WO2020145351A1 - 薬物動態関連遺伝子の網羅的配列解析法とそれに使用されるプライマーセット - Google Patents

薬物動態関連遺伝子の網羅的配列解析法とそれに使用されるプライマーセット Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to gene analysis, and more particularly to research, diagnosis, medical treatment, etc. using gene analysis.
  • pharmacokinetic-related genes often exist as a family having multiple members as constituent factors, and since they have very similar sequences to each other, PCR may amplify each constituent factor together, and In the sequence analysis, it was sometimes impossible to distinguish whether the sequence difference was due to the actual sequence difference or due to the misreading (false positive) in the sequence analysis. As described above, since many of the pharmacokinetics-related genes exist in a complicated genomic region, it is difficult to perform highly accurate and comprehensive genotyping by the method using the conventional PCR or the next-generation sequencer.
  • an object of the present invention is to provide a method for efficiently and accurately comprehensively analyzing the sequence of a pharmacokinetics-related gene.
  • each primer set designed for amplify a region of 260 to 490 bp was selected.
  • a method for comprehensively analyzing the sequences of multiple types of pharmacokinetic-related genes derived from a subject comprising: A primer set designed for each pharmacokinetics-related gene is used to amplify the sequences of the plurality of pharmacokinetics-related genes from each other, and a plurality of amplification reactions for each of the plurality of pharmacokinetics-related genes are used. Including a first step performed separately in the system, and a second step of sequence analysis of the gene amplification product obtained in the first step, The method, wherein each of the primer sets is designed to amplify a region of 260 to 490 bp.
  • the sequence of a pharmacokinetics-related gene can be efficiently and comprehensively analyzed at low cost and with high accuracy.
  • the analysis method of the present invention by analyzing a DNA sample derived from a patient in which serious side effects such as liver damage and interstitial pneumonia due to a cancer molecule-targeted drug have occurred, it is medically useful. Functional polymorphisms that serve as genomic biomarkers can be identified.
  • the present invention it is possible to analyze rare variants that cannot be detected by GWAS.
  • side effects can be predicted before administration of the drug, which is useful in determining the treatment policy.
  • many target samples can be analyzed with high throughput.
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the concept of primer design in the method of the present invention and the concept of dividing reaction vessels in multi-reaction system PCR by taking CYP1A1 (A) and CYP1A2 (B) as examples.
  • the method of the present invention is a method for comprehensively analyzing the sequences of multiple types of pharmacokinetics-related genes derived from a subject, Using a primer set designed for each pharmacokinetic-related gene to distinguish and amplify the sequences of the plurality of pharmacokinetic-related genes, the amplification reaction for each of the plurality of kinds of pharmacokinetic-related genes is performed in a plurality of reaction systems. It includes a first step that is performed separately, and a second step that analyzes the sequence of the gene amplification product obtained in the first step.
  • the pharmacokinetic-related gene includes a gene encoding a drug-metabolizing enzyme or a drug transporter, but may be a gene not classified into these as long as the mutation may be involved in the side effect of the drug.
  • NUDT1, NUDT15, VKORC1 and the like shown in Table 1 are also included in the pharmacokinetics-related genes.
  • the pharmacokinetics-related gene is preferably a gene expressed in the liver.
  • the pharmacokinetics-related genes include those listed in Table 1. It is preferable to analyze 25 or more types of pharmacokinetics-related genes, preferably 50 or more types, and more preferably all 100 types.
  • the pharmacokinetics-related genes there are CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP4F2, CYP2B6, DPYD, TPMT, SLCO1B1, UGT1A1, CYP3A5, etc. whose mutations are known to be involved in side effects of drugs, and at least these are analyzed.
  • CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP4F2, CYP2B6, DPYD, TPMT, SLCO1B1, UGT1A1, CYP3A5, etc. whose mutations are known to be involved in side effects of drugs, and at least these are analyzed.
  • a primer set designed for each pharmacokinetics-related gene is used, and an amplification reaction for each of the plurality of types of pharmacokinetics-related genes is performed separately in a plurality of reaction systems.
