(米国特許第5,118,801号)。
FRETハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、全ての種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用である(Matthews, J.A., and Kricka, L.J., Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25)。それは、同時に用いられ、増幅された標的核酸の同じ鎖の隣接部位に相補的である2種類の一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両方のプローブは異なる蛍光構成要素で標識されている。適切な波長の光で励起された際に、第1構成要素は、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出する予定の標的分子の隣接する位置に結合した際に第2構成要素の蛍光放射を測定することができるように、吸収したエネルギーを蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って第2構成要素に移動させる。FRETアクセプター構成要素の蛍光の増大を監視する代わりに、FRETドナー構成要素の蛍光の減少をハイブリダイゼーション事象の定量的測定として監視することも可能である。
増幅産物が二本鎖核酸結合部分を用いて検出される場合に、リアルタイムPCRが本発明に従う添加物の存在下で実施される場合も、本発明の範囲内である。例えば、それぞれの増幅産物を本発明に従って蛍光DNA結合色素により検出することもでき、それは二本鎖核酸との相互作用の際に、適切な波長の光による励起後に、対応する蛍光シグナルを放射する。色素SybrGreenIおよびSybrGold(Molecular Probes)が当技術において頻繁に用いられる。別の特に有用な色素は、LightCycler 480 Resolight色素(Roche Applied Science カタログ番号:04 909 640 001)である。
SybrGreen形式でのリアルタイムアンプリコン検出は特異的な生成物とプライマー/ダイマーのような増幅アーティファクトを識別することができないという事実のため、通常それに続いて融解曲線分析が実施される。PCR反応の完了後、その試料の温度を恒常的に増大させ、SybrGreenがその試料中に存在する二本鎖DNAに結合している限り蛍光が検出される。その二本鎖DNAが解離すると、そのシグナルは即時に減少する。この減少を、一次微分係数値を決定することができるような適切な蛍光対温度−時間プロットを用いて監視し、それにおいて蛍光の減少の最大値が観察される。プライマー/ダイマー二本鎖DNAは通常短いため、一本鎖DNAへの解離は二本鎖の特異的な増幅産物の解離と比較してより低い温度で起こる。
そのPCR反応構成は、ホットスタート効果、すなわち、時々結果としてプライマーダイマーのような非特異的増幅産物の形成をもたらす周囲温度での非特異的なプライマーのアニーリングおよびそれに続く伸長の阻害を提供するいくつかの化合物を含有することができる。温度が上昇した際、そのホットスタート化合物があらゆる結合パートナーから遊離するため、この阻害が除去された状態になり、その結果その熱安定性DNAポリメラーゼが熱的に活性化された状態になり、特異的なポリメラーゼに触媒されるプライマー伸長が起こることができる。そのような化合物に関する多くの例が当技術において既知である。具体的な例が米国特許第5,338,671号において与えられており、それはホットスタート化合物としてのTaqポリメラーゼ抗体を開示している。そのようなホットスタート化合物に関するより最近の例が欧州特許第1 989 324 A号および欧州特許第2 163 556号において開示されている。
上記で開示したように、本発明に従う方法を実施するためにマイクロタイタープレートを用いることができる。この場合、そのマイクロタイタープレートのそれぞれの容器または反応ウェルは、既にその表面上に、その後でPCRに必要である試薬の乾燥組成物を含んでいてよい。そのマスター混合物の乾燥組成物は、工程b)における“PCR反応緩衝液”の添加により溶解される。この場合、その“PCR反応緩衝液”にはその乾燥組成物の一部である試薬は一切含まれない。
