JP4617403B2 - 配列の相違を検出する方法 - Google Patents

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Description

本出願は、参照により図面を含むその全体が本明細書に組み込まれる、２００２年６月２８日出願の米国特許仮出願第６０／３９２，３３１号に基づく優先権を主張する。
本発明は、個体の集団の配列と比較した、ある個体のゲノムにおける配列の相違を同定するための分子遺伝学的方法に関する。より詳しくは、本発明は、ゲノム配列内の１ヌクレオチド相違を同定するための方法に関する。
ある生物のゲノムを含む核酸は、その生物に関する遺伝情報を含んでいる。個体間の遺伝子配列の変動性は、多くの明白な表現型の相違（例えば毛髪、皮膚等の色素形成）および多くの非明白なもの（例えば薬剤耐性および疾患の易罹患性）を説明するものである。１塩基対置換を含むヌクレオチド配列における微小な変化でさえも、タンパク質の性質または量に対して顕著な影響を及ぼす。１ヌクレオチド変化は、一塩基多型または単にＳＮＰｓと称され、ＳＮＰが生じる部位を本明細書においては多型部位と称する。ＤＮＡ多型はゲノム全体を通じて遺伝子内および遺伝子間に存在し、種々の型が結果として異なる遺伝子機能をもたらす場合があり、あるいはもたらさない場合もある（同じ配列の２つの別個の型の機能を比較することにより決定される）。ほとんどの多型は遺伝子機能を変化させず、「中立」多型と称される。その他のものは、例えばタンパク質のアミノ酸配列を変化させることにより、あるいはプロモーターのような制御配列またはＲＮＡスプライシングまたは分解シグナルを変化させることにより、遺伝子機能に影響を及ぼし、より一般的には突然変異と称される。ＳＮＰｓに関連する疾患には、鎌状赤血球貧血症、β−サラセミア（地中海貧血症）、糖尿病、嚢胞性線維症、高リポタンパク質血症、広範な種類の自己免疫疾患、および一部の癌遺伝子、例えば突然変異体ｐ５３の形成が包まれる。疾患の状態を誘発したり影響を及ぼしたりすることに加えて、点突然変異は変化した病原性または疾患への易罹患性および治療に対する抵抗性をもたらしうる。
ＤＮＡ配列内における特定のヌクレオチドの変化または突然変異を検出する能力は、医療上または非医療上の目的の多くに有用である。ヌクレオチドの変化を同定することができる方法は、ＳＮＰｓに関わる疾患のスクリーニングおよび診断を可能にする。多型はまた、疾患に関与する遺伝子を同定するための遺伝子研究において有用である。疾患への易罹患性が増大するように１以上の遺伝子の機能を多型が変化させる場合、多型は、疾患を有さない個体と比較して疾患を有する個体において、より高頻度に存在することになる。統計学的方法を用いることにより、正常な集団と比較した場合に罹患した集団で観察される多型の頻度を評価することができ、多型と疾患の表現型との間の因果関係の確立を容易にすることができる。
疾患に相関する配列の変異を迅速に同定できる方法はまた、予防的手段を行う場合、疾患発症の確率を調べる場合、およびこのような疾患の予後を評価する場合において、価値あるものである。ＳＮＰｓの非医療上の適用には、例えば、微生物またはその特定の系統の検出および法医学的分析が含まれる。
ＳＮＰｓの有用性の中核をなすのは、既知のＳＮＰｓに関して個体の遺伝子型を決定する能力である。この問題に対して多くのアプローチがなされてきた。例えば、一部の多型は、偶然にも制限エンドヌクレアーゼの開裂部位において変化をもたらし、これにより、消化されたゲノムＤＮＡ試料を電気泳動で分離する場合に観察されるフラグメントのパターンを変化させる。これは、制限酵素断片長多型分析、即ちＲＦＬＰ分析の基礎となる。ＲＦＬＰ分析は、それが制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に影響する変化を検出するのみであるという点で限界があり、前記方法はゲル電気泳動および染色に依存しており、このことがスループットを制限している。
１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析もまた、増幅されたＤＮＡフラグメント内のＳＮＰｓを検出できる。この方法においては、増幅されたフラグメントを変性させ、次に非変性ポリアクリルアミドゲル中における電気泳動の間に再アニーリングさせる。１ヌクレオチド配列変化の存在は、野性型配列と比較した場合に、コンホーメーションおよび試料の電気泳動における移動性に検出可能な変化をもたらしうる。この方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に依存しているという点で限界がある。
ハイブリダイゼーションに基づく方法では、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを使用する（例えば欧州特許公開公報ＥＰ−２３７３６２号およびＥＰ−３２９３１１号参照）。ハイブリダイゼーションに基づく方法には、例えば、プローブＲＮＡ：試料ＤＮＡ２本鎖でのミスマッチにおけるリボヌクレアーゼＡ切断に基づく検出、またはプローブＤＮＡ：試料ＤＮＡ２本鎖におけるミスマッチについての変性勾配ゲル電気泳動が含まれる（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９−２３７，１９８８；Ｒｏｓｓｉｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３−１２７５６，１９９０において概説されている）。
他のＳＮＰｓ遺伝子タイピング方法は、対立遺伝子特異的増幅（例えば米国特許第５，５２１，３０１号；第５，６３９，６１１号；および第５，９８１，１７６号参照）、ミニ配列決定法（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法（例えばいわゆる「ＴａｑＭａｎアッセイ」；例えば、Ｇｅｌｆａｎｄの米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらの米国特許第５，５３８，８４８号、およびＨａａｌａｎｄの米国特許第５，８６３，７３６号、並びにＨｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｕ．Ｅ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｃｈ ６：９９５−１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０（１９９１）；およびＬｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３５７−３６２（１９９５））、および１ヌクレオチドプライマー伸長（ＳＮｕＰＥ）アッセイ（例えば米国特許第５，８４６，７１０号）および関連する伸長アッセイ（例えば米国特許第６，００４，７４４号；第５，８８８，８１９号；第５，８５６，０９２号；第５，７１０，０２８号および第６，０１３，４３１号）を使用する。当該技術分野において、改善されたＳＮＰ遺伝子タイピングアッセイが求められている。
大部分のＳＮＰ遺伝子タイピング方法は、分析のために十分な材料を産生させるため（例えばＳＳＣＰ分析）または相違点を検出できるように１つの型を他の型に優先して特異的に増幅させるため（例えばプライマー伸長アッセイ）のいずれかのために、ある時点においてＰＣＲ増幅に依存している。ＰＣＲに基づく方法のスループットを増大させるために、複数のＳＮＰｓを１つの反応セットにおいて検出できるように反応の重複化に重点を置いている。複数のＳＮＰ含有フラグメントに特異的なプライマー対を単に付加することによる重複化は、標的フラグメントの効率の悪い増幅および人工のフラグメントの生成をもたらすような、プライマーの相互作用により生じる問題に直面している。当該技術分野において、改善された重複ＳＮＰ遺伝子タイピング法が求められている。
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、ＳＮＰｓを調べるために使用されてきた。ある研究では、１ヌクレオチドポリメラーゼ伸長アッセイの結果を分析するためにＣＥが使用された（Ｐｉｇｇｅｅら、１９９７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ．７８１：３６７−３７５）。その研究においては、多型部位に直接に隣接するプライマーのハイブリダイゼーションおよび１個の蛍光標識連鎖ターミネーターによるプライマーの伸長、その後のＣＥ分離と取り込まれた標識の検出とにより、既知のＳＮＰを含むＰＣＲ増幅ＤＮＡを分析した。別の研究においては、既知のＳＮＰを含むＰＣＲ増幅ＤＮＡは、２つの同一に蛍光標識された連鎖ターミネーターの１つを用いて伸長させ、その後ＣＥ分離および取り込まれた標識の検出を行った。取り込まれたターミネーターの同一性は、オリゴヌクレオチドに関するＣＥ泳動の配列特異的な相違に基づいて決定される。ＭｃＣｌａｙら（２００２、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０１：２００−２０６）は、共通の上流プライマーを有し３’末端塩基において異なる２つの異なって蛍光標識されたプライマーのセットを用いたＰＣＲ、その後のＣＥおよび蛍光検出を含むＳＮＰ遺伝子タイピングアッセイを記載している。スループットは、異なるサイズの増幅産物を混合して共に電気泳動に付すことにより、増大した。
米国特許第６，０７４，８３１号は、グラフ理論技術に従ってサブセットに分配された分子の同時分離のためのＣＥの使用、およびＳＮＰ遺伝子タイピングへのこの方法の適用を教示している。
米国特許第６，３２２，９８０号は、多型部位にハイブリダイズされたプライマーから蛍光標識を放出させるためにポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を使用するＳＮＰ検出方法におけるＣＥの使用を記載している。米国特許第６，２７０，９７３号もまた、核酸プローブ脱重合活性を含むＳＮＰ遺伝子タイピング方法におけるＣＥ分離の使用を記載している。
米国特許第６，３１２，８９３号は、タグが特定のヌクレオチドに相関する、有機的にタグ付加されたフラグメントを生成させる配列決定法を記載している。フラグメントはＣＥにより分離し、次にフラグメントからタグを切断し、切断されたタグを非蛍光スペクトル分析または電位差測定法により検出する。
米国特許第６，１５６，１７８号は、多型部位にハイブリダイズされたプライマーから識別ヌクレオチドを放出させる脱重合活性を用いるＳＮＰ検出方法におけるＣＥの使用を記載している。
上記した方法のいずれも、プライマー伸長または増幅の工程のいずれかにおける核酸配列タグ、伸長および増幅のための異なるプライマー、共通の増幅プライマーセット、またはリアルタイムの増幅のモニタリングおよび検出を使用していない。
発明の概要
本発明は、配列の相違に関して核酸試料を遺伝子タイピングするために有用な方法を提供する。好ましい態様においては、前記方法は、１ヌクレオチド相違、例えば一塩基多型の決定のために有用である。本発明の方法では、非相同配列タグを含むプライマー伸長産物のＰＣＲ増幅、その後のキャピラリー電気泳動によるサイズ分離および増幅伸長産物の検出が使用される。１つの態様において、サイズ分離および産物の検出はリアルタイムで行われる。ＣＥ分離および検出手法が増幅されたフラグメントのサイズおよびいずれかの所定の増幅産物上に存在する標識の同一性を含む情報を提供するため、開示した方法は、複数の既知のＳＮＰｓに関する遺伝子型について試料を同時に分析するために特に適している。各々の既知のＳＮＰは、その多型部位において特定のヌクレオチドの存在に特異的に相関する識別可能に標識された配列タグを持つ別個のサイズの増幅フラグメントを増幅させることにより検出できる。本発明の方法はまた、複数のＳＮＰｓを検出するために増幅プライマー１セットを必要とし、それによって、複数の異なる増幅プライマーの使用に関連する問題の影響を低減することができるという利点を有している。
本発明は、所定の核酸試料に関して、既知の多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法であって、前記方法が下記工程：ａ）核酸試料から生成したプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すこと、ここで、各プライマー伸長産物はタグ配列を含み、そのタグ配列は既知の多型部位において１つの特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応するものであり、ここで、増幅処理は上流増幅プライマーおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、下流増幅プライマーセットの各メンバーはプライマー伸長産物の集団のメンバーおよび識別可能な標識を構成するタグ配列を含み、ここで、各識別可能な標識は多型部位において特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応するものである；およびｂ）核酸分子への識別可能な標識の取り込みを検出し、それによって多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること；を含む、前記方法を包含する。
１つの実施形態において、識別可能な標識は蛍光標識である。
別の実施形態において、工程（ｂ）は、増幅処理中に作成される核酸分子をサイズおよび／または電荷により分離することを含む。好ましい実施形態において、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
別の実施形態において、増幅処理は増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、ここで各サイクルは、１）核酸鎖の分離；２）オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および３）アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長、の工程を含む。好ましい実施形態において、前記方法は、増幅処理の間および反応サイクルの少なくとも１回の後に、増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離する工程、および識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、検出により多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される。更に好ましい実施形態において、除去、分離、および検出は、処理の各サイクルの後に実施される。別の好ましい実施形態において、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
別の実施形態において、工程（ａ）および（ｂ）は、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される。
別の実施形態において、タグ配列は１５〜４０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、識別可能に標識された下流増幅プライマーのセットは、多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマー；多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマー；多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマー；および多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマーからなる。
別の実施形態において、識別可能に標識された下流増幅プライマーのセットは１対のオリゴヌクレオチドからなり、その１つは多型部位の第１の対立遺伝子に特異的に対応するタグ配列を含み、もう１つは多型部位の第２の対立遺伝子に特異的に対応するタグ配列を含む。