  • the primer set is designed for each pharmacokinetics-related gene in order to distinguish and amplify the sequences of a plurality of types of pharmacokinetics-related genes. For example, when analyzing 10 types of genes A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, each of these 10 types of genes A to J is specifically amplified. Prepare 10 sets of primer sets for The primer set for each gene can be set in a region having little homology with other genes based on a known gene sequence.
  • cytochrome P450 many pharmacokinetic-related genes such as cytochrome P450 are pseudogenes and highly similar sequences. Therefore, the sequence of each gene cannot be distinguished with a read length of about 2 ⁇ 100 bp of a general-purpose next-generation sequencer (NGS), so the primer sets are designed to amplify a region of 260 to 490 bp, respectively.
  • NGS next-generation sequencer
  • a plurality of regions may be amplified for one pharmacokinetics-related gene for sequence analysis. As a result, more mutations can be detected, and the genes can be distinguished more accurately.
  • the region to be amplified is preferably a coding region (exon), and when a plurality of regions are amplified, it is preferable to amplify each exon. Note that multiple regions may be amplified for one exon.
  • FIG. 2 shows an example of designing a primer set, using CYP1A1 and CYP1A2 as examples.
  • CYP1A1 and CYP1A2 are genes belonging to the same family (CYP1A family), and their sequences are similar to each other. These sequences were compared and sequenced at 3 locations in exon 1, 1 location in exon 2, 1 location in exon 3, 1 location in exon 4, 1 location in exon 5 and 2 locations in exon 6, a total of 9 locations, both Amplifies different regions.
  • CYP1A1 primer F1 forward primer 1
  • R1 reverse primer 1
  • CYP1A2 primers F1 and R1 are designed to amplify similar regions (about 300 bp) of CYP1A1 and CYP1A2, respectively, but the former is CYP1A1. Only the latter is designed to hybridize only to CYP1A2.
  • Table 2 shows an example of the primer set for each gene. These primer sets can be appropriately selected and used according to the type of gene to be analyzed. For example, in the case of analyzing 25 kinds of genes out of 100 genes shown in Table 1, the primer set shown in Table 2 may be used for the selected 25 kinds of genes.
  • the amplification reaction for carrying out the amplification reaction is performed separately in a plurality of reaction systems.
  • the plural reaction systems are preferably 4 or more and 15 or less, more preferably 6 or more and 10 or less, particularly preferably 8.
  • a total of 800 reactions are performed, but these are divided into a plurality of reaction systems.
  • 100 reactions using 100 primer sets can be carried out per reaction system, and a total of 8 reaction systems can be carried out.
  • 50 to 200 amplification reactions using 50 to 200 primer sets can be simultaneously performed.
  • the number of reactions in each reaction system does not necessarily have to be the same.
  • the reaction can be performed according to the usual PCR conditions. For example, 20 to 30 cycles of heat denaturation, annealing, and amplification are performed. The temperature of each of these steps can be appropriately set depending on the Tm value of the primer and the enzyme used.
  • ⁇ Second step> sequence analysis is performed on the amplification product of each pharmacokinetics-related gene obtained in the first step.
  • the sequence analysis method which may be amplified using a primer containing a sequence for sequence analysis is not particularly limited, but a next-generation sequencer or the like may be used. It is preferable to use. Existence of mutations can be examined by comprehensively analyzing using a next-generation sequencer and comparing each gene with the wild-type sequence.
  • administration of the drug can be regulated according to the type of the mutation. For example, when a person has a high-risk mutation for a side effect to a particular drug, the drug can be discontinued or the dose can be reduced.
  • FIG. Table designed translated (code) primer (1,102 sets) for 1 st PCR that can specifically amplify the region in pharmacokinetics related 100 gene described in 1 (Table 2). Divide the primer set into 8 groups and perform multiplex PCR in each group. To the resulting PCR products, sequencing performed 2 nd PCR to add an adapter sequence and index array for multiple specimens identification required for analysis of Illumina MiSeq, the library obtained in MiSeq of Illumina Yes (2 ⁇ 250 bp). The specific procedure is as follows.
