JP2004000039A

JP2004000039A - 遺伝子多型の検出方法

Info

Publication number: JP2004000039A
Application number: JP2002158237A
Authority: JP
Inventors: Yusuke Nakamura; 中村　祐輔; Akihiro Sekine; 関根　章博; Aritoshi Iida; 飯田　有俊; Osamu Saito; 斎藤　督
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2002-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2004-01-08
Also published as: WO2003102181A1; EP1536003A4; CN1678741A; US20060234230A1; CA2510406A1; AU2003241899A1; EP1536003A1

Abstract

【課題】遺伝子多型の検出方法の提供。
【解決手段】特定の塩基配列のうち第２１番目の塩基を含む少なくとも１３塩基の配列又はこれに相補的な配列を有するものからなる群から選択される少なくとも１つをオリゴヌクレオチドプローブ及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の遺伝子多型を検出する方法。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子多型情報、遺伝子多型情報の検出方法、遺伝子多型を用いた薬物の評価方法、及び薬物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの姿形が千差万別であるように、３０億からなる遺伝暗号も個人間で比較するとかなり多くの部位で異なっている。この遺伝暗号の違いを遺伝子多型（ポリモルフィズム）と呼んでおり、代表的な遺伝子多型として一塩基多型が知られている。
【０００３】
一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）とは、個人間における１遺伝暗号の違いを意味する。ヒトの顔貌や体型が千差万別であるように、遺伝暗号である塩基配列も一人ひとりかなり多くの部位で異なっている。ＳＮＰは、その存在する位置によってｃＳＮＰ（ｃｏｄｉｎｇ　ＳＮＰ）とｇＳＮＰ（ｇｅｎｏｍｅ　ＳＮＰ）に分類され、ｃＳＮＰには、さらにｓＳＮＰ（ｓｉｌｅｎｔ　ＳＮＰ）、ｒＳＮＰ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＳＮＰ）及びｉＳＮＰ（ｉｎｔｒｏｎ　ＳＮＰ）が含まれる。
【０００４】
上記ＳＮＰは、多型マーカーとしての疾患の発症や増悪に関連する遺伝子を見つけるために有用であり、最終的に臨床分野において疾患のリスク診断や薬剤の使い分けなどに直接関係する。また、疾患の原因となっている物質を標的分子とした証拠に基づく薬剤開発は、世界的趨勢となっている。ある疾患に対して薬剤を投与した場合、患者の応答性は様々であり、著効を示すもの、有効性の低いもの、全く効果を示さないもののように、薬剤に対する応答性には大きな違いがある。これは、症状が同じで同じ診断名であっても、その背景となっている疾患を起こしている経路が異なっていたり、あるいは薬剤の代謝速度が大きく異なっている可能性があるからである。従って、ＳＮＰなど遺伝子多型を参考にしながら、目的の疾患に応じた薬物の選択、治療法の開発（いわゆるオーダーメイド医療）が望まれる。
【０００５】
薬剤に対する応答性に加えて、時には致死的となるような強い副作用の問題も、医療従事者が対処していかなければならない大きな問題の一つである。これは、処方ミスなどによる過剰投与がなくても、時には思わぬ致死的な副作用に遭遇することがある。従って、薬剤の応答性に対しては、薬剤の代謝、薬剤の輸送、薬剤のレセプターなどによる薬剤応答性や副作用の強さを、ＳＮＰなどの遺伝子多型を参考にしながら決定することが望まれる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子多型情報の検出方法とその情報に基づく薬物の有効性並びに安全性を評価するための方法、及び薬物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、薬物代謝酵素をコードする遺伝子中の遺伝子多型を見出し、これを用いて薬物と疾患との因果関係を評価することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１〜２１５に示す塩基配列のうち第２１番目の塩基を含む少なくとも１３塩基の配列又はこれに相補的な配列を有するものからなる群から選択される少なくとも１つをオリゴヌクレオチドプローブ及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の遺伝子多型を検出する方法。
遺伝子多型としては、一塩基多型、複数個の塩基の欠失、置換若しくは挿入による多型、又はＶＮＴＲ若しくはマイクロサテライトによる多型が挙げられる。本発明における遺伝子多型情報は、表１に示される。
（２）上記（１）の方法により得られた検出結果から、チトクロームＰ４５０によって代謝される薬物の有効性及び安全性を評価することを特徴とする薬物の評価方法。
（３）上記（２）の評価方法により得られた評価を指標として、使用すべき薬物を選択することを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
【０００９】
（４）チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子及び／又はその相補配列中に含まれる遺伝子多型情報（例えば表１に示す情報）と、被験者から採取したチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子及び／又はその相補配列中に含まれる遺伝子多型情報とを比較して、チトクロームＰ４５０によって代謝される薬物の有効性及び／又は安全性を解析し、得られる解析結果から使用すべき薬物を選択することを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
（５）上記（１）〜（４）の方法において、チトクロームＰ４５０としては、２Ａ６、２Ａ１３、２Ｂ６、２Ｅ、２Ｓ１、５Ａ１、７Ａ１及び７Ｂ１からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
（６）配列番号１〜２１５に示される塩基配列又はこれに相補的な塩基配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【００１０】
（７）チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子及び／又はその相補配列中に存在する遺伝子多型情報から、当該遺伝子及び／又はその相補配列の遺伝子多型部位を含むように作製されたオリゴヌクレオチド。
この場合において、オリゴヌクレオチドは、その５’末端若しくは３’末端又は中央の塩基が、当該遺伝子多型部位となるように作製することができる。
また、遺伝子多型部位を含むオリゴヌクレオチドとしては、チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子又はその相補配列とハイブリダイズし得る断片とハイブリダイズしない断片とが結合したものであって、前記多型部位が、当該ハイブリダイズし得る断片の５’末端又は３’末端に位置するものが挙げられる。
具体的には、配列番号１〜２１５に示すいずれかの塩基配列のうち第２１番目の塩基を含む少なくとも１３塩基の配列又はこれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００１１】
（８）配列番号１〜２１５に示すいずれかの塩基配列中の遺伝子多型部位が含まれるゲノムＤＮＡ領域において、当該遺伝子多型部位から５’及び／又は３’側に向かってそれぞれ１０００ｂｐ以内に設計され、かつ、１３〜６０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチド。
（９）上記（６）〜（８）に示すいずれかのオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
（１０）上記（６）〜（８）に示すいずれかのオリゴヌクレオチド及び／又は上記（９）のマイクロアレイを含む遺伝子多型検出用キット。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、薬物代謝酵素に関する遺伝子多型情報、特にチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子及び／又はその相補配列の遺伝子多型情報を用いて、被検対象の遺伝子多型を検出する方法に関する。また、本発明は、薬物代謝酵素によって代謝される薬物の有効性及び安全性の有無又は強弱を解析することを特徴とし、この解析結果により、疾患と薬物との関係を評価するものである。複数人が同じ疾患に罹患している場合であっても、薬物代謝酵素遺伝子の遺伝子多型情報は個々の患者ごとに異なることが多い。従って、その異なる遺伝子多型情報から薬物代謝との関係を導き、どのような遺伝子多型情報を有する場合に特定の薬物の有効性が認められるのか又は認められないのか、また、どのような遺伝子多型情報を有する場合に副作用が出やすいのか又は出にくいのか、その薬物の有効性及び／又は安全性を評価する。その結果、ある疾患に対してどのような薬物を使用すべきなのか、遺伝子多型情報からそれぞれの患者ごとに適した投薬（オーダーメイド医療）が可能となる。
【００１３】
１．定義
以下、本明細書で使用する用語について説明する。
「薬物代謝酵素」とは、医薬品を含む外来性異物の生体内における構造変換を触媒する酵素群の総称である。また、一部の内在性物質であっても、治療目的で投与される場合にはその代謝に関わる酵素群も薬物代謝酵素に含まれる。
【００１４】