別の実施形態は、工程（ａ）の前に、プライマー伸長産物の集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを除去する工程を更に含む。更に好ましい実施形態においては、プライマー除去の工程は、プライマー伸長産物の集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを分解することを含む。更に好ましい実施形態においては、分解は熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる。更に好ましい実施形態においては、熱不安定性エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩからなる群より選択される。更に好ましい実施形態においては、工程（ａ）に続く前に、熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する。
本発明は更に、所定の核酸試料に関して精査すべき既知の多型部位のセットにおけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法であって、前記方法が下記工程：ａ）核酸試料から生成したプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すこと、ここで、各プライマー伸長産物はタグ配列のセットのメンバーを含み、そのタグ配列は既知の多型部位における１個の特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応するものであり、ここで、増幅処理は精査すべき既知の多型部位を含む各配列についての上流増幅プライマー１つおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、下流増幅プライマーセットの各メンバーはプライマー伸長産物の集団のメンバーおよび多型部位において特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応する識別可能な標識を構成するタグ配列を含み、ここで上流増幅プライマーは、精査すべき既知の多型部位のセットの各多型部位が別個のサイズを有する増幅産物に対応するように選択される；およびｂ）別個のサイズを有する増幅産物中の識別可能な標識の取り込みを検出し、それによって各多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること；を含む、前記方法を包含する。
１つの実施形態において、識別可能な標識は蛍光標識である。
別の実施形態において、工程（ｂ）は、増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび／または電荷により分離することを含む。好ましい実施形態において、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
１つの実施形態において、増幅処理は増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、ここで各サイクルは、１）核酸鎖の分離；２）オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および３）アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長、の工程を含む。
好ましい実施形態は、増幅処理の間および反応サイクルの少なくとも１回の後に、増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離する工程、および識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、検出により多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される。更に好ましい実施形態においては、除去、分離、および検出は、処理の各サイクルの後に実施される。更に好ましい実施形態においては、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
別の実施形態において、工程（ａ）および（ｂ）は、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される。
別の実施形態において、タグ配列は１５〜４０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、識別可能に標識された下流増幅プライマーのセットは、多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；および多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる。
別の実施形態は、工程（ａ）の前に、プライマー伸長産物の集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを除去する工程を更に含む。好ましい実施形態においては、プライマー除去の工程は、プライマー伸長産物の集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを分解することを含む。更に好ましい実施形態においては、分解は熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる。更に好ましい実施形態においては、熱不安定性エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩからなる群より選択される。更に好ましい実施形態においては、工程（ａ）に続く前に、熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する。
本発明は更に、所定の核酸試料に関して精査すべき既知の多型部位のセットにおけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法であって、前記方法が下記工程：ａ）核酸試料から生成したプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すこと、ここで、各プライマー伸長産物は第１のタグ配列またはその相補体、および第２のタグ配列またはその相補体のセットのメンバーを含み、その第２のタグ配列またはその相補体の存在は既知の多型部位における１個の特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応し、ここで、多型部位のセットにおける各多型部位について、第１のタグ配列は、他の多型部位を含む試料中の分子上の多型部位からの第１タグ配列の距離と比較して、多型部位の５’側に異なる距離で位置しており、ここで、増幅処理は第１のタグ配列を含む上流増幅プライマーおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、下流増幅プライマーセットの各メンバーは、プライマー伸長産物の集団のメンバーおよび多型部位における特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応する識別可能な標識を構成するタグ配列を含み、ここで上流増幅プライマーは、精査すべき既知の多型部位のセットの各多型部位が別個のサイズを有する増幅産物に対応するように選択される；およびｂ）別個のサイズを有する増幅産物中の識別可能な標識の取り込みを検出し、それによって各多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること；を含む、前記方法を包含する。
１つの実施形態において、識別可能な標識は蛍光標識である。
別の実施形態において、工程（ｂ）は、増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび／または電荷により分離することを含む。好ましい実施形態において、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
別の実施形態において、増幅処理は増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、ここで各サイクルは、１）核酸鎖の分離；２）オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および３）アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長、の工程を含む。好ましい実施形態は、増幅処理の間および反応サイクルの少なくとも１回の後に、増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離する工程、および識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、検出により多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される。更に好ましい実施形態においては、除去、分離、および検出は、処理の各サイクルの後に実施される。更に好ましい実施形態においては、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
別の実施形態において、工程（ａ）および（ｂ）は、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される。
別の実施形態において、タグ配列は１５〜４０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、識別可能に標識された下流増幅プライマーのセットは、多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；および多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる。
別の実施形態は、工程（ａ）の前に、プライマー伸長産物の集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを除去する工程を更に含む。好ましい実施形態において、プライマー除去の工程は、プライマー伸長産物の集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを分解することを含む。更に好ましい実施形態において、分解は熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる。更に好ましい実施形態においては、熱不安定性エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩからなる群より選択される。更に好ましい実施形態においては、工程（ａ）に続く前に、熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する。
本発明は更に、既知の多型部位における１ヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、前記方法が下記工程：Ｉ）多型部位を含む核酸試料を供給すること；ＩＩ）核酸試料の鎖を分離すること、および下記：ａ）既知の多型部位の上流で既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする３’領域を含む第１オリゴヌクレオチドプライマー、ここで第１オリゴヌクレオチドプライマーは３’領域の５’側に位置する第１配列タグを含む；およびｂ）第２オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ここでセットの各メンバーは下記：ｉ）多型部位の３’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする領域；ｉｉ）可変の３’末端ヌクレオチド、ここでメンバーが既知の配列にハイブリダイゼーションする場合には３’末端ヌクレオチドは多型部位と対向し、３’末端ヌクレオチドが多型部位のヌクレオチドに相補的である場合およびその場合に限って３’末端ヌクレオチド塩基が多型部位のヌクレオチドと対になる；およびｉｉｉ）（ｉｉ）の可変３’末端ヌクレオチドに対応するタグ配列、ここでタグ配列はメンバー上の（ｉ）の領域の５’側に位置する；を含む；の存在下において再アニーリングすること；ＩＩＩ）工程（ＩＩ）から得られたアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、伸長産物が生成するようにアニーリングされたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下において、核酸ポリメラーゼと接触させること、ここで、第１オリゴヌクレオチドプライマーから得られたプライマー伸長産物は、その相補体から分離される場合に、第２オリゴヌクレオチドプライマーのセットのメンバーの伸長産物を合成するための鋳型として働きうるものであり、およびその逆も成立する；ＩＶ）第１オリゴヌクレオチドと同一であるかまたはこれに相補的である配列およびオリゴヌクレオチドの第２のセットのメンバーの１つと同一であるかまたはこれに相補的である配列の両方を含む核酸分子の集団が生成するように、鎖の分離および接触の工程（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を２回反復すること；Ｖ）工程（ＩＶ）で生成した集団を、アニーリングしていないオリゴヌクレオチドプライマーの分解を可能にする条件下において、プライマーが分解されるように、熱不安定性エキソヌクレアーゼと接触させること；ＶＩ）熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化すること；ＶＩＩ）核酸分子の集団を増幅処理に付すこと、ここで増幅処理は、第１オリゴヌクレオチドプライマーを構成する第１配列タグを含む上流増幅プライマー、および下流増幅プライマーのセットを用いて実施され、下流増幅プライマーのセットの各メンバーは、第２オリゴヌクレオチドプライマーのセットのメンバー、および識別可能な標識を構成するタグを含む；およびＶＩＩＩ）識別可能な標識の少なくとも１個の取り込みを検出し、それによって既知の多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること；を含む、前記方法を包含する。
１つの実施形態において、識別可能な標識は蛍光標識である。
別の実施形態において、工程（ＶＩＩＩ）は、増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび／または電荷により分離することを含む。好ましい実施形態において、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
別の実施形態において、増幅処理は増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、ここで各サイクルは、１）核酸鎖の分離；２）オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および３）アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長、の工程を含む。好ましい実施形態は、増幅処理の間および反応サイクルの少なくとも１回の後に、増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離する工程、および識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで検出により、多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される。別の好ましい実施形態においては、除去、分離、および検出は、処理の各サイクルの後に実施される。
別の実施形態において、工程Ｉ〜ＶＩＩＩは、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される。
別の実施形態において、タグ配列はそれぞれ、１５〜４０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、既知の多型部位の上流の既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする３’領域は、１０〜３０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、多型部位の３’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする領域は、１０〜３０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、下流増幅プライマーのセットは、多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；および多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる。