  • PCR 1 st PCR is by a thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700, Thermo Fisher Scientific), 5 ng / ⁇ L template DNA 2 ⁇ L, 2 ⁇ Platinum Multiplex PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 5 ⁇ L, GC enhancer 1 [mu] L, 0.1 nM
  • thermal cycler GeneAmp PCR System 9700, Thermo Fisher Scientific
  • 5 ng / ⁇ L template DNA 2 ⁇ L 2 ⁇ Platinum Multiplex PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 5 ⁇ L
  • GC enhancer 1 [mu] L 0.1 nM
  • 2 nd PCR is by a thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700, Thermo Fisher Scientific), 5 ⁇ KAPA HiFi Fidelity Buffer (Kapa Biosystems) 2 ⁇ L, 10 mM dNTP 0.3 ⁇ L, 0.2 U KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems), Primer solution (5 ⁇ M equimolar mix of index 1 and index 2) 0.05 ⁇ L, 1 st PCR product 2 ⁇ L, total reaction solution 5 ⁇ L, initial thermal denaturation at 98°C for 45 seconds, cycling thermal denaturation at 99°C, Annealing was carried out for 15 seconds at 65° C. for 30 seconds, extension reaction at 72° C. for 30 seconds for 4 cycles, and final extension was performed at 72° C. for 1 minute.
  • a thermal cycler GeneAmp PCR System 9700, Thermo Fisher Scientific
  • 5 ⁇ KAPA HiFi Fidelity Buffer Kapa Biosystems
  • qPCR Real-time PCR system (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System, Thermo Fisher Scientific) by, 2 ⁇ KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (Kapa Biosystems) 5 ⁇ L, 2 nd PCR product after purification product 2 [mu] L, the reaction solution
  • initial heat denaturation was carried out at 95° C. for 5 minutes
  • cycling was carried out under conditions of heat denaturation at 95° C. for 30 seconds
  • annealing and extension reaction at 60° C. for 45 seconds for 40 cycles.

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Abstract

被験者由来の複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を網羅的に解析する方法であって、 前記複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を相互に区別して増幅するために薬物動態関連遺伝子ごとに設計されたプライマーセットを用い、前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについての増幅反応を複数の反応系に分けて行う第一工程、および 第一工程で得られた遺伝子増幅産物を配列解析する第二工程を含み、 前記プライマーセットはそれぞれ260～490bpの領域を増幅するように設計されていることを特徴とする方法。

Description

薬物動態関連遺伝子の網羅的配列解析法とそれに使用されるプライマーセット
本発明は遺伝子解析に関し、より詳細には遺伝子解析を利用した研究、診断、医療等に関する。