薬物の「有効性」とは、薬物を被験者に投与した場合に、薬物がその被験者に対し有利な効果（有効性）を与える薬物の性質を意味し、薬物の「安全性」とは、薬物を被験者に投与した場合に、薬物がその被験者に対し悪影響又は副作用を与える薬物の性質を指す。
【００１５】
「遺伝子多型情報」は、遺伝子中の多型情報と、その相補配列中の多型情報との双方を含むものである。
「治療」とは、症状又は疾患の少なくとも１つの症候を治癒又は緩和することを意味する。
薬物の「スクリーニング」とは、薬物候補を選択する工程を意味し、無数の被検物質をふるい分けて候補薬物を絞り込む工程をいう。
【００１６】
「遺伝子」とは、非コード機能を有するＲＮＡ（例えばリボソームＲＮＡ若しくはトランスファーＲＮＡ）、ポリペプチド又は前駆体の産生に必要な制御配列、及びコード配列を含むＤＮＡ配列を指す。ＲＮＡ又はポリペプチドは、完全長コード配列によりコードされるものであってもよいし、又は、所望の活性若しくは機能が保持される場合には上記コード配列の一部によりコードされるものであってもよい。
【００１７】
「野生型」とは、天然の供給源から単離された遺伝子又は遺伝子産物を意味し、その遺伝子又は遺伝子産物の機能を本来有するものをいう。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に認められるものであるため、遺伝子の「正常型」又は「野生型」を意味する。一方、「変異型」とは、野生型の遺伝子又は遺伝子産物と比較して配列及び／又は機能特性に変化を示す遺伝子又は遺伝子産物を意味し、「改変型」、「多型性」ということもある。変異型には、▲１▼野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較して改変された特性を有するもの、あるいは▲２▼遺伝子配列は異なるが機能は同じものの両者が含まれる。野生型構造遺伝子とその変異型とは、それらの配列間に、一塩基の置換及び／又は欠失、あるいは１以上のヌクレオチドの挿入が存在しており、このような２つの型の構造遺伝子には配列の相違（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が生じている。
【００１８】
「オリゴヌクレオチド」とは、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５〜３０ヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確な大きさ（サイズ）は、オリゴヌクレオチドの機能又は用途などにより変更することができる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の手法、例えば化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、又はこれらの組み合わせにより生成することができる。
【００１９】
オリゴヌクレオチドは、モノヌクレオチドを、そのペントース環の５’リン酸基を、ホスホジエステル結合を介してその近隣に存在するモノヌクレオチドのペントース環の３’酸素に一方向で結合させることにより作製する。この５’リン酸基がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合には、オリゴヌクレオチドの末端を「５’末端」と呼び、この３’酸素がモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸基に結合していない場合にはそれを「３’末端」と呼ぶ。ポリヌクレオチド配列は、５’及び３’末端を有するものといえる。あるポリヌクレオチド鎖において、第１の領域と第２の領域が存在する場合に、第１の領域の３’末端が、第２の領域の５’末端よりも前に存在する場合には、他の領域の「上流」にあるといえる。
【００２０】
「ポリヌクレオチド配列」とは、▲１▼オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド、▲２▼それらの断片若しくは一部、あるいは▲３▼ゲノム若しくは合成のＤＮＡ若しくはＲＮＡを意味し、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、また、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。なお、天然のポリヌクレオチドにおいて一般的に見出されない塩基が本発明で使用するポリヌクレオチドに含まれていてもよく、そのような塩基としては、例えばイノシン及び７−デアザグアニンが挙げられる。
【００２１】
「ヌクレオチド類似体」とは、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチド、例えば　７−デアザプリン（すなわち７−デアザ−ｄＡＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰ）を指す。ヌクレオチド類似体には塩基類似体が含まれ、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの修飾形態も含まれる。
【００２２】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、天然ポリヌクレオチドに見出されるような塩基又は塩基類似体を含むが、典型的なポリヌクレオチドの糖−リン酸骨格ではなく、ペプチド骨格に結合している核酸分子をいう。塩基のペプチドへの結合によって、オリゴヌクレオチドの場合と同じように、その塩基が、ポリヌクレオチドの相補的な塩基と塩基対合することが可能となる。上記のような小分子はまた、抗遺伝子剤とも呼ばれており、相補的なポリヌクレオチド鎖と結合することにより転写の伸長を停止する（Ｎｉｅｌｓｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．　８：５３　６３　（１９９３））。本発明においては、ポリヌクレオチドの代わりに上記ヌクレオチド類似体及びペプチド核酸を利用することもできる。
【００２３】
「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」とは、遺伝子産物について使用する場合には、同じ意味を有するものとする。なお、組換えＤＮＡ技術により産生されるポリペプチドを特に「組換えタンパク質」という。組換えタンパク質は、組換えＤＮＡ技術において、一般的にポリペプチドをコードするＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、これを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質を発現させることにより得ることができる。
【００２４】
「精製された」とは、ポリヌクレオチド分子又はペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質分子について、天然の環境から取り出され、又は組換えＤＮＡ技術により単離又は分離されたことを意味し、天然の状態では結合している他の成分の含有量が、少なくとも４０％以下、好ましくは２５％以下、最も好ましくは１０％以下であることをいう。従って、例えば「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたオリゴヌクレオチド」とは、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００２５】
「多型」とは、遺伝子又はその一部について１種以上の形態が同時に存在することを指す。遺伝子において少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する部分は、「遺伝子の多型領域」と呼ぶ。多型領域としては、後述するように例えば一塩基多型等の遺伝子多型があり、これは種々のアレルにおいて異なる。多型領域はまた、数ヌクレオチド長のものもある。
【００２６】
「多型性遺伝子」とは、少なくとも１つの多型領域を含む遺伝子を指す。ちなみに、「多型性遺伝子座」とは、集団のメンバー間で相違する、集団に存在する遺伝子座である。例えば、最も一般的なアレルは０．９５未満の頻度で存在する。一方、「単型性遺伝子座」は、集団のメンバー間でほとんど又は全く相違が認められない遺伝子座である。一般的に、最も一般的なアレルは集団の遺伝子プールにおいて頻度が０．９５を超えない遺伝子座と考えられる。
【００２７】
「情報」とは、事実又はデータの集積を指す。コンピュータシステムを用いて格納又は処理される場合の情報とは、任意のフォーマットで格納されるデータを意味する。ここでコンピュータシステムとしては、限定するものではないがインターネットが挙げられる。また、フォーマットとしては、例えばアナログ、デジタル、オプティカルなどが挙げられる。「被験者に関する情報」とは、被験者に関連する事実又はデータを意味する。「ゲノム情報」とは、ゲノムに関連する情報を指し、例えば限定されるものではないが、ヌクレオチド配列、遺伝子、アレル頻度、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型と表現型との相関などが挙げられる。「アレル頻度情報」とは、アレル頻度に関連する事実又はデータを指し、例えば限定されるものではないが、アレル同一性、アレルの存在と被験者の形質との間の統計学的相関、個体又は集団におけるアレルの有無、１つ以上の特定の形質を示す個体にアレルが存在する確率（％）などが挙げられる。
【００２８】
「相補的」又は「相補性」とは、塩基対合則の関係を有するポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列）について用いられる概念である。例えば、「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」配列は「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」配列に対し相補的である。相補性は、「部分的」、すなわちポリヌクレオチド中のある程度の数の塩基のみが塩基対合則により一致しているようなものであってもよいし、全体が完全に相補的であってもよい。このような相補性の程度は、ハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意に影響を及ぼす。これは、増幅反応、及びポリヌクレオチド間の結合による検出方法において特に重要である。他のヌクレオチド類似体（例えば、ＩｓｏＣ／ＩｓｏＧ塩基対）又は天然のヌクレオチドと塩基対を形成するために使用されるヌクレオチド類似体もまた、上記「相補性」及び「相補的」の定義内に含まれ、塩基対合するパートナーに対し相補的であるといえる。