本発明は更に、既知の多型部位の群に存在する１ヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、前記方法が下記工程：Ｉ）多型部位の群を含む核酸試料を供給すること；ＩＩ）核酸試料の鎖を分離すること、および下記：ａ）既知の多型部位の上流で既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする３’領域をそれぞれが含む第１オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ここで第１オリゴヌクレオチドプライマーのセットの各メンバーは３’領域の５’側に位置する共通の配列タグを含み、第１オリゴヌクレオチドプライマーのセットの各メンバーは、別個のサイズを有する増幅産物が既知の多型部位の群において各多型部位について生成するように選択される；およびｂ）下流増幅プライマーのセットであって、５’から３’の方向に、下記：ｉ）プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＧに特異的に対応するタグ；プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＡに特異的に対応するタグ；プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＴに特異的に対応するタグ；およびプライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＣに特異的に対応するタグからなる群より選択される配列タグ；ｉｉ）多型部位の群における多型部位に隣接しておよびその３’側にある配列に特異的にハイブリダイゼーションする領域、ここで下流増幅プライマーセットは、多型部位の群における各多型部位について多型部位に隣接して特異的にハイブリダイゼーションする領域を含む；およびｉｉｉ）Ｇ、Ａ、ＴまたはＣから選択される３’末端ヌクレオチド、ここで末端ヌクレオチドはその下流増幅プライマー上の（ｉ）に記載した配列タグに特異的に対応し、ここで、下流増幅プライマーが多型部位に隣接しておよび３’側にある配列にハイブリダイゼーションする場合に、３’末端ヌクレオチドは多型部位に対向する；を含む；の存在下において再アニーリングすること；ＩＩＩ）工程（ＩＩ）から得られたアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、伸長産物が生成するようにアニーリングされたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下において、核酸ポリメラーゼと接触させること、ここで、第１オリゴヌクレオチドプライマーから得られたプライマー伸長産物は、その相補体から分離される場合に、第２オリゴヌクレオチドプライマーのセットのメンバーの伸長産物を合成するための鋳型として働きうるものであり、およびその逆も成立する；ＩＶ）第１オリゴヌクレオチドと同一であるかまたはこれに相補的である配列および下流増幅プライマーセットのメンバーと同一であるかまたはこれに相補的である配列の両方を含む核酸分子の集団を含む反応混合物が生成するように、鎖の分離および接触の工程（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を２回反復すること；Ｖ）工程（ＩＶ）で生成した集団を、アニーリングしていないオリゴヌクレオチドプライマーの分解を可能にする条件下で、アニーリングしていないプライマーが分解されるように、熱不安定性エキソヌクレアーゼと接触させること；ＶＩ）熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化すること；ＶＩＩ）核酸分子の集団を増幅処理に付すこと、ここで増幅処理は、第１オリゴヌクレオチドプライマーを構成する共通の配列タグを含む上流増幅プライマー、および下流増幅プライマーのセットを用いて実施され、下流増幅プライマーセットの各メンバーは、第２オリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバー、および識別可能な標識を構成するタグを含む；およびＶＩＩＩ）識別可能な標識の少なくとも１個の取り込みを検出し、それによって既知の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定すること；を含む、前記方法を包含する。
１つの実施形態において、識別可能な標識は蛍光標識である。
１つの実施形態において、工程（ＶＩＩＩ）は、増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび／または電荷により分離することを含む。好ましい実施形態においては、分離はキャピラリー電気泳動を含む。
別の実施形態においては、増幅処理は増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、ここで各サイクルは、１）核酸鎖の分離；２）オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および３）アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長、の工程を含む。好ましい実施形態においては、増幅処理の間および反応サイクルの少なくとも１回の後に、増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離する工程、および識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで検出により、多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される。更に好ましい実施形態においては、除去、分離、および検出は、処理の各サイクルの後に実施される。
別の実施形態において、工程Ｉ〜ＶＩＩＩは、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される。
別の実施形態において、タグ配列は１５〜４０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、既知の多型部位の上流の既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする３’領域は、１０〜３０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、多型部位の３’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする領域は、１０〜３０個のヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、識別可能に標識された下流増幅プライマーのセットは、多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット；および多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる。
本発明は更に、核酸試料上に存在する多型部位において存在するヌクレオチドの決定のためのキットであって、前記キットが、下記：ａ）５’タグ配列、および既知の多型部位の上流の既知の距離において特異的にハイブリダイゼーションするために十分な３’配列を含む第１プライマー；を含む上流プライマーセット；およびｂ）５’から３’の方向に、下記：ｉ）プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＧに特異的に対応するタグ；プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＡに特異的に対応するタグ；プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＴに特異的に対応するタグ；およびプライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＣに特異的に対応するタグからなる群より選択される配列タグ；ｉｉ）多型部位の群における多型部位に隣接しておよびその３’側にある配列に特異的にハイブリダイゼーションする領域、ここで下流増幅プライマーセットは、多型部位の群における各多型部位について多型部位に隣接して特異的にハイブリダイゼーションする領域を含むプライマーのサブセットを含む；およびｉｉｉ）Ｇ、Ａ、ＴまたはＣから選択される３’末端ヌクレオチド、ここで末端ヌクレオチドは、その下流増幅プライマー上の（ｉ）に記載した配列タグに特異的に対応し、ここで、下流増幅プライマーが多型部位に隣接しておよび３’側にある配列にハイブリダイゼーションする場合に、３’末端ヌクレオチドは多型部位に対向する；を含む下流の第２プライマー４個のセット；を含む前記キットを包含する。
１つの実施形態は、多型について調べる生物のゲノム内の遺伝子に特異的な配列を欠いた５個のプライマーのセットを更に含み、前記プライマーは、第１プライマーのタグ配列を含むプライマーと、下流の第２プライマー４個のセットのタグ配列を含む識別可能に標識されたプライマー４個のセットとを含む。
本明細書において「試料」という用語は、その自然環境から単離され、ポリヌクレオチドを含む生体材料を指す。本発明に記載の「試料」とは、精製または単離されたポリヌクレオチドからなるか、あるいは、それは、ポリヌクレオチドを含有する組織試料、生物学的液体試料または細胞試料であってよい。生物学的液体には、血液、血漿、喀痰、尿、脳脊髄液、洗浄液および白血球搬出試料が包含される。本発明の試料は、ポリヌクレオチドを含有するいずれの植物、動物、細菌またはウイルスからの材料であってよい。
本明細書において「多型」という用語は核酸配列の変化を指す。天然の配列と比較した場合に、多型は、集団において０．０１％、０．１％、１％またはそれより高い頻度で存在しうる。本明細書においては、多型は、挿入、欠失、重複または再配列でありうる。本明細書において、「一塩基多型」あるいは「ＳＮＰ」とは、１ヌクレオチドの欠失、挿入または塩基の変化を含む、１ヌクレオチド残基における核酸配列の変化を指す。ＳＮＰを含む多型は、表現型として中立でありうるか、または、その遺伝子座における優勢な配列により示されるものとは異なる、関連する変異体の表現型を有することができる。本明細書において「中立な多型」とは、配列の変化が遺伝子の機能を変化させない多型を指し、「突然変異」または「機能的多型」とは、遺伝子の機能を変化させ、従って関連する表現型を有する、配列の変化を指す。
ＳＮＰに関して個体の遺伝子型を説明する場合に、「優勢な対立遺伝子」とは、試験される集団内において最も頻繁に存在するものである（即ち、２つの対立遺伝子が存在する場合、集団の５０％より多くに存在する対立遺伝子は優勢な対立遺伝子であり；２つより多くの対立遺伝子が存在する場合、「優勢な対立遺伝子」とは、最も高い頻度、例えばその部位における他の対立遺伝子と比較して少なくとも５％高い頻度で、対象となる集団に存在するものである。）。「変異体の対立遺伝子」という用語は、その集団において優勢な対立遺伝子よりも低い頻度で存在する対立遺伝子（単数または複数）を指すのに用いられる（例えば、２つの対立遺伝子が存在する場合、変異体の対立遺伝子とは、対象となる集団の５０％未満において存在するものであり；２つより多くの対立遺伝子が存在する場合、変異体の対立遺伝子は、より低い頻度で、例えば優勢な対立遺伝子よりも少なくとも５％低い頻度で存在するもののすべてである。）。
本明細書において「多型部位」という用語は、個体間で変動するヌクレオチドの、多型ヌクレオチド配列における、位置を指す。
本明細書において「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型にアニーリングし、ポリヌクレオチド鋳型に相補的な伸長産物を産生するための３’末端を提供することができる、ポリヌクレオチド分子（即ちＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。開始と伸長の条件は、通常、適当な緩衝液（「緩衝液」は、コファクターであるか、またはｐＨ、イオン強度等に影響を及ぼす置換体を包含する）中、適当な温度において、４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合誘導剤の存在を包含する。本発明のプライマーは、１本鎖または２本鎖であってよい。プライマーは増幅の最大効率のためには１本鎖であり、プライマーおよびその相補体は２本鎖のポリヌクレオチドを形成する。本発明において有用な「プライマー」は、１００ヌクレオチド長以下、例えば９０もしくは８０もしくは７０もしくは６０もしくは５０もしくは４０もしくは３０もしくは２０もしくは１５以下、または１０ヌクレオチド長である。
本明細書において「ポリメラーゼ伸長」という用語は、アニーリングされたプライマーの３’末端上への、核酸ポリメラーゼによる少なくとも１個の相補ヌクレオチドの鋳型依存的取り込みを意味する。ポリメラーゼ伸長により、好ましくは１個より多くのヌクレオチド、好ましくは鋳型の完全長に対応するヌクレオチドまでおよびそれらのヌクレオチドを含むものが付加される。ポリメラーゼ伸長のための条件は、ポリメラーゼの性質により変動する。ポリメラーゼ伸長の温度は、酵素の既知の活性特性に基づく。一般的に、酵素はその至適伸長温度以下においても少なくとも部分的な活性を保持するが、最も一般的に使用されている熱安定性ポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼおよびその変異体）によるポリメラーゼ伸長は、６５℃〜７５℃、好ましくは約６８〜７２℃で行う。
本明細書において「プライマー伸長産物」という用語は、ポリメラーゼ伸長の過程により生成する核酸分子を指す。
本明細書において「タグ配列」または単に「タグ」という用語は、ヌクレオチド配列、好ましくは非相同または人工のヌクレオチド配列であり、これは標準的なリン酸ジエスエル結合（即ち、タグの３’ＯＨとオリゴヌクレオチドの５’リン酸との間のリン酸ジエステル結合）を介してオリゴヌクレオチドプライマーに結合し、そして、「タグ」が取り込まれる（例えばプライマー伸長またはプライマー伸長産物の増幅により取り込まれる）ポリヌクレオチドの同定および追跡を可能にする。本発明に記載の「タグ」配列とは、少なくとも１５、好ましくは２０〜３０のヌクレオチドを含み、そして好ましくは、遺伝子タイピングされる生物のゲノム内の配列に、プライマー伸長条件下ではハイブリダイズしないものである。本発明のタグ配列は、必然的ではないが、ランダムであることができる。
本明細書において「特異的に対応する」という用語は、タグ配列の存在が所定の３’末端ヌクレオチドの存在を示すように、オリゴヌクレオチド上の所定の核酸タグ配列がその３’末端ヌクレオチドと共にのみ使用されることを意味する。例えば、タグ配列「１」は３’末端Ａを有するオリゴヌクレオチド上でのみ使用され、タグ配列「２」は３’末端Ｃを有するオリゴヌクレオチド上でのみ使用され、タグ配列「３」は３’末端Ｇを有するオリゴヌクレオチド上でのみ使用され、タグ配列「４」は３’末端Ｔを有するオリゴヌクレオチド上でのみ使用される。したがって、本発明の方法においては、フラグメントがタグ２に特異的なプライマーを用いて増幅される場合には、元のプライマー伸長プライマーの３’末端ヌクレオチドはＣであり、従って、多型ヌクレオチドはその試料においてＧであることがわかる。
本明細書において「増幅処理」という用語は、対象となる核酸配列を特異的に増幅、即ち対象となる核酸配列の量を増大させる過程を指す。本発明の増幅処理は、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上の反復サイクルを含んでおり、ここで各サイクルは、１）鎖の分離（例えば熱変性）；２）鋳型分子へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および３）アニーリングされたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長の工程を含む。これらの工程の各々について必要な条件および時間は、当該技術分野でよく知られている。増幅処理を用いて達成される増幅は、好ましくは指数関数的であるが、直線的であってもよい。本発明の増幅処理は、好ましくは熱サイクル装置において行われ、その多くは市販されている。
