WO2007055255A1 - 複数の識別用核酸配列を増幅する方法 - Google Patents

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WO2007055255A1
WO2007055255A1 PCT/JP2006/322304 JP2006322304W WO2007055255A1 WO 2007055255 A1 WO2007055255 A1 WO 2007055255A1 JP 2006322304 W JP2006322304 W JP 2006322304W WO 2007055255 A1 WO2007055255 A1 WO 2007055255A1
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WO
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nucleic acid
amplification
primer
sequence
acid sequence
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PCT/JP2006/322304
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuya Tanabe
Nobuhiko Morimoto
Original Assignee
Olympus Corporation
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Publication date
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Priority to US12/116,728 priority patent/US20090061440A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification reaction technique.
  • Human SNP Single Nucleotide Polymorphism; ie, single nucleotide polymorphism
  • Single nucleotide polymorphism is a gene polymorphism that is found at a frequency of about one in several hundred bases. These mutations are widely scattered in the genome regardless of coding region or non-coding region. The mutations include not only base substitutions but also base insertions (insertions) and deletions (delivery). Since the size of the human genome is 3 billion base pairs, even if there is such a polymorphism at a ratio of 1 force per 1000 bases, there will be 3 million SNPs in total. Therefore, finding a medically useful one out of such a large number of SNPs is not an easy task.
  • the related SNP can be identified with high accuracy by detecting as many samples as possible. For this purpose, first, a group of cases and a control group are formed so that statistically significant results can be obtained. Next, for each group, SNPs that are suspected of being related are detected with the required density and number, and their SNP types are determined, that is, typed. After that, the relationship with disease or drug sensitivity should be further analyzed.
  • the Sanger method is a method of typing using a DNA sequencer. Sequencing determines the nucleotide sequence surrounding SNP, and the ability to identify insertions and deletions. Designing primers to amplify genes with SNP is difficult, and sequencing reagents and equipment are expensive. In addition, the number of SNPs that can be typed in a single sequencing is approximately 1 force and 2 forces on average if the average interval and base length that can be sequenced. In this way, the highly reliable Sanger method limits the number of SNPs that can be examined at one time, which is time consuming and expensive. Therefore, in research to clarify the relationship between disease and SNP, it is necessary to narrow down the target gene and to perform the tuving.
  • the multiplex method was proposed in the late 90s as a gene analysis method such as SNP. This is the way it has been.
  • Orchid Cellmark provides a method called SNP-IT, which detects and reacts in one reaction and distinguishes 48 types of alleles using a microarray placed at the bottom of the microplate ( (Patent No. 3175110, Special Table 2002-508664).
  • the method most likely to be currently successful is the method provided by Illumina.
  • This method uses a polymerase extension reaction and a ligase ligation reaction to detect SNPs, then converts the target nucleic acid sequence into a zip code sequence, and is a unique detection device (Bead Array) that is similar to a microarray.
  • Bead Array a unique detection device that is similar to a microarray.
  • a maximum of about 1500 kinds of zip code sequences are simultaneously detected (Japanese Patent Publication No. 2002-519637, Japanese Patent Publication No. 2003-521252).
  • TM Bioscience provides a multiplex reaction kit that uses Luminex's fluorescently colored beads for detection (Japanese Patent Publication No. 200 4-522440). Special Table 2004-526433). This is provided as a genetic disease detection kit for research use.
  • Parallele provides the MIP (Molecular Inversion Probe) method.
  • MIP Molecular Inversion Probe
  • This provides a multiplex typing method by using a closed ring probe and a gap ligation method to reduce the cost of probe synthesis and increase the reaction efficiency (Hardenbol, P. et al, Nat. Biotechnol. 21, 673-678 (2003), Hardenbol, P. et al, Geno me Res. 15, 269-675 (2005)).
  • the common primer sequence is generally arranged so that the common primer is adjacent to both sides of the tag or the tag is sandwiched between other sequences.
  • a multiplex method using such a tag (hereinafter also referred to as a tag multiplex method) has been proposed as an effective means for analyzing SNPs.
  • the multiplex method using a tag also has a process of converting a natural gene sequence into an artificial sequence called a tag and detecting the converted tag.
  • a tag sequence has two characteristics because multiple genes are converted into tags and detected in a one-to-one correspondence within a single reaction solution. The first is that each tag reacts independently without cross-hybridization.
  • the tag multiplex method is free to associate with a gene. Therefore, if the same tag is always detected at the detection stage, the same detection method and detection device can be used even if the detection target gene changes.
  • the conventional tag multiplex method as described above includes amplifying the tag by PCR amplification using a common primer included with the tag.
  • the tag is detected after the amplification.
  • An example of a nucleic acid for detection used in the conventional method is shown in FIG.
  • the detection nucleic acid 1 has a common primer sequence 3, an identification nucleic acid tag 4, and a test gene complementary sequence 5 from the 5 ′ side.
  • the detection nucleic acid 2 has a common primer sequence 6 and a test gene complementary sequence 7 from the 3 ′ side. For example, when the detection nucleic acids 1 and 2 in Fig.
  • a base 8 complementary to the SNP to be detected is further included at the 3 'end of the detection nucleic acid 1 so that they are adjacent to each other.
  • the primer sequences contained in the detection nucleic acid 1 and the detection nucleic acid 2 designed in the above are used, and tag amplification is performed depending on the presence of the nucleic acid to be detected.
  • tag amplification is performed depending on the presence of the nucleic acid to be detected.
  • tag multiplex methods use a nucleic acid for detection and use the primer contained therein to detect the tag according to the presence of the nucleic acid to be detected. Is amplified.
  • an object of the present invention is to provide a method for amplifying a plurality of types of nucleic acids for identification.
  • the present invention provides the following means. That is,
  • nucleic acid fragments are a first nucleic acid sequence selected from the first group consisting of a first nucleic acid sequence up to the first force n, Nucleic acid fragment mixture comprising a plurality of nucleic acid fragments including one nucleic acid fragment selected from the second group consisting of 1 to m-th amplification nucleic acid sequence ability.
  • Amplification by using, as a primer, a sequence that is complementary or identical to the sequence of at least a portion of all the identifying and amplification nucleic acid sequences that may be present in the nucleic acid fragment mixture under conditions A method comprising:
  • n is an integer of 2 or more
  • the first to n-th identifying nucleic acid sequences included in the first group have different base sequences
  • m is an integer of 1 or more and n or less
  • the first to mth amplification nucleic acid sequences included in group 2 have different base sequences from each other: and
  • Reagent kit for use in the method described in (1) above comprising a plurality of primers from 1 to n, a common primer, a nucleic acid amplification enzyme, a noffer component and a dNTP mixture Kit:
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a nucleic acid for detection used in a conventional method.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing conventional amplification using two common probes.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the concept of the present invention.
  • FIG. 4 is a scheme showing one example of a gene analysis method using the method of the present invention.
  • FIG. 5 is a scheme showing 1 of the conventional gene analysis method.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a conventional nucleic acid for detection.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a conventional nucleic acid for detection.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing a conventional nucleic acid for detection.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing a conventional nucleic acid for detection.
  • FIG. 10 is a diagram schematically showing the reaction of the detection nucleic acid of FIG.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of detection performed in Examples.
  • Fig. 12 is a scatter plot of common primer PCR and a tag mix PCR.
  • Fig. 13 is a scatter diagram of common primer PCR and a scatter diagram of tag mix PCR.
  • Fig. 2 shows a typical conventional method.
  • the description will be given focusing on one nucleic acid fragment.
  • a reaction is performed on a plurality of nucleic acid fragments.
  • the nucleic acid fragment 21 comprises a nucleic acid sequence for identification 23, a first common primer binding site 22, a first gene complementary sequence 24, a second gene complementary sequence 25, and a second common primer binding site 26. Including.
  • the first common primer 27 and the second common primer 28 are used, and are amplified under conditions that allow nucleic acid amplification (FIG. 2 (A)).
  • a part of the amplification product obtained as a result is obtained as a nucleic acid fragment as shown in FIG. 2 (B).
  • Nucleic acid fragment 31 consists of a nucleic acid sequence for identification 32, a first gene complementary sequence 33, a second genetic sequence And a complementary nucleic acid sequence 34 and an amplification nucleic acid sequence 35.
  • a common primer 36 having a sequence complementary to the nucleic acid sequence 35 for amplification and a nucleic acid primer mixture 37 for all identification are used and amplified under conditions that allow nucleic acid amplification.
  • Figure 3 (B) a common primer 36 having a sequence complementary to the nucleic acid sequence 35 for amplification and a nucleic acid primer mixture 37 for all identification are used and amplified under conditions that allow nucleic acid amplification.
  • a first common primer binding portion and a second common primer binding site for hybridizing with two types of common primers to be used are provided. Is included (see Figure 2 (A)).
  • the sequence corresponding to the first common primer binding site 22 shown in FIG. 2 (A) is not included (see FIG. 3 (A)). That is, as shown in FIG. 3 (A), the nucleic acid fragment in the embodiment of the present invention includes the identification nucleic acid sequence 32, and the identification nucleic acid primer having a sequence complementary or partially complementary thereto.
  • nucleic acid sequence for amplification corresponds to the “common primer binding site” conventionally referred to, and therefore, the primer hybridizing thereto may be called “common primer”.
  • amplification nucleic acid sequence hybridizes to “amplification nucleic acid sequence” and functions as a primer, so it may be referred to as “amplification nucleic acid primer”, and “common primer” and “amplification nucleic acid primer” can be exchanged. May be used for
  • the "common primer” used herein has a base sequence selected according to the base sequence of the nucleic acid sequence for amplification and includes all or several different nucleic acid sequences for identification. Each of the amplification sequences having a specific base sequence ability may be included in common over a mixture of several nucleic acid fragments. As a result, it can be used in common for multiple types of nucleic acid fragments. Further, in the embodiment of the present invention, the common primer has a sequence that completely or partially hybridizes to the nucleic acid sequence for amplification 1 and has a different label, so that in the amplification system for the nucleic acid for identification 1 Multiple types may be used simultaneously Yes. For example, it may be designed so that a common primer can be discriminated, and that it can discriminate between genotypes of the polymorphic sites that have been hybridized.
  • the "common primer binding site" as the "amplification nucleic acid sequence” in the embodiment of the present invention is a force that only 1 is included in the nucleic acid fragment. It is used so as to hybridize to it. More preferably, it is 1 or more, and it is used in a smaller number than the kind of the nucleic acid primer for identification contained in all nucleic acid primer mixtures for identification used together.