【００２９】
ヌクレオチド配列の相補性とは、１つの配列の５’末端が他の配列の３’末端と対合するようにヌクレオチド配列を並べた場合に、オリゴヌクレオチドの配列が「逆並行の関係」にあることを意味する。相補性が完全である必要はなく、二重らせんはミスマッチ塩基対又は一致していない塩基を含んでいても安定である。当業者であれば、例えばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度、並びにミスマッチ塩基対の存在などを考慮して経験的に二重らせんの安定性を決定することが可能である。
【００３０】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なポリヌクレオチドが対合するときに用いられる概念である。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度（すなわちポリヌクレオチド−ポリヌクレオチドの結合強度）は、ポリヌクレオチド間の相補性、採用する条件のストリンジェンシー、及び形成されるハイブリッドのＴ_ｍなどにより影響を受ける。ハイブリダイゼーション法では、１つのポリヌクレオチドと他の相補的なポリヌクレオチド（相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド）とのアニーリングが行われる。
【００３１】
「Ｔ_ｍ」とは「融解温度」を意味し、ポリヌクレオチドの二本鎖が熱変性して一本鎖になる温度を指す。鋳型ＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してプライミング反応が起こるためには、アニーリングの温度をプライマーのＴ_ｍ以下にする必要がある。ポリヌクレオチドのＴ_ｍを計算するための式のいくつかは、当技術分野で周知である。標準的な参照文献に記載のように、Ｔ_ｍ値の簡便な推定値は、ポリヌクレオチドが１　Ｍ　ＮａＣｌ水溶液中に溶解している場合には、下記式により算出される：
Ｔ_ｍ　＝　８１．５　＋　０．４１（％　Ｇ　＋　Ｃ）
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ，　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（１９８５）参照）。他の参照文献には、構造的及び環境的特性、並びに配列の特性を考慮してより詳細にＴ_ｍを計算する方法も記載されている（例えば、Ａｌｌａｗｉ，　Ｈ．Ｔ．　＆　ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，　Ｊ．，　Ｊｒ．　Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ　ａｎｄ　ＮＭＲ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｎａｌＧ．Ｔ　ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ　ｉｎ　ＤＮＡ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３６，　１０５８１−９４　（１９９７））。
【００３２】
「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーションを実施する際の、温度、イオン強度及び他の化合物の存在の条件について用いられる概念である。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的な塩基を高頻度で有する配列からなるポリヌクレオチド断片の間でのみ塩基対合が起こる。従って、「弱い」又は「低」ストリンジェンシーの条件は、主としてポリヌクレオチドがハイブリダイズまたはアニーリングの対象となる他のポリヌクレオチドと完全には相補的ではない場合に用いられる。
【００３３】
「高ストリンジェンシー条件」としては、約５００塩基長のプローブを用いる場合に、５×ＳＳＰＥ（４３．８　ｇ／ｌ　ＮａＣｌ，　６．９　ｇ／ｌ　ＮａＨ_２ＰＯ_４Ｈ_２Ｏ及び１．８５　ｇ／ｌ　ＥＤＴＡ，　ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％　ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中で４２℃にて洗浄を行うのに相当する条件が挙げられる。ここで、５０×デンハルト試薬５００ｍｌ中には、５　ｇ　Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ　４００，　Ｐｈａｒａｍｃｉａ）、５　ｇ　ＢＳＡ（分画Ｖ；Ｓｉｇｍａ）が含まれる。
【００３４】
「中程度ストリンジェンシー条件」としては、約５００塩基長のプローブを用いる場合に、５×ＳＳＰＥ（４３．８　ｇ／ｌ　ＮａＣｌ，　６．９　ｇ／ｌ　ＮａＨ_２ＰＯ_４　Ｈ_２Ｏ及び１．８５　ｇ／ｌ　ＥＤＴＡ，ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％　ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせた後、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％　ＳＤＳを含む溶液中で４２℃にて洗浄を行うのに相当する条件が挙げられる。
【００３５】
「低ストリンジェンシー条件」としては、約５００塩基長のプローブを用いる場合に、５×ＳＳＰＥ（４３．８　ｇ／ｌ　ＮａＣｌ，　６．９　ｇ／ｌ　ＮａＨ_２ＰＯ_４　Ｈ_２Ｏ及び１．８５　ｇ／ｌ　ＥＤＴＡ，　ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％　ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせた後、５×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳを含む溶液中で４２℃にて洗浄を行うのに相当する条件が挙げられる。
【００３６】
相補性に関し、用途によってはハイブリダイゼーションが完全な又は部分的な相補性によるものであるかどうかを決定することが重要である。例えば、外来ＤＮＡ配列の有無を単に検出することを目的とする場合には、部分的に相補的なプローブであっても完全に相補的なプローブであっても、その検出対象のＤＮＡ配列が存在すると確実にハイブリダイゼーションが起こる条件を選択することが重要である。一方、部分的な相補性と完全な相補性とを区別するハイブリダイゼーション法が必要となることもある。
【００３７】
「プライマー」とは、プライマー伸長が開始する条件下に配置された場合に合成開始点として機能可能なオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドプライマーは、天然に存在し、制限消化により得て精製されたものであってもよいし、合成により生成したものであってもよい。プライマーは、鋳型の特定の配列に対し相補的となるように設計される。プライマーは、プライマー伸長が起こるように鋳型とハイブリダイズし、それにより鋳型−プライマー複合体が形成されてプライマーの伸長産物が合成されるように、鋳型の配列と十分な相補性を有する必要がある。但し、プライマー配列は、一部が相補的であって鋳型と結合することができる限り、必ずしも鋳型に対して全部が相補的でなくてもよい。
【００３８】
「標識」とは、検出（好ましくは定量）するために用いることができる任意の原子又は分子を指し、ポリヌクレオチド又はタンパク質に結合させることができるものである。標識としては、限定されるものではないが、色素；放射性標識（例えば^３２Ｐ）；結合基（例えばビオチン）；ハプテン（例えばジゴキシゲニン）；発光、リン光又は蛍光基；並びに蛍光色素が挙げられ、これらを単独で、又は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により発光スペクトルを抑制若しくはシフトすることができる基と組み合わせて用いる。標識は、蛍光、放射活性、比色定量、重量測定、Ｘ線回折若しくは吸収、磁気、又は酵素活性などにより検出可能なシグナルを生じるものとする。標識は、荷電した基（正又は負電荷）、あるいは中性電荷の基としてもよい。標識は、ポリヌクレオチド又はタンパク質配列が検出可能な標識を含むものであれば、上記のような荷電した配列を含むか又はそのような配列から構成されるものであってもよい。
【００３９】
「シグナル」とは、標識又はアッセイ反応により生じる検出可能な物理化学的信号を意味する。
「検出器」とは、システム又はシステムの構成要素、例えば、シグナルの存在を、ユーザー又はシステムの他の構成要素（例えばコンピュータ又はコントローラ）に伝達する装置又は反応性メディアを指す。上記装置としては、限定されるものではないが、カメラ、蛍光計、電荷結合素子、シンチレーションカウンターなどが挙げられる。また上記反応性メディアとしては、限定されるものではないが、Ｘ線若しくはカメラフィルム、又はｐＨ指示薬などが挙げられる。
【００４０】
検出器としては、紫外線、可視光又は赤外光（例えば蛍光又は化学発光）を検出し得る光分析システム、分光測光システム、放射線検出システム、分光システム（核磁気共鳴分光法、質量分析法又は表面励起ラマン分光法）、ゲル若しくはキャピラリー電気泳動又はゲル排除クロマトグラフィーなどのシステム、あるいは当技術分野で公知の他の検出系、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４１】