本明細書において「セット」という用語は、核酸試料、プライマーまたは他の物（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の群を意味する。セットは、既知の数の、少なくとも２個のこのような物を含む。
本明細書において「サブセット」という用語は、本明細書に定義するセットを構成する群を意味し、ここでサブセットの群はセットの各メンバーより小さい。本明細書においてサブセットは１つの物からなりうる。
本明細書において「上流」および「下流」という相対的な用語は、多型部位に対するポリヌクレオチド上の位置を指すために使用される。一般的に、「上流」とは多型部位の５’側を指し、「下流」とは多型部位の３’側を指す。２本鎖ＤＮＡ配列における「上流」および「下流」の選択は広く任意のものであり、即ち、いずれかの鎖に着目して選択することができ、どの鎖を「比較対照」鎖として選択するかにより、多型部位の「上流」または「下流」となる方向は変化する。不明瞭さを回避するために、所定の方法を説明する場合に本明細書においては、「上流」および「下流」の用語の選択のための「比較対照」鎖は、前記方法の全体を通じて同じままであるものとする。
本明細書において「識別可能に標識された」という用語は、１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーまたはそれが組み込まれる核酸分子からのシグナルが、他のこのように標識されたプライマーまたは核酸分子からのシグナルとは識別できることを意味する。検出可能な標識は、例えば光吸収性染料、蛍光染料または放射性標識を含む。蛍光染料が好ましい。一般的に、蛍光シグナルは、ピーク発光波長が少なくとも２０ｎｍ離れていれば、別の蛍光シグナルと識別することができる。特に、所定の反応におけるフルオロフォアの発光ピークが幅の狭いピークまたはより急激なピークではなく幅の広いピークである場合には、より大きいピーク分離が好ましい。
本明細書において「核酸分子を分離する」という用語は、サイズおよび／または電荷に基づいて試料またはその一部分における核酸分子を物理的に分離する過程を指す。電気泳動による分離が好ましく、キャピラリー電気泳動による分離が最も好ましい。
本明細書において「取り込みを検出する」という用語は、所定の標識されたオリゴヌクレオチドプライマーが伸長され、これにより標識をプライマー伸長または増幅産物内に取り込んだかどうかを調べる過程を指す。検出は、検出可能な標識に適合するいかなる手段によることもできるが、好ましくは蛍光標識の検出を含む。検出には、プライマー伸長または増幅産物における標識の存在および量の両方を決定することを包含する。蛍光検出器は当該技術分野でよく知られている。
本明細書において「特異的にハイブリダイゼーションする」という用語は、所定のハイブリダイゼーション条件下において、プローブまたはプライマーが標的配列を含む試料中の標的配列にのみハイブリダイゼーションすることを意味する。所定のハイブリダイゼーション条件には、増幅処理におけるアニーリング工程の条件、即ち、予測されるＴｍに基づいて選択されるアニーリング温度、および選択されたポリメラーゼ酵素に適する塩の条件が含まれる。
本明細書において「鎖の分離」または「鎖を分離する」という用語は、相補的な２本鎖分子がオリゴヌクレオチドプライマーへのアニーリングに使用できる２本の１本鎖に分離されるような核酸試料の処理を意味する。本発明に記載の鎖の分離は、核酸試料をそのＴｍより高温に加熱することにより達成される。一般的に、核酸ポリメラーゼに適する緩衝液中に核酸分子を含有する試料については、９４℃に加熱すれば、本発明の鎖の分離を達成するために十分である。例示的な緩衝液は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８、２５℃）、０．５〜３ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．１％ ＢＳＡを含む。
本明細書において「プライマーアニーリング」または「再アニーリング」という用語は、オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型核酸鎖にハイブリダイズさせることを意味する。プライマーアニーリングの条件はプライマーの長さおよび配列により異なり、そのプライマーについて計算されたＴｍに基づくものである。一般的に、増幅処理におけるアニーリング工程では、鎖の分離工程後の温度を、そのようなアニーリングが可能となるのに十分な時間に渡って、プライマー配列に関して計算されたＴｍに基づく温度まで低下させる。Ｔｍは、広く入手できる多数のアルゴリズムのいずれかを用いて、当業者が容易に予測できる（例えば、Ｏｌｉｇｏ（商標）、インターネットで入手できるプライマーデザインおよびプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）。大部分の増幅処理については、アニーリング温度は予測されるＴｍよりも約５℃低くなるように選択されるが、Ｔｍにより近いかまたはそれを超える温度（例えば、予測されるＴｍより１℃〜５℃低温、または予測されるＴｍより１℃〜５℃高温）も使用することができ、および予測されるＴｍより５℃を超えて低温または高温である温度（例えば６℃低温、８℃低温、１０℃低温またはそれより低温、および６℃高温、８℃高温または１０℃高温）も使用できる。一般的に、アニーリング温度がＴｍに近いほど、アニーリングはより特異的なものとなる。プライマーアニーリングの時間は、大部分は反応の容量に依存しており、より大容量であればより長時間を要するが、プライマーおよび鋳型の濃度にも依存しており、鋳型に対するプライマーの相対濃度が高濃度であるほど、低濃度の場合よりも必要時間は短い。容量および相対的なプライマー／鋳型の濃度に応じて、増幅処理におけるプライマーアニーリング工程は１秒〜５分のオーダーで行うことができるが、一般的には１０秒〜２分、好ましくは３０秒〜２分のオーダーである。
本明細書において「既知の多型部位の上流の既知の距離において配列にハイブリダイゼーションする３’領域」という用語は、核酸の試料中の遺伝子タイピングすべき既知の多型部位の上流（即ち５’側）の配列に特異的にハイブリダイゼーションする、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置するヌクレオチドの配列を意味する。「ハイブリダイゼーションする３’領域」とは、少なくとも１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５、１８、２１、２４、２７、３０ヌクレオチド長以上である。「ハイブリダイゼーションする領域」とは、本発明の方法により他の増幅産物と比較して別個のサイズを有する増幅産物をもたらすように、多型部位から既知の距離にあるように選択される。「既知の距離」とは、５０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは５０〜５００ヌクレオチド、または５０〜２５０ヌクレオチドである。
本明細書において「多型部位の３’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする領域」とは、領域の最後から２番目の３’ヌクレオチドが多型部位の１ヌクレオチド下流でハイブリダイゼーションするように、多型部位の３’側に特異的にハイブリダイゼーションする、一般的には１０〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列である。本発明はこのような領域を含むプライマー４種のセットを使用しており、そのセットは４種の異なる３’末端ヌクレオチドＧ、Ａ、ＴまたはＣを有するオリゴヌクレオチドから構成され、そのうちの１つのみが多型部位においてヌクレオチドにハイブリダイズし、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長を可能にする。
本明細書において「可変３’末端ヌクレオチド」という用語は、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣのいずれであってもよいオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを指す。
本明細書において「多型部位に対向」という用語は、あるヌクレオチド、即ち多型を含有する核酸鎖にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプライマー上の３’末端ヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドが多型部位のヌクレオチドに相補的である場合に、それが多型の位置におけるヌクレオチドとワトソンクリック型の水素結合塩基対を形成するように位置づけられることを意味する。
本明細書において「相補的」という用語は、ＡがＴと対になり、ＧがＣと対になるような、４種のデオキシリボヌクレオチドＧ、Ａ、ＴおよびＣの間における水素結合塩基対形成の選択性の序列を指す。
本明細書において「核酸ポリメラーゼ」という用語は、ヌクレオシド三リン酸の鋳型依存性の重合を触媒して、鋳型核酸配列の核酸鎖の１つに相補的であるプライマー伸長産物を形成する酵素を指す。核酸ポリメラーゼ酵素は、アニーリングされたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型の５’末端方向に向かって進行する。多くの核酸ポリメラーゼが当該技術分野で知られており、市販されている。好ましい核酸ポリメラーゼの１つの群は熱安定性であり、即ちそれらは、相補的な核酸のアニーリングされた鎖を変性させるのに十分な温度に付された後でも機能を保持している。
本明細書において「一部分（ａｌｉｑｕｏｔ）」という用語は、サイクル処理の間に回収される増幅反応の試料を指す。一部分は反応の総容量より少量であり、好ましくは０．１〜３０％の容量である。本発明の１つの実施形態においては、除去した各一部分について、反応に必要な試薬（例えば緩衝剤、塩、ヌクレオチドおよびポリメラーゼ酵素）を含有する反応緩衝液を等量ずつ加える。
本明細書において「伸長産物が生成するように、アニーリングされたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件」という用語は、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する条件となる、例えば温度、塩およびコファクターの濃度、ｐＨ並びに酵素濃度を含む条件のセットを指す。このような条件は、使用される核酸ポリメラーゼの性質により変動するが、有用な多数のポリメラーゼ酵素についての条件は当業者によく知られている。条件のセットの一例は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８、２５℃）、０．５〜３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および０．１％ＢＳＡ、７２℃であり、この条件下においてＴａｑポリメラーゼはプライマー伸長を触媒する。
本明細書において「リアルタイム」という用語は、核酸増幅反応における産物の蓄積の測定が少なくとも開始され、好ましくは増幅処理の間またはこれと同時に終了することを意味する。したがって、測定過程を「リアルタイム」とみなすためには、各一部分中の増幅産物の測定または検出の開始が少なくとも、増幅過程と同時になる。「開始」とは、一部分を回収して分離装置の中、例えばキャピラリー電気泳動のキャピラリーの中に入れ、分離を開始することを意味する。測定の完了は、一部分に由来する分離された核酸中の標識された物質種（ｓｐｅｃｉｅｓ）が検出されることである。分離および検出に必要な時間は増幅処理の個々の独立したサイクルの時間を超える場合があるため、増幅処理の完了の後１２０分まで、増幅産物の検出において遅延がある場合がある。好ましくは、このような遅れまたは遅延は３０分未満、例えば２５分、２０分、１５分、１０分、５分、４分、３分、２分、１分以内であり、遅れや遅延がない場合も含まれる。
本明細書において「キャピラリー電気泳動」という用語は、キャピラリー管内で分離を実施する、増幅反応からの一部分中の核酸分子の電気泳動分離を意味する。キャピラリー管は内径が約１０〜３００μｍのものが入手可能であり、長さは約０．２ｃｍ〜約３ｍの範囲であってよいが、好ましくは０．５ｃｍ〜２０ｃｍ、より好ましくは０．５ｃｍ〜１０ｃｍの範囲である。更に、微小流体マイクロキャピラリー（例えばＣａｌｉｐｅｒまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能）の使用が「キャピラリー電気泳動」の意味に特に含まれる。
本明細書において「モジュラー装置」という用語は、本発明の方法の特定の過程を実施する個々のユニットを含む装置を意味する。モジュラー装置の個々のユニットは必須ではないものの物理的に連結されていてよいが、個々のユニットはコンピュータのような中央制御装置により制御されることが好ましい。本発明において有用なモジュラー装置の例は、熱サイクル装置、サンプリング装置、および蛍光検出器を有するキャピラリー電気泳動装置を有する。本発明において有用なモジュラー装置はまた、電気泳動装置にサイクル反応から試料を移すためのロボットアームも含むことができる。
本明細書において、「サンプリング装置」という用語は、増幅処理の間に増幅からの一部分を回収する機構を指す。本発明で有用なサンプリング装置は、好ましくは、例えば１つの試料の採取後に廃棄されるピペットチップまたは針を用いることにより、あるいは各試料の採取後に針またはチップを洗浄する工程を１以上組み込むことにより、サイクル反応の汚染を最小限にするために適合させる。あるいは、サンプリング装置は、キャピラリーに一部分を充填させるために、キャピラリー電気泳動に使用するキャピラリーを直接増幅反応に接触させることができる。あるいは、サンプル装置は、特定のサイクルにおいて開放される制御可能な弁に連結された流体管（例えばチューブ）を含むことができる。当該技術分野で知られているサンプリング装置は、例えば、多目的のＲｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｄｒａ ９６ピペッターであり、これは９６穴プレートに試料を出し入れするのに適している。このようなものおよび他のものは、本発明の方法による使用に容易に適合させることができる。
本明細書において、「ロボットアーム」という用語は、試料、試料の入ったチューブまたはプレートを一箇所から別の箇所に物理的に移すマイクロプロセッサによって好ましくは制御される装置を意味する。各箇所は本発明で有用なモジュラー装置内のユニットであることができる。本発明において有用なロボットアームの一例は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ ＲＶ−Ｅ２ロボットアームである。ロボットアームを制御するためのソフトウエアは、一般的にはアームの製造元から入手できる。
本明細書において「増幅産物」という用語は、特定のポリヌクレオチド配列および／またはその相補的な配列の一部のコピーであるポリヌクレオチドを指し、これらはヌクレオチド配列において、鋳型のポリヌクレオチド配列およびその相補的な配列に対応する。本発明による「増幅産物」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、２本鎖または１本鎖であってよい。
本明細書において「別個のサイズを有する増幅産物」という用語は、異なるサイズの増幅産物から分割できる増幅産物を意味する。「異なるサイズ」とは、少なくとも１ヌクレオチド長さが異なる核酸分子を指す。一般的に、本発明において有用な別個のサイズを有する増幅産物は、本発明の所定の方法において使用される分離過程に関わる分割の限界を超えたヌクレオチドより多いかまたはそれに等しい程度に異なっている。例えば、分離の分割の限界が１塩基である場合は、別個のサイズを有する増幅産物は少なくとも１塩基だけ長さが異なるが、２塩基、５塩基、１０塩基、２０塩基、５０塩基、１００塩基またはそれ以上異なることもできる。分割の限界が例えば１０塩基である場合には、別個のサイズを有する増幅産物は少なくとも１０塩基だけ異なるが、１１塩基、１５塩基、２０塩基、３０塩基、５０塩基、１００塩基またはそれ以上異なることもできる。
