JP2005531314A - 配列の相違を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、配列の相違に関して核酸試料を遺伝子タイピングするために有用な方法を提供する。好ましい態様においては、前記方法は、1ヌクレオチド相違、例えば一塩基多型の決定のために有用である。本発明の方法では、非相同配列タグを含むプライマー伸長産物のPCR増幅、その後のキャピラリー電気泳動によるサイズ分離および増幅伸長産物の検出が使用される。1つの態様において、サイズ分離および産物の検出はリアルタイムで行われる。CE分離および検出手法が増幅されたフラグメントのサイズおよびいずれかの所定の増幅産物上に存在する標識の同一性を含む情報を提供するため、開示した方法は、複数の既知のSNPsに関する遺伝子型について試料を同時に分析するために特に適している。各々の既知のSNPは、その多型部位において特定のヌクレオチドの存在に特異的に相関する識別可能に標識された配列タグを持つ別個のサイズの増幅フラグメントを増幅させることにより検出できる。本発明の方法はまた、複数のSNPsを検出するために増幅プライマー1セットを必要とし、それによって、複数の異なる増幅プライマーの使用に関連する問題の影響を低減することができるという利点を有している。
本発明は、既知の一塩基多型に関して核酸試料の遺伝子型を決定する方法を提供する。本発明の方法は、配列タグを取り込むことにより、SNPsの群において存在する特定のヌクレオチドの同時同定を可能にするプライマー伸長反応を使用する。次に、タグ付加されたフラグメントは、下流プライマーが標識されたタグに特異的なプライマーのセットを用いて増幅する。増幅処理の間、反応の一部分を回収し、サイズ分離および増幅されたフラグメントの検出に付す。多型部位に存在するヌクレオチドは、サイズおよび増幅されたフラグメントに結合した標識の同一性に基づいて同定される。増幅産物のサイズおよび取り込まれた標識の両方を検出するので、前記システムは重複化に非常に適している。更に、分離および検出は、増幅反応のプロファイルがリアルタイムで作製されるように、増幅反応の間に実施される。リアルタイムの態様は、迅速な分析を提供し、ならびに例えばプライマー間の相互作用により生じる人為的なシグナルの同定および排除において有用である、増幅過程に関する情報を提供する。
第1工程として、本発明は配列タグ付加されたプライマーの伸長産物の生成を要する。この工程の厳密な側面は、いずれかの特定の伸長産物上のタグが多型部位のヌクレオチドの同一性に特異的に対応する点である。この段階において、タグは以下の一般的構造:
5’−Tagc−標的相補体−Vc−3’
を有するプライマーの伸長により取り込まれ、ここで「Tagc」はプライマーの3’末端におけるヌクレオチドの同一性に対応するタグ配列であり、「標的相補体」は既知のSNPに隣接して特異的にハイブリダイゼーションするプライマーの3’領域であり、VcはTagc配列の同一性に対応する可変3’末端ヌクレオチドである。Tagc配列は、好ましくは20〜30ヌクレオチド長であり、好ましくは、遺伝子タイピングされる生物のゲノム内の配列に、または所定の反応において使用される他のプライマーのいずれかに、プライマー伸長条件下でハイブリダイズしない。「標的相補体」は、プライマーと既知のSNPに隣接する配列との間の特異的ハイブリダイゼーションを与えるのに十分長いものであり、一般的には10〜25ヌクレオチド長である。VcはdG、dA、dTおよびdCから選択され、プライマーが調査すべき核酸試料にハイブリダイゼーションする場合に、既知の多型部位に対向するように位置づけられる。Vcは、それが多型部位におけるヌクレオチドに相補的である場合にのみ、その部位のヌクレオチドと塩基対を形成する。核酸ポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼは、3’末端ヌクレオチドが鋳型鎖上の隣接するヌクレオチドと塩基対を形成する場合にプライマーを伸長させるのみであるため、多型部位に対向する既知の3’末端ヌクレオチドを用いたプライマーの伸長により、多型部位に存在するヌクレオチドが3’末端ヌクレオチドの相補体であると同定する。
5’−Tag−標的相補体−3’
を有し、ここで「Tag」はプライマー伸長プライマーの下流のセットにおいて用いられるものの各々とは異なる配列タグを指し、「標的相補体」とは既知のSNPの上流の領域に相補的な配列を指す。上流プライマー上の「Tag」配列は、好ましくは20〜30ヌクレオチド長であり、好ましくは、遺伝子タイピングされる生物のゲノム内の配列に、または所定の反応において使用される他のプライマーのいずれかに、プライマー伸長条件下でハイブリダイズしない。「標的相補体」は、プライマーと既知のSNPの上流の配列との間でプライマー伸長条件下において特異的ハイブリダイゼーションを起こすのに十分長いものであり、一般的には10〜25ヌクレオチド長である。上流の距離は、一般的には少なくとも50ヌクレオチドであるが、多型部位から50〜1000ヌクレオチドまたはそれ以上上流であることもでき、好ましくは50〜500、または50〜250ヌクレオチド上流である。多型部位から上流プライマー配列までの距離が、その後の増幅産物のサイズまたは長さを決定する。その後の増幅産物のサイズは、サイズ分離に使用されるシステムの分割限度より大きく異なるように選択しなければならない。したがって、分離の分割限度が1塩基である場合には、増幅産物のサイズは少なくとも1塩基長、好ましくはそれより多く(例えば少なくとも5、10、15塩基以上)異なるように選択する必要がある。分割限度が例えば10塩基である場合には、増幅産物のサイズは少なくとも10塩基、好ましくはそれより多く(例えば少なくとも15、20、25、30塩基以上)異なる必要がある。
オリゴヌクレオチドプライマーは、一般的には5〜100ヌクレオチド長であり、好ましくは17〜45ヌクレオチド長であるが、種々の長さのプライマーも使用される。プライマー伸長反応のためのプライマーは好ましくは10〜60ヌクレオチド長であるが、増幅用のプライマーは好ましくは約17〜25ヌクレオチド長である。本発明において有用なプライマーは、融点推定法により特定の融解温度(Tm)を有するように設計できる。Oligo(商標)、Primer Design、およびインターネットで入手できるプログラム、例えばPrimer3およびOligo Calculatorを含む市販のプログラムを用いて、本発明において有用なポリヌクレオチド配列のTmを計算することができる。好ましくは、本発明において有用な増幅プライマー(例えばタグ配列)のTmは、例えばOligo Calculatorで計算した場合、約45℃〜65℃、より好ましくは約50℃〜60℃である。