「サンプル」とは、例えば生物学的試料、及び合成により得た試料をいう。生物学的サンプルとしては、動物（例えばヒト）、液体、固体（例えば糞便）又は組織、並びに、液状又は固形状の食品、飼料及び原料（例えば、日用品、野菜、肉類、肉製品）、その他廃棄物が挙げられる。生物学的サンプルは、家畜動物、野生又は野性動物、例えば限定されるものではないが、有蹄動物、クマ、魚類、齧歯類などの動物からも採取することができる。
【００４２】
検出の標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含有するか又は含有すると考えられるサンプルから供給される。標的ポリヌクレオチドの特に好ましい供給源は生物学的サンプルであり、例えば限定されるものではないが、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、痰、及び精液などが挙げられる。
【００４３】
ヌクレオチドの「切断構造」とは、少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとが相互作用し、二本鎖構造を形成し、その構造が切断剤により切断されて形成される構造を指す。切断剤としては、限定されるものではないが酵素（例えば制限酵素）が挙げられる。切断構造は、切断手段による特異的切断のための基質であり、非特異的切断のための基質であるポリヌクレオチド分子とは異なる。切断手段としては、例えば、２次構造に関係なくポリヌクレオチド分子を切断するホスホジエステラーゼなどの薬剤が挙げられる。
【００４４】
「キット」とは、物質を供給するための供給システムを指す。反応アッセイの場合には、このような供給システムには、反応試薬及び／又は補助物質を保管、輸送又は供給することができるシステムが含まれる。ここで、反応試薬としては、限定されるものではないが、容器に入れたオリゴヌクレオチド、酵素などが挙げられる。また補助物質としては、限定されるものではないが、バッファー、使用説明書などが挙げられる。キットには、例えば、関連する反応試薬及び／又は補助物質を含む、１種以上の格納装置（例えば箱）が含まれる。「部分的キット」とは、キットの全成分のうちの一部を含む、２個以上の別個の容器を含む供給システムを指す。この容器は、一緒に又は別々にユーザーに供給される。例えば、第１の容器はアッセイに使用する酵素を含有しており、第２の容器はオリゴヌクレオチドを含有する。また、「複合キット」として供給することもできる。複合キットは、単一の容器中に反応アッセイの全成分が含まれる供給システムを指す。例えば、必要な成分が単一の収納用ケースに入っているものがある。本発明において「キット」には、上記部分的キット及び複合キットの両方が含まれる。
【００４５】
「被験者」とは、本発明を利用して遺伝子多型情報を得て、薬物の評価及びスクリーニングを行うことが望まれる生物を意味する。例えば、被験者としては、限定されるものではないが、哺乳動物（例えば齧歯類、ヒトを含む霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ウシ）、鳥類、両生類、爬虫類などが挙げられる。被験者は、好ましくはヒトを含む霊長類、並びにラット及びマウスを含む齧歯類から選択されるものであり、最も好ましくはヒトである。さらに、遺伝子操作した動物、すなわちトランスジェニック動物、ノックアウト動物などもまた、種々の過程（胚発生及び組織形成など）に影響を及ぼす薬物の評価及びスクリーニングに有用である。
【００４６】
２．遺伝子多型
遺伝子多型には、一塩基多型、インサーション／デリーション型多型、及び塩基配列の繰り返し数が異なっていることにより生じる多型が含まれる。一塩基多型（ＳＮＰ）とは、一般にはある遺伝子又はその相補配列領域の特定の１個の塩基が他の塩基に置換することによる多型を意味するが、本発明においては、上記置換による多型のほか、当該１個の塩基が欠失したことによる多型、当該１個の塩基にさらに１個の塩基が挿入したことによる多型も含めることとする。また、インサーション／デリーション型多型とは、複数の塩基（例えば２個〜数十塩基）が欠失や挿入をしていることによる多型をいい、数百塩基〜数千塩基が欠失や挿入されているものも存在する。さらに、塩基配列の繰り返し数が異なっていることにより生じる多型は、２〜数十塩基の配列が繰り返されており、その繰り返し回数が個人間で異なっているものをいう。繰り返しの単位が数塩基から数十塩基のものをＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔ）といい、２〜４塩基単位程度のものをマイクロサテライト多型という。ＶＮＴＲやマイクロサテライト多型においては、この繰り返し回数の違いが個々人のアレル（対立遺伝子）で異なることにより、バリエーションを獲得している。
【００４７】
３．薬物代謝酵素
薬物代謝酵素は、薬物の吸収、代謝、排泄に関わるものであるため、その酵素の多型はその酵素の発現量（転写や翻訳）や活性を変化させ、結果として未変化体や代謝物の血中濃度などに違いが生じる。
【００４８】
本発明において、遺伝子多型解析の対象となる遺伝子により発現される薬物代謝酵素としては、チトクローム　Ｐ４５０　（ＣＹＰ）が挙げられる。
ＣＹＰ（チトクロームＰ４５０）は、第Ｉ相薬物代謝を司り、薬物に酸素原子を導入する酵素であり、例えばＣＹＰ　２Ａ６、ＣＹＰ　２Ａ１３、ＣＹＰ　２Ｂ６、ＣＹＰ　２Ｅ、ＣＹＰ　２Ｓ１、ＣＹＰ　５Ａ１、ＣＹＰ　７Ａ１及びＣＹＰ　７Ｂ１が挙げられ、これらのＣＹＰの１つ又は組合せから適宜選択される。
【００４９】
４．ＣＹＰ遺伝子多型の検出・同定
遺伝子多型情報は、一般的遺伝子多型検出法を利用して得ることができる。例えば、直接配列決定法、ＰＣＲによる方法、断片長多型アッセイ、アレル特異的オリゴヌクレオチドを鋳型としてハイブリダイゼーションを行う方法（例えばＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、インベーダー法、ＤＮＡチップ法）、プライマー伸長反応を利用する方法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法等が採用される。ＰＣＲ法や直接配列決定法はいずれの遺伝子多型の検出法にも使用することができ、他の方法は、主としてＳＮＰの検出法に使用することができる。
以下、遺伝子多型配列を検出するための方法の概要を説明する。
【００５０】
（１）直接配列決定アッセイ
遺伝子多型配列は、直接配列決定法を利用して検出することができる。このアッセイにおいては、最初に、適切な方法を用いて被験者からＤＮＡサンプルを採取する。検出対象の領域を適切なベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）での増殖により増幅させる。検出対象の領域とは、例えばＳＮＰ又は変異を含む領域をいう。あるいは、検出対象の領域内のＤＮＡをＰＣＲを利用して増幅してもよい。増幅後、検出対象領域内のＤＮＡを、適切な方法により配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。手動配列決定法としては、例えば放射性マーカーヌクレオチドを使用する方法などが挙げられ、自動配列決定法としては、Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを使用する方法などが挙げられる。配列決定の結果は、任意の適切な方法を利用して表示する。そして、所定のＳＮＰ又は変異の有無を決定する。
【００５１】
（２）ＰＣＲアッセイ
本発明においては、遺伝子多型配列をＰＣＲに基づくアッセイを利用して検出することもできる。ＰＣＲアッセイは、変異型又は野性型アレル（例えば多型又は変異領域）にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを利用するものである。その変異型及び野性型用の両方のプライマーセットを使用してＤＮＡサンプルを増幅する。変異型用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験者は変異型アレルを有することになる。野生型用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、被験者は野生型アレルを有することになる。
【００５２】
（３）断片長多型アッセイ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　Ａｓｓａｙ）
本発明においては、断片長多型アッセイを利用して遺伝子多型配列を検出することもできる。断片長多型アッセイでは、酵素による一連の位置におけるＤＮＡの切断に基づいて、独特なＤＮＡのバンドパターンが生じる。この酵素としては、例えば制限酵素、又はクリーバーゼＩ酵素（Ｔｈｉｒｄ　Ｗａｖｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが挙げられる。ＳＮＰ又は変異を有するサンプルに由来するＤＮＡ断片は、野性型とは異なるバンドパターンを有する。
【００５３】
（３−ａ）ＲＦＬＰアッセイ
本発明においては、制限断片長多型アッセイ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＲＦＬＰ）を利用して遺伝子多型配列を検出することもできる。まず、検出対象の領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、所定の多型に独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、一般的にはゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化する。断片の長さを、分子量マーカー、並びに野生型及び変異型対照により生じた断片と比較する。
【００５４】
（３−ｂ）ＣＦＬＰアッセイ
本発明においては、クリーバーゼ断片長多型アッセイ（Ｃｌｅａｖａｓｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＣＦＬＰ）を利用して遺伝子多型配列を検出することもできる（Ｔｈｉｒｄ　Ｗａｖｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；米国特許第５，８４３，６５４号、同第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，２０８号、及び同第５，８８８，７８０号参照）。クリーバーゼＩ酵素は、構造に特異的な耐熱性ヌクレアーゼであり、ＤＮＡの一本鎖領域と二本鎖領域との接合部を認識し、切断する作用を有する。