消化管からの吸収、肝臓での薬物代謝、胆汁・尿への排泄などの薬物体内動態における個人差により、薬の血中濃度に個人間変動が生じる結果、薬の効果や副作用の発現リスクに個人差が見られることが知られている。このような薬物動態の個人差は薬物代謝及び薬物の生体膜輸送に関連する遺伝子群の塩基配列の違いによることが多く、このような遺伝子配列の個人差を調べることは、薬の効果や副作用を予測するためのゲノムバイオマーカーの同定につながる。
しかしながら、薬物動態関連遺伝子は複数のメンバーを構成因子とするファミリーとして存在することが多く、互いに非常に類似した配列を有するため、PCRでは各構成因子を一緒に増幅してしまうことがあり、また、配列解析では、配列の違いが実際の配列の違いによるものか、配列解析における誤読（疑陽性）によるものかが区別できないこともあった。
このように、薬物動態関連遺伝子の多くは複雑なゲノム領域に存在するため、従来のPCRや次世代シークエンサーを用いる方法では高精度かつ網羅的な遺伝子型判定は困難であった。
Gordon et al., Hum Mol Genet, 2014, Apr. 15, Vol. 23（8）:1957-63 Twist et al., NPJ Genom Med, 2016, Jan. 13, 1:15007
上記のように薬物動態関連遺伝子を網羅的に配列解析する方法としては、次世代シークエンサーを用いた全ゲノムシークエンシング（WGS）や全エクソームシークエンシング（WES）などがある。しかしながら、WGSやWESは時間とコストがかかるうえ、薬物動態関連遺伝子が複雑なゲノム領域に存在し、高い配列相同性を有することから、薬物動態関連遺伝子の変異を精度よく解析することは困難であった。そこで、本発明は薬物動態関連遺伝子の配列を効率よく、かつ精度よく網羅的に解析するための方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、薬物動態関連遺伝子の配列を相互に区別して増幅するために薬物動態関連遺伝子ごとに設計されたプライマーセットであって、それぞれ260～490bpの領域を増幅するように設計されたプライマーセットを用い、複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについての増幅反応を複数の反応系に分けて行う第一工程、および第一工程で得られた遺伝子増幅産物を配列解析する第二工程、を行うことにより、被験者由来の複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を効率よく、かつ高精度で網羅的に解析することができることを見出した。
より具体的には、薬物代謝に関与することが報告されている60種類の薬物代謝酵素、37種類の薬物トランスポーターを含む薬物動態関連100遺伝子をリストアップした。それらの遺伝子の翻訳領域をターゲットとし、特定のゲノム領域のみを増幅可能なマルチプレックスPCR法でターゲット領域を濃縮することにより、100遺伝子の機能に影響する遺伝子多型及び極めて稀な変異 (レアバリアント) を網羅的かつ高精度に検出することができるターゲット・リシークエンス解析パネルを開発することに成功した。以上に基づき、本発明を完成させた。
本発明の要旨は以下のとおりである。
[１]被験者由来の複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を網羅的に解析する方法であって、
前記複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を相互に区別して増幅するために薬物動態関連遺伝子ごとに設計されたプライマーセットを用い、前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについての増幅反応を複数の反応系に分けて行う第一工程、および
第一工程で得られた遺伝子増幅産物を配列解析する第二工程を含み、
前記プライマーセットはそれぞれ260～490bpの領域を増幅するように設計されていることを特徴とする方法。
[２]前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについて、複数の領域の増幅反応を行う、[１]に記載の方法。
[３]解析対象の前記複数種類の薬物動態関連遺伝子は、表１の100種類から選択される25種類以上の遺伝子である、[１]または[２]に記載の方法。
[４]解析対象の前記複数種類の薬物動態関連遺伝子は、表１の100種類から選択される50種類以上の遺伝子である、[１]または[２]に記載の方法。
[５]解析対象の前記複数種類の薬物動態関連遺伝子は、表１の100種類全ての遺伝子である、[１]または[２]に記載の方法。
[６]前記複数の反応系は、６～１０の反応系である、[１]～[５]のいずれかに記載の方法。
[７]表１に記載されたプライマーセットを使用する、[１]～[６]のいずれかに記載の方法。
[８]被験者由来の複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を網羅的に解析する方法に使用される試薬であって、表２に記載のプライマーセットから選択される複数のプライマーセットを含む試薬。