本発明において有用なタグは、少なくとも15、好ましくは20〜30ヌクレオチド長の、好ましくは非相同または人工のヌクレオチド配列である。タグは、好ましくは、遺伝子タイピングすべき生物のゲノム内の配列にPCRアニーリング条件下でハイブリダイゼーションしない。本発明のタグ配列はランダムであってよいが、必須ではない。潜在的なタグ配列がPCRアニーリング条件下で生物のゲノム内の配列にハイブリダイゼーションするかどうかは、鋳型として対象となる生物に由来するゲノムDNAを用いたプライマー伸長反応において標識プライマーとしてタグ配列を使用することにより、調べることができる。標識されたプライマーは、本発明の方法の増幅工程のために使用することを計画したアニーリング温度においてゲノムDNAにアニーリングされ、ついで、伸長条件下において熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベーションする。次に、反応産物を標識されたプローブのみと共に電気泳動で分離する。標識されたタグがタグプライマーよりも大きいバンド中に現れた場合には、タグプライマーは、遺伝子タイピングすべき生物のゲノム内の配列にPCRアニーリング条件下においてハイブリダイゼーションしている。また、同じ反応に使用することを意図する他のタグに対して相補性を有するタグを回避するように、留意しなければならない。
本発明において有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、酵素的手段または化学的手段により検出可能な部分を取り込むことにより、以下に記載するようにして標識することができる。オリゴヌクレオチドプライマーに標識を連結またはコンジュゲーションする方法は、当然ながら、使用する標識の種類、およびプライマー上の標識の位置(即ち、3’末端、5’末端または本体部分への標識)により異なる。
PCR法は当業者がよく知るものであり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMullisおよびFaloona,1987,Methods Enzymol.,155:335,Saikiら、1985,Science 230:1350および米国特許第4,683,202号,第4,683,195号および第4,800,159号に記載されている。その最も簡単な形態において、PCRは、対向する鎖にハイブリダイズし、そして標的DNAの対象となる領域にフランキングする2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、特異的DNA配列を酵素的に合成するためのインビトロの方法である。鋳型の変性、プライマーアニーリング、およびDNAポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長を含む一連の反復反応工程により、プライマーの5’末端によりその末端が定義される特定のフラグメントの指数関数的な蓄積が生じる。PCRは、109倍で特定のDNA配列を選択的に濃縮することができると報告されている。
増幅処理の間の試料回収はいずれかの望ましい頻度において、またはいずれかの望ましいパターンにおいて、実施することができる。試料回収は処理の各サイクル後に行うことが好ましいが、より低い頻度の試料回収、例えばサイクル2回に1回、3回に1回、4回に1回なども使用できる。一定の間隔で試料回収を行うのが望ましい場合が最も多いが、試料回収を一定の間隔で行う必要性はない。一例として、試料回収のルーチン作業は、最初の5サイクルでは1回毎に、その後は1回おきに行ってよい。
本発明による核酸の分離は、例えば電気泳動、HPLCまたは質量分析を含む、核酸の分離に適するいずれかの手段により達成することができる。その速さと分割能のために、分離は好ましくはキャピラリー電気泳動(CE)により行われる。
本発明において有用な増幅産物検出方法は、蛍光標識の励起スペクトル範囲内の光によって照射される時に、標識プライマーにより放射される蛍光の強度を測定する。蛍光検出手法は高度に発達しており、極めて高感度であり、場合により1分子まで明確な検出が可能である。高感度の蛍光検出は、大部分の市販のプレートリーダー、マイクロアレイ検出セットアップおよびCE装置の標準的側面である。CE装置については、励起および発光のシグナルの光ファイバー伝達がしばしば用いられる。Spectrumedix,Applied Biosystems,Beckman CoulterおよびAgilentはそれぞれ、本明細書に記載した方法に必要な蛍光検出のために十分な蛍光検出器を備えるCE装置を販売している。
レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)は、3460、11778および14459の位置のミトコンドリアDNAにおける数個の点突然変異の存在と関連している。
プライマー:
a)上流プライマー
上流プライマーは以下の通りである:
下流プライマーは以下の通りである:
プライマー伸長プライマーの除去後、5つの増幅プライマー(1× Pfu緩衝液中、40pmolの各プライマー、最終容量75μl)を以下の通り添加する:
a)上流プライマー:
増幅は、新鮮なクローニングしたPfuポリメラーゼ 1μlを添加し、反応を以下のサイクル:94℃で45秒間、50℃で45秒間および72℃で2分間の35サイクルに付すことにより行う。各サイクルの後、またはいずれかの選択された時間間隔において、一部分(0.5μl)を回収し、準備されたキャピラリー電気泳動装置に充填する。分離を開始し、増幅処理の間、実施する。増幅したプライマー伸長産物は、キャピラリーの長さに渡って分離した後に蛍光により検出する。各フラグメントのシグナル強度を各サイクルについてプロットすることにより、増幅プロファイルが得られる。
本実施例において詳細に記載した方法は、同じ上流タグと、既に含まれているものとはサイズの異なる別のSNP含有フラグメントに特異的な3’領域とを有する、それぞれ別のSNPに対する別の上流プライマー伸長プライマーを含めることにより、更に重複化することができる。精査されるそれぞれ別のSNPもまた、4つの下流プライマータグの同じセット、SNPに隣接して特異的にハイブリダイゼーションする3’領域およびタグ配列に対応する可変3’末端ヌクレオチドを担持する、4つの下流プライマーのそれ自体のセットを有さなければならない。