  • FIG. 3 shows an example using one nucleic acid fragment for convenience, but when actually performing amplification, all the identification nucleic acids having a sequence complementary to at least one portion of the identification nucleic acid.
  • An amplification reaction may be performed on a plurality of nucleic acid fragments using a primer mixture as a primer and using one or more common primers.
  • each primer included in the all-identification nucleic acid primer mixture is included in the all-identification nucleic acid primer mixture in accordance with the amplification rate of the identification nucleic acid, which is a problem that may be a uniform amount.
  • the ratio of the nucleic acid primer for identification to be changed may be changed.
  • each identification nucleic acid is amplified by a primer complementary to each identification nucleic acid
  • the amount of the primer for amplifying each identification nucleic acid is limited. Amplification of tags with high amplification efficiency is not promoted abnormally. Conversely, even in the case of an identification nucleic acid with a low amplification factor, an amplification product is produced in which the primer that should be used for amplification is not deprived by the identification nucleic acid with a high amplification factor. Therefore, a plurality of types of nucleic acid for identification S are amplified with good balance.
  • nucleic acid fragment is shortened because one common primer is not required as compared with the conventional method. Therefore, nucleic acid synthesis costs are reduced and synthesis and Z or purification times are shortened.
  • nucleic acid fragment refers to an oligonucleotide that is conveniently synthesized as desired by the practitioner, a natural nucleic acid, or a part of a natural nucleic acid. But preferably synthesized oligonucleotides as desired by the practitioner It is. Further, in the tag multiplex method according to the embodiment of the present invention described later, the “nucleic acid fragment” may be referred to as “nucleic acid fragment”, which may be referred to as “detection nucleic acid”.
  • Detection nucleic acid may be used interchangeably.
  • the length of the nucleic acid fragment is about 10 bases or about 50 bases, preferably 15 to 30 bases.
  • nucleic acid fragment mixture refers to a mixture comprising a plurality of nucleic acid fragments.
  • base sequence of the nucleic acid fragment contained therein consists of two or more sequences.
  • the term "identification nucleic acid” refers to a nucleic acid to be amplified contained in a nucleic acid fragment. For example, a sequence to be detected or a target to be detected in a process subsequent to the amplification. For example, a nucleic acid containing a sequence.
  • identity nucleic acid may be used interchangeably with the word “tag”.
  • tag may be used interchangeably with “identification nucleic acid tag”.
  • the length of the nucleic acid for identification is about 15 bases and about 50 bases, preferably 15 bases to 30 bases.
  • the "all identification nucleic acid primer mixture” used herein can be used interchangeably with the term “tag mix primer” when the "identification nucleic acid” is indicated as “tag”.
  • the target nucleic acid that is hybridized to the “discriminating nucleic acid” and used as a primer is referred to as “discriminating nucleic acid primer” or simply “discriminating primer”.
  • the identification nucleic acid primer mixture used in one reaction system and the number of primers contained in the identification nucleic acid primer mixture may be determined as desired by the practitioner of the method according to the present invention. It is preferable to exist in the kind and quantity that correspond to the amplification sequence.
  • the number of bases of the identification nucleic acid sequence may be the same as the number of bases of the corresponding primer, and the identification nucleic acid sequence may be longer by 10 bases.
  • the number of bases of the nucleic acid sequence for amplification and the number of bases of the corresponding common primer may be the same, or the nucleic acid sequence for amplification may be longer by 10 bases.
  • the length of the nucleic acid sequence for amplification is about 50 bases, preferably about 20 to 30 bases, with about 10 bases.
  • nucleic acid is intended to mean cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, h nRNA, all DNA and RNA, including synthetic RNA.
  • under conditions allowing nucleic acid amplification may be any known conditions allowing nucleic acid amplification per se, but is appropriate, more appropriate or most appropriate in carrying out the amplification reaction.
  • the selection of conditions may be made freely by the practitioner of the present invention.
  • the conditions under which nucleic acid amplification is possible include appropriate primers according to the present invention, any known enzymes for nucleic acid amplification, known per se for adjusting the salt concentration balance of the reaction solution, etc. In an environment that contains any buffer components and dNTP mixture, etc., and the reaction temperature suitable for amplification is maintained.
  • amplification may be any amplification method known to those skilled in the art! Amplification methods such as PCR and asymmetric PCR can be preferably used.
  • the amplification method according to the present invention can be applied to any nucleic acid reaction system using a tag known per se, for example, a multi-status detection method using a tag, or amplification of a sequence in DNA computing.
  • a tag known per se
  • it is advantageously used as a method for amplifying the tag.
  • the multiplex typing method using the multiplex detection method is a method that has been proposed by the late 1990s in response to the recent demand for lower cost of genotyping and higher throughput. .
  • the present inventors amplify a tag contained in a nucleic acid for detection, and a gene sequence containing not only a tag but also a SNP in a region sandwiched between primer sequences is amplified together. I paid attention to it. As a result, it was found that the amplification rate can vary due to amplification of sequences other than the tag, and the amplification amount causes variation. Moreover, even if the reaction method is devised so that only the tag sequence is amplified and the sequence is selected so that the amplification efficiency is uniform, the efficiency of the tag conversion reaction up to that point will cause an early stage of tag amplification. The amount of amplification sometimes differed. Based on the above matters, the present inventors have found a multiplex tag amplification method according to the present invention.
  • multiplex tag amplification method refers to a method of amplifying a tag using a primer having a sequence complementary to each of a plurality of tags as a mixed primer.
  • a sample such as genomic DNA containing a mutation site to be analyzed, for example, SNP is collected, and this is subjected to multiplex PCR using a plurality of primers 42 (in the figure, (Referred to as Multiplex PCR) (Figure 4 (A)).
  • the obtained PCR product 43 is heat-denatured (denoted as “Heat Denaturation” in the figure) (FIG. 4 (B)).
  • the resulting single-stranded PCR product 43 (a) contains SNP (# 1) 46 in one strand.
  • This single-stranded PCR product 43 (a), oligonucleotide group 44 containing a predesigned tag sequence, and primer 45 labeled with piotin are reacted under appropriate conditions (Fig. 4 (C )).
  • genotype of SNP46 being analyzed matches the sequence of oligonucleotide 44 (a) contained in oligonucleotide group 44, they are linked by ligation (indicated as Ligation in the figure) ( Figure 4 (D)), and It is bound to magnetic beads 47 solid-phased with streptavidin (denoted SA in the figure) ( Figure 4 (E)).
  • This is alkali-denatured (denoted as Alkali denaturation in the figure), and is a common primer that is fluorescently labeled with the tag Mits primer 48 and the first fluorescent substance for the linking nucleotide 50 while remaining bound to the magnetic beads 47
  • amplification is performed under conditions capable of asymmetric PCR.
  • the first fluorescent substance and the second fluorescent substance can be distinguished from each other, and their use makes it possible to identify the genotype of the target SNP.
  • a PCR product 51 fluorescently labeled with either the first or second fluorescent substance depending on the genotype is obtained (FIG. 4 (G)).
  • Fig. 4 (H) By measuring the fluorescence intensity of the fluorescent label, The SNP (# 1) allele that exists at the specified position is determined.
  • a target product can be specifically amplified while maintaining amplification efficiency even in a sample containing a large amount of complex sequences or similar sequences such as a human genome. I think it can be done.
  • nucleic acid shall mean cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, mRNA, total RNA, hnRNA, and all DNA and RNA including synthetic RNA.
  • the target nucleic acid to be detected or quantified can be any nucleic acid having an arbitrary sequence, but a nucleic acid that can serve as a disease marker, such as a gene causing a disease, a cancer-related gene, or a nucleic acid derived from a virus, Preferred target nucleic acids. Therefore, the sample includes body fluids such as blood, urine and saliva, but any sample other than body fluids can be used.
  • the sample may be dissolved in the liquid by an appropriate method such as enzyme treatment, addition of a surfactant or organic solvent.
  • the target nucleic acid can be arbitrarily changed in carrying out this method. For example, by preparing a large amount of human genomic DNA necessary for this method by culturing cells in large quantities and culturing them in large quantities, or by obtaining a large amount of peripheral blood, the genomic DNA force detection reaction can be started directly. Alternatively, a small amount of genomic DNA can be obtained and detected using a WGA method (Whole Genome Amplification), such as the reagent kit GenomiPhi of Amersham Biosciences, to detect a sample from non-specifically amplified genomic DNA. You may start.
  • WGA method Whole Genome Amplification
  • the detection reaction may be started from the amplification of a specific sequence using primers such as PCR, multiplex PCR, and asymmetric PCR.
  • primers such as PCR, multiplex PCR, and asymmetric PCR.
  • the target nucleic acid is assumed to be genomic DNA or the like. It may be amplified by such as. Samples obtained by other enzymatic amplification methods, in the case of double-stranded samples, are heated to 95 ° C and rapidly cooled to 4 ° C to form single strands, Heat to 95 ° C in a very low solution to fragment, and then perform detection after adding single-strand and fragmentation procedures such as fragmenting with ultrasound and cleaving with restriction enzymes.
  • reaction solution used in the amplification step a general PCR reaction solution can be used, and a commercially available kit can also be used.
  • Enzyme Titanium Taq (Takara Bio)
  • Nota Titanium Taq buffer ⁇
  • Primer 0.1 ⁇ each DNA: 10 ng
  • Reaction volume 20 ⁇ L.
  • the following modes are conceivable.
  • the following can be considered for the use and place of the detection method of the present invention.
  • elucidation of the relationship between human genotypes and diseases, detection of drug susceptibility, detection of changes in protein binding in the gene regulatory region, molecular biologicals of gene polymorphisms when the target organism is changed from human to another organism Use for research such as simple analysis. These studies will be conducted in research institutes and laboratories such as universities and companies.
  • a test for selecting a treatment method at a hospital test center or a diagnosis for prevention in a medical checkup can be used for medical purposes such as drug susceptibility testing for the selection of anticancer drugs with small side effects.
  • the user himself / herself is implemented as a genetic polymorphism detection reagent kit for research and diagnosis for carrying out the method, and by an automatic reaction apparatus that automatically processes the method.
  • an automatic reaction apparatus that automatically processes the method.
  • reactions used for the conversion include ligase ligation (OLA) and single-base extension with polymerase. Each method maximizes the ability of the enzyme to discriminate between mismatched hybrids.
  • OLA ligase ligation
  • the probe sequence is set so that the SNP base is located at the 3 'end of the linked probe (Luo , J. et al, Im proving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase, Nucl. Acids Res. 24, 3071-78 (1996)).
  • the conventional technique uses two common primers, according to the reaction according to the embodiment of the present invention, the same amount of primers of two kinds of amplification sequences and an identification sequence (ie, tag) ) PCR amplification of a primer mixture containing the same amount of all types as a primer set ing.
  • the amount of primer may be changed for each tag while exerting force.
  • each tag is amplified with a primer complementary to each tag, the amount of primer for amplifying each tag is limited. As a result, amplification of tags with high amplification efficiency is not abnormally accelerated. Conversely, even if the tag has a low amplification factor, the primer that should be used for amplification has a high amplification factor and is not deprived of the tag, so that a sufficient amplification product is generated. Therefore, it is possible to suppress variations in amplification amounts of a plurality of tags.
  • the gene is widely used.
  • gene analysis is multiplexed using DCN. It is desirable in terms of cost and work efficiency if PCR can be multiplexed in the same way, as well as PCR that cuts around the SNP.
  • the present invention is not limited to this.
  • the method according to the present invention can effectively analyze SNPs.
  • FIG. 5 shows a scheme in which one embodiment of the present invention described in FIG. 4 is performed by a conventional method.
  • the force shown in FIG. 5 (A) is the same as that shown in FIG. 4 until (E).
  • there is a difference in the amplification reaction in FIG. That is, in the method of the present invention shown in FIG. 4, primers having mutual tag sequences were used, whereas in FIG. 5, the common primer 60, the first labeled common primer 61a, and the second labeled Use 6 lb of common primer.
  • the method for amplifying a nucleic acid for identification and the Z or tag multiplex method of the present invention can also be used for the zip code method shown in FIG.
  • the detection nucleic acid used in the method is schematically shown.
  • the target gene is analyzed using the detection nucleic acid 70 and the detection nucleic acid 72 before the reaction. After the reaction, the detection nucleic acid 70 and the detection nucleic acid 72 are linked to each other (FIG. 6 (B)).
  • FIG. 7 shows the two types of nucleic acids for detection used in the method of FIG. 5 before the reaction (FIG. 7 (A)) and the state after the reaction (FIG. 7 (B)).
  • the pre-reaction state of the MIP method is shown in Fig. 8 (A)
  • the post-reaction state is shown in Fig. 8 (B)
  • the hybrid of the detection nucleic acid and genomic DNA in Fig. 8 (B).
  • Figure 10 (A) to (D) show the formation mode and tag amplification process:
  • the state before reaction is shown in Fig. 9 (A)
  • the state after reaction is shown in Fig. 9 ( B) 7 self-written.
  • the structures of the nucleic acids for detection used in the Rose-Zip Code method, Toyama et al. Method, MLP method, and Illumina Golden Gate method are all in the common primer region. There are two places, and at least one tag sequence corresponding to a gene to be detected or a gene mutation is provided at one or more places. Therefore, according to the above-described method of the present invention, if the primer group complementary to the tag sequence is used and one of the common primers is not used, the above-described effects of the present invention can be obtained.
  • the amount of the tag primer may be changed according to the amplification rate of the tag. Also, asymmetric symmetric PCR may be executed with either primer amount being increased.
  • the tag sequence primer may be modified with a fluorescent dye
  • the common primer may be modified with a fluorescent dye
  • each primer may be modified with chemical modifications other than fluorescent dyes, such as DIG (digoxigenin), piotin, and hapten.
  • the common primer side may be classified into two or more types, preferably about 10 types, and reacted as a mix during PCR.
  • the types of tags that can be identified are (number of tag types) X (number of common primer types), so the number of tag types can be dramatically increased.
  • the method is a multiplex SNP detection method using a tag, and the detection reaction is Japanese Patent Application No. 2004-2967.
  • the SNP base sequence to be detected is a total of 96 SNPs obtained from the Japanese SNP database JSNP maintained by the Institute of Medical Science, the University of Tokyo.
  • the detected sample is human genomic DNA extracted from human peripheral blood cells stocked by the Human Science Research Resource Bank of the Human Science Promotion Foundation.
  • the detected sample is PSC
  • the region containing the genomic DNA strength target SNP was amplified by multiplex PCR. Since amplification at 24 SNP sites is performed in one reaction tube, amplification was performed 4 times per sample. This operation was performed according to the following procedure.
  • the composition of the solution used for this PCR reaction is as follows. Titanium Taq, a product of Takara Bio Inc., was used as the reaction solution. Ultrapure water was prepared by Milli-Q Synthesis from Millipore. Primer sequences were designed using Visual OMP from DNA Software, USA.
  • Titanium Taq (50 times concentration) 0.4 ⁇ L
  • the thermal cycle for the reaction was as follows.
  • the thermal cycler used was a PTC-200 from MJ Research.
  • the force shown in the method divided into four times can be performed once.
  • 94 primers can be amplified in a single tube.
  • primers having the sequences described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 94 were used.
  • Probe mix (96SNP detection mixture, 0.1 ⁇ ⁇ each) 0.2 ⁇ L
  • the encode reaction solution was reacted at the following temperature.
  • the magnetic beads whose surfaces were coated with streptavidin were Dynal's M-280 magnetic beads.
  • a solution having the following composition was used as a B & W buffer according to the instructions of the beads.
  • Streptavidin magnetic beads (hereinafter referred to as magnetic beads) are obtained by taking 5 ⁇ L from a stock solution containing a preservative and replacing the stock solution with B & W to make 5 ⁇ L again. The solution thus prepared is shaken at room temperature for 15 minutes so that the magnetic beads are well dispersed in the solution.
  • Primer SD (10 ⁇ ) 0.1 L
  • Primer Cy3-rED (10 ⁇ ⁇ ) 0.5 ⁇ L
  • Tag mix primer (25 M) 1 il l
  • the reaction solution was mixed with encoded magnetic beads except the solution to disperse the beads.
  • the thermal cycle of the reaction is as follows.
  • the PTC-200 was used for the thermal cycler. If the cycle elongation method is used, the number of cycles is preferably 30 to 40 cycles.
  • the product obtained here is called the labeled PCR product.
  • a detection reaction was performed.
  • a capillary array JP-A-11-75812
  • the capillary array is a device that detects nucleic acids using a hybridization similar to a DNA microarray, and is probed with a probe force S along a groove-shaped channel.
  • the array used in this study had 50 tag detection probes fixed in one groove, and the groove capacity was 25 1.
  • the pillar is formed on a silicon rubber plate and is attached to a slide glass in which the probe is spotted in a straight line using the adhesiveness of silicon rubber.
  • the labeled PCR product was hybridized to this capillary array.
  • the magnetic beads remain in the asymmetric PCR solution.
  • the magnetic beads were collected and the supernatant was collected without sucking it.
  • the hybridization reaction is completed by the above procedure, followed by the microarray scanner. Fluorescence detection was carried out. Axon GenePix 4000B was used as the scanner, and detection was performed at Cy3 and Cy5 detection wavelengths.
  • the fluorescence-labeled control target that hybridizes to a probe different from the sample at the time of hybridization was labeled with Cy3 and Cy5, respectively, added in the same amount, and hybridized simultaneously with the sample.
  • the normalized fluorescence intensity average is the average value of the sum of the fluorescence intensity of Cy5 and Cy3 of each SNPs divided by the fluorescence intensity of the same hybrid control target.
  • Fig. 11 shows the normalized fluorescence intensity average for each SNP, and is plotted in order from the highest.
  • the tag mix primer increased the average fluorescence intensity by 10 times, and the% CV value, which represents the variation in signal intensity, decreased to 160% force and 90%, improving amplification uniformity.
  • Table 1 Each amplification method and fluorescence intensity and variation of the obtained PCR products
  • a plurality of types of identification nucleic acids are amplified.
  • a method for providing is provided.

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Abstract

　タグを利用するマルチプレックス検出において複数のタグを使用した場合に、当該複数のタグ間の増幅量のばらつきが少ない方法を提供する。 　複数の核酸フラグメントを増幅する方法であって、前記核酸フラグメントは、第１から第ｎまでの識別用核酸配列からなる第1の群より選択された１の識別用核酸配列と、第1から第ｍまでの増幅用核酸配列からなる第２の群より選択された１の増幅用核酸配列とを含み、このような核酸フラグメントを複数種類含む核酸フラグメント混合物を、核酸増幅が可能な条件下において、前記核酸フラグメント混合物に存在する可能性のある全ての識別用核酸配列の少なくとも一部分の配列および増幅用核酸配列の少なくとも一部分の配列に相補的または同一鎖側の配列をプライマーとして使用することによって増幅することを具備する方法；ここで、ｎは２以上の整数であり、第1群に含まれる第1から第ｎまでの識別用核酸配列は互いに塩基配列が異なり、ｍは１以上のｎ以下の整数であり、第２の群に含まれる第１から第ｍまでの増幅用核酸配列は互いに塩基配列が異なる。

Description

明 細 書
複数の識別用核酸配列を増幅する方法
技術分野
[0001] 本発明は、核酸の増幅反応技術に関する。
背景技術
[0002] ヒトの SNP (Single Nucleotide Polymorphism;即ち、 1塩基多型）は、数百塩基に 1つ 程度の頻度で見られる遺伝子多型である。これらの変異は、コーディングリージョン、 ノンコーディングリージョンを問わず広くゲノム上に散在している。またその変異は、塩 基の置換のみならず、塩基の挿入 (インサーシヨン)や欠失 (デリシヨン)も見られる。ヒ トゲノムの大きさは 30億塩基対であるから、 1000塩基に 1力所の割合でそのような多型 があるとしても、全体では 300万の SNPが存在することになる。従って、このような膨大 な数の SNPの中から医学的に有用なものを見つけ出すことは、容易な作業ではない 。例えば、 SNPと疾病または SNPと薬剤感受性などの関連性を明らかにするためには 、できるだけ多くのサンプルを検出することにより精度高く関連 SNPを特定できる。そ のためには、まず、統計的に有意な結果が得られるだけの数のケース群と、コント口 ール群とを構成する。次に、それぞれの群について関連性の疑われる SNPを必要な 密度と数で検出し、それらの SNP型の決定、即ち、タイピングをする。その後、更に疾 病または薬剤感受性などとの関連性を解析しなければならない。
[0003] サンガー法は、 DNAシーケンサを用いてタイピングする方法である。シーケンシング すると SNPの周囲の塩基配列も確定し、挿入や欠失もわかる力 SNPのある遺伝子を 増幅するためのプライマーの設計が大変で、シーケンシング反応の試薬、装置も高 い。また、一度のシーケンシングでタイピングできる SNPの数はその平均間隔とシーケ ンシング可能な塩基長力 すれば力 平均 1力所力 2力所程度である。このように信頼 性高いサンガー法では一度に調べられる SNPの数が限られ、時間とコストがかかる。 そのために、疾病と SNPの関係を明らかにする研究では対象とする遺伝子を絞ってタ ィビングをせざるを得な 、。
[0004] マルチプレックス法は、 SNPなどの遺伝子解析方法として 90年代後半力も提案され てきたの方法である。
[0005] 例えば、コーネル大学のバラ-一らは、 LDR (即ち、 Ligase Detection Reaction)なる リガーゼを使った SNP検出方法と、 目的とする核酸配列をジップコードと呼ばれるタグ に変換することとを組み合わせることによって、同一の反応液内で複数の SNPを検出 する方法を開発した。この方法は、現在、 ABI社の検出キット SNPlexとして商品化され ている（特表 2000-511060公報、特表 2001-519648公報、特表 2004-526402公報）。
[0006] ォーキッド'セルマーク (Orchid Cellmark)社は、 1反応液中で検出反応し、マイクロ プレートの底に配置したマイクロアレイで 48種類のアレルを見分ける SNP-ITという方 法を提供している（特許第 3175110号明細書、特表 2002-508664公報)。
[0007] 現在もっとも成功を収めていると思われるのは、イルミナ (Illumina)社の提供する方 法である。この方法は、ポリメラーゼ伸長反応とリガーゼの連結反応を行って SNPを検 出した後で、 目的とする核酸配列をジップコード配列に変換し、マイクロアレイと同様 なシステムである独自の検出デバイス (Bead Arrayと称される)を用いることにより、最 大で約 1500種類のジップコード配列を同時に検出する方法である（特表 2002-51963 7公報、特表 2003-521252公報）。
[0008] TM ·バイオサイエンス (TM Bioscience)社は、ルミネックス (Luminex)社の蛍光で色分 けしたビーズを利用して検出するマルチプレックス反応キットを提供している (特表 200 4-522440公報、特表 2004-526433公報)。これは、研究用途の遺伝病検出キットとし て提供されている。
[0009] バーレル (Parallele)社は、 MIP (Molecular Inversion Probe)法を提供して 、る。これ は、閉環プローブとギャップライゲーシヨン法とを利用し、プローブ合成コストを下げ、 反応効率を高めたタグを用いることによるマルチプレックスタイピング法を提供する（H ardenbol, P. et al, Nat. Biotechnol. 21, 673-678 (2003)、 Hardenbol, P. et al, Geno me Res. 15, 269-675 (2005))。
[0010] 上述したマルチプレックス技術では、一般的に、タグの両側に共通プライマーを隣 接させるように、または他の配列を介してタグを挟み込むように共通プライマー配列を 配置するよう構成する。このようなタグを利用するマルチプレックス法（以下、タグマル チプレックス法とも称す）は、 SNPを解析するための有効な手段として提案されている [0011] タグを使ったマルチプレックス法は、天然の遺伝子配列をタグと呼ばれる人工の配 列に変換する反応と変換後のタグを検出する過程力もなる。マルチプレックス反応で は、ひとつの反応溶液内で複数の遺伝子を 1対 1対応でタグに変換し検出するため、 タグ配列は、 2つの特徴を備えている。まず 1つ目は、それぞれのタグが互いにクロス ハイブリダィゼーシヨンせずに独立に反応することである。 2つ目は、同一溶液で同時 に反応するために、融解温度 (即ち、 Tm値）が揃うように設計されていることである。タ グマルチプレックス法は、遺伝子配列そのものをプローブで捕らえるマイクロアレイと 違って遺伝子との対応付けが自由である。従って、検出段階でいつも同じタグを検出 すればよぐ検出対象の遺伝子が変わっても同一の検出手法、および検出デバイス が使えるので柔軟性がある。
[0012] また更に、上述したような従来のタグマルチプレックス法においては、タグと共に含 まれる共通プライマーを利用し、 PCR増幅することによってタグを増幅することも含ま れる。当該増幅の後でタグを検出する。従来の方法において使用される検出用核酸 の 1例を図 1に示す。この例の場合、 2つの検出用核酸を使用する。検出用核酸 1は 、 5'側から共通プライマー配列 3、識別用核酸タグ 4、被検遺伝子相補配列 5を有す る。検出用核酸 2は、 3'側から共通プライマー配列 6と被検遺伝子相補配列 7を有す る。例えば、図 1の検出用核酸 1および 2をジップコード法に使用する場合、検出用核 酸 1の 3'末に、検出しょうとする SNPに相補的な塩基 8が更に含まれ、隣接するように 設計された検出用核酸 1と検出用核酸 2に含まれる夫々のプライマー配列が利用さ れ、且つ検出しょうとする核酸の存在に依存してタグの増幅が行われる。このようなジ ップコード法に限らず、多くの従来のタグマルチプレックス法では、検出用核酸が使 用され、そこに含まれるプライマーを利用して、検出対象となる核酸の存在に応じて 当該タグが増幅される。
[0013] このような従来のタグ配列を用いたマルチプレックス法では、タグ配列の PCR増幅の 際に、増幅されたタグ配列が、特定のタグ配列に偏って高い増幅率であったり、逆に 特定のタグ配列に関して低い増幅率であったりと、その増幅率にはばらつきが存在し ており、得られる増幅産物の量にばらつきが生じてしまう。 発明の開示
[0014] [発明が解決しょうとする課題]
上述の状況に鑑み、本発明の目的は、複数種類の識別用核酸を増幅するための 方法を提供することである。
[0015] 本発明の更なる目的は、タグを利用するマルチプレックス検出において、増幅され る複数のタグについて、その増幅量におけるばらつきの少ない方法を提供することで ある。
[0016] [課題を解決するための手段]
上記の目的を解決するために本発明は以下の手段を提供する。即ち、
(1) 複数の核酸フラグメントを増幅する方法であって、前記核酸フラグメントは、第 1 力 第 nまでの識別用核酸配列からなる第 1の群より選択された 1の識別用核酸配列 と、第 1から第 mまでの増幅用核酸配列力 なる第 2の群より選択された 1の増幅用核 酸配列とを含み、このような核酸フラグメントを複数種類含む核酸フラグメント混合物 を、核酸増幅が可能な条件下において、前記核酸フラグメント混合物に存在する可 能性のある全ての識別用核酸配列および増幅用核酸配列の少なくとも一部分の配 列に相補的または同一鎖側の配列をプライマーとして使用することによって増幅する ことを具備する方法；
ここで、 nは 2以上の整数であり、第 1群に含まれる第 1から第 nまでの識別用核 酸配列は互いに塩基配列が異なり、 mは 1以上の n以下の整数であり、第 2の群に含 まれる第 1から第 mまでの増幅用核酸配列は互いに塩基配列が異なる：および
(2) 前項（1)に記載の方法に使用するための試薬キットであり、第 1から第 nまでの 複数のプライマーと、共通プライマーと、核酸増幅用酵素、ノッファ成分および dNTP 混合物を含む試薬キット：
である。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は、従来法で使用された検出用核酸を示す模式図である。
[図 2]図 2は、共通プローブを 2つ使用する従来の増幅を示す模式図である。
[図 3]図 3は、本発明の概念を示す模式図である。 [図 4]図 4は、本発明の方法を利用した遺伝子解析法の 1例を示すスキームである。
[図 5]図 5は、従来の遺伝子解析法の 1を示すスキームである。
[図 6]図 6は、従来の検出用核酸を示す模式図である。
[図 7]図 7は、従来の検出用核酸を示す模式図である。
[図 8]図 8は、従来の検出用核酸を示す模式図である。
[図 9]図 9は、従来の検出用核酸を示す模式図である。
[図 10]図 10は、図 8の検出用核酸の反応を模式的に示した図である。
[図 11]図 11は、実施例で行った検出の結果を示すグラフである。
[図 12]図 12は、共通プライマー PCRの散布図とタグミックス PCRによる散布図である
[図 13]図 13は、共通プライマー PCRの散布図とタグミックス PCRによる散布図である 発明を実施するための最良の形態
[0018] 1.識別用核酸の増幅方法
複数種類の識別用核酸を増幅する方法の概念について簡単に説明する。まず、一 般的な従来法を図 2に模式的に示した。ここでは便宜上、 1の核酸フラグメントに注目 して説明するが、実際に実施される場合には複数の核酸フラグメントに対して反応が 行われる。図 2(A)を参照されたい。従来の方法では、上述した通り、 2つの共通ブラ イマ一を使用する。従って、核酸フラグメント 21は、識別用核酸配列 23と、第 1の共 通プライマー結合部位 22と、第 1の遺伝子相補配列 24と第 2の遺伝子相補配列 25 および第 2の共通プライマー結合部位 26を含む。当該核酸フラグメント 21の増幅に は、第 1の共通プライマー 27と第 2の共通プライマー 28が用いられ、核酸増幅が可 能な条件下において増幅される (図 2(A))。その結果得られる増幅産物の一部は、図 2(B)に示すような核酸フラグメントとして得られる。
[0019] 次に本発明に従う複数種類の識別用核酸を増幅する方法の概念を簡単に説明す る。ここでも便宜上、 1の核酸フラグメントに注目して説明するが、実際に実施される 場合には複数の核酸フラグメントに対して反応が行われる。図 3(A)を参照されたい。 核酸フラグメント 31は、識別用核酸配列 32、第 1の遺伝子相補配列 33、第 2の遺伝 子相補配列 34および増幅用核酸配列 35を含む。当該核酸フラグメント 31の増幅に は、増幅用核酸配列 35に相補的な配列を有する共通プライマー 36と、全識別用核 酸プライマー混合物 37とが用いられ、核酸増幅が可能な条件下において増幅される (図 3(B》。
[0020] 上述した通り、本発明の態様に従う識別用核酸の増幅方法では、従来では、 2種類 使用する共通プライマーとハイブリダィズするための第 1の共通プライマー結合部と 第 2の共通プライマー結合部位が含まれている（図 2(A)を参照されたい)。それに対 して、本発明では、図 2(A)に示される第 1の共通プライマー結合部位 22に相当する 配列は含まれない (図 3(A)を参照されたい)。即ち、図 3(A)に示すように、本発明の態 様における核酸フラグメントには、識別用核酸配列 32が含まれ、それに相補的、また は一部相補的な配列を有する識別用核酸プライマー 37が使用され、配列に応じて 識別用核酸配列 32にハイブリダィズする。更に、ここでの増幅には更なるプライマー が必要であるが、このプライマーは、増幅用核酸配列 35にハイブリダィズすることの 可能な配列を有する共通プライマー 36であればよい。例えば、当該増幅用核酸配 列に相補的な配列または一部相補的な配列、または少なくとも一部が相同な配列で あってもよい。本発明の態様において、「増幅用核酸配列」は従来で称するところの「 共通プライマー結合部位」に相当し、従って、これにハイブリダィズするプライマーは 、「共通プライマー」と称されてもよい。また、本発明においては、「増幅用核酸配列」 にハイブリダィズしてプライマーとして機能することから「増幅用核酸プライマー」と称 してもよく、「共通プライマー」と「増幅用核酸プライマー」を交換可能に使用してもよ い。
[0021] ここで使用される「共通プライマー」とは、増幅用核酸配列の塩基配列からに応じて 選択された塩基配列を有し、全て、または幾つカゝの異なる識別用核酸配列を含む複 数の核酸フラグメント混合物に亘つて、特定の塩基配列力 なる増幅用各配列を共 通して含ませてもよい。それにより、複数種類の核酸フラグメントに対して共通して使 用することも可能になる。また本発明の態様において、共通プライマーは、 1の増幅 用核酸配列に完全にまたは一部ハイブリダィズするような配列を有し、且つ異なる標 識を付されて、 1の識別用核酸の増幅系において複数種類が同時に使用されてもよ い。例えば、共通プライマーに識別可能な標識をし、それがノ、イブリダィズした多型 部位の遺伝子型の違いを識別可能にするよう設計されてもよい。
[0022] 本発明の態様における「増幅用核酸配列」としての「共通プライマー結合部位」は 1 のみが当該核酸フラグメントに含まれる力 これにハイブリダィズするように使用される 共通プライマーは 1以上を同時に使用されてもよぐ好ましくは 1以上で且つ共に使 用される全識別用核酸プライマー混合物に含まれる識別用核酸プライマーの種類よ りも少な ヽ数で使用される。
[0023] 図 3には便宜上、 1の核酸フラグメントを用いた例を示したが、実際に増幅を行う際 には、当該識別用核酸に少なくとも 1部分において相補的な配列を有する全識別用 核酸プライマー混合物をプライマーとして使用し、且つ 1以上の共通プライマーを使 用し、複数の核酸フラグメントに対して増幅反応を実施してもよい。
[0024] また、全識別用核酸プライマー混合物に含まれる各々のプライマーは全て均一量 としてもよぐ問題となる識別用核酸の増幅率に応じて、当該全識別用核酸プライマ 一混合物に含まれる対応する識別用核酸プライマーの割合を変更してもよい。
[0025] このような本発明に従う複数種類の識別用核酸を増幅する方法によって、増幅され る核酸毎の増幅率のばらつきは従来よりも顕著に少なくなる。
[0026] 即ち、本発明の態様では、各識別用核酸を、各識別用核酸に相補的なプライマー によってそれぞれに増幅するため、各識別用核酸を増幅するプライマーの量が制限 され、それによつて増幅効率の高いタグの増幅が異常に促進されることがなくなる。ま た逆に、増幅率の低い識別用核酸の場合であっても増幅に使われるはずのプライマ 一が増幅率の高い識別用核酸に奪われることなぐ増幅産物が生成する。従って、 複数種類の識別用核酸力 Sバランスよく増幅される。
[0027] また、従来法に比べて共通プライマーが 1箇所不要となるので、核酸フラグメントの 長さが短縮される。従って、核酸の合成費用の低減や、合成および Zまたは精製時 間が短縮される。
[0028] ここで使用される「核酸フラグメント」とは、実施者の所望に応じて都合よく合成され たオリゴヌクレオチドであっても、天然の核酸力 なっても、天然の核酸を一部含むも のであってもよいが、好ましくは実施者の所望に応じて合成されたオリゴヌクレオチド である。また、後述する本発明の態様に従うタグマルチプレックス法においては、当 該「核酸フラグメント」は「検出用核酸」と称されてもよぐ 2つの語「核酸フラグメント」と
「検出用核酸」は交換可能に使用されてもよい。核酸フラグメントの長さは、約 10塩基 力も約 50塩基、好ましくは 15塩基から 30塩基である。
[0029] ここで使用される「核酸フラグメント混合物」とは、複数の核酸フラグメントからなる混 合物を指す。特に、「核酸フラグメントを複数種類含む核酸フラグメント混合物」の場 合、そこに含まれる核酸フラグメントの塩基配列は 2以上の配列からなる。
[0030] ここで使用される「識別用核酸」の語は、核酸フラグメントに含まれる増幅対象となる 核酸をいい、例えば、当該増幅の後に続く過程で検出の対象となる配列または当該 対象となる配列を含む核酸などである。後述する本発明の 1態様であるタグマルチプ レックス法で当該方法を使用する場合には、「識別用核酸」は「タグ」の語と交換可能 に使用されてよい。また、「タグ」の語は、「識別用核酸タグ」と交換可能に使用されて もよい。識別用核酸の長さは、約 12塩基力も約 50塩基、好ましくは 15塩基から 30塩 基である。
[0031] ここで使用される「全識別用核酸プライマー混合物」は、当該「識別用核酸」を「タグ 」と示す場合、「タグミックスプライマー」の語と交換可能に使用することが可能である。 「識別用核酸」にハイブリダィズさせプライマーとして使用する目的の核酸を「識別用 核酸プライマー」または単に「識別用プライマー」と称する。
[0032] 1反応系において使用される当該識別用核酸プライマー混合物およびに含まれる プライマー数は、本発明に従う方法の実施者が所望に応じて決定すればよいが、予 め決定した識別用配列と増幅用配列に対応するだけの種類と量で存在するのが好 ましい。
[0033] 識別用核酸配列の塩基数と、対応するプライマーの塩基数は同一であってもよぐ また、 1塩基力も 10塩基だけ、識別用核酸配列の方が長くてもよい。
[0034] また、増幅用核酸配列の塩基数と、対応する共通プライマーの塩基数は同一であ つてもよく、また、 1塩基力も 10塩基だけ、増幅用核酸配列の方が長くてもよい。増幅 用核酸配列の長さは、約 10塩基力も約 50塩基、好ましくは 20塩基から 30塩基であ る。 [0035] ここで使用される「核酸」の語は、 cDNA、ゲノム DNA、合成 DNA、 mRNA、全 RNA、 h nRNA、合成 RNAを含む全ての DNA及び RNAを意味するものとする。
[0036] 本明細書における「核酸増幅が可能な条件下」とは、それ自体公知の核酸増幅が 可能な何れの条件でもよいが、増幅反応を実施するに当たり、適切、より適切または 最も適切な条件の選択は、本発明の実施者によって自由に行われてよい。例えば、 核酸増幅が可能な条件とは、本発明に従う適切なプライマーと、それ自身公知の何 れかの核酸増幅用の酵素類、反応液の塩濃度バランスなどを調節するためのそれ 自身公知の何れかのバッファ成分および dNTP混合物などを含み、且つ、増幅に適 切な反応温度が維持された環境であればょ 、。
[0037] ここで使用される「増幅」とは、それ自身当業者に公知の何れの増幅方法であって もよ！/、が、 PCRおよびァシンメトリック PCRなどの増幅方法が好ましく使用し得る。
[0038] 2.マルチプレックスタグ増幅法
更なる態様に従うと、本発明に従う増幅方法は、例えば、タグを用いたマルチプレツ タス検出法、 DNAコンピューティングにおける配列の増幅など、それ自身公知のタグ を利用して行われる核酸反応系の何れにぉ 、ても、有利に当該タグを増幅するため の方法として使用される。
[0039] 例えば、マルチプレックス検出法を利用したマルチプレックスタイピング法は、最近 の遺伝子タイピングの低コスト化、高スループットィヒの要求に応えるベぐ 90年代後半 カゝら提案されてきた方法である。
[0040] 本発明の 1態様に従い、上述の項「1.識別用核酸の増幅方法」を使用し、タグ増幅 を行うことにより、タグ増幅において問題とされる増幅量のばらつきをより都合よく抑え ることが可能である。
[0041] 本発明者らは、マルチプレックス検出法では検出用核酸に含まれるタグを増幅する とき、プライマー配列にはさまれる領域にタグだけでなく SNPを含む遺伝子配列も一 緒に増幅されてしまうことに注目した。その結果、このようなタグ以外の配列の増幅に より増幅率にばらつきができ、増幅量がばらつきの原因になることを見出した。また、 反応方法を巧みにし、タグ配列のみを増幅するようにし、増幅効率が揃うように配列 を選抜しても、それに至るまでのタグ変換反応の効率差によりタグ増幅の初期段階で 増幅量が異なってしまうことがあった。以上の事項を基に、本発明者らは、本発明に 従うマルチプレックスタグ増幅法を見出した。
[0042] ここで使用される「マルチプレックスタグ増幅法」とは、複数のタグのそれぞれに相補 的な配列を有するプライマーを混合プライマーとして使用し、当該タグを増幅する方 法を指示する。
[0043] 以下、本発明の 1態様に従うマルチプレックスタグ増幅法を利用した SNP解析方法 の例を図 4を用いて説明する。
[0044] まず、対象カゝら解析しょうとする変異部位、例えば、 SNPなどを含む、例えば、ゲノム DNAなどの試料を採取し、これを複数のプライマー 42を用いてマルチプレックス PCR (図中、 Multiplex PCRと記す)する（図 4(A))。得られた PCR産物 43を熱変性 (図中、 H eat Denaturationと記す)する（図 4(B))。得られた 1本鎖 PCR産物 43(a)は、 SNP(#1)46 を一方の鎖に含む。この 1本鎖 PCR産物 43(a)と、予め設計されたタグ配列を含むオリ ゴヌクレオチド群 44と、ピオチンで標識ィ匕されたプライマー 45を適切な条件下で反 応させる (図 4(C))。解析中の SNP46の遺伝子型とオリゴヌクレオチド群 44に含まれる オリゴヌクレオチド 44(a)の配列が一致した場合、ライゲーシヨン (図中、 Ligationと記す )により連結され (図 4(D))、更に、ストレプトアビジン (図中、 SAと記す)を固相した磁気 ビーズ 47に結合される (図 4(E))。これをアルカリ変性 (図中、 Alkali denaturationと記 す)し、前記磁気ビーズ 47に結合したままで、連結ヌクレオチド 50について、タグミツ タスプライマー 48と第 1の蛍光物質で蛍光標識された共通プライマーである第 1の標 識ィ匕共通プライマー 49aと第 2蛍光物質で蛍光標識された共通プライマーである第 2 の標識ィ匕共通プライマー 49bの存在下で、ァシンメトリック PCRの可能な条件下で増 幅を行う (図 4(F))。ここでは、第 1の蛍光物質および第 2の蛍光物質は互いに識別可 能であり、これらの使用により、 目的とする SNPの遺伝子型が識別可能になる。その結 果、適切なタグプライマー 48(a)の利用により、当該遺伝子型に応じ第 1または第 2の 蛍光物質の何れかで蛍光標識された PCR産物 51が得られる (図 4(G》。この蛍光標 識された PCR産物 51を、各タグの配列相補的なプローブ 54をプローブ固相域 53に 有するマイクロアレイ 52に反応させると、 Dl=lのプローブ固相域 53のプローブとハイ ブリダィゼーシヨンする (図 4(H))。当該蛍光標識の蛍光強度を測定することにより、特 定の位置に存在する SNP(#1)のアレルが決定される。
[0045] 以上のような本発明の 1態様に従う方法により、ヒトゲノムのような複雑な配列や類 似配列を多く含む試料であっても、目的の産物を増幅効率を揃えながら特異的に増 幅することができると考えられる。
[0046] ここで、本明細書にぉ 、て、「核酸」には、 cDNA、ゲノム DNA、合成 DNA、 mRNA、 全 RNA、 hnRNA、合成 RNAを含む全ての DNA及び RNAを意味するものとする。検出 又は定量すべき前記標的核酸は、任意の配列を有する任意の核酸であり得るが、遺 伝病の原因遺伝子、癌関連遺伝子、又はウィルス由来の核酸など疾病のマーカーと なり得る核酸は、とりわけ好ましい標的核酸である。それ故、前記試料には、血液、尿 、唾液等の体液が含まれるが、体液以外の任意の試料を使用し得る。試料が固体で あれば、酵素処理、界面活性剤又は有機溶媒の添加等の適切な方法で液体に溶解 させればよい。上記の他にも、本方法の実施に当たって標的核酸は、随意に変更す ることができる。例えば細胞を株化して大量培養したり、抹消血を多めに取得したりす ることで本方法に必要なヒトゲノム DNAを大量に調製することにより、直接ゲノム DNA 力 検出反応を始めることができる。また、これに代わって、少量のゲノム DNAを取得 し、アマ一シャムバイオサイエンス社の試薬キット GenomiPhiのような WGA法（Whole Genome Amplification )で、非特異的にゲノム DNAを増幅した試料から検出反応を 始めてもよい。また、 PCR法や、マルチプレックス PCR法、ァシンメトリック PCR法のよう なプライマーを用いて特定の配列を増幅したものから検出反応を始めてもよい。特に 、本発明の方法を SNP特異的配列を検出するために使用する場合、標的核酸は、ゲ ノム DNAなどであることが想定される力 この場合は、予め標的の SNPを含む領域を P CRなどで増幅しておいてもよい。そのほかの酵素的に増幅する方法によりそれぞれ 得られた試料は、 2重鎖試料の場合は、 95°Cまで加熱してカゝら 4°Cに急冷して 1本鎖 化したり、塩濃度のきわめて低い溶液中で 95°Cまで加熱し断片化する、また、超音波 で断片化する、制限酵素で切断する等の 1本鎖化、断片化操作を加えてから検出操 作してちょい。
[0047] また、増幅工程に使用する反応溶液は、一般的な PCR反応溶液を使用することが でき、市販のキットを使用することもできる。たとえば、以下の実施例に示したように、 酵素： Titanium Taq (タカラバイオ)、ノ ッファ： Titanium Taq bufferゝプライマーそれ ぞれ 0.1 μ Μ、铸型 DNA: 10ng、反応体積： 20 μ Lとすることができる。
[0048] 本発明の実施態様の 1例としては、以下の形態が考えられる。特に、本発明の検出 方法の用途、場所には次のものが考えられる。例えばヒト遺伝子型と疾患の関連性 の解明、薬剤感受性の検出、遺伝子制御領域の蛋白結合性の変化の検出、対象生 物をヒトから別の生物に変えての遺伝子多型の分子生物学的な解析などの研究用 途がある。これら研究は、大学、企業等の研究所、研究室で行われるであろう。また、 遺伝子と特定の疾患との関連性、罹患リスクや、薬剤感受性が明らかにされた時点 で、病院の検査センターでの治療方法を選択するための検査や人間ドックでの予防 のための診断、副作用の小さい抗ガン剤の選択のための薬剤感受性検査等、医療 用に使えると考えられる。
[0049] 本発明の方法を実施するための形態としては、ユーザー自らが本方法を実施する ための研究用および診断用遺伝子多型検出試薬キットとしての実施、自動的に処理 する自動反応装置による実施、並びにユーザーゃ被検者に代わっての受託研究ま たは検査センターでの診断等の実施も考えられる。
[0050] 遺伝子解析において、このようなタグへの変換反応は重要である。その変換に使わ れる反応として、リガーゼ連結反応（OLA : Oligonucleotide Ligation Assay)や、ポリメ ラーゼによる 1塩基伸長などがある。それぞれの方法で酵素がミスマッチハイブリッド を識別する能力を最大限生力 ており、リガーゼ反応では連結するプローブの 3 '末 端に SNPの塩基が配置されるようにプローブ配列が設定されている（Luo, J. et al, Im proving the fidelity of Thermus thermophilus DNA ligase, Nucl. Acids Res. 24, 3071 -78 (1996))。
[0051] 例えば、疾病と SNP、または薬剤感受性と SNPの関係を明らかにするためにはでき るだけ多い人数の患者群と、コントロール群それぞれから、できるだけ多くの SNPを検 出することが必要であり、それにより精度高く両者の関係を見つけることができる。
[0052] 従来技術では 2つの共通プライマーを使用しているのに対して、本発明の態様に 従う反応によると、 2種類の増幅用配列のプライマー同量ずつと、識別用配列 (即ち、 タグ)すべての種類を同量含むプライマー混合物をプライマーの組として PCR増幅し ている。し力しながら、タグ毎にプライマーの量を変更してもよい。
[0053] 各タグを各タグに相補的なプライマーでそれぞれに増幅するため、各タグを増幅す るプライマー量が制限される。それにより、増幅効率の高いタグの増幅が異常に促進 されることがなくなる。逆に増幅率が低いタグでも増幅に使われるはずのプライマー が増幅率の高 、タグに奪われることがなくなるので、十分な増幅産物が生成される。 従って、複数のタグの増幅量のばらつきを抑えることができる。
[0054] また本発明に従うと、広く用いられており、たとえば、 DNAコンピューターを用いた S NP解析では DCNを用いて遺伝子解析の多重化を行うが、このときに、前処理にあた るゲノム力も SNP周囲を切り出す PCRも同様に多重化できればコストや作業効率の 面で望ましい。しかし、本発明はそれに限定するものではない。
[0055] また、本発明に従う方法は、効果的に SNPの解析を行うことが可能である。
[0056] 比較参考のために、図 4に記載した本発明の 1態様を従来の方法により行う場合の スキームを図 5に示す。図 5(A)力も (E)までは、図 4に記載の方法と同様な方法である 。これに対して、図 5(F)におけるアンプリファイ反応には相違がある。即ち、図 4の本 発明の方法では、タグの相互配列を有するプライマーを使用していたのに対して、図 5では、共通プライマー 60、第 1の標識化共通プライマー 61aおよび第 2の標識化共 通プライマー 6 lbを使用して 、る。
[0057] 更に、本発明の識別用核酸の増幅方法および Zまたはタグマルチプレックス法は、 図 6に示すジップコード法にも使用することが可能である。当該方法において使用す る検出用核酸を模式的に示す。図 6(A)に示す方法では反応前の検出用核酸 70と検 出用核酸 72とを用いて、目的とする遺伝子の解析を行うものである。反応後には、検 出用核酸 70と検出用核酸 72が互いに連結される (図 6(B))。
[0058] 図 7に示した図は、図 5の方法において使用された 2種類の検出用核酸の反応前（ 図 7(A))と反応後の状態 (図 7(B》を示す図である。同様に MIP法の反応前の状態は図 8(A),反応後の状態は図 8(B)に記載した。また、図 8(B)の検出用核酸とゲノム DNAと のハイブリダィゼーシヨン様式およびタグの増幅過程は図 10(A)から (D)に示してある 。 Golden Gate法についても同様に反応前の状態を図 9(A)、反応後の状態を図 9(B) に己載し 7こ。 [0059] ここで各例について図示したように、バラ-一のジップコード法、陶山らの方法、 Ml P法、イルミナ社の Golden Gate法で用いる検出用核酸の構造は、すべて共通プライ マー領域が 2箇所あり、少なくとも検出する遺伝子、もしくは遺伝子変異と 1対 1に対応 するタグ配列を 1箇所以上で備えている。従って、上述した本発明の方法に従って、 当該タグ配列に相補的なプライマー群を使用し、共通プライマーのうちの 1は使用し なければ、上述したような本発明による効果が得られる。
[0060] ここで、より増幅率を均一にするために、タグの増幅率に応じてタグプライマーの量 を変えてもよい。また、どちらかのプライマー量を多めにしァシンメトリック（非対称) PC Rを実行してもよい。
[0061] 更に、タグ配列プライマーに蛍光色素を修飾してもよいし、共通プライマーに蛍光 色素を修飾してもよい。また、各プライマーに蛍光色素以外の化学修飾、たとえば DI G (ジゴキシゲニン）やピオチン、ハプテンなどを修飾してもよ 、。
[0062] 共通プライマー側を種類分けし、 2種類以上、望ましくは 10種類程度にして、 PCRの ときにミックスにして反応してもよい。こうすることで、識別可能なタグの種類は (タグの 種類数） X (共通プライマーの種類数）となるので、飛躍的にタグの種類数を増やす ことができる。
実施例
[0063] 共通プライマーでタグを増幅する場合と、タグミックスプライマーでタグを増幅する場 合との違いを示し、発明の方法の効果を示す。
[0064] 方法は、タグを使ったマルチプレックス SNP検出法で、検出反応は特願 2004— 2967
84 (特開 2006-101844)の方法に準じて行った。
[0065] 実施例では、ヒューマンサイエンス振興財団のヒューマンサイエンス研究資源バンク 力も匿名化されたヒトゲノムサンプルを用い、検出した SNPは 96種類であった。
[0066] 本発明の方法によるタイピングは次の順番でおこなった。
[0067] 1.配列、サンプルの入手
2.ゲノム DNAの増幅
3.エンコード反応
4.アンプリファイ反応 5.検出。
[0068] 以下、実施内容を説明する。
[0069] 検出対象とする SNPの塩基配列は、東大医科学研究所の整備した日本人の SNPの データベース JSNPから得た合計 96個の SNPである。検出したサンプルは（財）ヒユー マンサイエンス振興財団のヒューマンサイエンス研究資源バンクが頒布しているヒト抹 消血細胞を株化したもの力も抽出したヒトゲノム DNAである。検出したサンプルは PSC
DA0503、 PSCDA0328、 PSCDA0719、 PSCDA0785の 4サンプルであった。
[0070] 以下、ゲノムサンプルを処理した方法について具体的に記す。
[0071] 最初に、ゲノム DNA力 標的の SNPを含む領域をマルチプレックス PCRにて増幅し た。 SNP24箇所の増幅を 1本の反応チューブでおこなうので、 1サンプルに対し都合 4 回増幅反応をおこなった。この操作は次の手順でおこなった。
[0072] この PCR反応に用いる溶液の組成は次のとおりである。反応液には、タカラバイオ 社の製品である Titanium Taqを用いた。超純水はミリポア社の Milli- Q Synthesisによ り作製した。プライマー配列は米国 DNAソフトウェア社の Visual OMPを用いて設計し た。
[0073] Titanium Taq(50倍濃度） 0.4 μ L
Titanium Taq Buffer(10倍濃度） 2 L
プライマー 24種 (100 ^ M) 0.74 L
MgCl (25mM) 2.4 μ L
2
dNTP (lOmM) 1.6 L
ゲノム DNA (5ng / μ \) 2
超純水 13.26
合計 20 μ L。
[0074] 反応のための熱サイクルは次のとおりであった。サーマルサイクラ一には MJリサ一 チ社の PTC-200を用いた。
[0075] 1.プレ加熱 94°C 3分
2.変性 94°C 15秒
3.伸長 73°C 1分 [2, 3を 50サイクル、伸長段階はサイクル毎ごとに 0.1°C温度下げ 5秒延長] 4.保存 10°C 温度固定
以上により標的 SNPを含むゲノムの PCR産物が得られた。
[0076] なお、ここでは 4回に分けた方法を示した力 これを 1回で行うことも可能である。 1回 で行う場合は、 94種のプライマーを 1本のチューブで増幅反応できる。ここで使用した 94種のプライマーは、配列番号 1から配列番号 94に記載した配列を有するプライマ 一を使用した。
[0077] 次にエンコード反応をおこなった。リガーゼに New England Biolab社の Taqリガーゼ を用いたので、付属の 10 Xバッファを使用した。
[0078] プローブミックス（96SNP検出用混合物、各 0.1 μ Μ含有） 0.2 μ L
10 X Taq DNAリガーゼ反応バッファ 3 L
Taq DNAリガーゼ（40U / μ \) 0.5 L
PCR産物（4液混合） L
超純水 22.3 /z L
合計 30 μ L。
[0079] これをもとに次の組成のエンコード反応液を作製した。用いた Taqリガーゼは New E ngland Biolab社製である。
[0080] このエンコード反応液を次の温度で反応させた。加熱に用いたのはサーマルサイク ラー、 PTC-200である。
[0081] 1.変性 95°C 1分
2.リガーゼ反応 58°C 60分
3.保存 10°C 温度固定。
[0082] これによりエンコード反応のうち、リガーゼによるプローブ連結反応を終わる。次に、 ストレプトアビジン磁気ビーズに、ピオチン化コモンプローブおよび、連結されたクエリ 一プローブとコモンプローブをとらえる操作をおこなった。溶液組成は次のとおりであ る。
[0083] エンコード産物 30 L
2 X B&Wバッファ 16.5 il l. ストレプトアビジン磁気ビーズ 5 /z L。
[0084] ストレプトアビジンで表面をコートした磁気ビーズは、 Dynal社の M-280磁気ビーズ で、このビーズの説明書に従い、次の組成の溶液を B&Wバッファとして用いた。
[0085] Tris-HCl (pH 7.5) 10 mM
EDTA 1 mM
NaCl 0.2 M。
[0086] ストレプトアビジン磁気ビーズ (以降磁気ビーズと呼ぶ）は、出荷された防腐剤を含 む原液から 5 μ Lをとり、原液を B&Wで置換して再び 5 μ Lにしたものである。このよう にして作製した溶液を磁気ビーズが溶液によく分散するようにして室温下で、 15分間 振盪する。
[0087] 振盪が終了したら、磁気ビーズの洗浄をおこなう。洗浄は次の手順でおこなった。
[0088] 1.磁石にて磁気ビーズを凝集させ、 B&Wバッファをのぞく；
2.室温下で 100 Lの lxB&Wバッファに再分散し、ピペッティングした後、磁石で 磁気ビーズを凝集させ B&Wバッファをのぞく洗浄操作を 2回おこなう；
3.室温下で 0.2Nの NaOH水溶液 100 Lに再分散し 4分間振盪機で振盪する；
4.磁石で磁気ビーズを凝集させ NaOH水溶液をのぞく；
5.室温下で 100 /z Lの 10mM Tris- HC1で、 2の要領で 2回洗浄する。
[0089] この洗浄操作で、非特異的に付着した DNAがのぞかれた磁気ビーズが得られた。
これをエンコード済み磁気ビーズと呼ぶ。
[0090] 次に、アンプリファイ反応でァシンメトリック PCRをおこない、タグの増幅と標識をおこ なった。 SDとはプライマー 1に相当する配列であり、 Cy3_rED、 Cy5_rED 'はプライマ 一 2の位置に入れたアレルに対応した 2種類の配列の相補鎖に相当する配列で、 5， 端に蛍光色素を標識したものである。ポリメラーゼにタカラバイオ社の Ex Taqを用い たため、作製に用いる 10倍濃度バッファと dNTP混合物はキットに付属のものを用い た。なお 10倍濃度バッファにはマグネシウムイオンを 20mM含むタイプを使用した。プ ライマーは超純水で希釈した。
[0091] [共通プライマーの場合]
プライマー SD (10 μ Μ) 0.1 L プライマー Cy3 - rED (10 μ Μ) 0.5 μ L
プライマー Cy5 - rED，（10 Μ) 0.5 L
10 χ Ex Taq / ッファ 5 μ L
Ex Taq 0.5 μ L
dNTP混合物（lOmM) 4 L
超純水 38.4 μ L
合計 50 μ L0
[0092] [タグミックスプライマーの場合]
タグミックスプライマー（25 M) 1 il l,
プライマー Cy3 - ED (10 μ Μ) 0.5 μ L
プライマー Cy5 - ED，（10 Μ) 0.5 L
10 X Ex Taqノッファ 5 μ L
Ex Taq O.o μ L
dNTP混合物（lOmM) 4 μ L
超純水 39.4 μ L
磁気ビーズ 全量
合計 50 μ L。
[0093] 溶液をのぞいたエンコード済み磁気ビーズにこの反応液を混ぜて、ビーズを分散さ せた。反応の熱サイクルは次のとおりである。サーマルサイクラ一には PTC-200を用 いた。もしサイクルエロンゲーシヨン法を用いるならば、サイクル数は 30〜40サイクル が好ましい。
[0094] 1ノ変性 94°C 1分
2.変性 94°C 30秒
3.アニーリング 55°C 6分
4.伸長 72°C 30分 [2〜4を 40サイクル]
5.冷却 10°C 温度固定
以上によりアンプリファイ反応が完了した。ここで得られたものを標識 PCR産物と呼ぶ ことにする。 [0095] 最後に検出反応をおこなった。検出には、キヤビラリアレイ (特開平 11-75812)を用 V、た。キヤビラリアレイは DNAマイクロアレイに似たノヽイブリダィゼーシヨンで核酸を検 出するデバイスであり、溝状の流路に沿ってプローブ力 Sスポットされている。今回使つ たキヤビラリアレイは 1本の溝の中にタグ検出用のプローブが 50点固定してあるもので 、溝の容量は 25 1であった。キヤビラリはシリコンゴムの板に形成されており、プロ一 ブを直線状にスポットしたスライドガラスにシリコンゴムの粘着性を利用して貼り付けて いる。この溝の両端には溝の反対側の面に貫通する穴があけてあり、溝のある面をス ライドガラス側に貼り付けても、それら貫通穴力 試料液を注入および抜き取り出来る ようになつている。プローブ固定用ガラススライドにはタカラバイオ社が発売するハツ ブノレスライドを用い、プローブのスポッティングには日立ソフトウェアエンジニアリング 社の SP-BIOを用いた。事前にシリコンゴムはスライドガラスのスポットに合うように貼り 付けておいた。
[0096] 標識 PCR産物をこのキヤビラリアレイにハイブリダィゼーシヨンさせた。ァシンメトリツ ク PCR溶液中には磁気ビーズが残留して ヽるので、これを吸わな ヽように磁気ビーズ を集めて上清をとつた。
[0097] ノ、イブリダィゼーシヨン溶液には 1レーン当たり、標識 PCR産物を 10 /z L、の残りを次 の最終濃度になるように 2倍ハイブリ反応用液をカ卩えた (0.5xSSC、 0.1%SDS、 15%フォ ルムアミド、 ImM EDTA)、ハイブリダィゼーシヨンの強さ、蛍光強度を規格化するため に 100番のプローブにハイブリする 2.5mMの濃度の標識済みコントロールターゲットォ リゴを 2 μ L混ぜた。この液を 95°Cに 1分間加熱し、その後、この液 24 Lを 37°Cの遮 光したホットプレート上にぉ 、てキヤビラリアレイに注入し、 60分間ハイブリダィゼーシ ヨンさせた。
[0098] ノ、イブリダィゼーシヨン後、 、て、洗いは次の手順で行った。
[0099] 1. 0.1xSSC、 0.2%SDS中でキヤビラリをガラススライドからはずす。
[0100] 2. 0.1xSSC、 0.2%SDS中で室温下で 5分間振盪する。
[0101] 3.超純水で室温下で 1分間振盪する。
[0102] 4.エアスプレーまたは、遠心機にてスライドガラスを乾燥させる。
[0103] 以上の手順でハイブリダィゼーシヨン反応を終了し、続いてマイクロアレイスキャナ によって蛍光検出をおこなった。スキャナとしては Axon社の GenePix 4000Bを使用し 、 Cy3、 Cy5検出波長にて検出した。
[0104] ハイブリダィゼーシヨン時にサンプルとは異なるプローブにハイブリダィズする蛍光 標識済みコントロールターゲットを、 Cy3、 Cy5でそれぞれ標識し、同一量入れて、サ ンプルと同時にハイブリダィズさせた。このシグナル強度を用いて、規格化蛍光強度 平均は、各 SNPsの Cy5、 Cy3の蛍光強度をそれぞれ同一のハイブリコントロールター ゲットの蛍光強度で割って規格ィ匕した和の平均値である。式にて表せば、
avg( SNP_n,sample(Cy5)/HybriCont(Cy5) + SNP_n,sample(Cy3)/HybriCont(Cy3) ) となる。 SNP_n,sample(Cy5)とは SNP番号力 ¾番のあるサンプルの Cy5蛍光強度をあら わし、 HybriCont(Cy5)は、 Cy5標識した定量コントロールターゲットの検出蛍光強度 である。
[0105] 図 11は、各 SNP毎に規格化蛍光強度平均を出し、高い順にプロットしたものである。
タグミックスプライマーで平均蛍光強度が 10倍になり、シグナル強度のばらつきをあら わす％CV値は 160%力も 90%に下がり増幅均一性が向上した。
[表 1] 表 1 各増幅方法と、得られた PCR産物の蛍光強度とばらつき
Figure imgf000022_0001
[0106] ここに示したデータを更に詳しく解析した結果を次に示す。コンピュータにはデルの
Optiplex GX150を使用し、マイクロソフト社のデータベースソフトウェアであるァクセ ス 2002にて散布図を作成した。
[0107] シグナル強度の指標として散布図の X軸、 Y軸の目盛りの最大値を仮に最大蛍光 強度として、 96個の SNPについてリストアップした。また、それら散布図を評価した QV 値（QV値とは特願 2006-249837にある、散布図のクラスタの評価値のことで大きけれ ば大きいほどクラスタ分離がよい。）も調べた。その結果、表 1にあるようにシグナルの 最大値は平均して 2倍以上になった。図 12の SNP65番で典型的な散布図の改善例 を示す。増幅方法を変えることにより著しくシグナル強度が強くなり、クラスタが正確に 分離した。
[0108] また増幅方法の変更により、多くの SNPのシグナル最大値が向上した。 96個の SNP のうち X軸のシグナルが向上した SNPは 75個、 Y軸のシグナルが向上したのは 72個あ つた。し力し、両軸おのおのシグナルが低下している SNPが 20個程度あった。これは、 図 13の SNP75番のように共通プライマーでは異常に強!、増幅を受けて 、たが、タグミ ックス PCRにすることで増幅に使えるプライマー量が制限され適正な増幅量にとどまり 、増幅量の均質ィ匕作用を示していると言える。シグナルが下がったことで散布図の質 が下がったと言える SNPは 1個だけであった。
[0109] 散布図の質は増幅方式の改善で若干良くなつて!/、る。散布図の分離具合を表す Q V値が 10以上の十分な分離ができて!/、る SNPの数は、共通プライマー PCRで 33個で あつたのに対し、タグミックス PCRでは 35個に増えている。
[表 2] 表 2
Figure imgf000023_0001
[0110] 以上をまとめると、タグミックスプライマーにすることにより PCR増幅に使われるプライ マーがどのタグにもほぼ均一に供給され、増幅均一性が増す力 であると考えられる
[0111] 検出強度のばらつきが、なおあるのは本発明のタグミックス PCRまでに、各 SNPを含 むゲノムを増幅する PCR、そしてリガーゼによる検出反応、磁気ビーズへの回収をお こなっており、これら段階でタグ毎 (SNP毎）に反応効率に差があることにより、 PCRま でにもともと増幅対象の量がばらついていた力もだと考えられる。
[0112] 以上説明した実施例は、本発明の効果を明示するために記載した 1例であり、本発 明がこれに限定されるものではないと理解されるべきである。なお、本明細書中に記 載した文献は、引用することにより本明細書に組み込まれる。
[0113] 以上説明したように、本発明の 1側面によると、複数種類の識別用核酸を増幅する ための方法が提供される。
[0114] また、本発明の更なる側面によると、タグを利用するマルチプレックス検出において 、タグ間の増幅率にばらつきの少な 、方法が提供される。
[0115] [符号の説明]
1 検出用核酸、 2 検出用核酸、 3 共通プライマー配列、 4 識別用核 酸タグ、 5 被検遺伝子相補配列、 6 共通プライマー配列、 7 被検遺伝子 相補配列、 8 SNPに相補的な塩基、 21 核酸フラグメント、 22 第 1の共通 プライマー結合部位、 23 識別用核酸配列、 24 第 1の遺伝子相補配列、 2 5 第 2の遺伝子相補配列、 26 第 2の共通プライマー結合部位、 27 第 1の 共通プライマー、 28 第 2の共通プライマー、 31 核酸フラグメント、 32 識 別用核酸配列、 33 第 1の遺伝子相補配列、 34 第 2の遺伝子相補配列、 3 5 増幅用核酸配列、 36 共通プライマー、 37 全識別用核酸プライマー混 合物、 42 複数のプライマー、 43 PCR産物、 44 オリゴヌクレオチド群、 45 標識化されたプライマー、 46 SNP、 47 磁気ビーズ、 48 タグミック スプライマー、 49a 第 1の標識ィ匕共通プライマー、 49b 第 2の標識化共通プ ライマー、 50 連結ヌクレオチド、 51 蛍光標識された PCR産物、 52 マイ クロアレイ、 53 プローブ固相域、 54 固相化プローブ、 55 蛍光標識され た PCR産物、 60 共通プライマー、 61a 第 1の標識ィ匕共通プライマー、 61b 第 2の標識ィ匕共通プライマー、 70、 72 検出用核酸、 73 第 1の共通プライ マー配列、 74 識別用核酸タグ、 75 被検遺伝子相補配列、 77 第 2の被 検遺伝子相補配列、 78 第 2の共通プライマー、 100 切断配列、 101 ゲ ノム DNA

Claims

請求の範囲
[1] 複数の核酸フラグメントを増幅する方法であって、前記核酸フラグメントは、第 1から 第 nまでの識別用核酸配列力 なる第 1の群より選択された 1の識別用核酸配列と、 第 1から第 mまでの増幅用核酸配列からなる第 2の群より選択された 1の増幅用核酸 配列とを含み、このような核酸フラグメントを複数種類含む核酸フラグメント混合物を、 核酸増幅が可能な条件下において、前記核酸フラグメント混合物に存在する可能性 のある全ての識別用核酸配列の少なくとも一部分の配列および増幅用核酸配列の 少なくとも一部分の配列に相補的または同一鎖側の配列をプライマーとして使用す ることによって増幅することを具備する方法；
ここで、 nは 2以上の整数であり、第 1群に含まれる第 1から第 nまでの識別用核 酸配列は互いに塩基配列が異なり、 mは 1以上の n以下の整数であり、第 2の群に含 まれる第 1から第 mまでの増幅用核酸配列は互いに塩基配列が異なる。
[2] 前記増幅が PCR増幅である請求項 1に記載の方法。
[3] 前記識別用核酸配列がタグ核酸であり、前記増幅する反応が、マルチプレックス検 出のために前記タグを増幅するため方法である請求項 1または 2の何れか 1項に記載 の方法。
[4] 請求項 3に記載の方法であって、更に以下を含む方法；
解析対象となる核酸を含むサンプルを入手すること；
前記解析対象となる核酸を増幅すること；
増幅で得られた増幅産物についてタグ配列への変換反応をすることにより、第 1 力 第 nまでの識別用核酸配列からなる第 1の群より選択された 1の識別用核酸配列 と、第 1から第 mまでの増幅用核酸配列力 なる第 2の群より選択された 1の増幅用核 酸配列とを含む核酸フラグメントを複数種類含む核酸フラグメント混合物を得ること； 第 1から第 nまでの識別用核酸配列プライマーと、第 1から第 mまでの増幅用核酸 配列プライマーとを用いて前記核酸フラグメント混合物を増幅すること。
[5] 前記第 1の識別用核酸配列の長さが、第 1の識別用プライマーの長さと同一であり 、同様に第 nまでの識別用核酸配列の長さも、第 nまでのプライマーの長さと同一で あり、更に前記第 1の増幅用核酸配列の長さが、第 1のプライマーの長さと同一であり 、同様に第 mまでの増幅用核酸配列の長さも、第 mまでのプライマーの長さと同一で ある請求項 1から 4の何れ力 1項に記載の方法。
[6] 前記第 1の識別用核酸配列の長さが、第 1のプライマーの長さよりも 1塩基から 10 塩基長ぐ同様に第 nまでの識別用核酸配列の長さも、第 nまでのプライマーの長さよ りも 1塩基から 10塩基長ぐ更に、前記第 1の増幅用核酸配列の長さが、第 1のプライ マーの長さよりも 1塩基力も 10塩基長ぐ同様に第 mまでの増幅用核酸配列の長さも 、第 mまでのプライマーの長さよりも 1塩基から 10塩基長い請求項 1から 4の何れか 1 項に記載の方法。
[7] 第 1から第 nまで、第 1から第 mまでの複数のプライマーは、それぞれ相補的な識別 用核酸配列または増幅用核酸配列に応じて異なる量で含まれる請求項 1から 6の何 れか 1項に記載の方法。
[8] 請求項 1から 7の何れか 1項に記載の方法であって、当該方法において使用される プライマーが、 3'末端以外の位置で標識物質により修飾されている方法。
[9] 請求項 1から 8の何れか 1項に記載の方法に使用するための試薬キットであり、第 1 から第 nまでの複数のプライマーと、共通プライマーと、核酸増幅用酵素、バッファ成 分および dNTP混合物を含む試薬キット。
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