例えば、そのような乾燥組成物は一対の増幅プライマーを含んでいてよく、またはそれのみで構成されていてよい。マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルは同じ増幅プライマーの対を含んでいてよく、それにより多数の試料の並行分析が可能になり、または実質的にそれぞれのウェルは異なる増幅プライマーの対を含んでいてよく、それにより1種類もしくはごく少数の異なる試料の多パラメーター分析が可能になる。当然、そのプレートのレイアウトはその2つの概念を混合したものに従って、ならびに二重、三重または四重の分析のために設計することもできる。PCR増幅プライマーのような核酸の乾燥組成物を生成するための方法は当技術で周知であり、それには冷凍乾燥(freeze drying)、凍結乾燥(lyophyllization)または真空乾燥の方法が含まれるが、それらに限定されない。WO2008/36544は乾燥組成物を提供するためのいわゆる充填物質の使用を記述しており、前記の充填物質は例えば炭水化物、例えばFICOLL(商標)、スクロース、グルコース、トレハロース、メレチトース、DEXTRAN(商標)またはマンニトール、タンパク質、例えばBSA、ゼラチンまたはコラーゲン、およびポリマー、例えばPEGまたはポリビニルピロリドン(PVP)である。その生物学的物質を炭水化物ポリマー母材中で乾燥させるために、冷凍乾燥(米国特許第5,593,824号)または真空乾燥(米国特許第5,565,318号)が開示されている。
本発明は、リアルタイムPCR分析を実施するための新規のタイプのキットも提供する。そのキットは試薬構成要素および使い捨ての構成要素を含み、それは一緒に上記で開示した方法のいずれかのために用いることができ、特にそれに適合している。
選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのGAPDH遺伝子およびRPLI13A遺伝子の増幅のためのqPCR
定められた数のマウスハイブリドーマ細胞を、細胞選別機(Beckton Dickinson,FACS Aria I)を用いて96ウェルマイクロタイタープレートの別々のウェルの中に、その液体ビームが常にそのウェルの中心に向けられるような方式で沈着させた。しかし、細胞選別機の基礎をなす技術のため、その選別された粒子の小さい割合が無傷の細胞全体ではなく細胞破砕片であることを排除できなかった。従って、以下において、選別された物質の数を細胞相当数と呼ぶことにする。
1細胞相当数/縦列1〜4のウェル
2細胞相当数/縦列5〜6中のウェル
4細胞相当数/縦列7〜8中のウェル
8細胞相当数/縦列9中のウェル
16細胞相当数/縦列10中のウェル
32細胞相当数/縦列11中のウェル
64細胞相当数/縦列12中のウェル
それぞれのウェルに、以下:
0.4μM 順方向プライマー agcttgtcatcaacgggaag(SEQ ID NO:1)
0.4μM 逆方向プライマー tttgatgttagtggggtctcg(SEQ ID NO:2)
0.2μM UPLプローブ(RocheApplied Science カタログ番号:04 685 075 001,No.9)
1×LC480 Probe Master(Roche Applied Science カタログ番号:04 902 343 001)
を含有するマスター混合物を添加した。
別々のプレート上で、その同じマスター混合物を添加したが、プライマーおよびプローブはマウスゲノムの12コピーのみ存在する遺伝子RPLI13Aを増幅するように設計された。プライマーおよびプローブは以下の通りであった:
0.4μM 順方向プライマー catgaggtcgggtggaagta(SEQ ID NO:3)
0.4μM 逆方向プライマー gcctgtttccgtaacctcaa(SEQ ID NO:4)
0.2μM UPLプローブ(RocheApplied Science カタログ番号:04 686 993 001,No.25)
LightCycler Probe Masterは熱安定性FastStart DNAポリメラーゼを含み、それは化学修飾されたホットスタート酵素である。前記の修飾を高温での保温により除去することにより、活性化が誘導される。
前保温: 1× 95℃ 10’
変性 45× 95℃ 10’’
アニーリング 45× 60℃ 30’’
伸長 45× 72℃ 1’’
冷却温度変動速度 2.2℃/s
加熱温度変動速度 4.4℃/s
増幅シグナルの検出およびcp値の計算(低いcp値は高レベルの増幅を示す)を、製造業者の説明書の指示に従って実施した。
選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのKcnj2遺伝子の増幅のためのqPCR
その実験は本質的に実施例1に関して開示したように実施され、プライマーおよびプローブが単一コピーのマウス遺伝子Kcnj2を増幅するように設計されたという変更があった。プライマーおよびプローブは以下の通りであった:
順方向プライマー ctgtcttgccttcgtgctct(SEQ ID NO:5)
逆方向プライマー agcagggctatcaaccaaaa(SEQ ID NO:6)
UPLプローブ(RocheApplied Science カタログ番号:04 688 996 001,No.76)
以下の表は、分析した異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する:
乾燥試薬を含有するマイクロタイタープレートを用いる選別されたマウスハイブリドーマ細胞からのKcnj2遺伝子の増幅のためのqPCR
その実験は本質的に実施例2に関して開示したように実施され、以下の変更があった:
必要なプライマーおよびプローブを含有する10μlの溶液を、マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルの中に入れた。そのマイクロタイタープレートを、そのプライマーおよびプローブがそのマイクロタイタープレートのそれぞれの反応ウェルの表面上に乾燥するように、25℃および200mBarで12時間、続いて25℃および50mBarで4時間保温した。
1細胞相当数/縦列1〜6のウェル
2細胞相当数/縦列7中のウェル
4細胞相当数/縦列8中のウェル
8細胞相当数/縦列9中のウェル
16細胞相当数/縦列10中のウェル
32細胞相当数/縦列11中のウェル
64細胞相当数/縦列12中のウェル
20μlのマスター混合物を添加した後、リアルタイムPCR分析を実施した。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する:
実施例4
乾燥試薬を含有するマイクロタイタープレートを用いる単一のマウスハイブリドーマ細胞からのKcnj2遺伝子の増幅のためのqPCR
細胞相当物のどれだけ多くの割合が細胞破砕片ではなく実際に生細胞に対応するのかを分析するため、3×30の選別された相当物をそれぞれ顕微鏡スライド上に沈着させ、計数した。顕微鏡による目視検査により、それぞれ28、28および29個の細胞を確認することができた。これは、細胞相当物(選別事象)あたり94%の生細胞対6%の細胞破砕片に対応する。
ActB、およびB2Mおよび1の発現の検出のための1ステップRT−PCR
細胞を選別し、実施例1で開示したようにマイクロタイタープレート上に配置し、結果として2μl未満の試料量をもたらした。
横列1〜2:ActBの1ステップRT−PCR
0.4μM 順方向プライマー AAGGCCAACCGTGAAAAGAT(SEQ ID NO:7)
0.4μM 逆方向プライマー GTGGTACGACCAGAGGCATAC(SEQ ID NO:8)
0.2μM UPLプローブ(RocheApplied Science カタログ番号:56)
横列3〜4:B2Mの1ステップRT−PCR
0.4μM 順方向プライマー TACGCCTGCAGAGTTAAGCA(SEQ ID NO:9)
0.4μM 逆方向プライマー GGTTCAAATGAATCTTCAGAGCA(SEQ ID NO:10)
0.2μM UPLプローブ(RocheApplied Science カタログ番号:117)
横列5〜6:18s RNAの1ステップRT−PCR
0.4μM 順方向プライマー GCCGCTAGAGGTGAAATTCTT(SEQ ID NO:11)
0.4μM 逆方向プライマー CGTCTTCGAACCTCCGACT(SEQ ID NO:12)
0.2μM UPLプローブ(Roche Applied Science カタログ番号:93)
第1プレートにおいて、LC480リアルタイムPCR機器中で、以下の熱サイクルプロトコルに従って1ステップRT−PCRを実施した:
前保温: 1× 95℃ 30’’
変性 45× 95℃ 10’’
アニーリング 45× 60℃ 30’’
伸長 45× 72℃ 1’’
冷却温度変動速度 2.2℃/s
加熱温度変動速度 4.4℃/s
第2プレートにおいて、LC480リアルタイムPCR機器中で、61℃でのさらなる前保温工程を含む熱サイクルプロトコルに従って1ステップRT−PCRを実施した:
前保温: 1× 61℃ 3’
前保温: 1× 95℃ 30’’
変性 45× 95℃ 10’’
アニーリング 45× 60℃ 30’’
伸長 45× 72℃ 1’’
冷却温度変動速度 2.2℃/s
加熱温度変動速度 4.4℃/s
増幅シグナルの検出およびcp値の計算(低いcp値は高レベルの増幅を示す)を、製造業者の説明書の指示に従って実施した。