【００５５】
まず、検出対象の領域のＤＮＡを例えばＰＣＲにより単離する。この際に、一方の鎖又は両方の鎖を標識することが好ましい。続いて、ＤＮＡ鎖を加熱して分離させる。次に、この反応物を冷却して鎖内で二次構造が形成するようにする。続いて、ＰＣＲ産物をクリーバーゼＩ酵素で処理して、所定のＳＮＰ又は変異に特有な一連の断片を生成させる。クリーバーゼ酵素で処理したＰＣＲ産物を、例えば変性ゲル電気泳動により分離し、検出する。続いて、例えばオートラジオグラフィー、蛍光イメージング又は染色などにより可視化を行う。断片の長さを、分子量マーカー、並びに野生型及び変異型コントロールにより生じた断片と比較する。
【００５６】
（４）ハイブリダイゼーションアッセイ
本発明においては、ハイブリダイゼーションアッセイを利用して遺伝子多型配列を検出することもできる。ハイブリダイゼーションアッセイは、サンプル由来のＤＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて、所定のＳＮＰ又は変異の有無を決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーションアッセイを行うことができる。アッセイの選択に関して以下に説明する。
【００５７】
（４−ａ）ハイブリダイゼーションの直接検出
プローブが検出対象の配列（例えばＳＮＰ又は変異）に対しハイブリダイズしたか否かは、その結合したプローブを可視化することにより直接検出することができる。これは、例えば、ノーザン又はサザンアッセイとして知られている（例えば、Ａｕｓａｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　（編），　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　ＮＹ　（１９９１）参照）。サザンアッセイの場合にはゲノムＤＮＡを、ノーザンアッセイの場合にはＲＮＡを被験者から単離する。続いて、単離したＤＮＡ又はＲＮＡを、ゲノムにおける及びマーカーの近隣領域以外における切断頻度が低い一連の制限酵素群で切断する。次に、ＤＮＡ又はＲＮＡを分離し、膜に転写する。この分離操作は、例えばアガロースゲル上で行うことができる。膜への転写は、標識化プローブ、又は検出対象のＳＮＰ若しくは変異に特異的なプローブを、低、中程度又は高ストリンジェンシー条件下で膜に転写して行う。標識は、例えば放射性ヌクレオチドを導入することにより行うことができる。未結合のプローブを除去した後、標識化プローブを可視化することにより、結合の存在を検出する。
【００５８】
（４−ｂ）ＤＮＡチップアッセイを利用したハイブリダイゼーションの検出
本発明においては、ＤＮＡチップハイブリダイゼーションアッセイを利用して遺伝子多型配列を検出することもできる。このアッセイにおいては、一連のオリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に貼り付ける。このオリゴヌクレオチドプローブは、所定のＳＮＰ又は変異に特異的なものとなるように設計する。被検ＤＮＡサンプルをＤＮＡチップと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００５９】
（４−ｃ）ハイブリダイゼーションの酵素による検出
本発明においては、酵素による特異的な構造の切断を利用してハイブリダイゼーションを検出することもできる（インベーダーアッセイ；Ｔｈｉｒｄ　Ｗａｖｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、同第６，０９０，５４３号、同第６，００１，５６７号、同第５，９８５，５５７号、及び同第５，９９４，０６９号参照）。インベーダーアッセイは、構造に特異的な酵素を利用して、オリゴヌクレオチドプローブにより重複部が形成された複合体を切断することにより、特定のＤＮＡ及びＲＮＡ配列を検出するものである。
【００６０】
あるいは、結合したプローブのハイブリダイゼーションを、ＴＡＱＭＡＮアッセイを利用して検出することもできる（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；例えば、米国特許第５，９６２，２３３号及び同第５，５３８，８４８号参照）。このアッセイはＰＣＲの反応過程で行うものである。ＴＡＱＭＡＮアッセイは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＡＭＰＬＩＴＡＱ　ＤＮＡポリメラーゼ）の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。所定のアレル又は変異に特異的なプローブをＰＣＲ反応に導入する。このプローブは、５’レポーター色素（例えば蛍光色素）と３’クエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドからなるものである。ＰＣＲ過程において、プローブが標的配列と結合した場合には、ＡＭＰＬＩＴＡＱポリメラーゼの５’−３’ポリヌクレオチド分解活性によって、プローブがレポーター色素とクエンチャー色素との間で切断される。レポーター色素がクエンチャー色素と分離することによって蛍光が増大する。シグナルはＰＣＲの各サイクルにおいて蓄積するため、蛍光検出器を用いてシグナルを検出することができる。
【００６１】
さらに、本発明においては、ＳＮＰ−ＩＴプライマー伸長アッセイを利用して多型を検出することもできる（Ｏｒｃｈｉｄ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；例えば、米国特許第５，９５２，１７４号及び同第５，９１９，６２６号参照）。このアッセイにおいては、特異的に合成したＤＮＡプライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いて、推定ＳＮＰ位置における一塩基からＤＮＡを選択的に伸長させることによりＳＮＰを特定する。まず、検出対象の領域内のＤＮＡは増幅し変性させる。続いて、ポリメラーゼ反応を、ミクロ流体素子（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）と呼ばれる小型システムを用いて行う。検出は、ＳＮＰ又は変異位置にあると推測されるヌクレオチドに標識を添加することにより行う。ＤＮＡに導入された標識は、任意の適切な方法により検出することができる。例えば、ヌクレオチドがビオチン標識を含有する場合には、ビオチンに特異的な蛍光標識抗体により検出することができる。
【００６２】
（５）プライマー伸長反応を利用する方法
本発明においては、プライマー伸長反応を利用して遺伝子多型配列を検出することもできる。プライマー伸長反応を利用する方法として、例えばＳｎｉＰｅｒ法を採用することもできる。ＳｎｉＰｅｒ法とは、ローリングサークル型複製法（ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲＣＡ）法と呼ばれる手法を基本原理とするものであり、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを連続して合成していくものである（例えば、米国特許第６，２１０，８８４号及び同第６，１８３，９６０号参照）。この方法によれば、ＤＮＡ増幅が起こった場合に生じる発色反応の有無を測定することによってＳＮＰを判定する（Ｌｉｚａｒｄｉ，　Ｐ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，　１９，　２２５−２３２　（１９９８）；　Ｐｉａｔｅｄ，　Ａ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，　１６，　３５９−３６３　（１９９８））。
【００６３】
（６）質量分光アッセイ
本発明においては、ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社）を利用して遺伝子多型配列を検出することもできる（例えば、米国特許第６，０４３，０３１号、同第５，７７７，３２４号、及び同第５，６０５，７９８号参照）。まず、標準的な手順によりＤＮＡをサンプルから単離する。続いて、検出対象の変異又はＳＮＰを含む特定のＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅する。この領域は、例えば２００塩基長とすることができる。続いて、増幅断片の一方の鎖を固相表面に結合させて固定化し、固定していない鎖を標準的な変性及び洗浄により除去する。残った固定化一本鎖を自動化酵素反応において鋳型として作用させ、遺伝子型に特異的な検出用産物を生成させる。
【００６４】
非常に少量の酵素産物（一般的に５〜１０ナノリットル）をＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰアレイに転写して、続いてＳｐｅｃｔｒｏＲＥＡＤＥＲ質量分析計を用いて自動分析を行う。各スポットには、検出用産物とマトリックスを形成する光吸収結晶を予め導入しておく。ＭａｓｓＡＲＲＡＹシステムは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　−　Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ）質量分析法を利用するものである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法は、質量分析機（ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｍｅｔｅｒ）を用いた方法であり、基本的には異なる一塩基の質量の違いを利用してＳＮＰジェノタイピングする方法である。ＰＣＲ増幅を利用した方法とｍｕｌｔｉｐｌｅｘを利用した方法がある（Ｈａｆｆ，Ｌ．Ａ．，　Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｉ．Ｐ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，７，３７８−　（１９９７）　；　Ｌｉｔｔｌｅ，　Ｄ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎｉｃａ．　Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　３５，　５４５−　（１９９７）　；　Ｒｏｓｓ，　Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１６，　１３４７−　（１９９８））。