本明細書において「プロファイル」という用語または等価な用語である「増幅曲線」および「増幅プロット」とは、試料を回収したサイクルの番号の関数としてプロットした、増幅処理の２以上の工程における対象となる核酸配列内に取り込まれた検出可能な標識から生じるシグナルを示す数学的曲線を意味する。プロファイルは、好ましくは、個々の反応試料の核酸のキャピラリー電気泳動分離後に検出される各バンドの蛍光をプロットすることにより作製する。最も一般的に入手可能な蛍光検出器は、検出されるシグナルに基づく曲線の作成を可能にするソフトウエアとインターフェイスする。
１つの反応において調べることのできる遺伝子の数は、産物のサイズの測定可能な差（１〜２塩基）およびＰＣＲ産物の分離可能なサイズ（５００〜１０００ｂｐ）に基づいて推定することができ、１０００もの高い値でありうるが、好ましくは１００〜２００である。
本明細書において「熱不安定性エキソヌクレアーゼ」という用語は、１本鎖核酸分子または部分的に２本鎖の核酸分子のオーバーハング１本鎖を分解し、上昇した温度においてインキュベーションすることにより非可逆的に不活性化される酵素を指す。不活性化の温度は酵素により異なり、また例えば緩衝液の条件および酵素の濃度により異なる。酵素不活性化のための条件は当業者に知られている。本発明において有用な熱不安定性エキソヌクレアーゼの非限定的な例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）（例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡより入手可能）である。ＥｘｏＩは、８０℃で２０分間インキュベーションすることにより不活性化される。
本明細書において「生物のゲノム内の遺伝子に特異的な配列を実質的に欠く」という用語は、所定のプライマーが、多型に関して調査すべき生物に由来するゲノムＤＮＡと共にプライマー伸長条件下においてインキュベーションされた場合に、プライマー伸長産物を生成しないことを意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、既知の一塩基多型に関して核酸試料の遺伝子型を決定する方法を提供する。本発明の方法は、配列タグを取り込むことにより、ＳＮＰｓの群において存在する特定のヌクレオチドの同時同定を可能にするプライマー伸長反応を使用する。次に、タグ付加されたフラグメントは、下流プライマーが標識されたタグに特異的なプライマーのセットを用いて増幅する。増幅処理の間、反応の一部分を回収し、サイズ分離および増幅されたフラグメントの検出に付す。多型部位に存在するヌクレオチドは、サイズおよび増幅されたフラグメントに結合した標識の同一性に基づいて同定される。増幅産物のサイズおよび取り込まれた標識の両方を検出するので、前記システムは重複化に非常に適している。更に、分離および検出は、増幅反応のプロファイルがリアルタイムで作製されるように、増幅反応の間に実施される。リアルタイムの態様は、迅速な分析を提供し、ならびに例えばプライマー間の相互作用により生じる人為的なシグナルの同定および排除において有用である、増幅過程に関する情報を提供する。
配列タグ付加されたプライマー伸長産物の生成
第１工程として、本発明は配列タグ付加されたプライマーの伸長産物の生成を要する。この工程の厳密な側面は、いずれかの特定の伸長産物上のタグが多型部位のヌクレオチドの同一性に特異的に対応する点である。この段階において、タグは以下の一般的構造：
５’−Ｔａｇｃ−標的相補体−Ｖｃ−３’
を有するプライマーの伸長により取り込まれ、ここで「Ｔａｇｃ」はプライマーの３’末端におけるヌクレオチドの同一性に対応するタグ配列であり、「標的相補体」は既知のＳＮＰに隣接して特異的にハイブリダイゼーションするプライマーの３’領域であり、ＶｃはＴａｇｃ配列の同一性に対応する可変３’末端ヌクレオチドである。Ｔａｇｃ配列は、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長であり、好ましくは、遺伝子タイピングされる生物のゲノム内の配列に、または所定の反応において使用される他のプライマーのいずれかに、プライマー伸長条件下でハイブリダイズしない。「標的相補体」は、プライマーと既知のＳＮＰに隣接する配列との間の特異的ハイブリダイゼーションを与えるのに十分長いものであり、一般的には１０〜２５ヌクレオチド長である。ＶｃはｄＧ、ｄＡ、ｄＴおよびｄＣから選択され、プライマーが調査すべき核酸試料にハイブリダイゼーションする場合に、既知の多型部位に対向するように位置づけられる。Ｖｃは、それが多型部位におけるヌクレオチドに相補的である場合にのみ、その部位のヌクレオチドと塩基対を形成する。核酸ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼは、３’末端ヌクレオチドが鋳型鎖上の隣接するヌクレオチドと塩基対を形成する場合にプライマーを伸長させるのみであるため、多型部位に対向する既知の３’末端ヌクレオチドを用いたプライマーの伸長により、多型部位に存在するヌクレオチドが３’末端ヌクレオチドの相補体であると同定する。
ＳＮＰ同定のために有用な下流プライマー伸長プライマーのセットは、各々の１個が３’末端のｄＧ、ｄＡ、ｄＴまたはｄＣに対応する、４種の異なるタグ配列を含む。したがって、タグを例えばＴａｇ１〜４と記載する場合に、Ｔａｇ１は３’ｄＧにおいて終止するプライマー上で使用し、Ｔａｇ２は３’ｄＡにおいて終止するプライマー上で使用し、Ｔａｇ３は３’ｄＴにおいて終止するプライマー上で使用し、Ｔａｇ４は３’ｄＣにおいて終止するプライマー上で使用する。本明細書において開示する方法の主要な利点は、得られる増幅産物がサイズにおいて異なるため、複数のＳＮＰｓについてのアッセイにおいて４種の下流Ｔａｇｃ配列の同じセットを使用できるという点である。これは、重複増幅を妨害する傾向を有する、増幅工程における非鋳型指向性プライマー間の相互作用の可能性を制限する。
配列タグ付加された上流プライマーを用いて、所定のＳＮＰ含有配列の対向する鎖を生成する。これらのプライマーは以下の一般的構造：
５’−Ｔａｇ−標的相補体−３’
を有し、ここで「Ｔａｇ」はプライマー伸長プライマーの下流のセットにおいて用いられるものの各々とは異なる配列タグを指し、「標的相補体」とは既知のＳＮＰの上流の領域に相補的な配列を指す。上流プライマー上の「Ｔａｇ」配列は、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長であり、好ましくは、遺伝子タイピングされる生物のゲノム内の配列に、または所定の反応において使用される他のプライマーのいずれかに、プライマー伸長条件下でハイブリダイズしない。「標的相補体」は、プライマーと既知のＳＮＰの上流の配列との間でプライマー伸長条件下において特異的ハイブリダイゼーションを起こすのに十分長いものであり、一般的には１０〜２５ヌクレオチド長である。上流の距離は、一般的には少なくとも５０ヌクレオチドであるが、多型部位から５０〜１０００ヌクレオチドまたはそれ以上上流であることもでき、好ましくは５０〜５００、または５０〜２５０ヌクレオチド上流である。多型部位から上流プライマー配列までの距離が、その後の増幅産物のサイズまたは長さを決定する。その後の増幅産物のサイズは、サイズ分離に使用されるシステムの分割限度より大きく異なるように選択しなければならない。したがって、分離の分割限度が１塩基である場合には、増幅産物のサイズは少なくとも１塩基長、好ましくはそれより多く（例えば少なくとも５、１０、１５塩基以上）異なるように選択する必要がある。分割限度が例えば１０塩基である場合には、増幅産物のサイズは少なくとも１０塩基、好ましくはそれより多く（例えば少なくとも１５、２０、２５、３０塩基以上）異なる必要がある。
「上流」および「下流」という用語は、本明細書において、本発明の説明を容易にするために使用する。しかしながら、ＤＮＡが２本鎖であるという性質のために、多型は、プライマーが一方の鎖に対して他方と対向するようにハイブリダイゼーションすることにより、いずれかの方向から、即ち上流または下流から、ＳＮＰ特異的プライマーにより接近される。本発明は、ゲノムＤＮＡのいずれかの鎖上のＳＮＰｓの精査を特に意図している。
本発明の配列タグ付加されたプライマー伸長産物を生成するためには、核酸試料を好ましくは熱により、例えば９５℃で２分間以上変性させ、上流の伸長プライマーおよび反応において精査すべき各ＳＮＰに対する下流のプライマー伸長プライマーのセットの存在下において再アニーリングさせる。変性およびアニーリングは、プライマー伸長反応に使用される核酸ポリメラーゼに適合する緩衝液、例えば１× Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液中において最も良好に行われる。再アニーリングは、一般的には約２０℃〜６０℃にて、プライマーのＴｍよりも低温で行うが、より低温またはより高温も一部のプライマーにとっては適当である。プライマーは、各プライマーにつき約１５〜５００ｎＭで存在する必要がある。至適プライマー濃度は、例えばプライマーを１５〜５００ｎＭの範囲にわたって変化させる試験反応を設定し、相対的な分割度、収量、および伸長または増幅反応の特異性に関して結果を分析することにより、最小限の実験で当業者が実験的に決定できる。
プライマーの存在下におけるアニーリングの後、核酸ポリメラーゼを用いて重合を行う。この工程のために十分な多くのポリメラーゼが知られており、当業者が選択できる。最も一般的に使用されている酵素の中には、熱安定性Ｔａｑポリメラーゼおよび他の熱安定性ポリメラーゼ、例えばＰｆｕポリメラーゼがある。プライマー伸長は、選択される酵素についての標準的な条件下、例えば５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．８、２５℃）、０．５〜３ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．１％ＢＳＡおよび１００μＭの各ｄＮＴＰを用いて７２℃で２分間行う。
プライマー伸長の第１ラウンドにより、一方の鎖が上流プライマーおよび取り込まれたタグ配列を有し、他方の鎖が下流プライマーおよび取り込まれたタグ配列を有する集団が得られる。各ＳＮＰについて取り込まれた下流プライマーは、３’末端ヌクレオチドが標的ＤＮＡの多型部位におけるヌクレオチドに相補的であるものである。その下流プライマーの取り込みにより、その３’末端ヌクレオチドに関連するかまたはそれに対応するタグ配列が必然的に取り込まれる。各鎖に相当する分子が上流のタグまたはその相補体、および下流のタグまたはその相補体の両方を持つような集団を生成するためには、第１プライマー伸長反応の産物は、変性、同じプライマーの存在下における再アニーリング、およびこれらのプライマーのポリメラーゼ伸長からなる別のラウンドに付す。
プライマー伸長の第２ラウンドの後、伸長しないプライマーを除去する。いずれのプライマー除去方法を使用してもよく、例えば電気泳動またはカラムクロマトグラフィーを使用してよいが、１本鎖ＤＮＡに特異的な熱不安定性エキソヌクレアーゼを使用することが好ましい。熱不安定性エキソヌクレアーゼの使用により、時間のかかる分離および精製の操作の必要性と汚染または試料の損失の可能性とを回避することができる。本発明において有用な熱不安定性エキソヌクレアーゼは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）およびエキソヌクレアーゼＶＩＩ（ＥｘｏＶＩＩ）を含む。例えばＥｘｏＩは３７℃では活性であるが、８０℃で２０分間インキュベーションすることにより不活性化される。
プライマー伸長に使用されるプライマーは、取り込まれた上流および下流のタグ配列に対応する新しいプライマーを用いてプライマー伸長産物の増幅ができるように、除去される。第１プライマーの除去後、上流タグ配列プライマーおよび４種の下流タグ配列プライマーを含むプライマーセットを添加する。４種の下流タグ配列プライマーの各々は、蛍光染料により識別可能に標識（例えば末端標識）されている。次に、添加された新しいプライマーとの混合物は、熱変性、再アニーリングおよびポリメラーゼ伸長のサイクルを含む増幅処理に付す。増幅処理は少なくとも２サイクルを含む必要があるが、好ましくは２〜３５サイクル、より好ましくは１０〜３０サイクル、更に好ましくは１５〜２５サイクルを含む。
サイクル処理の間、本発明のこの態様における変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルの少なくとも１回の後、反応の試料または一部分をチューブまたは反応容器から回収し、一部分中の核酸を分離し、検出する。分離および検出は、サイクル数の関数としての産物の量を示す曲線をサイクル実施中に作製できるように、サイクル処理と同時に実施する。本明細書において「同時」という用語は、サイクル処理の進行中に分離を少なくとも開始することを意味する。所定の反応において使用する分離手法（例えばキャピラリー電気泳動）および分離される物質種の数およびサイズに応じて、分離は一部分当たり１〜１２０分のオーダーを必要とする場合が多い。したがって、分離工程が各サイクルの時間よりも長時間を要する場合、および、例えば各サイクルの後に試料を回収する場合には、分離工程は完全なサイクル処理の完了後に完了する。しかしながら、本明細書に記載するとおり、この状況はなお、各試料の分離がサイクル処理の間に開始される限り、「同時」分離とみなされる。同時分離は、最も好ましくは、サイクル反応から試料を回収した直後に分離装置に試料を投入するロボット式サンプリング装置の使用により実施される。
上記した方法において、多型部位のヌクレオチドの同一性は、サイズ分離された増幅産物上の蛍光シグナルの検出により決定する。４種の下流タグプライマーの各々が識別可能な蛍光標識で標識されているため、および、所定のプライマー上のタグが元の下流プライマー伸長プライマーの３’末端ヌクレオチドの同一性に対応するため、その蛍光標識タグの取り込みおよび検出により、多型部位におけるヌクレオチドが同定される。
好ましい態様において、元のプライマー伸長反応は、１つより多いＳＮＰを認識するプライマーセットを含む。この態様において、各々の異なる多型は、別個のサイズを有する増幅産物により表される。例えば、別の上流プライマーを含むことができ、各々が同じタグ配列を含み、および別の既知のＳＮＰの上流の異なる距離にてハイブリダイゼーションするような３’領域が変動する。別の上流プライマーと共に、精査すべき別のＳＮＰの各々は４種の下流プライマー伸長プライマーのセットを必要とし、セットの各メンバーは５’から３’の方向に：ａ）そのプライマーの３’末端ヌクレオチドに対応するタグ配列、ここで前記タグ配列が、同じ一連の反応において精査される他のＳＮＰｓに対して用いられる下流プライマー上の３’末端ヌクレオチドに対応する同じタグ配列である；ｂ）既知のＳＮＰの下流にあり、およびそれに隣接するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションを指向するのに十分な領域；およびｃ）そのプライマー上のタグ配列に対応する可変３’末端ヌクレオチド、ここで、前記プライマーがそのゲノム標的配列にハイブリダイゼーションする場合に、３’末端ヌクレオチドは多型部位に対向し、そしてそれが相補的であれば、その部位におけるヌクレオチドと塩基対を形成できる、を含む。上記したとおり、２回のプライマー伸長反応および非取り込みプライマーの除去の後、１つのＳＮＰを精査する場合に使用するものと同一の１つの増幅プライマーセットを使用する。即ち、増幅プライマーセットは、上流タグを含む上流プライマー、およびプライマー伸長プライマー上に４種の下流タグを含む４種の識別可能に標識されたプライマーのセットを含み、ここで標識は、多型部位に対向するヌクレオチドに対応するタグに対応する。取り込まれたタグがセット間で共通であるため、同じ増幅プライマーセットを、精査する各ＳＮＰについて使用できる。即ち、すべての上流のプライマーは同じタグ配列を有しており、すべての下流のプライマー伸長プライマーセットは、同じ３’末端ヌクレオチドに対応する同じタグ配列を有する。精査する各ＳＮＰは分離されれば別個のサイズを有することになり、そのサイズの分子に取り込まれる標識の同一性により、多型部位に存在するヌクレオチドが明確に同定される。５種の増幅プライマーの１セットを用いて複数のＳＮＰｓを増幅して検出する能力は、多数のプライマーを増幅に用いる場合に遭遇するプライマー相互作用の問題を回避するという利点を有する。更に、プライマーアニーリング効率における変異の影響は、所定の増幅プライマーセットを用いて精査するすべてのＳＮＰｓがこのような変異に同程度に影響されるため、大半は無視できるものとなる。
５種のタグ配列の１つより多くのセットを使用することにより、重複化を更に進めることができる。別のセットは、他のセットにおいて使用されるものとは別個のタグを含む。同時に使用する他のタグに対して相補性を有するタグを回避するように注意が必要である。上記したとおり、各セットは、増幅産物が別個のサイズを有するように選択された上流タグ、およびそれぞれのタグがプライマー伸長プライマーの３’末端ヌクレオチドに対応する下流タグを含む。増幅のためには、他のセットと同じ対応する蛍光標識を用いて、または好ましくは、識別可能な蛍光標識の異なるセットを用いて、下流プライマーを標識することができる。サイズ分離の後、増幅されたＳＮＰ含有フラグメントをサイズにより同定し、多型部位におけるヌクレオチドの同一性を、上記したとおり、取り込まれた標識により同定する。
プライマー設計に関する一般的な考慮事項
オリゴヌクレオチドプライマーは、一般的には５〜１００ヌクレオチド長であり、好ましくは１７〜４５ヌクレオチド長であるが、種々の長さのプライマーも使用される。プライマー伸長反応のためのプライマーは好ましくは１０〜６０ヌクレオチド長であるが、増幅用のプライマーは好ましくは約１７〜２５ヌクレオチド長である。本発明において有用なプライマーは、融点推定法により特定の融解温度（Ｔｍ）を有するように設計できる。Ｏｌｉｇｏ（商標）、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ、およびインターネットで入手できるプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含む市販のプログラムを用いて、本発明において有用なポリヌクレオチド配列のＴｍを計算することができる。好ましくは、本発明において有用な増幅プライマー（例えばタグ配列）のＴｍは、例えばＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒで計算した場合、約４５℃〜６５℃、より好ましくは約５０℃〜６０℃である。
ポリヌクレオチドのＴｍは、別のポリヌクレオチドに対するそのハイブリダイゼーションに影響を及ぼす（例えば、鋳型ポリヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング）。本発明の方法においては、種々の工程において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、標的鋳型または標的鋳型に由来するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションすることが好ましい。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、２つのポリヌクレオチド配列が実質的に相補的（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの長さに渡り少なくとも約６５％相補的、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的）である場合に生じる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，１９８４，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｓ．１２：２０３を参照されたい。その結果、プライミング部位におけるある程度のミスマッチが許容できることが予測される。このようなミスマッチは、モノ、ジまたはトリヌクレオチド程度の小さいものである。あるいは、ミスマッチの領域は、連続する一連の４以上のヌクレオチドにおいてミスマッチが存在する領域として定義される、ループを含んでよい。
多くの要因が、第２のポリヌクレオチド分子に対するプライマーのハイブリダイゼーションの効率および選択性に影響を及ぼす。プライマー長、ヌクレオチド配列および／または組成、ハイブリダイゼーション温度、緩衝液組成、およびプライマーがハイブリダイズしなければならない領域における立体障害の可能性を含むこれらの要因は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの設計時に考慮される。
プライマー長とプライマーが標的配列にアニーリングする効率および精度の双方との間には、正の相関が存在する。特に、より長い配列はより短いものよりも高い融解温度（Ｔｍ）を有し、所定の標的配列内で反復される可能性がより低いため、無差別なハイブリダイゼーションを最小限にすることができる。高いＧ−Ｃ含量を有するプライマー配列か、またはパリンドローム配列を含むプライマー配列は、２分子ではなく１分子のハイブリダイゼーション動態が一般的には溶液中で好適であるため、その意図する標的部位と同様に自己ハイブリダイゼーションする傾向がある。しかしながら、各Ｇ−Ｃ対は、ＡとＴの塩基対が標的配列に結合する場合に観察される２つではなく３つの水素結合により結合しており、したがってより堅固で強力な結合を形成することから、十分な数のＧ−Ｃヌクレオチド対を含むプライマーを設計することも重要である。ハイブリダイゼーション温度は、プライマー反応またはハイブリダイゼーション混合物に含まれうる、例えばホルムアミドのような有機溶媒の濃度と同様に、プライマーアニーリング効率と逆比例して変動するが、塩濃度の上昇は結合を促進する。ストリンジェントなアニーリング条件下では、より長いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーは、より緩やかな条件下では十分な、より短いものよりも効率的にハイブリダイゼーションする。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、適当な緩衝液（例えば、１× Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、またはプライマーの伸長および増幅に用いられる酵素に適する他の緩衝液）中、オリゴヌクレオチドプライマーに対してポリヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションさせる条件下で行う。長さおよび／またはポリヌクレオチドの組成またはオリゴヌクレオチドプライマーに応じて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は変動（例えば約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度から）し、ハイブリダイゼーション温度も変動（例えば０℃程度の低温〜２２℃より高温、約３０℃より高温、（より頻繁には）約３７℃超）しうる。より長いフラグメントは、特異的ハイブリダイゼーションのためにはより高いハイブリダイゼーション温度を要する場合がある。数種の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響するため、パラメーターの組み合わせは１つの要因の絶対的尺度よりも重要である。
所定の遺伝子上のいずれかの配列を認識するためにされるプライマーの設計とは異なり、既知のＳＮＰの近傍でハイブリダイゼーションするように設計されたプライマーは、Ｔｍを操作するために行うことができる修飾に関しては限界がある。例えば、通常では、より好ましいＧＣ含量を有する領域を発見するために配列上でより上流または下流にシフトさせることができるところであるが、プライマーをＳＮＰに隣接してハイブリダイゼーションするように設計すると、プライマーを別の位置に移動させることができなくなる。次に、このような状況において、Ｔｍを操作する主要な手段は、プライマーにおける相補的な配列の長さを変えることである。
本発明において有用な配列タグ
本発明において有用なタグは、少なくとも１５、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長の、好ましくは非相同または人工のヌクレオチド配列である。タグは、好ましくは、遺伝子タイピングすべき生物のゲノム内の配列にＰＣＲアニーリング条件下でハイブリダイゼーションしない。本発明のタグ配列はランダムであってよいが、必須ではない。潜在的なタグ配列がＰＣＲアニーリング条件下で生物のゲノム内の配列にハイブリダイゼーションするかどうかは、鋳型として対象となる生物に由来するゲノムＤＮＡを用いたプライマー伸長反応において標識プライマーとしてタグ配列を使用することにより、調べることができる。標識されたプライマーは、本発明の方法の増幅工程のために使用することを計画したアニーリング温度においてゲノムＤＮＡにアニーリングされ、ついで、伸長条件下において熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベーションする。次に、反応産物を標識されたプローブのみと共に電気泳動で分離する。標識されたタグがタグプライマーよりも大きいバンド中に現れた場合には、タグプライマーは、遺伝子タイピングすべき生物のゲノム内の配列にＰＣＲアニーリング条件下においてハイブリダイゼーションしている。また、同じ反応に使用することを意図する他のタグに対して相補性を有するタグを回避するように、留意しなければならない。
オリゴヌクレオチドプライマーの標識
本発明において有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、酵素的手段または化学的手段により検出可能な部分を取り込むことにより、以下に記載するようにして標識することができる。オリゴヌクレオチドプライマーに標識を連結またはコンジュゲーションする方法は、当然ながら、使用する標識の種類、およびプライマー上の標識の位置（即ち、３’末端、５’末端または本体部分への標識）により異なる。
蛍光染料が好ましいが、本発明における使用に適する種々の標識、ならびにプライマーへのその取り込み方法は当該技術分野で知られており、例えば、相互に作用してシグナルを増強、変化または減衰させるような、酵素（例えばアルカリホスファターゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ）および酵素基質、放射性原子、発色団、蛍光クエンチャー、化学ルミネセンス標識、および電気化学発光標識、例えばＯｒｉｇｅｎ（商標）（Ｉｇｅｎ）が包含されるが、これらに限定されない。当然ながら、熱サイクルを伴うＰＣＲに基づく増幅アッセイにおいて標識された分子を使用する場合には、標識は、この自動化工程において必要とされる温度サイクルに耐えうるものでなければならない。理想的には、同様の装置、方法および／または基質を用いて検出できる４つの識別可能な標識が好ましい。本発明の標識プライマーの構築において標識として使用するためのフルオロフォアは、例えばローダミンおよび誘導体（例えばテキサスレッド）、フルオレセインおよび誘導体（例えば５−ブロモメチル フルオレセイン）、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＪＯＥ、ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）、ルシファーイエロー、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセタート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセタート、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセタート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビマン、ピレン トリスルホネート、例えばカスケードブルー、およびモノブロモトリメチル（ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｒｉｍｅｔｈｙｌ）−アンモニオビマンを包含するが、これらに限定されない。一般的に、単色計ではなくフィルターを有する蛍光計の使用を可能にし、検出の効率を上昇させるには、広いストークスシフトを有するフルオロフォアが好ましい。
標識は、種々の手法を用いて直接または間接的にオリゴヌクレオチドに連結することができる。使用する標識またはタグの厳密な種類に応じて、標識は、プライマーの５’末端に位置するか、またはプライマーの内部に位置することができ、あるいは種々のサイズと組成のスペーサーアームと連結することによりシグナル相互作用を促進することができる。５’末端標識が好ましい。市販のホスホロアミダイト試薬を用いて、適切に保護されたホスホロアミダイトを介して５’末端に官能基（例えばチオールまたは第１級アミン）を含有するオリゴマーを作製することができ、また、例えば「ＰＣＲプロトコル：方法および適用の指針（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｄ．，１９９０に記載されているプロトコルを用いて、これらを標識することができる。
典型的には５’末端において、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に１以上のスルフィドリル、アミノまたはヒドロキシル部分を導入するためにオリゴヌクレオチド官能基化試薬を使用する方法は、米国特許第４，９１４，２１０号に記載されている。５’リン酸基は、ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰまたはγ−３３Ｐ−ＡＴＰを用いることにより放射性同位体として導入し、これによりレポーター基とすることができる。ビオチンは、合成の間に導入されたアミノチミジン残基または６−アミノヘキシル残基をビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることにより、５’末端に付加することができる。
増幅
ＰＣＲ法は当業者がよく知るものであり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５，Ｓａｉｋｉら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０および米国特許第４，６８３，２０２号，第４，６８３，１９５号および第４，８００，１５９号に記載されている。その最も簡単な形態において、ＰＣＲは、対向する鎖にハイブリダイズし、そして標的ＤＮＡの対象となる領域にフランキングする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、特異的ＤＮＡ配列を酵素的に合成するためのインビトロの方法である。鋳型の変性、プライマーアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長を含む一連の反復反応工程により、プライマーの５’末端によりその末端が定義される特定のフラグメントの指数関数的な蓄積が生じる。ＰＣＲは、１０９倍で特定のＤＮＡ配列を選択的に濃縮することができると報告されている。
ＰＣＲサイクルの各工程の長さおよび温度ならびにサイクル数は、実際にはストリンジェンシーの要件に応じて調節される。アニーリング温度および時間は、プライマーが鋳型にアニーリングする際の予測される効率および許容されるミスマッチの程度の両方により決定される。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを至適化する能力は、当業者によく知られている。２０℃〜７２℃のアニーリング温度が最も一般的に使用されている。鋳型分子の最初の変性は通常は９２℃〜９９℃で４分間のインキュベーションにより達成され、その後、変性（９４℃で１５秒〜１分）、アニーリング（温度は上記したとおりＴｍに基づき、最も低いＴｍを有する反応中のオリゴヌクレオチドのＴｍより通常は約５度低温；通常は１〜２分）および伸長（通常は７２℃で１〜３分間）からなる２０〜４０サイクルが行われる。
試料回収
増幅処理の間の試料回収はいずれかの望ましい頻度において、またはいずれかの望ましいパターンにおいて、実施することができる。試料回収は処理の各サイクル後に行うことが好ましいが、より低い頻度の試料回収、例えばサイクル２回に１回、３回に１回、４回に１回なども使用できる。一定の間隔で試料回収を行うのが望ましい場合が最も多いが、試料回収を一定の間隔で行う必要性はない。一例として、試料回収のルーチン作業は、最初の５サイクルでは１回毎に、その後は１回おきに行ってよい。