本発明によれば、薬物動態関連遺伝子の配列を効率よく、低コストかつ精度よく網羅的に解析することができる。例えば、本発明の解析手法を用いて、がん分子標的薬などによる肝障害や間質性肺炎などの重篤な副作用が起こった患者由来のDNAサンプルを解析することにより、医学的に有用なゲノムバイオマーカーとなる機能的多型を同定することができる。
さらに、本発明によれば、GWASでは検出できない稀な変異 (rare variant) を解析可能である。また、重篤な副作用に関する変異の有無を調べることにより、薬剤の投与前に副作用予測ができ、治療方針の決定に有用である。また、本発明によれば、多くの対象のサンプルを高スループットで解析できる。
本発明の方法の一態様を示す解析フロー図。 本発明の方法におけるプライマー設計と、多反応系PCRにおける反応容器分けの概念をCYP1A1（A）、CYP1A2（B）を例に挙げて説明するための模式図。 本発明の方法とWESとの変異検出精度を比較した図。
本発明の方法は、被験者由来の複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を網羅的に解析する方法であって、
前記複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を区別して増幅するために薬物動態関連遺伝子ごとに設計されたプライマーセットを用い、前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについての増幅反応を複数の反応系に分けて行う第一工程、および
第一工程で得られた遺伝子増幅産物を配列解析する第二工程を含む。
＜薬物動態関連遺伝子＞
薬物動態関連遺伝子としては、薬物代謝酵素または薬物トランスポーターをコードする遺伝子が含まれるが、その変異が薬物の副作用に関与する可能性が有る限りにおいて、これらに分類されない遺伝子でもよい。例えば、表１に記載のNUDT1、NUDT15、VKORC1なども薬物動態関連遺伝子に含まれる。薬物動態関連遺伝子は肝臓で発現する遺伝子であることが好ましい。
薬物動態関連遺伝子としてより具体的には、表１に記載されたものが挙げられる。
薬物動態関連遺伝子は２５種類以上解析することが好ましく、５０種類以上解析することが好ましく、１００種類全て解析することがさらに好ましい。
薬物動態関連遺伝子の中では、その変異が薬剤の副作用に関与することが知られているCYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP4F2、CYP2B6、DPYD、TPMT、SLCO1B1、UGT1A1、CYP3A5などがあり、少なくともこれらを解析することが好ましい。
以下、各工程について説明する。
＜第一工程＞
第一工程では薬物動態関連遺伝子ごとに設計されたプライマーセットを用い、前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについての増幅反応を複数の反応系に分けて行う。
＜プライマーセット＞
プライマーセットは複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を区別して増幅するために薬物動態関連遺伝子ごとに設計される。
例えば、A,B,C,D,E,F,G,H,I,Jの１０種類の遺伝子を解析する場合、これらA～Jの１０種類の遺伝子に対し、それぞれを特異的に増幅するためのプライマーセット１０組を用意する。各遺伝子に対するプライマーセットは、公知の遺伝子配列に基づき、他の遺伝子とは相同性の少ない領域に設定することができる。
特に、同じファミリーに属する遺伝子同士を区別して増幅するためには、両遺伝子の配列を比較し、配列が異なる２ヵ所にプライマーを設計することが好ましい。
また、チトクロームP450等の薬物動態関連遺伝子は偽遺伝子や類似性の高い配列が多い。そのため汎用されている次世代シークエンサー (NGS) の２ｘ１００bp程度のリード長では各遺伝子の配列を区別することができなくなるため、前記プライマーセットはそれぞれ260～490bpの領域を増幅するように設計される。この範囲の長さの領域を増幅し、解析することで、増幅効率を低下させることなく配列を増幅でき、さらに、相同性の高い配列同士を正確に区別して精度の高い配列解析ができる。
なお、１つの薬物動態関連遺伝子につき、複数の領域を増幅して配列解析してもよい。これにより、より多くの変異を検出でき、遺伝子同士の区別もより正確に行うことができる。
増幅する領域はコード領域（エクソン）であることが好ましく、複数の領域を増幅する場合、各エクソンについてそれぞれ増幅することが好ましい。なお、1つのエクソンについて複数領域を増幅してもよい。
図２に、CYP1A1とCYP1A2を例として、プライマーセットの設計の例を示す。
CYP1A1とCYP1A2は同じファミリー（CYP1Aファミリー）に属する遺伝子であり、配列が互いに類似している。
これらの配列を比較し、エクソン１に３ヵ所、エクソン２に１ヵ所、エクソン３に１ヵ所、エクソン４に１ヵ所、エクソン５に１ヵ所、エクソン６に２ヵ所、合計９カ所、両者で配列が異なる領域を増幅する。
CYP1A1のプライマーF1（forward primer 1）、R1（reverse primer 1）、およびCYP1A2のプライマーF1、R1はそれぞれCYP1A1、CYP1A2の類似領域（約300bp）を増幅するように設計されているが、前者はCYP1A1のみ、後者はCYP1A2のみにハイブリダイズするように設計されている。
各遺伝子に対するプライマーセットの例を表２に示す。解析対象遺伝子の種類に応じ、これらプライマーセットから適宜選択して使用することができる。例えば、表１の100遺伝子のうち、25種類の遺伝子を解析する場合、選択された25種類の遺伝子につき、表２に記載のプライマーセットを使用すればよい。
＜増幅反応＞
前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについて、増幅反応を行う
増幅反応は複数の反応系に分けて行う。ここで複数の反応系とは、好ましくは、４以上、１５以下、より好ましくは６以上、１０以下、特に好ましくは８である。
例えば、１００種類の遺伝子につき、それぞれ８ヵ所ずつ増幅する場合、合計８００の反応を行うことになるが、これらを複数の反応系に分ける。例えば、１反応系当たり、１００プライマーセットを用いた１００の反応を行い、合計８つの反応系で反応を行うことができる。一反応系において、例えば、５０～２００のプライマーセットを用いた５０～２００の増幅反応を同時に行うことができる。
なお、各反応系の反応数は必ずしも同じである必要はない。
このように複数の反応系を分ける場合、特に同一ファミリーに存在する遺伝子同士を区別して増幅する場合、これら遺伝子同士の対応領域を増幅するための反応は別々の反応系で行うようにすることが好ましい。
例えば、図２に示すように、CYP1A1とCYP1A2が解析対象に含まれる場合は、これらを確実に分けて増幅するために、CYP1A1とCYP1A2で類似する領域を増幅するプライマーセット同士、ここではCYP1A1のF1-R1とCYP1A2のF1-R1は別々の反応系に加え、増幅反応を別々に行う。これにより、類似遺伝子同士を分けて増幅することができるので、配列解析における疑陽性を確実に避けることができる。
反応は通常のPCRの条件に準じて行うことができる。
例えば、熱変性、アニーリング、増幅のサイクルを２０～３０サイクル行う。これらの各ステップの温度はプライマーのTm値や使用する酵素などに応じて適宜設定できる。
＜第二工程＞
第二工程では、第一工程で得られた各薬物動態関連遺伝子の増幅産物について配列解析を行う。
なお、配列解析の前に、配列解析用の配列を付加するために、配列解析用の配列を含むプライマーを用いて増幅してもよい
配列解析の方法は特に制限されないが、次世代シークエンサーなどを用いることが好ましい。
次世代シークエンサーなどを用いて網羅的に解析し、各遺伝子を野生型配列と比較することで変異の有無などを調べることができる。
本発明の配列解析法により、薬物動態関連遺伝子に変異が見られた場合、その変異のタイプに応じ、薬物の投与を調節することができる。例えば、特定の薬剤に対する副作用に対して高リスク型変異を有する場合、その薬剤の投与を中止したり、投与量を減らしたりすることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施態様には限定されない。
本発明の方法を用いたターゲット・リシークエンシングのワークフローを図１に示す。
表１に記載の薬物動態関連100遺伝子における翻訳（コード）領域を特異的に増幅することができる1st PCR用のプライマー (1,102セット) を設計した（表２）。プライマーセットを8つのグループに分け、それぞれのグループでマルチプレックスPCRを実施する。得られたPCR産物に、イルミナ社MiSeqの解析に必要なアダプター配列や多検体識別用のインデックス配列を付加するために2ndPCRを実施し、得られたライブラリーをイルミナ社のMiSeqでシークエンシングする (2 × 250 bp)。
具体的手順は以下の通り。
（１）プライマーの設計
薬物動態関連100遺伝子の翻訳領域は合計162,216 bpであった。これらの翻訳領域を特異的に増幅するために、260-490 bpのPCR産物が得られるように、15-30 bpのプライマーを設計した。最終的に、1,102セットのプライマー (表２) を8つのグループに分けた後、1st PCRを実施し、159,347 bpの領域を増幅した。
（２）PCR
1stPCRは、サーマルサイクラー(GeneAmp PCR System 9700、Thermo Fisher Scientific) により、5 ng/μLテンプレートDNA 2 μL、2×Platinum Multiplex PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 5 μL、GCエンハンサー 1 μL、0.1 nMプライマー溶液2 μL、反応溶液総量10 μLについて、初期熱変性を95℃、2分間、サイクリングは、熱変性を95℃、30秒間、アニーリングを60℃、90秒間、伸長反応を72℃、3分間で25サイクルとし、最終伸長を72℃、10分間行った。
2ndPCRは、サーマルサイクラー(GeneAmp PCR System 9700、Thermo Fisher Scientific) により、5×KAPA HiFi Fidelity Buffer (Kapa Biosystems) 2 μL、10 mM dNTP 0.3 μL、0.2 U KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems)、プライマー溶液 (5 μM equimolar mix of index 1 and index 2) 0.05 μL、1st PCR産物 2 μL、反応溶液総量5 μLについて、初期熱変性を98℃、45秒間、サイクリングは、熱変性を99℃、15秒間、アニーリングを65℃、30秒間、伸長反応を72℃、30秒間で4サイクルとし、最終伸長を72℃、1分間行った。
qPCRをリアルタイムPCRシステム (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System、Thermo Fisher Scientific) により、2×KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (Kapa Biosystems) 5 μL、2ndPCR産物の精製後産物 2 μL、反応溶液総量10 μLについて、初期熱変性を95℃、5分間、サイクリングは、熱変性を95℃、30秒間、アニーリング及び伸長反応を60℃、45秒間で40サイクルの条件下で行った。
（３）ライブラリー精製とシークエンスラン2ndPCR産物より、AMPure XP (Beckman Coulter) を用いて目的サイズのDNA断片を回収し、ライブラリーを精製した。各グループのライブラリーを4 nMに希釈した後、等量混合し、Illumina MiSeqシステム及びMiSeq Reagent Kit v2を用いてシークエンシングを行った(2 × 250 bp、500サイクル)。
（４）変異の検出
変異の検出を、シークエンシングによって得られたFastqファイルのヒト参照ゲノム(hg19)へのマッピングにＢＷＡ(Li H et al、Bioinformatics、２００９、２５：１７５４）を用いて、変異の検出及びフィルタリングにGATK（McKenna A et al、Genome Res、２０１０、２０（９）：１２９７－３０３）を用いて、行った。また、コピー数変異(CNV)の検出を、BED Tools（Quinlan AR、２０１４、４７：11、12、１－３４）を用いて、行った。
その結果、図３に示すように、一人のゲノムから１６３の変異を検出した。同じゲノムにWESを用いたところ１６２の変異を検出した。変異検出のゴールドスタンダードであるサンガーシークエンシングの結果と比較したところ、本発明の感度及び特異度は共に１００％を示した。一方WESの感度及び特異度はそれぞれ９１．４％及び９９．９９２％を示した。WESとサンガーシークエンシングの結果の不一致の内訳は偽陽性が１３変異及びリード数の不足による未検出が１４変異であった。
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Claims (8)

  1. 被験者由来の複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を網羅的に解析する方法であって、
    前記複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を相互に区別して増幅するために薬物動態関連遺伝子ごとに設計されたプライマーセットを用い、前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについての増幅反応を複数の反応系に分けて行う第一工程、および
    第一工程で得られた遺伝子増幅産物を配列解析する第二工程を含み、
    前記プライマーセットはそれぞれ260～490bpの領域を増幅するように設計されていることを特徴とする方法。
  2. 前記複数種類の薬物動態関連遺伝子それぞれについて、複数の領域の増幅反応を行う、請求項１に記載の方法。
  3. 解析対象の前記複数種類の薬物動態関連遺伝子は、表１の100種類から選択される25種類以上の遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 解析対象の前記複数種類の薬物動態関連遺伝子は、表１の100種類から選択される50種類以上の遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 解析対象の前記複数種類の薬物動態関連遺伝子は、表１の100種類全ての遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記複数の反応系は、６～１０の反応系である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 表１に記載されたプライマーセットを使用する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 被験者由来の複数種類の薬物動態関連遺伝子の配列を網羅的に解析する方法に使用される試薬であって、表２に記載のプライマーセットから選択される複数のプライマーセットを含む試薬。
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