【００６５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでは、脱離として知られる過程において、マトリックスが、レーザービームからのパルスと衝突する。レーザービームからのエネルギーはマトリックスに移動し、それが気化して、少量の検出用産物がフライトチューブに排出される。電界パルスをそのフライトチューブに印加した場合に検出用産物が荷電するため、これらの産物の存在により、フライトチューブが検出器に向かって発進する。電界パルスの印加と検出用産物の検出器への衝突との間の時間は、飛行時間として表される。この方法は、分子の質量が飛行時間と直接相関するため、産物の分子量を非常に正確に測定することできる。すなわち、小分子はフライト時間が短く、高分子はフライト時間が長くなる。このアッセイは１／１０００秒以内に完了するため、反復的なデータ採集も含めて合計３〜５秒でサンプルを分析することができる。続いて、ＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲソフトウエアにより、サンプル当たり３秒の速度で遺伝子型を算出、記録、比較及び報告することができる。
【００６６】
（７）他の検出アッセイ
本発明の方法において利用可能な他の検出アッセイとしては、限定されるものではないが、酵素ミスマッチ切断方法（例えば、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ社、米国特許第６，１１０，６８４号、同第５，９５８，６９２号、同第５，８５１，７７０号参照）、ポリメラーゼ連鎖反応、分枝鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション法（例えば、Ｃｈｉｒｏｎ社、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，７１０，２６４号、同第５，１２４，２４６号、及び同第５，６２４，８０２号参照）、ＮＡＳＢＡ法（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号参照）、モレキュラービーコン技術（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号参照）、Ｅ−センサー技術（Ｍｏｔｏｒｏｌａ、米国特許第６，２４８，２２９号、同第６，２２１，５８３号、同第６，０１３，１７０号、及び同第６，０６３，５７３号参照）、サイクリングプローブ技術（例えば、米国特許第５，４０３，７１１号、同第５，０１１，７６９号、及び同第５，６６０，９８８号参照）、デイド・ベーリング（Ｄａｄｅ　Ｂｅｈｒｉｎｇ）シグナル増幅法（例えば、米国特許第６，１２１，００１号、同第６，１１０，６７７号、同第５，９１４，２３０号、同第５，８８２，８６７号、及び同第５，７９２，６１４号参照）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒｎａｙ　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　ＳｃｉＵＳＡ　８８，　１８９−９３　（１９９１））、並びに、サンドイッチハイブリダイゼーション法（例えば、米国特許第５，２８８，６０９号参照）などが挙げられる。以上の検出法により得られたＣＹＰ遺伝子の遺伝子多型情報は表１の通りである。
【００６７】
【表１】

【００６８】
表１において、「遺伝子名」の欄には薬物代謝酵素（ＣＹＰ）をコードする遺伝子名を記載した。「配列」の欄においてアルファベット大文字で示した塩基が遺伝子多型情報である。「／」を付した２つの塩基は、その塩基のホモ又はヘテロのＳＮＰを示す。例えば、「Ａ／Ｇ」と表示した場合は、アレルがＡ／Ａ若しくはＧ／Ｇのホモ、又はＡ／Ｇのヘテロであることを意味する。表中の配列は、遺伝子多型の前後２０塩基を示している。但し、括弧を付した塩基（例えばＣＹＰ５Ａ１の第４０番の（Ｃ）：配列番号１１９）はインサートによる多型を、Δ（例えばＣＹＰ５Ａ１の第２１番目：配列番号１００）は塩基の欠失による多型を意味する。また、括弧に数字を付した塩基は、その括弧内の塩基がその数字の数だけ繰り返されていることを意味する。例えば、配列番号６６の配列（表１、ＣＹＰ２Ｅの第１６番）において「（Ｔ）９−１１」とあるのは、Ｔが９〜１１個の繰り返し配列であることを意味する。ここで、表１の「配列」に示す塩基配列の位置関係を説明する場合に使用するときの「第２１番目」は、遺伝子多型部位の位置を意味するものである。したがって、欠失のＳＮＰ（Δ）の場合は、その欠失した架空の塩基が「第２１番目」であり、複数の塩基が存在する場合は、複数の塩基のひとかたまりが「第２１番目」の塩基となる。例えば、ＣＹＰ２Ｅの第１５番（配列番号６５）の場合は多型部位「ＴＧＴ」が、ＣＹＰ２Ｅの第１６番（配列番号６６）の場合は多型部位「（Ｔ）９−１１」が第２１番目の塩基となる。
【００６９】
「存在位置」は、ＳＮＰのゲノム上の位置を示す。５’フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）領域、３’フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域のＳＮＰｓの存在位置は、第１エキソンの最も５’側の塩基より１塩基５’側を−１番とし、以下５’側に向かって−２、−３、−４、・・・となる。イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）領域は、あるエキソンの３’側端から１塩基３’側から、次のエキソンまでの間を意味し、また、その番号は５’側のエキソン番号で表す。例えば、エキソン３とエキソン４との間に存在するイントロン（すなわち、エキソン３の３’側に存在するイントロン）をイントロン３という。イントロン領域のＳＮＰｓの存在位置は、そのイントロンの５’側に位置するエキソン／イントロン接合点（ｅｘｏｎ／ｉｎｔｒｏｎ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）からみて３’側の最初の塩基をそのイントロンの塩基配列１番として数えた。そして、（＋）表示又は無表示は３’下流方向に、（−）表示は５’上流方向に向かって数えた数字を示した。例えば、エキソン３／イントロン３接合点から３’側に向かって３塩基目の塩基が多型であれば、「ｉｎｔｒｏｎ　３，　＋３」と表示する。同様に、イントロン３／エキソン４接合点から５’側に向かって５塩基目の塩基が多型であれば、「ｉｎｔｒｏｎ　３，　−５」と表示する。また、最終エキソンの３’側を３’フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）といい、ＳＮＰｓの存在位置は、その遺伝子の最終エキソンの最も３’側の塩基より更に１塩基３’側の塩基を１番として数えた。
【００７０】
「Ｎｏ．」の欄に記載された数字は、各遺伝子の遺伝子地図（図９〜１６）上の遺伝子多型の位置を示す番号と対応する。また、図９〜１６には、公のゲノムデータベースにおける多型のアクセッション番号が示されている。表１、図面及びデータベースの情報を利用することにより、多型に隣接する領域の配列を特定することができる。例えば、このような情報は、多型に隣接するＰＣＲプライマーを作成する際に有用である。
上記ゲノムデータベースとしては、限定されるものではないが、ＩＭＳ−ＪＳＴ　ＪＳＮＰデータベースウエブサイト（理化学研究所、遺伝子多型研究センター、遺伝子多型タイピング研究・支援チーム）が挙げられる。
【００７１】
５．オリゴヌクレオチドプローブ又はオリゴヌクレオチドプライマーの作製
本発明の検出方法においてプライマー及び／又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、例えばＳＮＰを検出するときは表１に示す塩基配列（配列番号１〜２１５）を基本とし、これらの配列自体を合成してもよく、これらの配列の一部を含むように設計し合成してもよい。但し、その塩基配列中には必ず遺伝子多型（表１の「配列」の欄にアルファベット大文字で表示した部分）又はその一部が含まれるようにする。また、本発明においてはこれらの配列の相補鎖も含まれる。
【００７２】
ＳＮＰを例に説明すると、ＳＮＰ部位は、プライマー又はプローブの塩基配列の３’若しくは５’端に、又は相補的な配列の３’若しくは５’端に存在するように設計する。あるいは、前２者の３’若しくは５’端から４塩基内、好ましくは２塩基内に存在するように設計する。さらに、オリゴヌクレオチドの塩基配列全長の中央にＳＮＰが存在するように設計してもよい。「中央」とは、ＳＮＰの塩基よりも５’端に向かう塩基の数と、３’端に向かう塩基の数とがほぼ同数となる中心部の領域をいい、オリゴヌクレオチドの塩基数が奇数の場合は、中心部の５塩基、好ましくは中心部の３塩基、さらに好ましくは最も中心部の１塩基をいう。例えば、４１個の塩基数の場合は、第１９番目〜第２３番目、好ましくは第２０番目〜第２２番目、さらに好ましくは第２１番目の塩基が「中央」となる。また、オリゴヌクレオチドの塩基数が偶数の場合は、中心部の４塩基、好ましくは中心部の２塩基をいう。例えば、表１の「配列」に示す塩基配列において、欠失の多型の場合は、実際の配列の長さは４０個で偶数となる。したがって、この配列に基づいて４０個の塩基数のオリゴヌクレオチドを設計した場合は、第１９番目〜第２２番目、好ましくは第２０番目の塩基が「中央」となる。
【００７３】