試料回収は反応から一部分を手動によりピペッテイングするほどに単純でありうるが、好ましくは、所定の試料回収間隔で自動的に一部分を回収するように自動化される。反応混合物には、ｄＮＴＰ、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼのような等容量の新しい成分を各回収時に補給することが好ましい。本発明のこの態様および他の態様については、必須ではないが、サイクルはマイクロタイターまたはマルチウェルプレートフォーマットで行うことが好ましい。複数の反応ウェルを含むプレートを使用するこのフォーマットは、アッセイ過程のスループットを向上させるのみならず、プレートのモジュールの性質およびプレート上のウェルの均一なグリッド型の配置により、自動化された試料回収工程にも非常に適合している。本発明において有用な一般的なマイクロタイタープレートの設計は、例えば１２、２４、４８、９６，３８４以上のウェルを有するが、プレートに物理的に適合し、所望の反応容量（通常は１０〜１００μｌ）を収容できれば、いかなる数量のウェルも本発明において使用できる。一般的には、９６または３８４ウェルのプレートフォーマットが好ましい。
自動化された試料回収過程は、プログラムされたルーチン作業として容易に実施することができ、試料回収における人為的な誤差（即ち、試料サイズおよび試料の同一性を追跡する際の誤差）および試料回収者からの汚染の可能性の両方が回避される。熱サイクル装置から一部分を回収できるロボット式サンプリング装置は、当該技術分野で入手可能である。例えば、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ ＲＶ−Ｅ２ロボットアームをＳｃｉＣｌｏｎｅ（商標）リキッドハンドラーまたはＲｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｄｒａ９６ピペッターと組み合わせて使用することができる。
本発明において有用なロボット式サンプリング装置は熱サイクル装置と一体型化するか、または、サンプリング装置とサイクル装置はモジュール式に設計できる。サイクル装置およびサンプリング装置を一体型にする場合、熱サイクリングおよび試料回収は同じ場所で行われ、試料はロボット式サンプリング装置によりプログラムされた間隔で回収される。サイクル装置とサンプリング装置をモジュール式に設計する場合、サイクル装置とサンプリング装置は別々のモジュールとなる。１つの実施態様においては、アッセイプレートは、例えばロボット式アームにより、サイクル装置からサンプリング装置に物理的に移動され、サイクル装置に戻される。
試料回収工程において取り出される一部分の容量は、例えば増幅反応の総容量、産物検出の感度、および使用する分離の種類に応じて変動する。増幅容量は数μｌ〜数百μｌ（例えば５μｌ、１０μｌ、２０μｌ、４０μｌ、６０μｌ、８０μｌ、１００μｌ、１２０μｌ、１５０μｌまたは２００μｌ以上）、好ましくは１０〜１５０μｌの範囲、より好ましくは１０〜１００μｌの範囲内で変動することができる。一部分の容量は反応混合物の０．１〜３０％で変動することができる。
核酸の分離
本発明による核酸の分離は、例えば電気泳動、ＨＰＬＣまたは質量分析を含む、核酸の分離に適するいずれかの手段により達成することができる。その速さと分割能のために、分離は好ましくはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）により行われる。
ＣＥは試料の微量分析に対して効率的な分析分離手法である。ＣＥは、「キャリア電解質（ｃａｒｒｉｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ）」と称される電気伝導性の媒体を充填した狭い内径のキャピラリーチューブで行う。電場をキャピラリーチューブの両端の間に適用し、試料中の物質種が一方の電極から他方の電極に向けて、各物質種の電気泳動における移動度およびチューブ内の流体移動の速度に依存する速度で移動する。ＣＥは、キャピラリー内でゲルまたは緩衝液のような液体を用いて行ってよい。「フリーゾーン電気泳動」として知られている液体方式の１つにおいては、分離は試料の物質種の自由な溶液の移動度における差に基づいている。別の液体方式においては、ミセルを用いて疎水性の相違に基づく分離を行う。これはミセル動電キャピラリー電気泳動（Ｍｉｃｅｌｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＭＥＣＣ）として知られている。
ＣＥは電荷に基づいて核酸分子を分離し、これは効果的にサイズまたはヌクレオチド数によるその分離をもたらす。いくつかのフラグメントが生成する場合、それらはサイズが増大する順に、キャピラリーの端部近傍で蛍光検出器を通過する。即ち、より小さいフラグメントはより大きいものに先立って移動し、最初に検出される。
ＣＥは、主に分離速度、必要な試料が少量であること（１〜５０ｎｌのオーダー）および高い分割度において、従来の電気泳動よりも顕著な利点を有する。例えば、ＣＥを用いる分離の速度は従来のゲル電気泳動よりも１０〜２０倍高速であり、泳動後の染色も必要ない。ＣＥは高い分割度をもたらし、僅か１塩基対のみ異なる約１０〜１，０００塩基対の範囲の分子を分離する。高い分割度は、部分的には、キャピラリーのより広い表面積が効率的に熱を放散させ、高い電圧の使用を可能にすることから、可能となっている。さらに、バンドのブロード化はキャピラリーの狭小な内径により最小限にされる。フリーゾーン電気泳動においては、電気浸透の現象、すなわち電気浸透流（ＥＯＦ）が生じる。これは電荷に関わらず試料分子のすべてに影響を及ぼす液体の総体流（ｂｕｌｋ ｆｌｏｗ）である。特定の条件下では、ＥＯＦはフリーゾーンＣＥの分割度および分離速度を改善するのに貢献する場合がある。
ＣＥは、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１７，７３１号；第６，００１，２３０号および第５，９６３，４５６号に記載されている、当該技術分野でよく知られた方法により実施できる。高スループットＣＥ装置は、例えばＨＴＳ９６１０ハイスループット分析システムおよびＳＣＥ９６１０全自動９６キャピラリー電気泳動遺伝子分析システムがＳｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）から販売されている。他には、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）のＰ／ＡＣＥ ５０００シリーズ、およびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００遺伝子分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）がある。これらの装置の各々は、ＣＥカラムの端部近傍の試料中の分子による光の放射をモニタリングする蛍光検出器を含む。標準的な蛍光検出器は多くの異なる波長の蛍光放射を識別することができ、これにより増幅試料から１回のＣＥ泳動において複数の蛍光標識物質種を検出する能力を与える。
ＣＥ分離のスループットを増加させる別の手段は、複数のキャピラリー、または好ましくはキャピラリーのアレイを使用することである。キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）装置は、９６キャピラリー（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｙｎａｍｉｃｓのＭｅｇａＢＡＣＥ機器）、および更に１０００キャピラリーもの容量を有するものが開発されている。近接して並置されている複数のキャピラリー間の光の分散により生じるＤＮＡからの蛍光の検出に関わる問題点を回避するためには、共焦点蛍光スキャナを用いることができる（Ｑｕｅｓａｄａら、１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：６１６−２５）。
分離（および検出）のための装置は、熱サイクル処理および試料回収のために使用する装置とは別々にするか、または一体型にすることができる。本発明によれば分離工程はサイクル処理と同時に開始されるため、試料は好ましくは増幅反応から直接回収され、分離が増幅と同時に進行するように分離装置内に入れられる。したがって、必須ではないが、分離装置は熱サイクルおよび試料回収装置と一体型であることが好ましい。１つの実施形態において、この装置は、熱サイクル反応から試料を回収し、分離／検出装置内に入れるロボット式サンプリング装置と共に熱サイクルモジュールおよび分離／検出モジュールを含むモジュール式のものである。
検出
本発明において有用な増幅産物検出方法は、蛍光標識の励起スペクトル範囲内の光によって照射される時に、標識プライマーにより放射される蛍光の強度を測定する。蛍光検出手法は高度に発達しており、極めて高感度であり、場合により１分子まで明確な検出が可能である。高感度の蛍光検出は、大部分の市販のプレートリーダー、マイクロアレイ検出セットアップおよびＣＥ装置の標準的側面である。ＣＥ装置については、励起および発光のシグナルの光ファイバー伝達がしばしば用いられる。Ｓｐｅｃｔｒｕｍｅｄｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔはそれぞれ、本明細書に記載した方法に必要な蛍光検出のために十分な蛍光検出器を備えるＣＥ装置を販売している。
２以上の異なる蛍光標識から生じる蛍光シグナルは、発光のピーク波長が各々スペクトル中で２０ｎｍ以上離れている場合に、相互に識別可能である。一般的に専門家は、選択されたフルオロフォアがブロードな発光波長ピークを有する場合には特に、ピーク波長の間の分離がより大きいフルオロフォアを選択する。これは、より多種のフルオロフォアを試料中に含有させて同時に検出したい場合には、その発光ピークはより狭いものである必要があるということである。
１ヌクレオチド相違の検出
レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）は、３４６０、１１７７８および１４４５９の位置のミトコンドリアＤＮＡにおける数個の点突然変異の存在と関連している。
Figure 0004617403
レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）に関わるヒトミトコンドリアＤＮＡ中のＳＮＰｓに関する個体の遺伝子型は、以下の通り決定することができる。
プライマー伸長：
プライマー：
ａ）上流プライマー
上流プライマーは以下の通りである：
Figure 0004617403
ｂ）下流プライマー
下流プライマーは以下の通りである：
Figure 0004617403
各多型部位についての５つのプライマー伸長プライマーの完全セット（各４０ｐｍｏｌ、合計１５プライマー）を、総容量５０μｌの１× Ｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００および０．１ｍｇ／ｍｌヌクレアーゼ非含有ＢＳＡ）中、試験すべき個体からの鋳型ゲノムＤＮＡ １μｇと混合する。混合物を９４℃で２分間加熱し、ゆっくり室温まで冷却し、プライマーをアニーリングさせる。クローニングされたＰｆｕポリメラーゼ １μｌ（２．５Ｕ／μｌ）＋各ｄＮＴＰ １．２５μｌ（最終濃度２００μＭ）を添加し、試料を７２℃で３分間インキュベーションする。次に、試料を９４℃で２分間、次に５０℃で１分間、そして７２℃で３分間のサイクルに付し、上流プライマーまたはその相補体および下流プライマーまたはその相補体を有するプライマー伸長産物の集団を生成する。
プライマー伸長プライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２０Ｕの添加および３７℃で２０分間のインキュベーションにより除去する。次に、ＥｘｏＩを８０℃で２０分間のインキュベーションにより不活性化する。
増幅：
プライマー伸長プライマーの除去後、５つの増幅プライマー（１× Ｐｆｕ緩衝液中、４０ｐｍｏｌの各プライマー、最終容量７５μｌ）を以下の通り添加する：
ａ）上流プライマー：
Figure 0004617403
ｂ）下流プライマー：（識別可能に標識）
Figure 0004617403
増幅は、新鮮なクローニングしたＰｆｕポリメラーゼ １μｌを添加し、反応を以下のサイクル：９４℃で４５秒間、５０℃で４５秒間および７２℃で２分間の３５サイクルに付すことにより行う。各サイクルの後、またはいずれかの選択された時間間隔において、一部分（０．５μｌ）を回収し、準備されたキャピラリー電気泳動装置に充填する。分離を開始し、増幅処理の間、実施する。増幅したプライマー伸長産物は、キャピラリーの長さに渡って分離した後に蛍光により検出する。各フラグメントのシグナル強度を各サイクルについてプロットすることにより、増幅プロファイルが得られる。
増幅産物は以下の通りである：
Figure 0004617403
本実施例において詳細に記載した方法は、同じ上流タグと、既に含まれているものとはサイズの異なる別のＳＮＰ含有フラグメントに特異的な３’領域とを有する、それぞれ別のＳＮＰに対する別の上流プライマー伸長プライマーを含めることにより、更に重複化することができる。精査されるそれぞれ別のＳＮＰもまた、４つの下流プライマータグの同じセット、ＳＮＰに隣接して特異的にハイブリダイゼーションする３’領域およびタグ配列に対応する可変３’末端ヌクレオチドを担持する、４つの下流プライマーのそれ自体のセットを有さなければならない。
更に重複化するには、本明細書において上記したように、異なるセットの上流および下流のタグを有する新しいプライマーセットを含めることにより達成される。
他の実施形態
本明細書において引用したすべての特許、特許出願および公開された参考文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明はその好ましい実施形態を参照にしながら特に説明したが、当業者の知るとおり、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細事項における種々の変更を行うことができることが理解されよう。
図１は、本発明の１つの実施形態において有用なプライマー伸長反応の概略図である。Ｓ１およびＳ５は異なる配列タグである。 図２は、本発明の１つの実施形態において有用な増幅処理および検出の概略図である。Ｓ１およびＳ５は、相互に異なるが図１に示すＳ１〜Ｓ５と同一であるタグ配列プライマーである。

Claims (41)

  1. ａ）核酸試料から生成したプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すステップ
    （それぞれのプライマー伸長産物が、既知の多型部位における１つの特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応するタグ配列セットのメンバーを含み、
    前記増幅処理は、精査すべき既知の多型部位を含む各配列についての１つの上流増幅プライマーおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、
    前記下流増幅プライマーセットの各メンバーは、プライマー伸長産物の前記集団のメンバーを構成する前記タグ配列と、前記多型部位において特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応する識別可能な標識とを含み、
    前記上流増幅プライマーは、精査すべき既知の多型部位の前記セットの各多型部位が別個のサイズを有する増幅産物に対応するように選択される。）と、
    ｂ）別個のサイズの増幅産物をサイズおよび／または電荷で分離するステップと、
    ｃ）別個のサイズの増幅産物中の識別可能な標識の取り込みを検出することによって前記各多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定するステップであって、前記識別可能に標識されたプライマーの同じセットは、前記標的多型部位セットのすべてのメンバーにおけるヌクレオチドの同一性を特定するステップ
    とを含む、所定の核酸試料に関して、精査すべき既知の多型部位のセットにおけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法。
  2. 前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分離するステップがキャピラリー電気泳動を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、ここで各サイクルが、
    １）核酸鎖を分離するステップと、
    ２）オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングするステップと、
    ３）アニーリングされたプライマーをポリメラーゼ伸長するステップ