本明細書において引用したすべての特許、特許出願および公開された参考文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明はその好ましい実施形態を参照にしながら特に説明したが、当業者の知るとおり、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細事項における種々の変更を行うことができることが理解されよう。
Claims (75)
- 所定の核酸試料に関して既知の多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法であって、前記方法が下記工程:
a)核酸試料から生成するプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すこと、ここで、各プライマー伸長産物はタグ配列を含み、前記タグ配列は既知の多型部位において1つの特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応するものであり、ここで、前記増幅処理は上流増幅プライマーおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、前記下流増幅プライマーセットの各メンバーは前記プライマー伸長産物の集団のメンバーおよび識別可能な標識を構成する前記タグ配列を含み、ここで、各識別可能な標識は前記多型部位において特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応するものである;および
b)核酸分子への識別可能な標識の取り込みを検出し、それによって前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること;
を含む方法。 - 前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)が前記増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび/または電荷により分離することを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも2回含み、ここで各サイクルは1)核酸鎖の分離;2)オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング;および3)アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長の工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅処理の間および前記反応サイクルの少なくとも1回の後に、前記増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび/または電荷により核酸分子を分離する工程、および前記識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、前記検出により前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項5に記載の方法。
- 前記除去、分離、および検出を前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項6に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項6に記載の方法。
- 工程(a)および(b)が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記タグ配列が15〜40個のヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 識別可能に標識された下流の増幅プライマーの前記セットが、多型部位においてAの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマー;多型部位においてCの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマー;多型部位においてGの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマー;および多型部位においてTの存在に特異的に対応するタグ配列を含むプライマーからなる、請求項1に記載の方法。
- 識別可能に標識された下流の増幅プライマーの前記セットが1対のオリゴヌクレオチドからなり、その1つは多型部位の第1の対立遺伝子に特異的に対応するタグ配列を含み、もう1つは多型部位の第2の対立遺伝子に特異的に対応するタグ配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の前に、プライマー伸長産物の前記集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを除去する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記除去する工程が、プライマー伸長産物の前記集団が作成されたときに取り込まれなかった前記プライマーを分解することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記分解が熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる、請求項14に記載の方法。
- 前記熱不安定性エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼVIIからなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 工程(a)に続く前に前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する、請求項16に記載の方法。
- 所定の核酸試料に関して精査すべき既知の多型部位のセットにおけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法であって、前記方法が下記工程:
a)核酸試料から生成したプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すこと、ここで、各プライマー伸長産物はタグ配列のセットのメンバーを含み、そのタグ配列は既知の多型部位における1つの特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応するものであり、ここで、前記増幅処理は精査すべき既知の多型部位を含む各配列についての上流増幅プライマー1つおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、前記下流増幅プライマーセットの各メンバーはプライマー伸長産物の前記集団のメンバーおよび前記多型部位において特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応する識別可能な標識を構成する前記タグ配列を含み、ここで、前記上流増幅プライマーは、精査すべき既知の多型部位の前記セットの各多型部位が別個のサイズを有する増幅産物に対応するように選択される;
b)別個のサイズを有する増幅産物中の識別可能な標識の取り込みを検出し、それによって前記各多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること;
を含む方法。 - 前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項18に記載の方法。
- 前記工程(b)が前記増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび/または電荷により分離することを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも2回含み、ここで各サイクルが、1)核酸鎖の分離;2)オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング;および3)アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長の工程を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記増幅処理の間および前記反応サイクルの少なくとも1回の後に、前記増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび/または電荷により核酸分子を分離する工程、および前記識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、前記検出により前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項22に記載の方法。
- 前記除去、分離、および検出を前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項23に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項23に記載の方法。
- 工程(a)および(b)が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項18に記載の方法。
- 前記タグ配列が15〜40個のヌクレオチドを含む、請求項18に記載の方法。
- 識別可能に標識された下流の増幅プライマーの前記セットが、多型部位においてAの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてCの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてGの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;および多型部位においてTの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる、請求項18に記載の方法。
- 工程(a)の前に、プライマー伸長産物の前記集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを除去する工程を更に含む、請求項18に記載の方法。
- 前記除去する工程が、プライマー伸長産物の前記集団が作成されたときに取り込まれなかった前記プライマーを分解することを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記分解が熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる、請求項30に記載の方法。
- 前記熱不安定性エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼVIIからなる群より選択される、請求項31に記載の方法。
- 工程(a)に続く前に、前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する、請求項32に記載の方法。
- 所定の核酸試料に関して精査すべき既知の多型部位のセットにおけるヌクレオチドの同一性を決定するための方法であって、前記方法が下記工程:
a)核酸試料から生成したプライマー伸長産物の集団を増幅処理に付すこと、ここで、各プライマー伸長産物は第1のタグ配列またはその相補体、および第2のタグ配列またはその相補体のセットのメンバーを含み、その第2のタグ配列またはその相補体の存在は既知の多型部位における1つの特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応し、ここで、前記多型部位のセットにおける各多型部位について、前記第1のタグ配列は、他の多型部位を含む前記試料中の分子上の多型部位からの前記第1タグ配列の距離と比較して、前記多型部位の5’側に異なる距離で位置しており、ここで、前記増幅処理は前記第1タグ配列を含む上流増幅プライマーおよび識別可能に標識された下流増幅プライマーセットを用いて行われ、前記下流増幅プライマーセットの各メンバーは、プライマー伸長産物の前記集団のメンバーおよび前記多型部位における特定のヌクレオチドの存在に特異的に対応する識別可能な標識を構成する前記タグ配列を含み、ここで、前記上流増幅プライマーは、精査すべき既知の多型部位の前記セットの各多型部位が別個のサイズを有する増幅産物に対応するように選択される;
b)別個のサイズを有する増幅産物中の識別可能な標識の取り込みを検出し、それによって前記各多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること;