多型部位が複数の塩基で構成される場合は、多型部位の全部又は一部の塩基配列又はその相補配列が含まれるようにプローブ又はプライマーを設計及び作製する。作製されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いると、ハイブリダイズの有無又は差を利用してアレルを決定することができる。プローブ又はプライマーのＤＮＡのうち、多型部位又はその周辺領域と相補鎖を形成する塩基を「対応塩基」とすると、プローブ又はプライマーは、多型を構成する配列のうちいずれかの配列上に対応塩基が位置するように設計することができる。「周辺領域」とは、多型を構成する配列の最も５’側端からさらに１〜３塩基外側（５’側）、又は多型を構成する配列の最も３’側端からさらに１〜３塩基外側（３’側）の領域を意味する。特に、プローブ又はプライマー中の対応塩基は、相補鎖を形成するときの５’又は３’末端の塩基が、多型を構成する配列中の５’末端側、３’末端側又は中央に位置するように設計することができる。本発明では、中央に位置することが好ましい。さらに、対応塩基は、多型を構成する配列の周辺領域上に位置するように設計することもできる。
【００７４】
例えば、後述のインベーダー法において表１のＣＹＰ２Ｅの第１５番（配列番号６５）に示す遺伝子多型（ＴＧＴ）を検出するためにインベーダープローブ及びアレルプローブを作製する場合は、アレルプローブについては、多型部位ＴＧＴに相当する「Ａ」、「Ｃ」又は「Ａ」がアレルプローブの対応塩基となってハイブリダイズするように設計する（図４Ｂのａ〜ｃ）。例えば、図４Ｂ（ａ）は、相補鎖を形成する最も５’側の対応塩基「Ｃ」が、多型を構成する塩基（ＴＧＴ）の中央に位置し、図４Ｂ（ｂ）は、相補鎖を形成する最も５’側の対応塩基「Ａ」が、多型を構成する塩基（ＴＧＴ）の５’側の「Ｔ」上に位置するという位置関係を示している。また、図４Ｂ（ｄ）には、アレルプローブの対応塩基が、多型部位（下線部）の周辺領域（３塩基）に位置するように設計したものが示されている。
【００７５】
インベーダープローブについては、３’端の塩基「Ｎ」（Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧのいずれか）の位置が、ハイブリダイズした場合に多型部位の塩基（ＴＧＴ）のいずれかと対応する位置になるように設計する。但し、アレルプローブと１塩基重複するように設計するのが最も効果的である（図４Ｃ）。一方、もう１つの遺伝子多型であるＴＧＴ欠失の場合には、その１〜３塩基分５’側又は３’側の位置に相当する塩基をインベーダープローブ及びアレルプローブの重複塩基としてＴＧＴ欠失を考慮して（配列から欠失させて）設計すればよい。図４Ｂ（ｅ）には、欠失部位の両側２塩基がアレルプローブとハイブリダイズするようにしたものを示す。なお、ＴａｑＭａｎプローブでは、このＴＧＴのいずれかの塩基又はその欠失位置が、ＴａｑＭａｎプローブの中央となるように設計すればよい。
【００７６】
塩基配列の長さは、少なくとも１３塩基、好ましくは１３塩基〜６０塩基、さらに好ましくは１５〜４０塩基、最も好ましくは１８〜３０塩基となるように設計する。このオリゴヌクレオチド配列は、被検遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、フォワード（センス）プライマー及びリバース（アンチセンス）プライマーのどちらに使用してもよい。
【００７７】
また、オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡとハイブリダイズする領域とハイブリダイズしない領域とがタンデムに連結したものであってもよい。連結の順序はどちらが上流でも下流でもよい。このオリゴヌクレオチドのうちハイブリダイズする領域は、表１に記載のＳＮＰを含む配列情報から設計し、ゲノムＤＮＡとハイブリダイズする領域の最も５’側又は３’側の配列がＳＮＰとなるように作製する。上記オリゴヌクレオチドのうちハイブリダイズしない領域は、表１に記載のＳＮＰを含む配列とハイブリダイズしないように、ランダムに配列を設計する。このオリゴヌクレオチドは、主としてインベーダー法によるＳＮＰの検出に、プローブとして使用することができる。
【００７８】
さらに、本発明において使用されるプライマーは、表１に示す塩基配列のうち、そのＳＮＰに起因する機能変化、有効／無効の判断、副作用の有無を調べる目的で、ＰＣＲにて増幅される配列の中に遺伝子多型を含むよう設計される。この場合の、プライマーの長さは、少なくとも１５塩基、好ましくは１５〜３０塩基、さらに好ましくは１８〜２５塩基の長さを有するように設計する。このときのプライマー配列は、増幅断片が１０００ｂｐ以下、好ましくは５００ｂｐ以内（例えば１２０〜５００ｂｐ）、さらに好ましくは２００ｂｐ以内（例えば１２０〜２００ｂｐ）となるように鋳型ＤＮＡの領域から適宜選択する。
例えば、ＳＮＰの５’側又は３’側に隣接する塩基から起算して、センス又はアンチセンスのプライマーの少なくともどちらか一方が、それぞれ５’又は３’側方向に１０００ｂｐ以内、好ましくは２００ｂｐ以内、さらに好ましくは１００ｂｐ以内の領域に含まれるように設計する。
【００７９】
以上のように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブは、公知の手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。
なお、プローブには、予め蛍光標識（例えばＦＡＭ，　ＶＩＣ，　Ｒｅｄｍｏｎｄ　Ｄｙｅ等）を付加して作業の自動化を図ることも可能である。
【００８０】
６．キット
上記オリゴヌクレオチドは、遺伝子多型検出用キットに含めることができる。本発明の遺伝子多型検出用キットは、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含むものである。例えば、本発明のキットは、酵素を保存若しくは供給するためのもの、及び／又は切断アッセイ（例えばインベーダーアッセイ）を実施するために必要な反応成分を含むものである。本発明のキットは、酵素、又はアッセイに必要な（好適な）成分のうち、任意の全ての成分を含むものである。そのような成分としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）、バッファー（例えばＴｒｉｓ緩衝液）、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用及び／又は検出用試薬（ＶＩＣ、ＦＡＭ等の蛍光色素）、固相支持体、説明書、説明図及び／又は製品情報、阻害剤、包装環境調節剤（例えば、氷、乾燥剤）などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。また、本発明のキットは、各容器が使用対象の成分のうちの一部を含む、２つ以上の別個の容器を含むものであってもよい。例えば、第１の容器が酵素を含有し、第２の容器がオリゴヌクレオチドを含有するものが挙げられる。ここで、酵素は、例えば適切な保存用バッファー中又は容器内に入れられた構造特異的切断酵素などであり、オリゴヌクレオチドは、例えばインベーダーオリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド、コントロール用標的オリゴヌクレオチドなどである。あるいは、１種以上の反応成分を予め分配した形で提供してもよい。この場合には、本発明の方法の１ステップで使用するために予め定量して分配されているため、再度計量したり、再度分配する必要がない。また、選択した反応成分を混合して一緒に分配しておいてもよい。反応成分は、予め分配され、反応容器中に入れられていることが好ましい。反応容器としては、限定されるものではないが、反応チューブ又はウエル、あるいはマイクロタイタープレートなどが挙げられる。予め分配される反応成分は、例えば脱水又は凍結乾燥などにより、反応容器中で乾燥させておくことが特に好ましい。
【００８１】
７．検出
上記のようにして調製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ＤＮＡポリメラーゼを用いて薬物代謝酵素をコードする遺伝子（鋳型ＤＮＡ）を増幅する。あるいは、上記のようにして調製されたプローブを鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせて、目的の遺伝子多型を有するＤＮＡを検出する。鋳型となるＤＮＡの調製は、公知の手法、例えば塩化セシウム密度勾配超遠心法、ＳＤＳ溶解法又はフェノール・クロロホルム抽出法等により行うことができる。
【００８２】
（１）　ＰＣＲによる検出
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼとしてはＬＡ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）、Ｅｘ　Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社）、Ｇｏｌｄ　Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ），　ＡｍｐｌｉＴａｑ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等が挙げられる。
【００８３】
増幅の条件は、８５℃〜１０５℃で１０秒〜４０秒、好ましくは９４℃で２０秒〜３０秒の変性工程、５０℃〜７２℃で２０秒〜１分、好ましくは６０℃で２０秒〜１分のアニーリング工程、及び６５℃〜７５℃で１分〜４分、好ましくは７２℃で２分〜３分の伸長工程を１サイクルとしてこれを３０〜４０サイクル行う。但し、鋳型ＤＮＡ及びプライマーを十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に９５℃で１分〜５分〔但し、ＧｏｌｄＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用の際は、最低８分〜１５分、好ましくは１０分から１２分〕の変性工程を加えてもよく、また、増幅されたＤＮＡを完全に伸長するために、増幅サイクルの後に７２℃で１分〜１０分の伸長工程を加えてもよい。さらに、増幅産物の検出を直ちに行わない場合は、非特異的な増幅が起こらないようにするために、増幅産物を４℃で保存する工程を加えることが好ましい。このようにして、薬物代謝酵素をコードする遺伝子（ＣＹＰ）を増幅することができる。