    とを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記増幅処理の間、および少なくとも１回の前記反応サイクルの後に、
    増幅反応産物の一部分を除去するステップと、
    サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離するステップと、
    前記識別可能な標識の取り込みを検出するステップ
    とをさらに含み、前記検出するステップにより前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記除去するステップと、分離するステップと、検出するステップとを、前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記分離するステップがキャピラリー電気泳動を含む、請求項５に記載の方法。
  8. ステップ（ａ）および（ｂ）が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記タグ配列が１５〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 識別可能に標識された下流の増幅プライマーの前記セットが、
    多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、
    多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、
    多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、
    多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット
    とからなる、請求項１に記載の方法。
  11. ステップ（ａ）の前に、プライマー伸長産物の前記集団が作製されたときに取り込まれなかったプライマーを除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記除去するステップが、プライマー伸長産物の前記集団が作製されたときに取り込まれなかった前記プライマーを分解するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記分解するステップが熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記熱不安定性エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. ステップ（ａ）に続く前に、前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する、請求項１４に記載の方法。
  16. ａ）核酸試料から生成したプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すステップ
    （各プライマー伸長産物が第１のタグ配列またはその相補体、および第２のタグ配列またはその相補体のセットのメンバーを含み、
    前記第２のタグ配列またはその相補体の存在は、既知の多型部位における１つの特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応し、
    前記多型部位のセットにおける各多型部位について、前記第１のタグ配列は、他の多型部位を含む前記試料中の分子上の多型部位からの前記第１タグ配列の距離と比較して前記多型部位の５’側に特異的な距離で位置しており、
    前記増幅処理は、前記第１タグ配列を含む上流増幅プライマーおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、
    前記下流増幅プライマーセットの各メンバーは、プライマー伸長産物の前記集団のメンバーを構成する前記第２タグ配列と、前記多型部位における特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応する識別可能な標識とを含み、
    前記上流増幅プライマーは、精査すべき既知の多型部位の前記セットの各多型部位が別個のサイズの増幅産物に対応するように選択される。）と、
    ｂ）別個のサイズの増幅産物をサイズおよび／または電荷で分離するステップと、
    ｃ）別個のサイズの増幅産物中の識別可能な標識の取り込みを検出することによって前記各多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定するステップであって、前記識別可能に標識されたプライマーの同じセットは、前記標的多型部位セットのすべてのメンバーにおけるヌクレオチドの同一性を特定するステップ
    とを含む、所定の核酸試料に関して、精査すべき既知の多型部位のセットにおけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法。
  17. 前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記分離するステップがキャピラリー電気泳動を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、各サイクルが、
    １）核酸鎖を分離するステップと、
    ２）オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングするステップと、
    ３）アニーリングされたプライマーをポリメラーゼ伸長するステップ
    とを含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記増幅処理の間、および少なくとも１回の前記反応サイクルの後に、
    増幅反応産物の一部分を除去するステップと、
    サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離するステップと、
    前記識別可能な標識の取り込みを検出するステップ
    とをさらに含み、前記検出するステップにより前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記除去するステップと、分離するステップと、検出するステップとを、前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記分離するステップがキャピラリー電気泳動を含む、請求項２０に記載の方法。
  23. ステップ（ａ）および（ｂ）が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項１６に記載の方法。
  24. 前記第１タグ配列および／または第２タグ配列が１５〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
  25. 識別可能に標識された下流の増幅プライマーの前記セットが、
    多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、
    多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、
    多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、
    多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット
    とからなる、請求項１６に記載の方法。
  26. ステップ（ａ）の前に、プライマー伸長産物の前記集団が作製されたときに取り込まれなかったプライマーを除去するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  27. 前記除去するステップが、プライマー伸長産物の前記集団が作製されたときに取り込まれなかった前記プライマーを分解するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記分解するステップが熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記熱不安定性エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. ステップ（ａ）に続く前に、前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する、請求項２９に記載の方法。
  31. （Ｉ）多型部位の群を含む核酸試料を供給するステップと、
    （ＩＩ）
    ａ）既知の多型部位の上流で既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする３’領域をそれぞれが含む第１オリゴヌクレオチドプライマーのセット
    （前記第１オリゴヌクレオチドプライマーのセットの各メンバーは３’領域の５’側に位置する共通の配列タグを含み、
    前記第１オリゴヌクレオチドプライマーのセットの各メンバーは、別個のサイズを有する増幅産物が前記既知の多型部位の群において各多型部位について生成するように選択される。）と、
    ｂ）５’から３’の方向に、
    ｉ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＧに特異的に対応するタグ、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＡに特異的に対応するタグ、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＴに特異的に対応するタグ、および前記プライマーの３’末端ヌクレオチドとしてＣに特異的に対応するタグからなる群より選択される配列タグと、
    ｉｉ）前記多型部位の群における多型部位に隣接してかつその３’側にある配列に特異的にハイブリダイゼーションする領域であって、下流増幅プライマーセットが、前記多型部位の群における各多型部位について前記多型部位に隣接して特異的にハイブリダイゼーションする領域を含有するプライマーのサブセットを含む領域と、
    ｉｉｉ）Ｇ、Ａ、ＴまたはＣから選択される３’末端ヌクレオチドであって、前記末端ヌクレオチドは、その下流増幅プライマー上の（ｉ）に記載した配列タグに特異的に対応し、かつ、前記下流増幅プライマーが、多型部位に隣接してかつ３’側にある前記配列にハイブリダイゼーションする場合に、前記３’末端ヌクレオチドは前記多型部位に対向する、３’末端ヌクレオチド
    とを含む下流増幅プライマーのセット
    との存在下において、核酸試料の鎖を分離および再アニーリングするステップと、
    （ＩＩＩ）ステップ（ＩＩ）から得られたアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、伸長産物が生成するようにアニーリングされたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下で核酸ポリメラーゼと接触させるステップ（第１オリゴヌクレオチドプライマーから得られたプライマー伸長産物は、その相補体から分離される場合に、第２オリゴヌクレオチドプライマーのセットのメンバーの伸長産物を合成するための鋳型として働きうるものであり、およびその逆も成立する。）と、
    （ＩＶ）前記第１オリゴヌクレオチドと同一であるかまたはこれに相補的である配列、および前記下流増幅プライマーセットのメンバーと同一であるかまたはこれに相補的である配列の両方を含む核酸分子の集団を含む反応混合物が生成するように、鎖の分離および接触のステップ（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を２回反復するステップと、
    （Ｖ）アニーリングしていないオリゴヌクレオチドプライマーの分解を可能にする条件下で、アニーリングしていないプライマーが分解されるように、ステップ（ＩＶ）で生成した集団を熱不安定性エキソヌクレアーゼと接触させるステップと、
    （ＶＩ）前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化するステップと、
    （ＶＩＩ）核酸分子の前記集団を増幅処理に付すステップ
    （前記増幅処理は、前記第１オリゴヌクレオチドプライマーを構成する共通の配列タグを含む上流増幅プライマー、および識別可能に標識された下流増幅プライマーのセットを用いて実施され、
    前記識別可能に標識された下流増幅プライマーセットの各メンバーは、前記下流増幅プライマーセットを構成するタグを含む。）と、
    （ＶＩＩＩ）別個のサイズの増幅産物をサイズおよび／または電荷で分離するステップと、
    （ＩＸ）少なくとも１つの識別可能な標識の取り込みを検出することによって前記既知の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するステップ（前記識別可能に標識されたプライマーの同じセットは、前記標的多型部位セットのすべてのメンバーにおけるヌクレオチドの同一性を特定する。）
    とを含む、既知の多型部位の群に存在する一塩基の同一性を決定する方法。
  32. 前記識別可能に標識された下流プライマーが蛍光部分を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記分離するステップがキャピラリー電気泳動を含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも２回含み、各サイクルが、
    １）核酸鎖を分離するステップと、
    ２）オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングするステップと、
    ３）アニーリングされたプライマーをポリメラーゼ伸長するステップ
    とを含む、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記増幅処理の間、および少なくとも１回の前記反応サイクルの後に、
    増幅反応産物の一部分を除去するステップと、
    サイズおよび／または電荷により核酸分子を分離するステップと、
    前記識別可能な標識の取り込みを検出するステップ
    とをさらに含む方法であって、前記検出するステップにより前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記除去するステップと、分離するステップと、検出するステップとを、前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ステップ（Ｉ）〜（ＩＸ）が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項３１に記載の方法。
  38. 前記第１タグ配列および／または第２タグ配列がそれぞれ１５〜４０個のヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の方法。
  39. 前記既知の多型部位の上流の既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする前記３’領域が１０〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の方法。
  40. 前記多型部位の３’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする前記領域が１０〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の方法。
  41. 前記識別可能に標識された下流の増幅プライマーのセットが、多型部位においてＡの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、多型部位においてＣの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、多型部位においてＧの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットと、多型部位においてＴの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットとからなる、請求項３１に記載の方法。
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