を含む方法。 - 前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項34に記載の方法。
- 前記工程(b)が前記増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび/または電荷により分離することを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも2回含み、ここで各サイクルが、1)核酸鎖の分離;2)オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング;および3)アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長の工程を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記増幅処理の間および前記反応サイクルの少なくとも1回の後に、前記増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび/または電荷により核酸分子を分離する工程、および前記識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、前記検出により前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項38に記載の方法。
- 前記除去、分離、および検出を前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項39に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項39に記載の方法。
- 工程(a)および(b)が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項34に記載の方法。
- 前記タグ配列が15〜40個のヌクレオチドを含む、請求項34に記載の方法。
- 識別可能に標識された下流の増幅プライマーの前記セットが、多型部位においてAの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてCの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてGの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;および多型部位においてTの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる、請求項34に記載の方法。
- 工程(a)の前に、プライマー伸長産物の前記集団が作成されたときに取り込まれなかったプライマーを除去する工程を更に含む、請求項34に記載の方法。
- 前記除去する工程が、プライマー伸長産物の前記集団が作成されたときに取り込まれなかった前記プライマーを分解することを含む、請求項45に記載の方法。
- 前記分解が熱不安定性エキソヌクレアーゼを用いて行われる、請求項46に記載の方法。
- 前記熱不安定性エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼVIIからなる群より選択される、請求項47に記載の方法。
- 工程(a)に続く前に、前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化する、請求項48に記載の方法。
- 既知の多型部位における1ヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、前記方法が下記工程:
I)前記多型部位を含む核酸試料を供給すること;
II)前記核酸試料の鎖を分離すること、および下記:
a)前記既知の多型部位の上流で既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする3’領域を含む第1オリゴヌクレオチドプライマー、ここで、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーは前記3’領域の5’側に位置する第1配列タグを含む;および
b)第2オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ここで、前記セットの各メンバーは下記:
i)前記多型部位の3’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする領域;
ii)可変の3’末端ヌクレオチド、ここで、前記メンバーが前記既知の配列にハイブリダイゼーションする場合には前記3’末端ヌクレオチドは前記多型部位と対向し、およびここで、前記3’末端ヌクレオチドが前記多型部位のヌクレオチドに相補的である場合およびその場合に限って、前記3’末端ヌクレオチド塩基が前記多型部位の前記ヌクレオチドと対になる;および
iii)(ii)の可変3’末端ヌクレオチドに対応するタグ配列、ここで、前記タグ配列は前記メンバー上の(i)の領域の5’側に位置する;
を含む;
の存在下において再アニーリングすること;
III)工程(II)から得られたアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、伸長産物が生成するようにアニーリングされたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下において、核酸ポリメラーゼと接触させること、ここで、第1オリゴヌクレオチドプライマーから得られたプライマー伸長産物は、その相補体から分離される場合に、第2オリゴヌクレオチドプライマーのセットのメンバーの伸長産物を合成するための鋳型として働きうるものであり、およびその逆も成立する;
IV)前記第1オリゴヌクレオチドと同一であるかまたはこれに相補的である配列およびオリゴヌクレオチドの前記第2のセットのメンバーの1つと同一であるかまたはこれに相補的である配列の両方を含む核酸分子の集団が生成するように、鎖の分離および接触の工程(II)および(III)を2回反復すること;
V)工程(IV)で生成した集団を、アニーリングしていないオリゴヌクレオチドプライマーの分解を可能にする条件下において、前記プライマーが分解されるように、熱不安定性エキソヌクレアーゼと接触させること;
VI)前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化すること;
VII)核酸分子の前記集団を増幅処理に付すこと、ここで前記増幅処理は、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーを構成する第1配列タグを含む上流増幅プライマー、および下流増幅プライマーのセットを用いて実施され、下流増幅プライマーの前記セットの各メンバーは、第2オリゴヌクレオチドプライマーの前記セットのメンバーおよび識別可能な標識を構成するタグを含む;および
VIII)識別可能な標識の少なくとも1つの取り込みを検出し、それによって前記既知の多型部位におけるヌクレオチドの同一性を決定すること;
を含む方法。 - 前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項50に記載の方法。
- 前記工程(VIII)が、前記増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび/または電荷により分離することを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも2回含み、ここで各サイクルが、1)核酸鎖の分離;2)オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング;および3)アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長の工程を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記増幅処理の間および前記反応サイクルの少なくとも1回の後に、前記増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび/または電荷により核酸分子を分離する工程、および前記識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、前記検出により前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項54に記載の方法。
- 前記除去、分離、および検出を前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項55に記載の方法。
- 工程(I)〜(VIII)が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項50に記載の方法。
- 前記タグ配列がそれぞれ15〜40個のヌクレオチドを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記既知の多型部位の上流の既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする前記3’領域が10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記多型部位の3’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする前記領域が10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項50に記載の方法。
- 下流の増幅プライマーの前記セットが、多型部位においてAの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてCの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてGの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;および多型部位においてTの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる、請求項50に記載の方法。
- 既知の多型部位の群に存在する1ヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、前記方法が下記工程:
I)前記多型部位の群を含む核酸試料を供給すること;
II)前記核酸試料の鎖を分離すること、および下記:
a)既知の多型部位の上流で既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする3’領域をそれぞれが含む第1オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ここで、第1オリゴヌクレオチドプライマーの前記セットの各メンバーは前記3’領域の5’側に位置する共通の配列タグを含み、第1オリゴヌクレオチドプライマーの前記セットの各メンバーは、別個のサイズを有する増幅産物が前記既知の多型部位の群において各多型部位について生成するように選択される;および
b)下流増幅プライマーのセットであって、5’から3’の方向に、下記:
i)前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてGに特異的に対応するタグ;前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてAに特異的に対応するタグ;前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてTに特異的に対応するタグ;および前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてCに特異的に対応するタグからなる群より選択される配列タグ;
ii)前記多型部位の群における多型部位に隣接しておよびその3’側にある配列に特異的にハイブリダイゼーションする領域、ここで、前記下流増幅プライマーセットは、前記多型部位の群における各多型部位について前記多型部位に隣接して特異的にハイブリダイゼーションする領域を含む;および
iii)G、A、TまたはCから選択される3’末端ヌクレオチド、ここで、前記末端ヌクレオチドはその下流増幅プライマー上の(i)に記載した配列タグに特異的に対応し、ここで、前記下流増幅プライマーが、多型部位に隣接しておよび3’側にある前記配列にハイブリダイゼーションする場合に、前記3’末端ヌクレオチドは前記多型部位に対向する;
を含む;
の存在下において再アニーリングすること;
III)工程(II)から得られたアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、伸長産物が生成するようにアニーリングされたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件下において、核酸ポリメラーゼと接触させること、ここで、第1オリゴヌクレオチドプライマーから得られたプライマー伸長産物は、その相補体から分離される場合に、第2オリゴヌクレオチドプライマーのセットのメンバーの伸長産物を合成するための鋳型として働きうるものであり、およびその逆も成立する;
IV)前記第1オリゴヌクレオチドと同一であるかまたはこれに相補的である配列および前記下流増幅プライマーセットのメンバーと同一であるかまたはこれに相補的である配列の両方を含む核酸分子の集団を含む反応混合物が生成するように、鎖の分離および接触の工程(II)および(III)を2回反復すること;
V)工程(IV)で生成した集団を、アニーリングしていないオリゴヌクレオチドプライマーの分解を可能にする条件下で、アニーリングしていないプライマーが分解されるように、熱不安定性エキソヌクレアーゼと接触させること;
VI)前記熱不安定性エキソヌクレアーゼを熱により不活性化すること;
VII)核酸分子の前記集団を増幅処理に付すこと、ここで、前記増幅処理は、前記第1オリゴヌクレオチドプライマーを構成する共通の配列タグを含む上流増幅プライマー、および下流増幅プライマーのセットを用いて実施され、前記下流増幅プライマーセットの各メンバーは、前記第2オリゴヌクレオチドプライマーセットのメンバー、および識別可能な標識を構成するタグを含む;および
VIII)識別可能な標識の少なくとも1つの取り込みを検出し、それによって前記既知の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定すること;
を含む方法。 - 前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項62に記載の方法。
- 前記工程(VIII)が、前記増幅処理中に作成された核酸分子をサイズおよび/または電荷により分離することを含む、請求項62に記載の方法。
- 前記分離がキャピラリー電気泳動を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記増幅処理が増幅反応サイクルを少なくとも2回含み、ここで各サイクルが、1)核酸鎖の分離;2)オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング;および3)アニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長の工程を含む、請求項62に記載の方法。
- 前記増幅処理の間および前記反応サイクルの少なくとも1回の後に、前記増幅反応の一部分を除去する工程、サイズおよび/または電荷により核酸分子を分離する工程、および前記識別可能な標識の取り込みを検出する工程を更に含み、ここで、前記検出により前記多型部位におけるヌクレオチドの同一性が決定される、請求項66に記載の方法。
- 前記除去、分離、および検出を前記処理の各サイクルの後に実施する、請求項67に記載の方法。
- 工程(I)〜(VIII)が、熱サイクル装置、サンプリング装置、キャピラリー電気泳動装置および蛍光検出器を含むモジュラー装置において実施される、請求項62に記載の方法。
- 前記タグ配列がそれぞれ15〜40個のヌクレオチドを含む、請求項62に記載の方法。
- 前記既知の多型部位の上流の既知の距離にある配列にハイブリダイゼーションする前記3’領域が10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項62に記載の方法。
- 前記多型部位の3’側およびこれに隣接してハイブリダイゼーションする前記領域が10〜30個のヌクレオチドを含む、請求項62に記載の方法。
- 識別可能に標識された下流の増幅プライマーの前記セットが、多型部位においてAの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてCの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;多型部位においてGの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセット;および多型部位においてTの存在に特異的に対応するタグ配列を含むサブセットからなる、請求項62に記載の方法。
- 核酸試料上に存在する多型部位において存在するヌクレオチドの決定のためのキットであって、前記キットが、下記:
a)5’タグ配列、および既知の多型部位の上流の既知の距離において特異的にハイブリダイゼーションするために十分な3’配列を含む第1プライマー;
を含む上流プライマーセット;および
b)下流の第2プライマー4個のセットであって、5’から3’の方向に、下記のものを含む:
i)前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてGに特異的に対応するタグ;前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてAに特異的に対応するタグ;前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてTに特異的に対応するタグ;および前記プライマーの3’末端ヌクレオチドとしてCに特異的に対応するタグからなる群より選択される配列タグ;
ii)前記多型部位の群における多型部位に隣接しておよびその3’側にある配列に特異的にハイブリダイゼーションする領域、ここで、前記下流増幅プライマーセットは、前記多型部位の群における各多型部位について前記多型部位に隣接して特異的にハイブリダイゼーションする領域を含むプライマーのサブセットを含む;および
iii)G、A、TまたはCから選択される3’末端ヌクレオチド、ここで、前記末端ヌクレオチドは、その下流増幅プライマー上の(i)に記載した配列タグに特異的に対応し、ここで、前記下流増幅プライマーが、多型部位に隣接しておよび3’側にある配列にハイブリダイゼーションする場合に、3’末端ヌクレオチドは前記多型部位に対向する;
を含むキット。 - 多型について調べる生物のゲノム内の遺伝子に特異的な配列を欠いた5個のプライマーのセットを更に含み、前記プライマーが、前記第1プライマーのタグ配列を含むプライマーと、下流の第2プライマー4個の前記セットのタグ配列を含む識別可能に標識されたプライマー4個のセットとを含む、請求項74に記載のキット。
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