【００８４】
その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本又は２〜３本のバンド（ＤＮＡフラグメント）として検出することにより、薬物代謝酵素をコードする遺伝子中の遺伝子多型を含む薬物代謝酵素の一部分をＤＮＡフラグメントとして検出することができる。アガロースゲル電気泳動の代わりにポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいはキャピラリー電気泳動を実施してもよい。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。また、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により検出する等、電気泳動を必要としない検出方法も採用することができる。
【００８５】
（２）　ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法による検出
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法は、前述の通り蛍光標識したアレル特異的オリゴとＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応とを利用した方法である。ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法で用いるアレル特異的オリゴ（ＴａｑＭａｎプローブという）は、前記ＳＮＰ情報に基づいて設計することができる。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭやＶＩＣなどの蛍光レポーター色素Ｒによって標識されており、同時に３’末端がクエンチャーＱ（消光物質）によって標識されている（図１）。従って、この状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出できない。ＴａｑＭａｎプローブの３’末端はリン酸化されているため、ＰＣＲ反応中にＴａｑＭａｎプローブからの伸長反応は起こらない（図１）。しかし、このＴａｑＭａｎプローブを、ＳＮＰを含む領域を増幅するように設計したプライマーとＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼとともにＰＣＲ反応を行うと、次の反応が起こる。
【００８６】
まず、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡの特異的な配列にハイブリダイゼーションし（図２ａ）、同時にＰＣＲプライマーから伸長反応が起こる（図２ｂ）。この際、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を有しているため、ＰＣＲプライマーの伸長反応が進む際にハイブリダイゼーションしたＴａｑＭａｎプローブを切断する。ＴａｑＭａｎプローブが切断されると、蛍光色素がクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を検出することができる（図２ｃ）。
【００８７】
例えば、図３に示すように、ＳＮＰ部位がＡのアレル（アレル１とする）と、Ｇのアレル（アレル２とする）が存在すると仮定する。アレル１に特異的なＴａｑＭａｎプローブはＦＡＭで、アレル２に特異的なＴａｑＭａｎプローブはＶＩＣで標識する（図３）。２種類のアレル特異的オリゴをＰＣＲ試薬に添加し、検出の対象となる鋳型とＴａｑＭａｎ　ＰＣＲを行う。その後、蛍光検出器にてＦＡＭ及びＶＩＣの蛍光強度を測定する。その結果、アレルのＳＮＰ部位と、ＴａｑＭａｎプローブのＳＮＰに対応する部位とが相補的である場合は、プローブがアレルとハイブリダイズし、Ｔａｑポリメラーゼによりプローブの蛍光色素が切断されて、クエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光強度が検出される。
なお、鋳型がアレル１のホモ接合体である場合はＦＡＭの強い蛍光強度を認め、ＶＩＣの蛍光はほとんど認められない。鋳型がアレル１とアレル２のヘテロ接合体である場合は、ＦＡＭとＶＩＣの両者の蛍光を検出することができる。
【００８８】
（３）インベーダー法によるＳＮＰの検出
インベーダー法は、アレル特異的オリゴと鋳型とをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰを検出する方法である。インベーダー法では、２種類の非標識オリゴと１種類の蛍光標識オリゴを用いる。２種類の非標識オリゴのうちのひとつは、アレルプローブと呼ばれるものである。アレルプローブは、ゲノムＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）とハイブリダイズして相補二本鎖を形成する領域と、鋳型ＤＮＡの配列とは無関係な配列であってゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない配列の領域（フラップという）とから構成されており、ハイブリダイズする領域のうち最も５’側又は３’側の位置が、ＳＮＰに対応する塩基となっている（図４Ａ（ａ））。上記フラップ配列は、後述するフレットプローブと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。もうひとつのオリゴは、インベーダープローブと呼ばれている。このオリゴは、ＳＮＰ部位からゲノムＤＮＡの３’側方向に向かって相補的にハイブリダイズするように設計されている（図４Ａ（ｂ））。但し、ＳＮＰ部位に対応する配列（図４Ａ（ｂ）中、「Ｎ」）は任意の塩基でよい。従って、鋳型であるゲノムＤＮＡと上記２つのプローブをハイブリダイゼーションさせると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの１塩基（Ｎ）が割り込むように侵入し（図４Ａ（ｃ））、ＳＮＰ部位が３重鎖を形成する。
【００８９】
一方、蛍光標識オリゴはアレルと全く無関係な配列であり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通である。このプローブをフレット（ＦＲＥＴ）プローブ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｂｅ）という（図５）。ＦＲＥＴプローブの５’末端の塩基（レポーター）には蛍光色素Ｒが標識されており、その上流にはクエンチャーＱが結合している。従って、この状態ではクエンチャーが蛍光色素を吸収してしまうため蛍光を検出できない。また、ＦＲＥＴプローブの５’末端（レポーター塩基）から一定領域（領域１とする）は、その領域１よりも３’側の領域と向き合って相補的な配列となるように設計されている（これを領域２という）。従って、領域１は領域２と自分自身で相補鎖を形成する（図５）。また、この相補鎖形成領域よりもさらに３’方向の領域は、アレルプローブのフラップとハイブリダイズして相補鎖を形成できるように設計されている（図５）。
【００９０】
インベーダー法では、ＤＮＡの特殊な構造を認識して切断する特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素（５’ヌクレオチダーゼ）の１つであるクリーバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）を用いる。クリーバーゼは、ゲノムＤＮＡ、アレルプローブ及びインベーダープローブがＳＮＰ位置で３重になった時に、アレルプローブのＳＮＰ位置の３’側を切断する酵素である。従って、図４Ａ（ｃ）のように３つの塩基が並び、５’末端がフラップ状になっている部分を認識して、そのフラップ部分を切断する。これによって、このＳＮＰ部位の構造がクリーバーゼにより認識され（図６ａ）、フラップの部位でアレルプローブが切断されフラップ部分が遊離する（図６ｂ）。次に、アレルプローブから遊離したフラップ部分は、ＦＲＥＴプローブと相補的な配列をもつため相補結合する（図６ｃ）。このとき、フラップのＳＮＰ部位がＦＲＥＴ自身の相補結合部位に割り込んで侵入する。クリーバーゼは再びこの構造を認識して蛍光色素部分を切断する。切断された蛍光色素は、クエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発する（図６ｄ）。ＳＮＰ部位がアレルプローブのＳＮＰに対応する配列とマッチしない場合は、図７のように、クリーバーゼが認識する特異的なＤＮＡ構造をとらないため、プローブは切断されず、蛍光は検出されない。
【００９１】
例えば、あるＳＮＰがＴ／Ｃのときに、Ｔ用のインベーダープローブ、アレルプローブ、及びＳＮＰに対応するレポーターにＦＡＭを結合させたフレットプローブ、並びにこれとは別にＣ用のインベーダープローブ、アレルプローブ、及びＳＮＰに対応するレポーターにＶＩＣを結合させたフレットプローブを準備し、全て混合してＳＮＰ検出を行う。その結果、ＳＮＰがＴ／Ｔのホモの場合にはＦＡＭの蛍光を発し、Ｃ／Ｃのホモの場合にはＶＩＣの蛍光を発し、Ｔ／Ｃヘテロの場合にはＦＡＭとＶＩＣ両者の蛍光を発する。ＦＡＭとＶＩＣは蛍光波長が異なるため、両者を分別できることになる。蛍光色素で標識された産物は、蛍光プレートリーダー、又は反応過程で生じた蛍光データを採集するよう設定した装置（リアルタイム蛍光検出器）を用いて検出することができる。リアルタイム蛍光検出器としては、例えばＡＢＩ　７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）が挙げられる。
【００９２】
（４）　ＳｎｉＰｅｒ法による検出
ＳｎｉＰｅｒ法でＳＮＰを検出するためには、アレルの識別をＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による増幅の有無で行うことができる。すなわち、鋳型になるべきゲノムＤＮＡを直鎖状にしておいて、このゲノムＤＮＡにプローブをハイブリダイズさせる。プローブの配列と鋳型であるