KR20050034651A

KR20050034651A - 서열 차이를 감지하는 방법

Info

Publication number: KR20050034651A
Application number: KR1020047021365A
Authority: KR
Inventors: 블라디미르아이. 슬렙네브
Original assignee: 센션 인코포레이티드
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2005-04-14
Also published as: EP1534859B1; US20110300537A1; JP2005531314A; EP1534859A4; CA2490864A1; AU2009200987A1; WO2004003136A2; JP4617403B2; CA2490864C; US20040096870A1; DE60335116D1; CN1665938B; EP1534859A2; AU2003243700A1; CN1665938A; ATE489477T1; KR101038137B1; AU2003243700B2; WO2004003136A3

Abstract

본 발명은 핵산 시료에서 단일 뉴클레오티드 차이의 유전형 분석 방법에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 게놈 DNA 시료에서 다형성 부위 또는 일군의 다형성 부위의 뉴클레오티드를 확인하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 한 세트의 태그서열이 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체에 상응하는 태그-표지된 프라이머 신장을 이용한다. 프라이머 신장 산물은 공통하는 한 세트의 태그-특이적 프라이머, 식별가능 라벨을 보유하는 하류 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다. 크기 및/또는 전하에 의한 분리이후, 예상 크기의 산물에서 식별가능 라벨의 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다. 상기 방법은 일련의 반응에서 다중 단일-뉴클레오티드 차이의 유전형 분석에 매우 적합하다.

Description

서열 차이를 감지하는 방법{METHODS OF DETECTING SEQUENCE DIFFERENCES}

본 출원은 U.S. 분할 출원 60/392,331(2002/6/28)의 우선권을 주장한다.

본 발명은 개체군의 서열과 비교하여 개인의 게놈에서 서열 차이를 확인하는 분자유전학 방법에 관한다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 게놈 서열에서 단일 뉴클레오티드 차이의 확인 방법에 관한다.

생물체의 게놈을 포함하는 핵산은 생물체에 대한 유전 정보를 보유한다. 개체간 유전자 서열에서 변이성(variability)은 명백한 표현형 차이(예, 머리카락, 피부 등의 색소형성) 및 명백하지 않은 표현형 차이(예, 약제 내성과 질환 감수성)의 원인이 된다. 단일 염기쌍 치환을 비롯한 뉴클레오티드 서열의 미세한 변화도 단백질의 성질이나 수량에 영향을 줄 수 있다. 단일 뉴클레오티드 변화는 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 SNP라고 하는데, SNP가 발생하는 부위는 다형성 부위라고 한다. DNA 다형성은 게놈 전체에서 유전자이내 및 유전자간에 위치하고, 다양한 형태가 차별적 유전자 기능(동일한 서열의 양 택일적 형태의 기능을 비교하여 측정)을 유발하거나 유발하지 않을 수 있다. 대부분의 다형성은 유전자 기능을 변화시키지 않는데, 이는 "중성" 다형성이라 한다. 다른 다형성은 예로써 단백질의 아미노산 서열을 변화시키거나 프로모터 또는 RNA 절단접합이나 분해 신호와 같은 조절 서열을 변화시킴으로써 유전자 기능에 영향을 주는데, 통상적으로 돌연변이라 한다. SNP와 연관된 질환은 아래와 같다: 겸상 적혈구 빈혈, β-지중해빈혈, 당뇨병, 낭포성 섬유증, 고지방단백혈증, 다양한 자가면역 질환 및 일부 종양 유전자, 예를 들면, 변이 P53의 형성. 점 돌연변이는 질병 상태를 유발하거나 영향을 줄 뿐만 아니라 변화된 병원성이나 질병 감수성 및 약제 내성을 유발할 수 있다.

DNA 서열에서 특이적인 뉴클레오티드 변화 또는 돌연변이를 감지하는 능력은 다양한 의료와 비-의료 목적에 유용하다. 뉴클레오티드 변화를 확인할 수 있는 능력은 SNP와 연관된 유전자를 확인하는 유전자 연구에도 유용하다. 다형성이 하나이상 유전자의 기능을 변화시켜 질환 감수성이 증가한다면, 이런 질환이 없는 개체와 비교하여 이런 질환을 앓는 개체에서 다형성이 더욱 빈번하게 나타난다. 통계학적 방법을 이용하여 정상 개체군과 비교하여 병든 개체군에서 발견되는 다형성 빈도를 평가하고 다형성과 질환 표현형간 인과 관계의 확립을 용이하게 할 수 있다.

질환과 상관하는 서열을 변이를 신속하게 확인할 수 있는 방법은 예방적 조치를 가능하게 하고, 질환 발병의 가능성을 사정하며 이런 질환의 예후를 평가하는 데에도 유용하다. SNP의 비-의료적 활용의 예는 미생물 또는 이들의 특정 균주의 감지 및 법의학적 분석이다.

SNP 유용성의 핵심은 공지된 SNP에 관하여 개체의 유전형을 결정하는 능력이다. 이런 문제에 대한 다양한 접근이 시도되었다. 가령, 일부 다형성은 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 우연한 변화를 유도하고, 따라서 절단된 게놈 DNA 시료가 전기영동에 의해 분리될 때 관찰되는 단편의 패턴을 변화시킨다. 이는 제한 단편 길이 다형성 분석법(또는 RFLP 분석법)의 기초이다. RFLP 분석법은 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 영향을 주는 변화만을 감지할 수 있고, 처리량을 한정하는 겔 전기영동과 염색에 의존한다는 점에서 제한된다.

단일-가닥 구조 다형성(SSCP) 분석법 역시 증폭된 DNA 단편에서 SNP를 감지할 수 있다. 상기 방법에서, 증폭된 단편은 변성되고, 이후 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동동안 재-어닐링된다. 단일 뉴클레오티드 서열 변화의 존재는 야생형 서열과 비교하여 시료의 구조와 전기영동 이동(electrophoretic migration)에서 감지가능한 변화를 유발할 수 있다. 상기 방법은 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 대한 의존으로 인하여 제한된다.

혼성화-기초한 방법은 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 프로브를 이용한다(참조: European Patent Publications EP-237362; EP-329311). 혼성화-기초한 방법의 예는 예로써 프로브 RNA:시료 DNA 이중나선의 미스매치(mismatch)에서 리보뉴클레아제 A 절단 또는 프로브 RNA:시료 DNA 이중나선의 미스매치에 대한 변성 구배 겔 전기영동에 기초한 감지이다(Landegren et al., Science 242: 229-237, 1988; Rossiter et al, J. Biol. Chem. 265: 12753-12756, 1990).

SNP의 유전형을 분석하는 다른 방법은 대립형질-특이적 증폭(U.S. Pat. No. 5,521,301; 5,639,611; 5,981,176), 미니-서열화 방법, 정량적 RT-PCR 방법(예, "TaqMan 분석법": U.S. Pat. No. 5,210,015(Gelfand); U.S. Pat. No. 5,538,848(Livak, et al.,); U.S. Pat. No. 5,863,736(Haaland); Heid, C. A., et al. Genome Research, 6: 986-994 (1996); Gibson, U.E. M, et al., Genome Research 6: 995-1001 (1996); Holland, P. M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 7276-7280, (1991); Livak, K. J., et al., PCR Methods and Applications 357-362 (1995)), 단일 뉴클레오티드 프라이머 신장(SNuPE) 분석법(U.S. Pat No. 5,846,710) 및 관련된 신장 분석법(U.S. Pat. Nos. 6,004,744; 5,888,819; 5,856,092; 5,710,028; 6,013,431)을 이용한다. 향상된 SNP 유전형 분석법이 당분야에 요구된다.

대부분의 SNP 유전형 분석법은 분석(SSCP 분석)을 위한 충분한 재료를 만들기 위하여, 또는 차이가 감지되도록 한가지 형태와 다른 형태를 차별적으로 증폭하기 위하여 PCR 증폭에 상당히 의존한다. PCR-기초한 방법의 처리량을 증가시키기 n위하여, 다중 SNP가 한 세트의 반응물에서 감지될 수 있도록 반응물을 다중화하는데 노력이 집중되고 있다. 다중 SNP-보유 단편에 특이적인 프라이머 쌍을 단순히 첨가하는 다중화는 표적 단편의 비효율적인 증폭 및 인공 단편의 발생을 유발하는 프라이머 상호작용에 의한 문제점에 직면한다.

모세관 전기영동(CE)은 SNP를 검사하는데 이용되고 있다. 한 연구에서는 CE를 이용하여 단일 뉴클레오티드 중합효소 신장 분석법의 결과를 분석하였다(Piggee et al., 1997, J. Chromatography A. 781: 367-375). 상기 연구에서, 공지된 SNP를 보유하는 PCR-증폭된 DNA는 다형성 부위에 바로 인접한 프라이머의 혼성화와 단일 형광 표지된 사슬 종결인자로 프라이머의 신장, 이후 CE 분리와 함입된 라벨의 감지에 의해 분석되었다. 다른 연구에서, 공지된 SNP를 보유하는 PCR-증폭된 DNA는 2개의 동일하게 형광 표지된 사슬 종결인자중 한가지로 신장하고, 이후 CE 분리와 함입된 라벨의 감지를 실행하였다. 함입된 종결인자의 실체는 CE 이동에서 올리고뉴클레오티드에 대한 서열-특이적 차이에 기초한다. McClay et al. Anal. Biochem. 301: 200-206, 2002에서는 3' 말단 염기에서 차별되는 한 세트의 2가지 차별적으로 형광 표지된 프라이머를 공통 상류 프라이머로 이용한 PCR, 이후 CE와 형광 감지를 수반하는 SNP 유전형 분석법을 기술한다. 처리량은 상이한 크기의 증폭 산물을 혼합하고 전기영동하여 증가시켰다.

U.S. 특허 6,074,831에서는 그래프 이론 기술에 따라 부분세트로 분할된 분자의 동시 분리를 위한 CE의 활용 및 상기 방법의 SNP 유전형 분석에 적용을 기술한다.

U.S. 특허 6,322,980에서는 다형성 부위에 혼성화된 프라이머로부터 형광 라벨을 방출시키는 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 이용한 SNP 감지 방법에서 CE의 활용을 기술한다. U.S. 특허 6,270,973 역시 핵산 프로브 해중합 활성을 수반하는 SNP 유전형 분석법에서 CE 분리의 활용을 기술한다.

U.S. 특허 6,312,893에서는 태그가 특정 뉴클레오티드와 상관하는 유기적으로 표지된 단편을 생성하는 서열화 방법을 기술한다. 단편은 CE로 분리하고, 이후 단편으로부터 태그를 절단하고 비-형광 분광법 또는 전위차법(potentiometry)으로 절단 태그를 감지한다.

U.S. 특허 6,156,178에서는 다형성 부위에 혼성화된 프라이머로부터 식별 뉴클레오티드를 방출하는 해중합 활성을 이용한 SNP 감지 방법에서 CE의 활용을 기술한다.

하지만, 상기한 방법에서는 프라이머 신장이나 증폭 단계에서 핵산 서열 태그, 신장과 증폭에 서로 다른 프라이머, 공통 증폭 프라이머 세트 또는 실시간 증폭 모니터링과 감지를 이용하지 않는다.

본 발명의 요약

본 발명은 서열 차이에 관하여 핵산 시료의 유전형 분석에 유용한 방법을 제시한다. 바람직한 측면에서, 상기 방법은 단일 뉴클레오티드 차이, 예를 들면, 단일 뉴클레오티드 다형성의 결정에 유용하다. 본 발명의 방법은 이질성 서열 태그를 포함하는 프라이머 신장 산물의 PCR 증폭, 이후 모세관 전기영동 크기 분리와 증폭된 신장 산물의 감지를 수반한다. 한 측면에서, 크기 분리와 산물 감지는 실시간으로 실행된다. CE 분리와 감지 기술이 증폭된 단편 크기 및 일정한 증폭 산물에 존재하는 라벨의 실체를 비롯한 정보를 제공하기 때문에, 상기한 방법은 시료에서 공지된 다중 SNP에 관하여 유전형을 동시 분석하는데 매우 적합하다. 각 공지된 SNP는 다형성 부위에서 특정 뉴클레오티드의 존재와 특이적으로 상관하는 식별가능하게 표지된 서열 태그를 보유하는 변화된 크기의 증폭 단편의 증폭으로 감지될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 다중 SNP의 감지를 위하여 한 세트의 증폭 프라이머를 요구하고, 따라서 서로 다른 다중 증폭 프라이머의 이용과 관련된 문제점의 충격을 감소시킨다.

본 발명은 일정한 핵산 시료에 대하여 공지된 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 아래의 단계로 구성된다:

a) 핵산 시료로부터 발생된 프라이머 신장 산물 집합체에 증폭 과정을 실시하고, 각 프라이머 신장 산물은 태그 서열을 포함하고, 상기 태그 서열은 공지된 다형성 부위에서 하나의 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하고, 여기서 상기 증폭 과정은 하나의 상류 증폭 프라이머와 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 프라이머 신장 산물 집합체의 구성원과 식별가능 라벨로 구성되는 태그 서열을 포함하고, 각 식별가능 라벨은 다형성 부위에서 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응한다;

b) 식별가능 라벨의 핵산 분자로의 함입을 감지하여 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.

한 구체예에서, 식별가능 라벨은 형광 라벨이다.

다른 구체예에서, (b) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리한다. 바람직한 구체예에서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행한다.

다른 구체예에서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다. 또 더욱 바람직한 구체예에서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행한다. 또 더욱 바람직한 구체예에서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행한다.

다른 구체예에서, (a)와 (b) 단계는 서열 증폭기, 시료 채취 장치, 모세관 전기영동 장치, 형광 감지기를 포함하는 모듈 기구에서 실행한다.

다른 구체예에서, 태그 서열은 15개 내지 40개 뉴클레오티드를 포함한다.

다른 구체예에서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머로 구성된다.

다른 구체예에서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머 한 쌍의 올리고뉴클레오티드: 다형성 부위의 첫 번째 대립형질에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 다형성 부위의 두 번째 대립형질에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성된다.

다른 구체예는 (a) 단계에 앞서, 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 제거 단계는 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 분해시킨다. 더욱 바람직한 구체예에서, 분해는 열 불안정한 엑소뉴클레아제를 사용하여 실행한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I과 엑소뉴클레아제 Ⅶ에서 선택된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 (a) 단계로의 속행에 앞서, 열에 의해 불활화된다.

또한, 본 발명은 일정한 핵산 시료에 대하여 의문되는 한 세트의 공지된 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 아래의 단계로 구성된다:

a) 핵산 시료로부터 발생된 프라이머 신장 산물 집합체에 증폭 과정을 실시하고, 각 프라이머 신장 산물은 한 세트의 태그 서열의 구성원을 포함하고, 상기 태그 서열은 공지된 다형성 부위에서 하나의 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하고, 여기서 상기 증폭 과정은 의문되는 공지된 다형성 부위를 포함하는 각 서열에 대한 하나의 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 프라이머 신장 산물 집합체의 구성원 및 다형성 부위에서 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하는 식별가능 라벨로 구성되는 태그 서열을 포함하고, 상류 증폭 프라이머는 의문되는 한 세트의 공지된 다형성 부위의 각 다형성 부위가 변화된 크기의 증폭 산물에 상응하도록 선택된다;

b) 변화된 크기의 증폭 산물에서 식별가능 라벨의 함입을 감지하여 각 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.

한 구체예에서, 식별가능 라벨은 형광 라벨이다.

한 구체예에서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성된다.

바람직한 구체예는 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행한다.

다른 구체예에서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트로 구성된다.

다른 구체예는 (a) 단계에 앞서, 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제거 단계는 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 분해시킨다. 더욱 바람직한 구체예에서, 분해는 열 불안정한 엑소뉴클레아제를 사용하여 실행한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I과 엑소뉴클레아제 Ⅶ에서 선택된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 (a) 단계로의 속행에 앞서, 열에 의해 불활화된다.

a) 핵산 시료로부터 발생된 프라이머 신장 산물 집합체에 증폭 과정을 실시하고, 각 프라이머 신장 산물은 1차 태그 서열 또는 이의 보체 및 한 세트의 2차 태그 서열의 구성원 또는 이의 보체를 포함하고, 2차 태그 서열 또는 이의 보체의 존재는 공지된 다형성 부위에서 하나의 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하고, 각 다형성 부위에 대하여 한 세트의 다형성 부위에서 1차 태그 서열은 다른 다형성 부위를 보유하는 시료에서 분자상의 다형성 부위로부터 1차 태그 서열의 간격과 비교하여 다형성 부위의 5'에서 변화된 간격으로 위치하고, 여기서 상기 증폭 과정은 1차 태그 서열을 포함하는 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 프라이머 신장 산물 집합체의 구성원 및 다형성 부위에서 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하는 식별가능 라벨로 구성되는 태그 서열을 포함하고, 상류 증폭 프라이머는 의문되는 한 세트의 공지된 다형성 부위의 각 다형성 부위가 변화된 크기의 증폭 산물에 상응하도록 선택된다;

한 구체예에서, 식별가능 라벨은 형광 라벨이다.

다른 구체예에서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성된다. 바람직한 구체예는 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행한다.

또한, 본 발명은 공지된 다형성 부위에서 단일 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 아래의 단계로 구성된다:

I) 다형성 부위를 포함하는 핵산 시료를 제공하고;

Ⅱ) 핵산 시료의 가닥을 분리하고 아래의 존재에서 재-어닐링하며;

a) 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역을 포함하는 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 3' 영역의 5'에 위치한 1차 서열 태그를 포함하고;

b) 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 한 세트의 각 구성원은 아래를 포함하고:

i) 다형성 부위의 3'에 혼성화되고 인접하는 영역;

ii) 가변 3' 말단 뉴클레오티드, 여기서 상기 구성원은 공지된 서열에 혼성화되고, 3' 말단 뉴클레오티드는 다형성 부위를 마주보며, 3' 말단 뉴클레오티드가 다형성 부위에서 뉴클레오티드에 상보적인 경우에 상기 3' 말단 뉴클레오티드 염기는 다형성 부위에서 상기 뉴클레오티드와 쌍을 이루고;

iii) (ii)의 가변 3'-말단 뉴클레오티드에 상응하는 태그 서열, 상기 태그 서열은 상기 구성원에서 (i) 영역의 5'에 위치하고;

III) 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 신장을 가능하게 하는 조건하에 (II) 단계에서 유래된 어닐링된 올리고뉴클레오티드와 핵산 중합효소를 접촉시켜 신장 산물을 생성하고, 여기서 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 프라이머 신장 산물은 보체로부터 분리될 때 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원의 신장 산물의 합성을 위한 주형으로 기능할 수 있고;

Ⅳ) 가닥 분리와 접촉 단계 (II)와 (III) 2회 반복하여 1차 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 서열 및 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드의 구성원과 동일하거나 상보적인 서열 모두를 포함하는 핵산 분자 집합체를 생성시키고;

V) 어닐링되지 않은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 분해를 가능하게 하는 조건하에 (IV) 단계에서 생성된 집합체를 열-불안정성 엑소뉴클레아제와 접촉시켜 프라이머를 분해시키고;

VI) 열-불안정성 엑소뉴클레아제를 열에 의해 불활성화시키고;

Ⅶ) 핵산 분자 집합체에 증폭 과정을 실행하고, 상기 증폭 과정은 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성되는 1차 서열 태그를 포함하는 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원과 식별가능 라벨로 구성되는 태그를 포함하고;

Ⅷ) 적어도 하나의 식별가능 라벨의 함입을 감지하여 공지된 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.

한 구체예에서, 식별가능 라벨은 형광 라벨이다.

다른 구체예에서, (Ⅷ) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리한다. 바람직한 구체예에서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행한다.

다른 구체예에서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성된다. 바람직한 구체예는 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다. 다른 바람직한 구체예에서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행한다.

다른 구체예에서, I-Ⅷ 단계는 서열 증폭기, 시료 채취 장치, 모세관 전기영동 장치, 형광 감지기를 포함하는 모듈 기구에서 실행한다.

다른 구체예에서, 공지된 다형성 부위의 상류에 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역은 10-30개 뉴클레오티드를 포함한다.

다른 구체예에서, 다형성 부위의 3'에 혼성화되고 인접하는 영역은 10-30개 뉴클레오티드를 포함한다.

다른 구체예에서, 한 세트의 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트로 구성된다.

또한, 본 발명은 일군의 공지된 다형성 부위에 존재하는 단일 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 아래의 단계로 구성된다:

I) 일군의 다형성 부위를 포함하는 핵산 시료를 제공하고;

a) 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역을 포함하는 한 세트의 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 한 세트의 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 각 구성원은 상기 3' 영역의 5'에 위치한 공통 서열 태그를 포함하고, 상기 한 세트의 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 각 구성원은 변화된 크기의 증폭 산물이 일군의 공지된 다형성 부위에서 각 다형성 부위에 대하여 생성되도록 선택되고;

b) 5'에서 3' 순서로 아래를 포함하는 한 세트의 하류 증폭 프라이머: i) 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 G에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 A에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 T에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 C에 특이적으로 상응하는 태그에서 선택되는 서열 태그;

ii) 일군의 다형성 부위에서 다형성 부위에 인접하는 3' 서열에 특이적으로 혼성화되는 영역, 여기서 한 세트의 하류 증폭 프라이머는 일군의 다형성 부위의 각 다형성 부위에서 다형성 부위에 특이적으로 혼성화되고 인접하는 영역을 보유하는 프라이머 부분세트를 포함하고;

iii) G, A, T, C에서 선택되는 3' 말단 뉴클레오티드, 상기 말단 뉴클레오티드는 하류 증폭 프라이머에서 (i)에 기술된 서열 태그에 특이적으로 상응하고, 상기 하류 증폭 프라이머가 다형성 부위에 인접하는 3' 서열에 혼성화되면 상기 3' 말단 뉴클레오티드는 다형성 부위를 마주보며;

III) 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 신장을 가능하게 하는 조건하에 (Ⅱ) 단계에서 유래된 어닐링된 올리고뉴클레오티드와 핵산 중합효소를 접촉시켜 신장 산물을 생성하고, 여기서 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 프라이머 신장 산물은 보체로부터 분리될 때 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원의 신장 산물의 합성을 위한 주형으로 기능할 수 있고;

Ⅳ) 가닥 분리와 접촉 단계 (II)와 (III) 2회 반복하여 1차 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 서열 및 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 구성원과 동일하거나 상보적인 서열 모두를 포함하는 핵산 분자 집합체를 함유하는 반응 혼합물을 생성시키고;

V) 어닐링되지 않은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 분해를 가능하게 하는 조건하에 (IV) 단계에서 생성된 집합체를 열-불안정성 엑소뉴클레아제와 접촉시켜 어닐링되지 않은 프라이머를 분해시키고;

Ⅶ) 핵산 분자 집합체에 증폭 과정을 실행하고, 상기 증폭 과정은 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성되는 공통 서열 태그를 포함하는 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원과 식별가능 라벨로 구성되는 태그를 포함하고;

Ⅷ) 적어도 하나의 식별가능 라벨의 함입을 감지하여 공지된 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.

한 구체예에서, 식별가능 라벨은 형광 라벨이다.

한 구체예에서, (Ⅷ) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리한다. 바람직한 구체예에서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행한다.

다른 구체예에서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성된다. 바람직한 구체예는 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행한다.

다른 구체예에서, 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역은 10-30개 뉴클레오티드를 포함한다.

또한, 본 발명은 핵산 시료에 존재하는 다형성 부위에서 뉴클레오티드를 결정하기 위한 키트에 관하는데, 상기 키트는 아래를 포함하는 한 세트의 상류 프라이머를 함유한다:

a) 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격으로 특이적으로 혼성화될 만큼 충분한 5'-태그 서열과 3' 서열을 포함하는 1차 프라이머;

b) 5'에서 3' 순서로 아래를 포함하는 한 세트의 4가지 하류 증폭 프라이머: i) 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 G에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 A에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 T에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 C에 특이적으로 상응하는 태그에서 선택되는 서열 태그;

iii) G, A, T, C에서 선택되는 3' 말단 뉴클레오티드, 상기 말단 뉴클레오티드는 하류 증폭 프라이머에서 (i)에 기술된 서열 태그에 특이적으로 상응하고, 상기 하류 증폭 프라이머가 다형성 부위에 인접하는 3' 서열에 혼성화되면 상기 3' 말단 뉴클레오티드는 다형성 부위를 마주본다.

한 구체예는 다형성을 검사받는 생물체의 게놈에서 유전자에 특이적인 서열이 부재하는 한 세트의 5가지 프라이머를 추가로 포함하고, 상기 프라이머는 1차 프라이머의 태그 서열을 보유하는 프라이머 및 한 세트의 4가지 하류 2차 프라이머의 태그 서열을 보유하는 한 세트의 4가지 식별가능하게 표지된 프라이머를 포함한다.

본 명세서에서 "시료"는 자연 환경에서 분리되고 폴리뉴클레오티드를 함유하는 생물학적 물질을 의미한다. 본 명세서에 따른 "시료"는 정제되거나 분리된 폴리뉴클레오티드로 구성되거나, 또는 조직 시료, 생물학적 유체 시료 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 시료와 같은 생물학적 시료로 구성된다. 생물학적 유체에는 혈액, 혈장, 가래, 뇨, 뇌 척수액, 위 세척액, leukophoresis 시료가 포함된다. 본 발명의 시료는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 임의의 식물, 동물, 세균 또는 바이러스 물질이다.

본 명세서에서 "다형성"은 핵산 서열 변이를 의미한다. 자연 발생 서열과 비교하여, 다형성은 개체군에서 0.01%, 0.1%, 1% 또는 그 이상의 빈도로 나타날 수 있다. 본 명세서에서, 다형성은 삽입, 결실, 중복 또는 재정렬일 수 있다. 본 명세서에서, "단일 뉴클레오티드 다형성" 또는 "SNP"는 단일 뉴클레오티드 결실, 삽입, 또는 염기 변화를 비롯한 단일 뉴클레오티드 잔기에서 핵산 서열 변이를 의미한다. SNP를 비롯한 다형성은 표현형에서 중성이거나 해당 좌위에서 우세 서열에 의해 나타나는 표현형과 구별되는 변이 표현형을 보유할 수 있다. 본 명세서에서 "중성 다형성"은 서열 변이가 유전자 기능을 변화시키지 않는 다형성을 의미하고, "돌연변이" 또는 "기능적 다형성"은 유전자 기능을 변화시키고 연관된 표현형을 갖는 서열 변이를 의미한다.

SNP에 관한 개체의 표현형에서, "우세 대립형질"은 검사되는 개체군에서 가장 빈번하게 나타나는 대립형질을 의미한다(2개의 대립형질이 존재하는 경우에, 50% 초과의 개체군에서 나타나는 대립형질은 우세 대립형질이다; 2개 초과의 대립형질이 존재하는 경우에, "우세 대립형질"은 검사되는 개체군에서 최대 빈도, 예를 들면, 해당 부위에서 다른 대립형질과 비교하여 적어도 5% 높은 빈도로 나타나는 대립형질을 의미한다). "변이 대립형질"은 상기 개체군에서 우세 대립형질보다 낮은 빈도로 나타나는 대립형질을 의미한다(2개의 대립형질이 존재하는 경우에, 50% 미만의 개체군에서 나타나는 대립형질은 변이 대립형질이다; 2개 초과의 대립형질이 존재하는 경우에, 변이 대립형질은 우세 대립형질과 비교하여 적어도 5% 낮은 빈도로 나타나는 모든 대립형질을 의미한다).

본 명세서에서, "다형성 부위"는 다형성 뉴클레오티드 서열에서 개체간 변화되는 뉴클레오티드 위치를 의미한다.

본 명세서에서 "올리고뉴클레오티드 프라이머"는 폴리뉴클레오티드 주형에 상보적인 신장 산물을 생산하기 위하여 폴리뉴클레오티드 주형에 어닐링하고 3' 말단을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자(즉, DNA 또는 RNA)를 의미한다. 일반적으로, 개시와 신장 조건은 적절한 온도에서 적절한 완충액("완충액"은 보조인자이거나 pH, 이온력 등에 영향을 주는 치환기를 보유한다)에 4가지 서로 다른 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산염 및 중합화-유도제, 예를 들면, DNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재를 수반한다. 본 발명에 따른 프라이머는 단일- 또는 이중-가닥이다. 프라이머는 증폭에서 최대 효율을 위하여 단일-가닥이고, 프라이머와 이의 보체는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 형성한다. 본 발명에 유용한 "프라이머"는 100개 이하, 예를 들면, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20게, 또는 15개, 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

본 명세서에서, "중합효소 신장"은 핵산 중합효소에 의한 적어도 하나의 상보성 뉴클레오티드의 어닐링된 프라이머 3' 말단으로의 주형-의존성 함입을 의미한다. 적절하게는, 중합효소 신장은 하나이상 뉴클레오티드, 바람직하게는 주형의 전장에 상응하는 뉴클레오티드를 추가한다. 중합효소 신장을 위한 조건은 중합효소의 실체에 좌우된다. 중합효소 신장의 온도는 상기 효소의 공지된 활성에 기초한다. 일반적으로, 이들 효소가 최적 신장 온도 미만에서 적어도 부분적인 활성을 유지하긴 하지만, 가장 일반적으로 사용되는 열안정성 중합효소(예, Taq 중합효소와 이의 변이체)에 의한 중합효소 신장은 65℃ 내지 75℃, 바람직하게는 대략 68-72℃이다.

본 명세서에서, "프라이머 신장 산물"은 중합효소 신장 방법으로 생성된 핵산 분자를 의미한다.

본 명세서에서, "태그 서열," 또는 단순히 "태그"는 표준 포스포디에스테르 결합(즉, 태그의 3' OH와 올리고뉴클레오티드의 5' 인산염 사이의 포스포디에스테르 결합)을 통하여 올리고뉴클레오티드 프라이머에 부착되고 "태그"가 함입되는(예로써, 프라이머 신장 또는 프라이머 신장 산물의 증폭에 의해 함입되는) 폴리뉴클레오티드의 확인 또는 추적을 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 이질성이나 인공 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본 발명에 따른 "태그" 서열은 적어도 15개, 바람직하게는 20개 내지 30개 뉴클레오티드를 포함하고, 바람직하게는 프라이머 신장 조건하에, 유전형 분석되는 생물체의 게놈에서 서열에 혼성화되지 않는다. 본 발명에 따른 태그 서열은 무작위일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.

본 명세서에서, "특이적으로 상응하는"은 올리고뉴클레오티드에서 일정한 핵산 태그 서열이 일정한 3'-말단 뉴클레오티드와 함께 이용되어, 이런 태그 서열의 존재가 상기 3'-말단 뉴클레오티드의 존재를 지시한다는 것을 의미한다. 가령, 태그 서열 "1"은 3'-말단 A를 갖는 올리고뉴클레오티드에만 사용되고, 태그 서열"2"는 3'-말단 C를 갖는 올리고뉴클레오티드에만 사용되며, 태그 서열 "3"은 3'-말단 G를 갖는 올리고뉴클레오티드에만 사용되고, 태그 서열 "4"는 3'-말단 T를 갖는 올리고뉴클레오티드에만 사용된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서, 단편이 태그 2에 특이적인 프라이머로 증폭되면, 최초 프라이머 신장 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드는 C이고, 시료에서 다형성 뉴클레오티드는 G이다.

본 명세서에서, "증폭 과정"은 관심 핵산 서열을 특이적으로 증폭하는, 다시 말하면, 상기 서열의 존재비(abundance)를 증가시키는 공정을 의미한다. 본 발명에 따른 증폭 과정은 적어도 2회, 바람직하게는 적어도 5회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회, 35회 또는 그 이상의 반복 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리(예, 열 변성); 2) 주형 분자에 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성된다. 이들 각 단계에 필요한 조건과 시간은 당분야에 널리 공지되어 있다. 증폭 과정을 이용하여 달성된 증폭은 가급적 기하급수적이지만 선형일 수도 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 증폭 과정은 상업적으로 구입가능한 서열 증폭기에서 실행한다.

본 명세서에서, "한 세트(set)"은 일군의 핵산 시료, 프라이머 또는 존재물을 의미한다. 한 세트는 공지된 숫자, 예를 들면 적어도 2개의 존재물을 포함한다.

본 명세서에서, "부분세트"는 상기한 한 세트로 구성되는 일군을 의미하는데, 부분세트는 한 세트의 모든 구성원보다 적다. 본 명세서에서 부분세트는 단일 존재물로 구성될 수 있다.

본 명세서에서, 상대적 용어 "상류"와 "하류"는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위에 상대적인 위치를 표시한다. 일반적으로, "상류"는 다형성 부위의 5'를 의미하고, "하류"는 다형성 부위의 3'을 의미한다. 이중-가닥 DNA 서열에서 "상류"와 "하류"의 선택은 상당히 임의적인데, 그 이유는 어떤 가닥이 "참고"가닥으로 선택되는 지에 따라 다형성 부위의 "상류" 또는 "하류" 방향이 변하기 때문이다. 본 명세서에 기술된 방법에서 불명료함(ambiguity)을 차단하기 위하여, 용어 "상류"와 "하류"의 선택을 위한 "참고" 가닥은 상기 방법에서 동일하게 한다.

본 명세서에서, "식별가능하게 표지된"은 라벨이 함입되는 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 핵산 분자로부터 신호가 다르게 표지된 프라이머 또는 핵산 분자로부터 신호와 차별된다는 것을 의미한다. 감지가능 라벨에는 예로써 광-흡수 염료, 형광 염료, 또는 방사능 라벨이 포함된다. 형광 염료가 선호된다. 일반적으로, 형광 신호는 피크 방출 파장이 적어도 20 nm로 분리되면 다른 형광 신호로부터 식별가능하다. 특히 일정한 반응물에서 형광단의 방출 피크가 폭이 좁거나 갑작스런 피크와 대조적으로, 폭이 넓은 경우에 좀더 높은 분리가 선호된다.

본 명세서에서, "핵산 분자를 분리하는"은 크기 및/또는 전하에 기초하여 시료 또는 분량에서 핵산 시료를 물리적으로 분리하는 공정을 의미한다. 전기 영동 분리가 선호되고, 모세관 전기영동 분리가 가장 선호된다.

본 명세서에서, "함입을 감지하는"은 일정한 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 신장되고, 따라서 라벨이 프라이머 신장이나 증폭 산물에 함입되었는 지를 결정하는 공정을 의미한다. 감지는 감지가능 라벨에 적합한 임의의 수단으로 실행할 수 있지만, 가급적 형광 라벨의 감지를 수반한다. 감지는 프라이머 신장이나 증폭 산물에서 라벨의 존재와 존재비 모두의 결정을 포괄한다. 형광 감지기는 당분야에 널리 공지되어 있다.

본 명세서에서, "특이적으로 혼성화되는"은 일정한 혼성화 조건하에 프로브 또는 프라이머가 표적 서열을 포함하는 시료에서 표적 서열에만 혼성화된다는 것을 의미한다. 일정한 혼성화 조건에는 증폭 과정에서 어닐링 단계를 위한 조건, 다시 말하면, 예정된 Tm에 기초하여 선택된 어닐링 온도 및 선택되는 중합효소에 적합한 염 조건이 포함된다.

본 명세서에서, "가닥 분리" 또는 "가닥을 분리하는"은 상보성 이중-가닥 분자가 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 어닐링에 가용한 2개의 단일 가닥으로 분리되도록 하는 핵산 시료의 처리를 의미한다. 본 발명에 따른 가닥 분리는 Tm 이상으로 핵산 시료를 가열하여 달성한다. 일반적으로, 핵산 중합효소에 적합한 완충액에서 핵산 분자를 보유하는 시료의 경우에, 94℃로 가열은 본 발명에 따른 가닥 분리를 달성할 만큼 충분하다. 전형적인 완충액은 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.8, 25℃), 0.5 내지 3 mM MgCl₂, 0.1% BSA를 함유한다.

본 명세서에서, "프라이머 어닐링" 또는 "재-어닐링"은 올리고뉴클레오티드 프라이머가 주형 핵산 가닥에 혼성화되도록 함을 의미한다. 프라이머 어닐링을 위한 조건은 프라이머의 길이와 서열에 따라 변하고, 프라이머에 대한 계산된 Tm에 기초한다. 일반적으로, 증폭 과정에서 어닐링 단계는 이런 어닐링을 가능하게 하는 충분한 시간동안, 가닥 분리 단계이후 온도를 프라이머 서열에 대한 계산된 Tm에 기초한 온도로 감소시키는 단계를 수반한다. Tm은 다양한 이용가능 알고리즘(예, Oligo^TM, Primer Design 및 Primer3과 Oligo Calculator를 비롯한 인터넷에서 입수가능한 프로그램)을 이용하여 당업자가 용이하게 예측할 수 있다. 대부분의 증폭 과정에서, 어닐링 온도는 예측된 Tm보다 5℃ 낮은 온도로 선택되지만, Tm에 좀더 근접하거나 초과하는 온도(예, 예측된 Tm보다 1℃ 내지 5℃ 낮은 온도, 또는 예측된 Tm보다 1℃ 내지 5℃ 높은 온도)가 이용될 수도 있고, 예측된 Tm보다 5℃ 초과하여 낮거나 높은 온도(예, 6℃ 낮은 온도, 8℃ 낮은 온도, 10℃ 낮은 온도 또는 그 이상 낮은 온도; 6℃ 높은 온도, 8℃ 높은 온도 또는 10℃ 높은 온도). 일반적으로, 어닐링 온도가 Tm에 근접할수록, 어닐링이 더욱 특이적이다. 프라이머 어닐링의 시간은 반응 부피(부피가 클수록 시간이 길어진다) 및 프라이머와 주형 농도(프라이머 대 주형의 상대적 비율이 높을수록 시간이 짧아진다)에 거의 좌우된다. 부피 및 프라이머/주형 농도에 따라, 증폭 과정에서 프라이머 어닐링 단계는 1초 내지 5분, 일반적으로 10초 내지 2분, 바람직하게는 30초 내지 2분의 차수로 진행된다.

본 명세서에서, "공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역"은 핵산 시료에서 유전형 분석되는 공지된 다형성의 상류(즉, 5') 서열에 특이적으로 혼성화되고 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "혼성화되는 3' 영역"은 적어도 12개, 바람직하게는 적어도 15개, 18개, 21개, 24개, 27개, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. "혼성화되는 영역"은 본 발명에 따른 방법에서 다른 증폭 산물과 비교하여 변화된 크기의 증폭 산물이 생성되도록 하는 다형성 부위로부터 공지된 간격일수 있다. "공지된 간격"은 50 내지 1000개 뉴클레오티드, 바람직하게는 50 내지 500개 뉴클레오티드 또는 50 내지 250개 뉴클레오티드이다.

본 명세서에서, "다형성 부위에 인접하여 3'에 혼성화되는 영역"은 상기 영역의 인접기 3' 뉴클레오티드가 다형성 부위의 하류에서 뉴클레오티드에 혼성화되도록 다형성 부위의 3'에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드, 일반적으로 10 내지 25개 뉴클레오티드이다. 본 발명에서는 이런 영역을 포함하는 한 세트의 4가지 프라이머를 이용하는데, 상기 세트는 4가지 상이한 3' 말단 뉴클레오티드, G, A, T 또는 C를 보유하는 올리고뉴클레오티드로 구성되고, 이들 중에서 하나만 다형성 부위에서 뉴클레오티드에 혼성화되고 핵산 중합효소에 의한 프라이머 신장이 가능하다.

본 명세서에서, "가변 3'-말단 뉴클레오티드"는 G, A, T 또는 C에서 선택될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오티드를 의미한다.

본 명세서에서, "다형성 부위를 마주보는"은 3'-말단 뉴클레오티드가 다형성 부위에서 뉴클레오티드에 상보적인 경우에, 다형성-보유 핵산 가닥에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머에서 뉴클레오티드, 3'-말단 뉴클레오티드가 다형성 부위에서 뉴클레오티드와 Watson-Crick 수소 결합된 염기쌍을 형성하도록 위치되었음을 의미한다.

본 명세서에서, "상보성"은 4가지 데옥시리보뉴클레오티드 G, A, T, C 사이에 A가 T와 쌍을 형성하고 G가 C와 쌍을 형성하는 수소-결합된 염기쌍 형성의 우선 체계를 의미한다.

본 명세서에서, "핵산 중합효소"는 뉴클레오시드 삼인산염의 주형-의존성 중합화를 촉매하여 주형 핵산 서열의 핵산 가닥중 하나에 상보적인 프라이머 신장 산물을 형성하는 효소를 의미한다. 핵산 중합효소는 어닐링된 프라이머의 3' 말단에서 합성을 개시하고 주형의 5' 말단 방향으로 합성을 진행시킨다. 다수의 핵산 중합효소가 당분야에 널리 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하다. 일군의 바람직한 핵산 중합효소는 열안정성이다. 다시 말하면, 이들은 상보성 핵산의 어닐링된 가닥을 변형시킬 만큼 충분한 온도에 노출된 이후에도 기능을 유지한다.

본 명세서에서 "분량"은 사이클링 과정동안 채취된 증폭 반응물의 시료를 의미한다. 분량은 반응물의 전체 부피보다 적고, 바람직하게는 부피에서 0.1-30%이다. 본 발명의 한 구체예에서, 제거되는 각 분량에 대하여 반응에 필요한 반응물(예, 완충액, 염, 뉴클레오티드, 중합효소)을 함유하는 동등 부피의 반응 완충액이 도입된다.

본 명세서에서, "신장 산물이 생성되도록 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 신장을 가능하게 하는 조건"은 핵산 중합효소가 프라이머 신장을 촉매하는 예로써 온도, 염과 보조 인자 농도, pH, 효소 농도를 비롯한 한 세트의 조건을 의미한다. 이런 조건은 사용되는 핵산 중합효소의 실체에 좌우되긴 하지만, 다수한 중합효소에 대한 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 한가지 전형적인 일단의 조건은 72℃에서 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.8, 25℃), 0.5 내지 3 mM MgCl₂, 200 μM의 각 dNTP, 0.1 % BSA인데, 이런 조건하에 Taq 중합효소가 프라이머 신장을 촉매한다.

본 명세서에서, "실시간"은 증폭 과정동안 또는 증폭 과정과 동시에 핵산 증폭 반응물에서 산물 축적의 측정이 적어도 개시되고, 바람직하게는 완결되는 것을 의미한다. 따라서, 이런 측정이 "실시간"으로 간주되려면, 적어도 각 분량에서 증폭 산물의 측정 또는 감지의 개시가 증폭과 동시에 진행되어야 한다. "개시된"은 분량이 채취되고 분리 기구, 예를 들면, 모세관 전기영동 기구에 놓여지며 분리가 시작된다는 것을 의미한다. 측정의 완결은 분량으로부터 분리된 핵산에서 표지된 화학종의 감지이다. 분리와 감지에 요구되는 시간이 증폭 과정의 각 개별 사이클의 시간을 초과하기 때문에, 증폭 과정의 완결이후 최대 120분까지 증폭 산물의 감지에서 지체가 나타날 수 있다. 적절하게는, 이런 지체 또는 지연은 지체 또는 지연 없음을 비롯하여 30분 미만, 예를 들면, 25분, 20분, 15분, 10분, 5분, 4분, 3분, 2분, 1분 미만이다.

본 명세서에서, "모세관 전기영동"은 증폭 반응물의 분량에서 핵산 분자의 전기영동 분리를 의미하는데, 여기서 분리는 모세관 튜브에서 실행된다. 가용한 모세관 튜브는 대략 10 내지 300 ㎛의 내부 직경 및 대략 0.2 cm 내지 3 m 길이, 바람직하게는 0.5 cm 내지 20cm, 더욱 바람직하게는 0.5 cm 내지 10 cm의 길이를 보유한다. 이에 더하여, 미세유동성 마이크로모세관(Caliper 또는 Agilent Technologies)의 이용은 "모세관 전기영동"의 의미에 부합된다.

본 명세서에서, "모듈 기구"는 본 발명에 따른 방법의 특정 공정이 실행되는 개별 단위를 포함하는 기구를 의미한다. 모듈 기구의 개별 단위는 물리적으로 연결될 수 있지만 반드시 그렇지는 않고, 바람직하게는 컴퓨터와 같은 중앙 조절 장치에 의해 조절된다. 본 발명에 유용한 전형적인 모듈 기구는 서열 증폭기 단위, 시료 재취 장치 단위, 모세관 전기영동 단위, 형광 감지기를 보유한다. 본 발명에 유용한 모듈 기구는 사이클링 반응으로부터 전기영동 단위로 시료를 이동시키는 로봇팔을 또한 포함할 수 있다.

본 명세서에서, "시료 채취 장치"는 증폭 과정동안 증폭 반응물로부터 분량을 채취하는 장치를 의미한다. 적절하게는, 본 발명에 유용한 시료 채취 장치는 예로써 단일 시료의 채취이후 폐기되거나 각 시료가 채취된 이후에 1회 이상 세척되는 피펫 첨단 또는 바늘을 이용하여 사이클링 반응의 오염을 최소화시키도록 접합된다. 대안으로, 시료 채취 장치는 분량을 모세관에 적하하기 위하여, 모세관 전기영동에 이용되는 모세관을 증폭 반응물과 직접 접촉시킬 수 있다. 당분야에 공지된 시료 채취 장치는 예로써 다목적 Robbins Scientific Hydra 96 피펫(pipettor)인데, 이는 96 웰 평판 내외로 시료 채취에 적합된다. 이들은 본 발명의 방법에 따른 이용에 용이하게 적합될 수 있다.

본 명세서에서 "로봇팔"은 시료, 튜브, 또는 시료를 보유하는 평판을 한 위치에서 다른 위치로 물리적으로 이동시키는 장치, 바람직하게는 마이크로프로세서에 의해 조절되는 장치를 의미한다. 각 위치는 본 발명의 유용한 모듈 기구에서 단위일 수 있다. 본 발명에 유용한 로봇팔의 예는 Mitsubishi RV-E2 로봇팔이다. 로봇팔의 조절 소프트웨어는 일반적으로, 제조업체로부터 제공된다.

본 명세서에서, "증폭 산물"은 특정 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 이의 상보성 서열 일부분의 사본이 되는 폴리뉴클레오티드를 의미하는데, 이들은 뉴클레오티드 서열에서 주형 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 상보성 서열에 상응한다. 본 발명에 따른 "증폭 산물"은 DNA 또는 RNA이고, 이중-가닥 또는 단일-가닥이다.

본 명세서에서, "변화된 크기의 증폭 산물"은 상이한 크기의 증폭 산물로부터 결정되는 증폭 산물을 의미한다. "상이한 크기"는 적어도 하나의 뉴클레오티드 길이로 차별되는 핵산 분자를 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 변화된 크기의 증폭 산물은 본 발명에 따른 방법에 이용되는 분리 공정의 분석 한계 이상으로 차별된다. 가령, 분리의 분석 한계가 하나의 염기이면, 상이한 크기의 증폭 산물은 적어도 하나의 염기 길이로 차별되지만 2개, 5개, 10개, 20개, 50개, 100개 또는 그 이상의 염기로 차별될 수 있다. 분석의 한계가 예로써 10개의 염기이면, 상이한 크기의 증폭 산물은 적어도 10개 염기로 차별되지만 11개, 15개, 20개, 30개, 50개, 100개 또는 그 이상의 염기로 차별된다.

본 명세서에서, "프로필" 또는 "증폭 곡선"과 "증폭 플랏"은 증폭 과정의 2가지이상 단계에서 관심 핵산 서열로 함입된 감지가능 라벨로부터 신호를 나타내고, 시료를 채취하는 사이클 횟수의 함수로 플랏된 수학적 곡선을 의미한다. 적절하게는, 프로필은 개별 반응 시료에서 핵산의 모세관 전기영동 분리이후 감지된 각 밴드의 형광을 플랏하여 산출한다. 대부분의 상업적으로 입수가능한 형광 감지기는 감지되는 신호에 기초한 곡선의 산출을 가능하게 하는 소프트웨어와 조화된다.

단일 반응물에서 조사될 수 있는 유전자의 총수는 산물 크기(1-2개 염기)의 측정가능 차이 및 PCR 산물(500-1000bp)의 분리가능 크기에 기초하여 산정할 수 있는데, 최대 1000, 바람직하게는 100-200이다.

본 명세서에서, "열-불안정성 엑소뉴클레아제"는 부분적 이중 가닥 핵산 분자에서 단일-가닥 핵산 분자 또는 돌출 단일 가닥을 분해시키고 상승된 온도에서 배양으로 비가역적으로 불활성화되는 효소를 의미한다. 불활성화 온도는 효소 및 예로써 완충 조건과 효소 농도에 좌우된다. 효소 불활성화 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 열-불안정성 엑소뉴클레아제의 무-제한적 예는 대장균(E. coli)으로부터 유래된 엑소뉴클레아제 I(ExoI)(New England Biolabs, Beverly MA)이다. ExoI은 80℃에서 20분동안 배양으로 불활성화시킨다.

본 명세서에서, "생물체의 게놈에서 유전자에 특이적인 서열이 실질적으로 부재하는 "은 정해진 프라이머가 프라이머 신장 조건하에서, 다형성에 관하여 조사되는 생물체로부터 유래된 게놈 DNA와 함께 배양될 때 프라이머 신장 산물을 생성시키지 않는다는 것을 의미한다.

도 1에서는 본 발명의 한 구체예에 유용한 프라이머 신장 반응의 개요도를 도시한다. Sl과 S5는 상이한 서열 태그이다.

도 2에서는 본 발명의 한 구체예에 유용한 증폭 과정과 감지의 개요도를 도시한다. Sl과 S5는 서로 차별되지만 도 1에 도시된 S1 내지 S5와 동일한 태그 서열 프라이머이다.

본 발명은 공지된 단일 뉴클레오티드 다형성에 관하여 핵산 시료의 유전형을 결정하는 방법을 제시한다. 본 발명의 방법은 일군의 SNP에 존재하는 특이적인 뉴클레오티드의 동시 확인을 가능하게 하는 서열 태그를 함입하는 프라이머 신장 반응을 이용한다. 이후, 하류 프라이머로 표지된 태그에 특이적인 일단의 프라이머를 이용하여 태그-표지된 단편을 증폭한다. 증폭 과정동안, 반응물의 분량은 채취되고 증폭된 단편의 크기 분리와 감지에 적용된다. 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드는 증폭 단편에 부착된 라벨의 크기와 실체에 기초하여 확인한다. 상기 시스템은 증폭 반응물 크기 및 함입된 라벨을 모두 감지하기 때문에, 멀티플렉싱(multiplexing)에 매우 적합하다. 게다가, 분리와 감지는 증폭 반응동안 실행되고, 따라서 증폭 반응물의 프로필이 실시간으로 산출된다. 실시간 측면은 신속한 분석 및 예로써 프라이머간 상호작용에 의해 발생된 인공 신호를 확인하고 제거하는데 유용한 증폭 과정에 관한 정보를 제공한다.

서열 태그-표지된 프라이머 신장 산물의 산출:

제 1 단계로써, 본 발명은 서열-태그-표지된 프라이머 신장 산물의 생성을 요한다. 본 단계의 중요한 측면은 특정 신장 산물에서 태그가 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체와 특이적으로 상응한다는 점이다. 상기 단계에서, 태그는 아래의 화학을 갖는 프라이머의 신장에 의해 함입된다:

5'-Tag_c-표적 보체-V_c-3'

"Tag_c"는 프라이머의 3' 말단에서 뉴클레오티드의 실체와 상응하는 태그 서열이고, "표적 보체"는 공지된 SNP에 인접하여 특이적으로 혼성화되는 프라이머의 3' 영역이며, V_c는 Tag_c서열의 실체와 상응하는 가변 3' 말단 뉴클레오티드이다. 적절하게는, Tag_c 서열은 20 내지 30개 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 프라이머 신장 조건하에, 유전형 분석되는 게놈에서 서열 또는 일정한 반응에 사용되는 다른 프라이머에 혼성화되지 않는다. "표적 보체"는 프라이머 및 공지된 SNP에 인접한 서열간 특이적인 혼성화를 제공할 만큼 충분히 길이를 갖는데, 일반적으로 대략 10 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다. V_c는 dG, dA, dT, dC에서 선택되고, 프라이머가 조사되는 핵산 시료에 혼성화되는 경우에 공지된 다형성 부위와 마주보도록 위치한다. V_c는 다형성 부위에서 뉴클레오티드와 상보적인 경우에만 다형성 부위에서 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룬다. 핵산 중합효소, 예를 들면, Taq 중합효소는 3'-말단 뉴클레오티드가 주형 가닥에서 인접한 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 경우에만 프라이머를 신장하기 때문에, 다형성 부위를 마주보는 공지된 3'-말단 뉴클레오티드로 프라이머의 신장은 3'-말단 뉴클레오티드의 보체로써 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드를 확인한다.

SNP의 확인에 유용한 한 세트의 하류 프라이머 신장 프라이머는 4가지 서로 다른 태그 서열을 포함하는데, 이들은 각각 3'-말단 dG, dA, dT, dC에 상응한다. 따라서, 이들 태그를 태그 1-4로 지칭하면, 예로써 태그 1은 3'dG에서 종결되는 프라이머에 이용되고, 태그 2는 3'dA에서 종결되는 프라이머에 이용되며, 태그 3은 3'dT에서 종결되는 프라이머에 이용되고, 태그 4는 3'dC에서 종결되는 프라이머에 이용된다. 본원에 개시된 방법의 중요한 이점은 다중 SNP의 분석에서 동일한 세트의 4가지 하류 Tag_c서열이 이용될 수 있다는 점인데, 그 이유는 생성된 증폭 산물이 크기에서 차별되기 때문이다. 이는 다중 증폭을 간섭하는 증폭 단계에서 비-주형 시발된 프라이머간 상호작용의 가능성을 제한한다.

서열-태그-표지된 상류 프라이머를 이용하여 일정한 SNP-보유 서열의 역가닥을 생성한다. 이들 프라이머는 아래의 화학식을 갖는다:

5'-Tag-표적 보체-3'

"Tag"는 프라이머 신장 프라이머의 하류 세트에 이용되는 태그와 구별되는 서열 태그를 의미하고, "표적 보체"는 공지된 SNP의 상류 영역에 상보적인 서열을 의미한다. 적절하게는, 상류 프라이머에서 "Tag" 서열은 20 내지 30개 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 프라이머 신장 조건하에, 유전형 분석되는 게놈에서 서열 또는 일정한 반응에 사용되는 다른 프라이머에 혼성화되지 않는다. "표적 보체"는 프라이머 및 공지된 SNP의 상류 서열간 특이적인 혼성화를 제공할 만큼 충분히 길이를 갖는데, 일반적으로 대략 10 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다. 상류 간격은 일반적으로 다형성 부위의 상류에서 적어도 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 50 내지 1000개 뉴클레오티드, 50 내지 500개, 또는 50 내지 250개 뉴클레오티드 상류이다. 다형성 부위로부터 상류 프라이머 서열의 간격은 후기 증폭 산물의 크기 또는 길이를 결정한다. 후기 증폭 산물의 크기는 크기 분리에 이용되는 시스템의 분석 한계를 초과하여 차별되도록 선택해야한다. 따라서, 분리의 분석 한계가 하나의 염기이면, 증폭 산물의 크기는 적어도 하나의 염기, 바람직하게는 그 이상(예, 적어도 5개, 10개, 15개 또는 그 이상)의 염기로 차별된다. 분석의 한계가 예로써 10개의 염기이면, 증폭 산물의 크기는 적어도 10개 염기, 바람직하게는 그 이상(예, 적어도 15개, 20개, 25개, 30개 또는 그 이상)의 염기로 차별된다.

본 명세서에서 "상류"와 "하류"는 본 발명의 설명을 용이하게 하기 위하여 이용된다. 하지만, DNA의 이중-가닥 성질로 인하여, 다형성은 다른 가닥의 반대 방향으로 한 가닥에 프라이머의 혼성화에 의해 양 측면으로부터, 다시 말하면, 상류 또는 하류로부터 SNP-특이적 프라이머로 접근할 수 있다. 본 발명에서는 게놈 DNA의 한 가닥에서 SNP의 조사를 고려한다.

본 발명에 따른 서열-태그-표지된 프라이머 신장 산물을 생성하기 위하여, 핵산 시료는 예로써 2분 이상동안 95℃로 변성시키고 상류 신장 프라이머 및 반응물에서 의문되는 각 SNP에 대한 일단의 하류 프라이머 신장 프라이머의 존재하에 재-어닐링시킨다. 변성과 어닐링은 프라이머 신장 반응에ㅔ 이용되는 핵산 중합효소에 적합한 완충액, 예를 들면, 1X Taq 중합효소 완충액에서 최적으로 실행된다. 재-어닐링은 프라이머의 Tm보다 낮은 온도, 일반적으로 대략 20℃ 내지 60℃에서 실행되지만, 일부 프라이머에서는 좀더 높거나 낮은 온도가 적합하다. 프라이머는 각 프라이머에서 대략 15 내지 500 nM로 존재한다. 최적 프라이머 농도는 최소한의 실험, 예를 들면, 프라이머가 15 내지 500 nM 범위로 변하는 검사 반응물을 만들고 신장이나 증폭 반응물의 상대적 분석, 수율, 특이성에 관하여 결과를 분석함으로써 당업자가 경험적으로 결정할 수 있다.

프라이머의 존재하에 어닐링이후, 핵산 중합효소를 이용하여 중합화를 실행한다. 이런 단계에 적합한 다수의 중합효소가 공지되어 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 효소는 열안정성 Taq 중합효소 및 다른 열안정성 중합효소, 예를 들면, Pfu 중합효소이다. 프라이머 신장은 선택된 효소에 대한 표준 조건, 예를 들면, 72℃에서 2분동안 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH8.8, 25℃), 0.5 내지 3 mM MgCl₂, 0.1% BSA, 100M의 각 dNTP이다.

1차 프라이머 신장은 한 가닥이 상류 프라이머와 및 함입된 태그 서열을 보유하고 다른 가닥이 하류 프라이머 및 함입된 태그 서열을 보유하는 개체군을 결과한다. 각 SNP에 대한 통합된 하류 프라이머는 3'-말단 뉴클레오티드가 표적 DNA에서 다형성 부위의 뉴클레오티드에 상보적이다. 하류 프라이머의 함입은 3'-말단 뉴클레오티드에 연관하거나 상응하는 태그 서열을 필연적으로 함입한다. 각 가닥을 대표하는 분자들이 상류 태그 또는 이의 보체 및 하류 태그 또는 이의 보체를 모두 보유하는 개체군을 생성하기 위하여, 1차 프라이머 신장 반응의 산물은 추가로 변성, 동일 프라임의 존재하에 재-어닐링, 이들 프라이머의 중합효소 신장을 실행한다.

2차 프라이머 신장이후, 신장되지 않은 프라이머를 제거한다. 임의의 프라이머 제거 방법, 예를 들면, 전기영동 또는 칼럼 크로마토그래피를 이용할 수 있지만, 바람직하게는 단일-가닥 DNA에 특이적인 열 불안정한 엑소뉴클레아제가 이용된다. 열-불안정성 엑소뉴클레아제의 이용은 시간-소모적인 분리와 정제 절차 및 오염이나 시료 손실의 가능성을 차단한다. 본 발명에 유용한 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 예로써 대장균(E. coli) 엑소뉴클레아제 I(ExoI)과 엑소뉴클레아제 Ⅶ(ExoⅦ)이다. 가령, ExoI는 37℃에서 활성을 나타내지만 80℃에서 20분동안 배양으로 불활성화된다.

프라이머 신장에 사용된 프라이머를 제거하여 함입된 상류와 하류 태그 서열에 상응하는 새로운 프라이머를 프라이머 신장 산물의 증폭에 이용할 수 있다. 1차 프라이머의 제거이후, 상류 태그 서열 프라이머 및 4가지 하류 태그 서열 프라이머를 포함하는 한 세트의 프라이머를 첨가한다. 4가지 하류 태그 서열 프라이머 각각은 형광 염료로 식별가능하게 표지된다(예, 말단 표지된다). 이후, 새로운 프라이머가 첨가된 혼합물은 열 변성, 재-어닐링, 중합효소 신장의 사이클로 구성되는 증폭 과정을 실행한다. 이런 증폭 과정은 적어도 2회 사이클, 바람직하게는 2 내지 35회 사이클, 더욱 바람직하게는 10 내지 30회 사이클, 더욱 바람직하게는 15 내지 25회 사이클을 포함한다.

사이클링 과정동안, 본 발명의 이런 측면에서 적어도 1회 사이클의 변성, 프라이머 어닐링, 프라이머 신장이후, 튜브 또는 반응 용기로부터 반응물의 시료 또는 분량을 채취하고, 분량에서 핵산을 분리하고 감지한다. 분리와 감지는 사이클링 과정과 동시에 실행하여, 사이클이 진행되는 동안 사이클 횟수의 함수로써 산물 존재비를 나타내는 곡선을 산출할 수 있다. 본 명세서에서, "동시에"는 사이클링 과정이 진행되는 동안 분리가 적어도 개신된다는 것을 의미한다. 이용된 분리 기술(예, 모세관 전기영동) 및 일정한 반응물에서 분리되는 종의 총수와 크기에 따라, 분리는 대부분의 경우에 분량당 1-120분을 요한다. 따라서, 분리 단계가 각 사이클 시간보다 오랜 시간을 요하고 시료가 예로써 매 사이클이후 채취되는 경우에, 분리 단계는 완전 사이클링 과정의 완결이후 완결된다. 하지만, 본 명세서에서, 이런 상황은 각 시료의 분리가 사이클링 과정동안 개시되면, 여전히 "동시" 분리로 간주된다. 가장 적절하게는, 동시 분리는 시료가 사이클링 반응물로부터 채취된 직후에 시료를 분리 기구에 전달하는 로봇팔 시료 채취 장치의 이용을 통하여 실행된다.

상기한 방식에서, 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체는 크기-분리된 증폭 산물에서 형광 신호의 감지로 결정된다. 4가지 하류 태그 프라이머 각각이 식별가능 형광 라벨로 표지되고, 일정한 프라이머에서 태그가 최초 하류 프라이머 신장 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드의 실체에 상응하기 때문에, 형광 표지된 태그의 함입과 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드를 확인한다.

바람직한 측면에서, 최초 프라이머 신장 반응물은 하나이상 SNP를 인식하는 프라이머 세트를 보유한다. 이런 측면에서, 각각의 서로 다른 다형성은 상이한 크기의 증폭 산물로 나타난다. 가령, 추가의 상류 프라이머를 보유할 수 있는데, 이들 각각은 동일한 태그 서열을 포함하고 추가의 공지된 SNP의 상류에서 별개의 간격에서 혼성화되는 3' 영역에서 차별된다. 추가의 상류 프라이머와 협력하에, 의문되는 추가의 SNP 각각은 한 세트의 4가지 하류 프라이머 신장 프라이머를 요구하고, 상기 세트의 각 구성원은 5'에서 3' 순서로 아래를 포함한다: a) 상기 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드에 상응하는 태그 서열, 상기 태그 서열은 동일한 일련의 반응물에서 의문되는 다른 SNP에 이용되는 하류 프라이머에서 3'-말단 뉴클레오티드에 상응하는 동일한 태그 서열이다; b) 공지된 SNP에 인접한 하류 프라이머의 특이적인 혼성화를 유도할 만큼 충분한 영역; c) 상기 프라이머에서 태그 서열에 상응하는 가변 3'-말단 뉴클레오티드, 여기서 프라이머가 게놈 표적 서열에 혼성화될 때, 3'-말단 뉴클레오티드는 다형성 부위를 마주보고 상보성인 경우 상기 부위에서 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 상기한 바와 같이 2회 프라이머 신장 반응 및 함입되지 않은 프라이머의 제거이후, 단일 SNP가 의문되는 경우에서와 동일한 단일 증폭 프라이머 세트가 이용된다. 다시 말하면, 증폭 프라이머 세트는 상류 태그를 보유하는 상류 프라이머 및 프라이머 신장 프라이머에서 4가지 하류 태그를 보유하는 한 세트의 4가지 식별가능하게 표지된 프라이머를 포함하는데, 여기서 라벨은 다형성 부위를 마주보는 뉴클레오티드에 상응하는 태그에 상응한다. 동일한 증폭 프라이머 세트는 의문되는 각 SNP에 이용될 수 있는데, 그 이유는 함입된 태그가 이들 세트에서 공통이기 때문이다. 다시 말하면, 모든 상류 프라이머가 동일 태그 서열을 보유하고, 모든 하류 프라이머 신장 프라이머 세트는 동일한 3' 말단 뉴클레오티드에 상응하는 동일한 태그 서열을 보유한다. 의문되는 각 SNP는 분리될 때 상이한 크기를 보유하고, 이런 크기의 분자로 함입되는 라벨의 실체는 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드를 긍정적으로 확인한다. 단일 세트의 5가지 증폭 프라이머로 다중 SNP를 증폭하고 감지하는 능력은 다수의 프라이머가 증폭에 사용될 때 만연하는 프라이머 상호작용 문제를 차단하는 이점이 있다. 이에 더하여, 프라이머 어닐링 효율에서 변이 효과가 거의 부정되는데, 그 이유는 일정한 증폭 프라이머 세트로 의문되는 모든 SNP가 이런 변이에 의해 동일한 정도의 영향을 받기 때문이다.

추가의 멀티플렉싱은 한 세트 이상의 5가지 태그 서열을 이용하여 달성할 수 있다. 추가의 세트는 다른 세트에 사용되는 태그와 구별되는 태그를 포함한다. 다른 태그에 상보성을 보이는 태그가 동시에 사용되지 않도록 주의한다. 상기한 바와 같이, 각 세트는 증폭 산물이 상이한 크기를 갖도록 선택된 상류 태그 및 개별 태그가 프라이머 신장 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드에 상응하는 하류 태그를 포함한다. 증폭을 위하여, 하류 프라이머는 다른 세트와 동일한 상응하는 형광 라벨, 또는 바람직하게는 상이한 세트의 식별가능 형광 라벨로 표지될 수 있다. 크기 분리이후, 증폭된 SNP-보유 단편은 크기에 의해 확인되고, 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체는 상기한 바와 같이, 통합된 라벨에 의해 확인된다.

프라이머 디자인의 일반적인 전략

5 내지 100개 뉴클레오티드, 적절하게는 17 내지 45개 뉴클레오티드 길이를 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하지만, 길이가 다른 것도 이용할 수 있다. 프라이머 신장 반응용 프라이머는 10 내지 60개 뉴클레오티드 길이를 갖고, 증폭용 프라이머는 약 17-25개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 본 발명에 유용한 프라이머는 용융 온도 측정 방법에 따라 특정한 용융 온도(Tm)를 가지도록 한다. Oligo^TM,Primer Design 및 인터넷상에서 이용할 수 있는 Primer3, Oligo Calculator 프로그램을 비롯한 상용 프로그램을 이용하여 본 발명에 유용한 폴리뉴클레오티드 서열의 Tm을 산정할 수 있다. 적절하게는, 본 발명에 유용한 증폭 프라이머(예, 태그 서열)의 Tm(Oligo Calculator로 계산함)은 약 45 내지 65℃, 바람직하게는 약 50 내지 60℃이다.

폴리뉴클레오티드의 Tm은 다른 폴리뉴클레오티드에 혼성화(가령, 주형 폴리뉴클레오티드에 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링)에 영향을 준다. 본 발명의 방법에서, 다양한 단계에서 이용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 주형, 또는 표적 주형에서 유도된 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화된다. 일반적으로, 두 폴리뉴클레오티드 서열이 실질적으로 상보적인(적어도 14 내지 25개 뉴클레오티드 길이에서 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 약 90% 상보적) 경우, 선택적 혼성화 반응이 일어난다(Kanehisa, M., 1984, Polynucleotides Res. 12:203). 결과적으로, 프라이밍 부위(priming site)에서 어는 정도 미스매치는 용인되는 것으로 보인다. 이와 같은 미스매치는 단일, 이중 또는 삼중 뉴클레오티드 정도의 작은 범위가 된다. 대안으로, 미스매치 영역에는 루프가 포함되는데, 상기 루프는 중단되지 않은 4개 이상의 뉴클레오티드에 미스매치가 존재하는 영역으로 정의된다.

프라이머가 제 2 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 효율 및 선택성에 영향을 주는 여러 인자가 존재한다. 프라이머 길이, 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성, 혼성화 온도, 완충액 조성, 프라이머가 혼성화되는 영역에서 공간적 방해 가능성 등과 같은 인자들을 고려하여 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계한다.

프라이머 길이 및 프라이머가 표적 서열에 어닐링되는 효율과 정확성간에는 양성 상관관계가 존재한다. 특히, 긴 서열은 짧은 서열보다 높은 용융 온도(Tm)를 보유하고 주어진 표적 서열 내에서 반복될 가능성이 낮기 때문에, 무차별적인 혼성화 반응이 최소화된다. G-C 함량이 높거나 팰린드롬 서열을 포함하는 프라이머 서열은 정해진 표적 부위에서처럼 자가-혼성화되는 경향이 있는데, 그 이유는 쌍분자보다는 단분자 혼성화 역학이 용액에서 선호되기 때문이다. 하지만, 충분한 숫자의 G-C 뉴클레오티드 쌍을 보유하는 프라이머를 고안하는 것이 중요한데, 그 이유는 A와 T 염기쌍이 표적 서열에 결합할 때 관찰되는 2개의 수소 결합보다는 각 G-C쌍이 3개의 수소 결합에 의해 결합하여 더욱 견고하고 강한 결합을 형성하기 때문이다. 혼성화 온도는 유기 용매, 예를 들면, 프라이밍 반응 또는 혼성화 혼합물에 포함되는 포름아미드의 농도에서처럼 프라이머 어닐링 효율과는 역으로 변하고, 반면 염 농도의 증가는 결합을 조장한다. 엄밀도 어닐링 조건하에서, 혼성화 반응 프로브 또는 합성 프라이머의 길이가 길수록 짧은 길이(용인되는 조건하에서는 충분히 혼성화되는 길이)보다 더욱 효과적으로 혼성화된다. 적절하게는, 엄밀도(strigent) 혼성화 반응은 폴리뉴클레오티드 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 혼성화되도록 하는 조건하에 적절한 완충액(예, 1X Taq 중합효소 완충액, 또는 프라이머 신장과 증폭에 이용되는 효소에 적합한 다른 완충액)에서 실행한다. 올리고뉴클레오티드리드 프라이머의 길이 및/또는 뉴클레오티드 조성에 따라, 엄밀도 혼성화 조건이 변할 수 있고(예, 1M 미만의 염 농도, 일반적으로 약 500 mM 미만, 바람직하게는 약 200 mM 미만) 혼성화 온도가 변할 수 있다(예, 0℃ 정도의 낮은 온도에서 22℃ 이상, 30℃이상, 가장 빈번하게는 약 37℃ 초과). 단편의 길이가 길수록 특이적인 혼성화에 더욱 높은 혼성화 온도가 요구된다. 여러 인자가 혼성화의 엄밀도에 영향을 주기 때문에, 파라미터의 조합은 단일 인자의 절대치보다 더욱 중요하다.

일정한 유전자에서 서열을 인식하기 위한 프라이머의 설계와 달리, 공지된 SNP 주변에 혼성화되도록 설계된 프라이머는 Tm을 조절하기 위한 변형이 제한된다. 가령, 프라이머가 SNP에 인접하여 혼성화되도록 설계될 때 좀더 유리한 GC 함량을 갖는 영역을 발견할 수 있는 서열의 상류 또는 하류에서 정상적으로 전위할 수 있는 경우에, 프라이머를 다른 위치로 이동시킬 수 없다. 이런 상황에서, Tm을 조절하는 일차적인 수단은 프라이머에서 상보성 서열의 길이를 변하시키는 것이다.

본 발명에 유용한 서열 태그

본 발명에 유용한 태그는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이의 이질성이나 인공 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 20 내지 30개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 적절하게는, 태그는 PCR 어닐링 조건하에 유전형 분석되는 생물체의 게놈 서열에 혼성화되지 않는다. 본 발명에 따른 서열 태그는 무작위일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. PCR 어닐링 조건하에 잠재적 태그 서열이 생물체의 게놈 서열에 혼성화되는 지는 관심 생물체로부터 유래된 게놈 DA를 주형으로 하는 프라이머 신장 반응에서 표지된 프라이머로써 이들 태그 서열을 이용함으로써 결정할 수 있다. 표지된 프라이머는 본 발명의 증폭 단계에 이용되는 어닐링 온도에서 게놈 DNA에 어닐링하고, 이후 신장 조건하에 열안정성 중합효소와 함께 배양한다. 이후, 반응 산물은 표지된 프로브 단독으로 전기영동 분리한다. 표지된 태그가 밴드에서 태그 프라이머보다 크게 나타나면, 태그 프라이머는 PCR 어닐링 조건하에 유전형 분석되는 생물체의 게놈 서열에 혼성화된다. 동일한 반응에 사용되는 다른 태그에 상보성을 보이는 태그는 사용하지 않도록 주의한다.

올리고뉴클레오티드 프라이머의 라벨링

본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 아래에서 설명하는 바와 같이 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 효소 또는 화학적 수단으로 감지할 수 있는 분자를 함입시켜 표지할 수 있다. 라벨을 올리고뉴클레오티드 프라이머에 연결 또는 결합시키는 방법은 이용된 라벨의 유형 및 프라이머에서 라벨 위치(즉, 3'-말단, 5'-말단 또는 본체-표지된) 등에 따라 달라질 수 있다.

형광 염료가 선호되긴 하지만, 본 발명에 적합한 다양한 라벨 및 프라이머에 이들 라벨의 함입 방법은 당해 분야에 공지되어 있는데, 서로 작용하여 신호를 강화시키거나 변화시키거나 약화시킬 수 있는 효소(예, 알칼리 포스포타제, 양고추냉이 과산화효소), 효소 기질, 방사성 원자, 케모포어(chemophore), 형광 켄처, 화학적 발광 라벨, 전자화학적 발광 라벨(Origen^TM (Igen)) 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다, 물론, 표지된 분자를 서열 증폭을 수반하는 PCR 기초한 증폭 검사에 이용되는 경우에, 라벨은 이런 자동화 과정에서 요구되는 온도 사이클링을 극복할 수 있어야 한다. 이상적으로, 유사한 장비, 방법 및/또는 기질을 이용하여 감지될 수 있는 4가지 식별가능 라벨이 선호된다.

본 발명의 표지된 프라이머를 작제하는데 라벨로 사용되는 형광단에는 로다민과 이의 유도체(Texas Red), 플루레신과 이의 유도체(5-브로모메틸 플루레신), Cy5, Cy3, JOE, FAM, Origen Green^TM, Lucifer Yellow, IAEDANS, 7-Me₂N-코우라민-4-아세테이트, 7-OH-4-CH₃-코우마린(coumarin)-3-아세테이트, 7-NH₂-4-CH₃-코우마린-3-아세테이트(AMCA), 모노브로모비만, 파이렌 트리설포네이트(Cascade Blue), 모노브로모메틸-암모니오비만 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 일반적으로, 단일색채계(monochromometer) 이외의 필터를 갖는 형광분석기의 이용을 가능하게 하고 감지 효율을 증가시키는 넓은 스토크 시프트(stoke shift)의 형광단이 선호된다.

라벨은 다양한 기술을 이용하여 직간접적으로 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 이용되는 라벨 또는 태그의 정확한 유형에 따라, 라벨은 프라이머의 5' 말단 또는 내부에 위치할 수 있고, 또는 신호 상호작용을 조정하는 다양한 크기와 조성의 스페이스 암(spacer arm)에 부착될 수 있다. 시판되는 포스포라미디트 시약을 이용하여, 적절하게 보호된 포스포라미디트를 경유하여 5' 말단에서 기능기(예, 티올 또는 1차 아민)를 보유하는 올리고머를 만들고, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. Academic Press, Ind., 1990에 기술된 프로토콜을 이용하여 이들을 표지할 수 있다.

올리고뉴클레오티드 프라이머 서열의 일반적으로 5' 말단에 하나이상의 설프하이드릴, 아미노 또는 하이드록시 부분을 도입하는 올리고뉴클레오티드 기능 시약을 도입하는 방법은 U.S. Patent No. 4,914,210에서 설명한다. 5' 인산기는 리포터 기를 제공하는 폴리뉴클레오티드 카이나제 및 감마-³²P-ATP 또는 감마-³³P-ATP를 이용하여 방사능동위원소로써 도입될 수 있다. 비오틴의 N-하이드록시숙시니미드 에스테르 및 합성 동안에 도입된 아미노티미딘 잔기 또는 6-아미노 헥실 잔기를 반응시켜, 비오틴을 5'단부에 첨가할 수 있다.

증폭

PCR은 당분야에 잘 알려진 방법이다(Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335, Saiki et al., 1985, Science 230:1350; U.S. Patent Nos. 4,683,202, 4,683,195, 4,800,159). 가장 단순한 형태에서, PCR은 상대 가닥에 혼성화되고 표적 DNA에서 관심 영역을 측면에서 접하는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 특정 DNA 서열의 효소 합성을 위한 in vitro 방법이다. 주형 변성, 프라이머 어닐링, DNA 중합효소에 의한 어닐링된 프라이머의 신장 등의 반복적인 일련의 반응 단계는 말단이 프라이머의 5' 말단으로 정의되는 특정 단편의 기하급수적 누적을 결과한다. PCR은 특정 DNA서열을 10⁹의 계수로 선택적으로 증가시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다.

실제 엄밀도 요구조건에 따라 PCR 사이클의 각 단계의 길이와 온도 및 사이클 횟수가 조절된다. 어닐링 온도와 시간은 프라이머가 주형에 어닐링될 것으로 기대되는 효율 및 용인되는 미스매치 정도에 의해 결정한다. 프라이머 어닐링 조건의 엄밀도를 최적화하는 능력은 당업자의 지식에 속한다. 20℃ 내지 72℃ 범위의 어닐링 온도가 가장 일반적으로 이용된다. 주형 분자의 초기 변성은 92℃ 내지 99℃에서 4분간 배양, 이후 변성(94℃에서 15초 내지 1분), 어닐링(상기한 Tm에 기초한 온도, 일반적으로 최소 Tm을 갖는 반응물에서 올리고뉴클레오티드의 Tm보다 대략 5℃ 낮은 온도; 1-2분간), 신장(72℃에서 1-3분)으로 구성되는 20-40회 사이클에 의해 달성된다.

시료 채취

증폭 과정동안 시료 채취는 임의의 빈도로 또는 임의의 원하는 패턴으로 실행될 수 있다. 시료 채취는 이런 과정에서 각 사이클이후 진행하는 것이 바람직하지만, 매 2회 사이클, 매 3회 사이클, 매 4회 사이클 등과 같은 낮은 빈도의 시료 채취 역시 가능하다. 균일한 시료 간격이 바람직하긴 하지만, 시료 채취를 균일한 간격으로 실행할 필요는 없다. 한가지 예로써, 시료 채취 작업은 첫 5회 사이클동안 매 사이클이후, 차후에는 매 2회 사이클이후 시료 채취를 수반한다.

시료 채취는 반응물로부터 분량의 수동 피펫팅에서처럼 단순할 수도 있지만, 바람직하게는 분량이 미리 결정된 시료 채취 간격으로 자동적으로 채취되도록 자동화된다. 적절하게는, 반응 혼합물은 각 채취에서 동등 부피의 새로운 성분, 예를 들면, dNTP, 프라이머, DNA 중합효소로 재충전된다. 본 발명의 이런 측면에서, 사이클링은 마이크로역가 또는 다중웰 평판 형식에서 실행하는 것이 바람직하다. 다중 반응 웰을 보유하는 평판을 이용하는 이런 형식은 평판의 모듈 성질 및 평판에서 웰의 균일한 격자 배치로 인하여, 분석 공정의 처리량을 증가시킬 뿐만 아니라 자동화된 시료 재취 단계에 매우 적합하다. 본 발명에 유용한 공통 마이크로역가 평판 설계는 예로써 12개, 24개, 48개, 96개, 384개 또는 그 이상의 웰을 보유하지만, 평판에 물리적으로 적합되고 원하는 반응 부피(일반적으로 10-100 ㎕)를 수용할 수 있는 임의 개수의 웰이 본 발명에 이용될 수 있다. 일반적으로, 96 또는 384개 웰 평판 형식이 선호된다.

자동화 시료 채취 공정은 프로그램된 루틴(routine)으로써 용이하게 실행될 수 있고, 시료채취에서 인간의 오류(즉, 시료 크기 및 시료 실체의 추적에서 오류) 및 인간 시료채취로부터 오염의 가능성을 차단한다. 서열 증폭기로부터 분량을 채취할 수 있는 로봇팔은 당분야에 가용하다. 가령, Mitsubishi RV-E2 로봇팔은 SciClone^TM Liquid Handler 또는 Robbins Scientific Hydra 96 피펫과 병용될 수 있다.

본 발명에 유용한 로봇 채취 장치는 서열 증폭기와 통합되거나, 또는 시료 채취 장치와 증폭기는 모듈로 설계될 수 있다. 증폭기와 시료 채취 장치가 통합되는 경우에, 서열 증폭과 시료 채취는 동일한 위치에서 진행되고 시료는 로봇 시료 채취 장치에 의해 프로그램된 간격으로 채취된다. 증폭기와 시료 채취 장치가 모듈로 설계되는 경우에, 증폭기와 시료 채취 장치는 별개의 모듈이다. 한 구체예에서, 분석 평판은 로봇팔에 의해 증폭기로부터 시료 채취 장치로, 다시 증폭기로 물리적으로 이동된다.

시료 채취 단계에서 제거되는 분량의 부피는 예로써 증폭 반응의 전체 부피, 산물 감지의 감수성, 이용된 분리 유형에 따라 변한다. 증폭 부피는 수 ㎕에서 수백 ㎕(예, 5㎕, 10㎕, 20㎕, 40㎕, 60㎕, 80㎕, 100㎕, 120㎕, 150㎕, 또는 200㎕ 또는 그 이상), 바람직하게는 10-150㎕ 범위, 더욱 바람직하게는 10-100㎕이다. 분량 부피는 반응 혼합물의 0.1 내지 30%이다.

핵산의 분리

본 발명에 따른 핵산의 분리는 예로써 전기영동, HPLC 또는 질량 분광법을 비롯한 핵산 서열의 분리에 적합한 임의의 수단으로 달성할 수 있다. 속도와 분석력으로 인하여, 분리는 모세관 전기영동(CE)에 의해 실행된다.

CE는 미량 시료의 분석에 효과적인 분석 분리 기술이다. CE 분리는 "담체 전해질"이라고 하는 전기전도성 매체로 채워진 좁은 직경 모세관 튜브에서 실행된다. 전기장이 모세관 튜브의 양 단부 사이에 가해지고, 시료에서 화학종은 각 화학종의 전기영동 이동성 및 튜브에서 유동 움직임의 속도에 기초한 속도로 한 전극에서 다른 전극으로 이동된다. CE는 모세관에서 겔 또는 액체, 예를 들면, 완충액을 이용하여 실행할 수 있다. "자유 존 전기영동"으로 알려진 한 액체 양식에서, 분리는 시료 화학종의 유리 용리 이동성에서 차이에 기초한다. 다른 액체 양식에서, 미셀을 이용하여 소수성에서 차이에 기초한 분리를 달성한다. 이는 Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography(MECC)로 알려져 있다.

CE는 전하에 기초하여 핵산 분자를 분리하는데, 이는 뉴클레오티드의 크기 또는 총수에 의해 분리를 효과적으로 달성한다. 생성된 다수의 단편은 크기의 올림차순으로 모세관의 단부 인근의 형광 감지기를 통과한다. 다시 말하면, 작은 단편은 큰 단편에 앞서 이동하고 먼저 감지된다.

CE는 분리 속도, 요구되는 시료의 작은 크기(1-50 nl의 차수), 높은 분석력으로 통상적인 전기영동보다 현저한 이점을 제공한다. 가령, CE를 이용한 분리 속도는 통상적인 겔 전기영동보다 10 내지 20배 빠르고, 실행후 염색(post-run staining)이 필요하지 않다. CE는 높은 분석력을 제공하고, 단일 염기쌍의 차이로 대략 10-1,000개 염기쌍의 범위에서 분자를 분리한다. 높은 분석력은 모세관의 넓은 표면적이 열을 효과적으로 발산하여 고전압의 이용을 가능하게 하기 때문에 부분적으로 가능하다. 이에 더하여, 모세관의 좁은 내부 직경으로 인하여 밴드 넓어짐(band broadening)이 최소화된다. 자유-존 전기영동에서, 전기삼투 또는 전기삼투적 흐름(EOF) 현상이 나타난다. 이는 전하에 상관없이 전체 시료 분자에 영향을 주는 액체의 총괄 흐름(bulk flow)이다. 특정 조건하에, EOF는 자유-존 CE에서 향상된 분석력과 분리 속도에 기여할 수 있다.

CE는 당업자에게 공지된 방법으로 실행할 수 있다(U.S. Patent No. 6,217,731; 6,001,230; 5,963,456). 대용량 CE 장비, 예를 들면, HTS9610 High Throughput Analysis System과 SCE 9610 완전 자동화된 96-모세관 전기영동 유전자 분석 시스템(Spectrumedix Corporation, State College, PA)은 상업적으로 구입가능하다. 다른 장비에는 the P/ACE 5000 시리즈(Beckman Instruments Inc, Fullerton, CA)와 ABI PRISM3100 유전자 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA) 등이 포함된다. 이들 장치 각각은 CE 칼럼의 단부 인근에서 시료 분자에 의한 광의 방출을 모니터하는 형광 감지기를 포함한다. 표준 형광 감지기는 수많은 서로 다른 파장의 형광 방출을 구별할 수 있고, 단일 CE 실행에서 증폭 시료로부터 형광 표지된 복수의 화학종을 감지하는 능력을 제공한다.

CE 분리의 처리량을 증가시키는 다른 수단은 복수의 모세관, 바람직하게는 모세관 어레이를 이용하는 것이다. 96개 모세관 수용력을 갖는 모세관 어레이 전기영동(CAE) 장치(예, MegaBACE 계기, Molecular Dynamics), 심지어 1000개의 모세관을 수용하는 CAE 장치가 개발되었다. 근접하여 병렬된 복수 모세관 사이에 광 산란에 의해 유발된 DNA로부터 형광 감지의 문제점을 차단하기 위하여, 공초점 형광 스캐너를 이용할 수 있다(Quesada et al., 1991, Biotechniques 10: 616-25).

분리(및 감지) 기구는 서열 증폭과 시료 채취에 이용되는 기구와 분리되거나 통합될 수 있다. 본 발명에서 분리 단계는 사이클링 과정과 동시에 개시되기 때문에, 시료는 가급적 증폭 반응물로부터 직접 채취하고 분리 기구에 위치시켜 분리가 증폭과 동시에 진행되도록 한다. 따라서, 분리 기구는 서열 증폭과 시료 채취 기구와 통합하는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 이런 기구는 서열 증폭 반응물로부터 시료를 채취하고 이를 분리/감지 기구에 위치시키는 로봇 시료 채취 장치와 함께, 서열 증폭 모듈과 분리/감지 모듈을 포함하는 모듈 기구이다.

감지

본 발명에 유용한 증폭산물 감지 방법은 표지된 프라이머가 형광 라벨의 여기 스펙트럼 광으로 자극될 때 이들 프라이머에 의해 방출되는 형광의 강도를 측정한다. 형광 감지 기술은 고도로 개발되고 매우 민감한데, 일부 경우는 단일 분자를 감지한다. 고도 감수성 형광 감지는 대부분의 상용 플레이트 판독기, 마이크로어레이 감지 장치, CE 기구의 표준 양상이다. CE 장비에서는 여기와 방출 신호의 광학 섬유 전달이 빈번하게 이용된다. Spectrumedix, Applied Biosystems, Beckman Coulter, Agilent는 본원에 기술된 방법에 필요한 형광 감지에 적합한 형광 감지를 구비한 CE 장비를 판매하고 있다.

2가지 이상의 서로 다른 형광 라벨로부터 형광 신호는 스펙트럼에서 방출의 피크 파장이 각각 20 nm 이상 분리되면 서로 구별될 수 있다. 일반적으로, 특히 선택된 형광단이 넓은 방출 파장 피크를 보유하는 경우에, 피크 파장간에 더 많이 분리되는 형광단이 선택된다. 시료에 포함시켜 동시에 감지하고자 하는 형광단이 상이할수록, 파장 피크는 더욱 한정된다.

실시예 1. 단일 뉴클레오티드 차이의 감지.

레버씨 시신경 위축증(Leber's hereditary optic neuropathy)(LHON)은 미토콘드리아 DNA의 3460, 11778, 14459 위치에서 여러 점 돌연변이의 존재와 연관한다.

변이체: SNP 영역 (굵은 글씨, 밑줄로 표시된 다형성 부위)

3460 5'-CGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA C G C CAT AAA-3'(SEQ ID NO: 1)

11778 5'-TCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT C G C ATC ATA-3'(SEQ ID NO: 2)

14459 5'-CTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT C G C TGT AGT-3'(SEQ ID NO: 3)

레버씨 시신경 위축증(LHON)과 연관된 사람 미토콘드리아 DNA에서 SNP에 관한 개체의 유전형은 아래와 같이 결정할 수 있다:

프라이머 신장:

프라이머:

a) 상류 프라이머

상류 프라이머는 아래와 같다:

변이체: 상류 프라이머 (소문자는 태그 서열이다)

3460 5'-gttacaagat tctcacacgc taagg-TTC ATA GTA GAA GAG CGA TGG-3'

(SEQ ID NO: 4)

11778 5'-gttacaagat tctcacacgc taagg-AAA AAG CTA TTA GTG GGA GTA-3'

(SEQ ID NO : 5)

14459 5'-gttacaagat tctcacacgc taagg-TCG GGT GTG TTA TTA TTC TGA-3'

(SEQ ID NO : 6)

b) 하류 프라이머.

하류 프라이머 아래와 같다:

변이체: 하류 프라이머

3460 G-프라이머: 5'-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA CG-3'(SEQ ID NO: 7)

A-프라이머: 5'-gatgctggtg tggctggtgt tcccgCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA CA-3'(SEQ ID NO: 8)

T-프라이머: 5'-ggttggttgc acactggaga tattggCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA CT-3'(SEQ ID NO: 9)

C-프라이머: 5'-ctggagcatc tggaaaagta gtaccCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA CC-3'(SEQ ID NO: 10)

11778 G-프라이머: 5'-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT CG-3'(SEQ ID NO: 11)

A-프라이머: 5'-gatgctggtg tggctggtgt tcccgTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT CA-3'(SEQ ID NO: 12)

T-프라이머: 5'-ggttggttgc acactggaga tattggTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT CT-3'(SEQ ID NO: 13)

C-프라이머: 5'-ctggagcatc tggaaaagta gtaccTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT CC-3'(SEQ ID NO: 14)

14459 G-프라이머: 5'-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT CG-3'(SEQ ID NO: 15)

A-프라이머: 5'-gatgctggtg tggctggtgt tcccgCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT CA-3'(SEQ ID NO: 16)

T-프라이머: 5'-ggttggttgc acactggaga tattggCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT CT-3'(SEQ ID NO: 17)

C-프라이머: 5'-ctggagcatc tggaaaagta gtaccCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT CC-3'(SEQ ID NO: 18)

각 다형성 부위에 대한 완전 세트의 5가지 프라이머 신장 프라이머(각각 40 pmol, 총 15개 프라이머)는 1X Pfu 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.8, 10 mM KCl, 10 mM(NH₄)₂SO₄, 2 mM MgS0₄, 0.1% Triton-X-100, 0.1 ㎎/㎖ 뉴클레아제-없는 BSA)에서 50 ㎕의 총부피로 검사 개체로부터 유래된 1 ㎍의 주형 게놈 DNA와 혼합한다. 혼합물은 94℃에서 2분동안 가열하고 실온으로 천천히 냉각하여 프라이머 어닐링을 실행한다. 1 ㎕(2.5 U/㎕)의 클론된 Pfu 중합효소 + 1.25 ㎕의 각 dNTP(최종 농도 200 μM)를 첨가하고, 시료는 72℃에서 3분동안 배양한다. 이후 시료는 94℃에서 2분, 50℃에서 1분, 2℃에서 3분으로 순환시켜 상류 프라이머 또는 이의 보체 및 하류 프라이머 또는 이의 보체를 보유하는 프라이머 신장 산물의 집합체를 생성한다.

프라이머 신장 프라이머는 20 U의 대장균(E. coli) 엑소뉴클레아제 I(ExoI; New England Biolabs)의 첨가 및 37℃에서 20분동안 배양으로 제거한다. 이후, ExoI은 80℃에서 20분동안 배양으로 불활성화시킨다.

증폭:

프라이머 신장 프라이머의 제거이후, 5가지 증폭 프라이머(1X Pfu 완충액에서 40 pmol의 각 프라이머, 최종 부피 75 ㎕)를 아래와 같이 첨가한다:

a) 상류 프라이머: 5'-gttacaagat tctcacacgc taagg-3'(SEQ ID NO: 19)

b) 하류 프라이머: (식별가능하게 표지됨)

G-프라이머: 5'-R6G-agttggcgaa gcagtcgcta gaaga-3'(SEQ ID NO: 20)

A-프라이머: 5'-FAM-gatgctggtg tggctggtgt tcccg-3'(SEQ ID NO: 21)

T-프라이머: 5'-ROX-ggttggttgc acactggaga tattgg-3'(SEQ ID NO: 22)

C-프라이머: 5'-JOE-ctggagcatc tggaaaagta gtacc-3'(SEQ ID NO: 23)

증폭은 1 ㎕의 새로운 클론된 Pfu 중합효소를 첨가하고 아래와 같이 반응을 순환시켜 실행한다: 94℃에서 45초, 50℃에서 45초, 72℃에서 2분의 35회 사이클. 각 사이클이후, 또는 임의의 선택된 간격에서, 분량(0.5 ㎕)을 채취하고 준비된 모세관 전기영동 기구에 적하한다. 증폭 과정동안 분리를 개시하고 실행한다. 증폭된 프라이머 신장 산물은 모세관 범위에서 분리이후 형광으로 감지한다. 각 사이클에서 각 단편의 신호 강도를 플랏하여 증폭 프로필을 산출한다.

증폭된 산물은 아래와 같다:

변이체 산물 크기 야생형 다형성 변이 다형성

뉴클레오티드 뉴클레오티드

3460 249 G A(ROX 염료에서 249bp

산물로 감지됨)

11778 350 G A(ROX 염료에서 350bp

산물로 감지됨)

14459 456 G A(ROX 염료에서 456bp

산물로 감지됨)

본 실시예에 상술된 방법은 동일한 상류 태그 및 이미 포함된 것과 차별되는 상이한 크기의 SNP-보유 단편에 특이적인 3' 영역을 보유하는 각 추가의 SNP에 대한 추가의 상류 프라이머 신장 프라이머를 포함시킴으로써 더욱 다중화될 수 있다. 의문되는 각 추가의 SNP는 동일한 세트의 4가지 하류 프라이머 태그를 포함하는 한 세트의 고유한 4가지 하류 프라이머, SNP에 인접하여 특이적으로 혼성화되는 3' 영역, 태그 서열에 상응하는 가변 3' 말단 뉴클레오티드를 보유해야 한다. 추가의 다중화는 상기한 바와 같이 서로 다른 세트의 상류와 하류 태그를 보유하는 새로운 프라이머 세트를 포함시켜 달성할 수 있다.

다른 구체예

본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 간행물은 순전히 참조한다. 본원은 바람직한 구체예를 인용하여 기술하였지만, 당업자가 인지하는 바와 같이 이의 균등한 개변은 아래에 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주에 포섭된다.

SEQUENCE LISTING <110> Slepnev, Vladimir I <120> Methods of Detecting Sequence Differences <130> 19781/2048 <140> Not yet assigned <141> 2003-06-20 <150> US 60/392,331 <151> 2002-06-28 <160> 23 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgggctacta caacccttcg ctgacgccat aaa 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcaaactacg aacgcactca cagtcgcatc ata 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctcaggatac tcctcaatag ccatcgctgt agt 33 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(46) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 4 gttacaagat tctcacacgc taaggttcat agtagaagag cgatgg 46 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(46) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 5 gttacaagat tctcacacgc taaggaaaaa gctattagtg ggagta 46 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(46) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 6 gttacaagat tctcacacgc taaggtcggg tgtgttatta ttctga 46 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 7 agttggcgaa gcagtcgcta gaagacgggc tactacaacc cttcgctgac g 51 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 8 gatgctggtg tggctggtgt tcccgcgggc tactacaacc cttcgctgac a 51 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(52) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 9 ggttggttgc acactggaga tattggcggg ctactacaac ccttcgctga ct 52 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 10 ctggagcatc tggaaaagta gtacccgggc tactacaacc cttcgctgac c 51 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 11 agttggcgaa gcagtcgcta gaagatcaaa ctacgaacgc actcacagtc g 51 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 12 gatgctggtg tggctggtgt tcccgtcaaa ctacgaacgc actcacagtc a 51 <210> 13 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(52) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 13 ggttggttgc acactggaga tattggtcaa actacgaacg cactcacagt ct 52 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 14 ctggagcatc tggaaaagta gtacctcaaa ctacgaacgc actcacagtc c 51 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 15 agttggcgaa gcagtcgcta gaagactcag gatactcctc aatagccatc g 51 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 16 gatgctggtg tggctggtgt tcccgctcag gatactcctc aatagccatc a 51 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(52) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 17 ggttggttgc acactggaga tattggctca ggatactcct caatagccat ct 52 <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> Synthetic primer sequence comprising human LHON-associated sequen ce linked to an artificial tag sequence. <400> 18 ctggagcatc tggaaaagta gtaccctcag gatactcctc aatagccatc c 51 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic amplification primer that hybridizes to artificial tag sequence incorporated by primer extension primers. <400> 19 gttacaagat tctcacacgc taagg 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic amplification primer that hybridizes to artificial tag sequence incorporated by primer extension primers. <400> 20 agttggcgaa gcagtcgcta gaaga 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic amplification primer that hybridizes to artificial tag sequence incorporated by primer extension primers. <400> 21 gatgctggtg tggctggtgt tcccg 25 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> Synthetic amplification primer that hybridizes to artificial tag sequence incorporated by primer extension primers. <400> 22 ggttggttgc acactggaga tattgg 26 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Synthetic amplification primer that hybridizes to artificial tag sequence incorporated by primer extension primers. <400> 23 ctggagcatc tggaaaagta gtacc 25 6 1

Claims

일정한 핵산 시료에 대하여 공지된 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

a) 핵산 시료로부터 발생된 프라이머 신장 산물 집합체에 증폭 과정을 실시하고, 각 프라이머 신장 산물은 태그 서열을 포함하고, 상기 태그 서열은 공지된 다형성 부위에서 하나의 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하고, 여기서 상기 증폭 과정은 하나의 상류 증폭 프라이머와 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 프라이머 신장 산물 집합체의 구성원과 식별가능 라벨로 구성되는 태그 서열을 포함하고, 각 식별가능 라벨은 다형성 부위에서 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응한다;

b) 식별가능 라벨의 핵산 분자로의 함입을 감지하여 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.
제 1 항에 있어서, 식별가능 라벨은 형광 라벨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, (b) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리한다
제 3 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (a)와 (b) 단계는 서열 증폭기, 시료 채취 장치, 모세관 전기영동 장치, 형광 감지기를 포함하는 모듈 기구에서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 태그 서열은 15개 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머 한 쌍의 올리고뉴클레오티드: 다형성 부위의 첫 번째 대립형질에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 다형성 부위의 두 번째 대립형질에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (a) 단계에 앞서, 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 제거 단계는 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 분해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 분해는 열 불안정한 엑소뉴클레아제를 사용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I과 엑소뉴클레아제 Ⅶ에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 (a) 단계로의 속행에 앞서, 열에 의해 불활화되는 것을 특징으로 하는 방법.
일정한 핵산 시료에 대하여 의문되는 한 세트의 공지된 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

a) 핵산 시료로부터 발생된 프라이머 신장 산물 집합체에 증폭 과정을 실시하고, 각 프라이머 신장 산물은 한 세트의 태그 서열의 구성원을 포함하고, 상기 태그 서열은 공지된 다형성 부위에서 하나의 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하고, 여기서 상기 증폭 과정은 의문되는 공지된 다형성 부위를 포함하는 각 서열에 대한 하나의 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 프라이머 신장 산물 집합체의 구성원 및 다형성 부위에서 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하는 식별가능 라벨로 구성되는 태그 서열을 포함하고, 상류 증폭 프라이머는 의문되는 한 세트의 공지된 다형성 부위의 각 다형성 부위가 변화된 크기의 증폭 산물에 상응하도록 선택된다;

b) 변화된 크기의 증폭 산물에서 식별가능 라벨의 함입을 감지하여 각 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.
제 18 항에 있어서, 식별가능 라벨은 형광 라벨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, (b) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, (a)와 (b) 단계는 서열 증폭기, 시료 채취 장치, 모세관 전기영동 장치, 형광 감지기를 포함하는 모듈 기구에서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 태그 서열은 15개 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, (a) 단계에 앞서, 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 제거 단계는 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 분해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30 항에 있어서, 분해는 열 불안정한 엑소뉴클레아제를 사용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I과 엑소뉴클레아제 Ⅶ에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 (a) 단계로의 속행에 앞서, 열에 의해 불활화되는 것을 특징으로 하는 방법.
일정한 핵산 시료에 대하여 의문되는 한 세트의 공지된 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

a) 핵산 시료로부터 발생된 프라이머 신장 산물 집합체에 증폭 과정을 실시하고, 각 프라이머 신장 산물은 1차 태그 서열 또는 이의 보체 및 한 세트의 2차 태그 서열의 구성원 또는 이의 보체를 포함하고, 2차 태그 서열 또는 이의 보체의 존재는 공지된 다형성 부위에서 하나의 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하고, 각 다형성 부위에 대하여 한 세트의 다형성 부위에서 1차 태그 서열은 다른 다형성 부위를 보유하는 시료에서 분자상의 다형성 부위로부터 1차 태그 서열의 간격과 비교하여 다형성 부위의 5'에서 변화된 간격으로 위치하고, 여기서 상기 증폭 과정은 1차 태그 서열을 포함하는 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 프라이머 신장 산물 집합체의 구성원 및 다형성 부위에서 특이적인 뉴클레오티드의 존재에 특이적으로 상응하는 식별가능 라벨로 구성되는 태그 서열을 포함하고, 상류 증폭 프라이머는 의문되는 한 세트의 공지된 다형성 부위의 각 다형성 부위가 변화된 크기의 증폭 산물에 상응하도록 선택된다;

b) 변화된 크기의 증폭 산물에서 식별가능 라벨의 함입을 감지하여 각 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.
제 34 항에 있어서, 식별가능 라벨은 형광 라벨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, (b) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, (a)와 (b) 단계는 서열 증폭기, 시료 채취 장치, 모세관 전기영동 장치, 형광 감지기를 포함하는 모듈 기구에서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, 태그 서열은 15개 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, (a) 단계에 앞서, 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 45 항에 있어서, 제거 단계는 프라이머 신장 산물 집합체가 만들어질 때 함입되지 않은 프라이머를 분해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 46 항에 있어서, 분해는 열 불안정한 엑소뉴클레아제를 사용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 47 항에 있어서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I과 엑소뉴클레아제 Ⅶ에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 48 항에 있어서, 열 불안정한 엑소뉴클레아제는 (a) 단계로의 속행에 앞서, 열에 의해 불활화되는 것을 특징으로 하는 방법.
공지된 다형성 부위에서 단일 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

I) 다형성 부위를 포함하는 핵산 시료를 제공하고;

Ⅱ) 핵산 시료의 가닥을 분리하고 아래의 존재에서 재-어닐링하며;

a) 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역을 포함하는 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 3' 영역의 5'에 위치한 1차 서열 태그를 포함하고;

b) 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 한 세트의 각 구성원은 아래를 포함하고:

i) 다형성 부위의 3'에 혼성화되고 인접하는 영역;

ii) 가변 3' 말단 뉴클레오티드, 여기서 상기 구성원은 공지된 서열에 혼성화되고, 3' 말단 뉴클레오티드는 다형성 부위를 마주보며, 3' 말단 뉴클레오티드가 다형성 부위에서 뉴클레오티드에 상보적인 경우에 상기 3' 말단 뉴클레오티드 염기는 다형성 부위에서 상기 뉴클레오티드와 쌍을 이루고;

iii) (ii)의 가변 3'-말단 뉴클레오티드에 상응하는 태그 서열, 상기 태그 서열은 상기 구성원에서 (i) 영역의 5'에 위치하고;

III) 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 신장을 가능하게 하는 조건하에 (II) 단계에서 유래된 어닐링된 올리고뉴클레오티드와 핵산 중합효소를 접촉시켜 신장 산물을 생성하고, 여기서 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 프라이머 신장 산물은 보체로부터 분리될 때 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원의 신장 산물의 합성을 위한 주형으로 기능할 수 있고;

Ⅳ) 가닥 분리와 접촉 단계 (II)와 (III) 2회 반복하여 1차 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 서열 및 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드의 구성원과 동일하거나 상보적인 서열 모두를 포함하는 핵산 분자 집합체를 생성시키고;

V) 어닐링되지 않은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 분해를 가능하게 하는 조건하에 (IV) 단계에서 생성된 집합체를 열-불안정성 엑소뉴클레아제와 접촉시켜 프라이머를 분해시키고;

VI) 열-불안정성 엑소뉴클레아제를 열에 의해 불활성화시키고;

Ⅶ) 핵산 분자 집합체에 증폭 과정을 실행하고, 상기 증폭 과정은 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성되는 1차 서열 태그를 포함하는 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원과 식별가능 라벨로 구성되는 태그를 포함하고;

Ⅷ) 적어도 하나의 식별가능 라벨의 함입을 감지하여 공지된 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.
제 50 항에 있어서, 식별가능 라벨은 형광 라벨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, (Ⅷ) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 54 항에 있어서, 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55 항에 있어서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, I-Ⅷ 단계는 서열 증폭기, 시료 채취 장치, 모세관 전기영동 장치, 형광 감지기를 포함하는 모듈 기구에서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, 태그 서열은 15개 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, 공지된 다형성 부위의 상류에 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역은 10-30개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, 다형성 부위의 3'에 혼성화되고 인접하는 영역은 10-30개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서, 한 세트의 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
일군의 공지된 다형성 부위에 존재하는 단일 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

I) 일군의 다형성 부위를 포함하는 핵산 시료를 제공하고;

Ⅱ) 핵산 시료의 가닥을 분리하고 아래의 존재에서 재-어닐링하며;

a) 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역을 포함하는 한 세트의 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 한 세트의 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 각 구성원은 상기 3' 영역의 5'에 위치한 공통 서열 태그를 포함하고, 상기 한 세트의 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 각 구성원은 변화된 크기의 증폭 산물이 일군의 공지된 다형성 부위에서 각 다형성 부위에 대하여 생성되도록 선택되고;

b) 5'에서 3' 순서로 아래를 포함하는 한 세트의 하류 증폭 프라이머: i) 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 G에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 A에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 T에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 C에 특이적으로 상응하는 태그에서 선택되는 서열 태그;

ii) 일군의 다형성 부위에서 다형성 부위에 인접하는 3' 서열에 특이적으로 혼성화되는 영역, 여기서 한 세트의 하류 증폭 프라이머는 일군의 다형성 부위의 각 다형성 부위에서 다형성 부위에 특이적으로 혼성화되고 인접하는 영역을 보유하는 프라이머 부분세트를 포함하고;

iii) G, A, T, C에서 선택되는 3' 말단 뉴클레오티드, 상기 말단 뉴클레오티드는 하류 증폭 프라이머에서 (i)에 기술된 서열 태그에 특이적으로 상응하고, 상기 하류 증폭 프라이머가 다형성 부위에 인접하는 3' 서열에 혼성화되면 상기 3' 말단 뉴클레오티드는 다형성 부위를 마주보며;

III) 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 신장을 가능하게 하는 조건하에 (Ⅱ) 단계에서 유래된 어닐링된 올리고뉴클레오티드와 핵산 중합효소를 접촉시켜 신장 산물을 생성하고, 여기서 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 프라이머 신장 산물은 보체로부터 분리될 때 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원의 신장 산물의 합성을 위한 주형으로 기능할 수 있고;

Ⅳ) 가닥 분리와 접촉 단계 (II)와 (III) 2회 반복하여 1차 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 상보적인 서열 및 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 구성원과 동일하거나 상보적인 서열 모두를 포함하는 핵산 분자 집합체를 함유하는 반응 혼합물을 생성시키고;

V) 어닐링되지 않은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 분해를 가능하게 하는 조건하에 (IV) 단계에서 생성된 집합체를 열-불안정성 엑소뉴클레아제와 접촉시켜 어닐링되지 않은 프라이머를 분해시키고;

VI) 열-불안정성 엑소뉴클레아제를 열에 의해 불활성화시키고;

Ⅶ) 핵산 분자 집합체에 증폭 과정을 실행하고, 상기 증폭 과정은 1차 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성되는 공통 서열 태그를 포함하는 상류 증폭 프라이머 및 한 세트의 하류 증폭 프라이머를 이용하여 실행하고, 한 세트의 하류 증폭 프라이머의 각 구성원은 한 세트의 2차 올리고뉴클레오티드 프라이머의 구성원과 식별가능 라벨로 구성되는 태그를 포함하고;

Ⅷ) 적어도 하나의 식별가능 라벨의 함입을 감지하여 공지된 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 실체를 결정한다.
제 62 항에 있어서, 식별가능 라벨은 형광 라벨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, (Ⅷ) 단계는 증폭 과정동안 만들어진 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 64 항에 있어서, 분리는 모세관 전기영동으로 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 증폭 과정은 적어도 2회 증폭 반응 사이클을 포함하고, 각 사이클은 1) 핵산 가닥 분리; 2) 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링; 3) 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 66 항에 있어서, 증폭 과정 동안 및 적어도 1회 반응 사이클 이후 증폭 반응의 분량을 제거하고, 핵산 분자를 크기 또는 전하로 분리하며, 식별가능 라벨의 함입을 감지하는 단계를 추가로 포함하고, 이런 감지는 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 67 항에 있어서, 제거, 분리, 감지는 상기 과정에서 각 사이클 이후 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, I-Ⅷ 단계는 서열 증폭기, 시료 채취 장치, 모세관 전기영동 장치, 형광 감지기를 포함하는 모듈 기구에서 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 태그 서열은 15개 내지 40개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격의 서열에 혼성화되는 3' 영역은 10-30개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 다형성 부위의 3'에 혼성화되고 인접하는 영역은 10-30개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 한 세트의 식별가능하게 표지된 하류 증폭 프라이머는 다형성 부위에서 A의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 C의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 G의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트; 다형성 부위에서 T의 존재에 특이적으로 상응하는 태그 서열을 포함하는 부분세트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
핵산 시료에 존재하는 다형성 부위에서 뉴클레오티드를 결정하기 위한 키트에 있어서, 아래를 포함하는 한 세트의 상류 프라이머를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트:

a) 공지된 다형성 부위의 상류에서 공지된 간격으로 특이적으로 혼성화될 만큼 충분한 5'-태그 서열과 3' 서열을 포함하는 1차 프라이머;

b) 5'에서 3' 순서로 아래를 포함하는 한 세트의 4가지 하류 증폭 프라이머: i) 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 G에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 A에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 T에 특이적으로 상응하는 태그, 상기 프라이머의 3'-말단 뉴클레오티드로써 C에 특이적으로 상응하는 태그에서 선택되는 서열 태그;

ii) 일군의 다형성 부위에서 다형성 부위에 인접하는 3' 서열에 특이적으로 혼성화되는 영역, 여기서 한 세트의 하류 증폭 프라이머는 일군의 다형성 부위의 각 다형성 부위에서 다형성 부위에 특이적으로 혼성화되고 인접하는 영역을 보유하는 프라이머 부분세트를 포함하고;

iii) G, A, T, C에서 선택되는 3' 말단 뉴클레오티드, 상기 말단 뉴클레오티드는 하류 증폭 프라이머에서 (i)에 기술된 서열 태그에 특이적으로 상응하고, 상기 하류 증폭 프라이머가 다형성 부위에 인접하는 3' 서열에 혼성화되면 상기 3' 말단 뉴클레오티드는 다형성 부위를 마주본다.
제 74 항에 있어서, 다형성을 검사받는 생물체의 게놈에서 유전자에 특이적인 서열이 부재하는 한 세트의 5가지 프라이머를 추가로 포함하고, 상기 프라이머는 1차 프라이머의 태그 서열을 보유하는 프라이머 및 한 세트의 4가지 하류 2차 프라이머의 태그 서열을 보유하는 한 세트의 4가지 식별가능하게 표지된 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.