18s標的に対するDNA PCRおよび1ステップRT−PCRの間の比較
以下のピペット操作スキームに従って、細胞を実施例1で開示したように選別し、マイクロタイタープレート上に配置した:
番号1〜3の3個の同一のプレートに関して、RNAを1ステップRT−PCR反応で増幅するために、1×LC480 RNA Master加水分解プローブ(Roche Applied Science カタログ番号04 991 885 001、T.thポリメラーゼおよびホットスタートアプタマーを含有)を添加した。プライマーは、この反応の間にRNAおよびその対応するゲノムDNA断片の両方が増幅できるような方式で設計された。4番目のプレート(番号4)に関して、逆転写酵素活性を一切有しない熱安定性DNA依存性DNAポリメラーゼを含むReal Time ready DNA probes master(Roche Applied Science カタログ番号:05 502 381 001)を用いた。
0.4μM 順方向プライマー GCCGCTAGAGGTGAAATTCTT(SEQ ID NO:11)
0.4μM 逆方向プライマー CGTCTTCGAACCTCCGACT(SEQ ID NO:12)
0.2μM UPLプローブ(Roche Applied Science カタログ番号:93)
プレート1に関して、LC480リアルタイムPCR機器中で、以下の熱サイクルプロトコルに従って、61℃での前保温工程を含む1ステップRT−PCRを実施した:
前変性: 1× 95℃ 1’
前保温: 1× 61℃ 3’
前保温: 1× 95℃ 30’’
変性 45× 95℃ 10’’
アニーリング 45× 60℃ 30’’
伸長 45× 72℃ 1’’
冷却温度変動速度 2.2℃/s
加熱温度変動速度 4.4℃/s
プレート2および3に関して、61℃での前保温一切なしでRT−PCRを実施した:
前保温: 1× 95℃ 30’’(プレート2)または2’(プレート3)
変性 45× 95℃ 10’’
アニーリング 45× 60℃ 30’’
伸長 45× 72℃ 1’’
冷却温度変動速度 2.2℃/s
加熱温度変動速度 4.4℃/s
逆転写活性一切なしでPCRを実施するために、プレート3に関するプロトコルと同じプロトコルをプレート4に関して用いた。
測定されたcp値がDNAではなく実際にmRNAの発現の検出を反映していることを証明するため、続いてアンプリコンの正確な大きさをゲル電気泳動により確認した。以下の表は、分析された異なる細胞数に関して得られた平均cp値を開示する。
Claims (4)
- 単一コピーDNA標的核酸の増幅のための方法であって、以下の工程:
a)1個以上の生細胞を含む第1の量を有する液体試料を容器の中に移し、
b)前記の容器に第2の量を有するPCR反応緩衝液を添加し、
一方で前記の第2の量は前記の第1の量の少なくとも2倍の大きさであり、
c)前記の容器を少なくとも90℃で30秒間〜1分間保温し、
d)前記の標的を、中間の精製工程を実施せずに熱安定性DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅する;
を含み、工程a)〜d)が同じ容器内で実施されることを特徴とし、
前記の容器がマイクロタイタープレートのウェルであることを特徴とし、
前記のマイクロタイタープレートの前記の容器がPCR増幅プライマーの乾燥組成物を含み、前記の組成物が場合により少なくとも1種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは二本鎖DNA結合蛍光化合物のどちらかを含むことを特徴とし、
前記の工程a)の生細胞の数の、工程d)のポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が少なくとも1細胞/25μlである、
前記方法。 - 前記の乾燥組成物が追加で熱安定性DNAポリメラーゼおよびdNTPを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 工程a)の前に前記の少なくとも1個以上の生細胞を含む液体試料が細胞選別法により得られていることを特徴とする、請求項1又は2記載の方法。
- 前記の工程a)の生細胞の数の、工程d)のポリメラーゼ連鎖反応が実施される液体の量に対する比率が2細胞/μlより大きくない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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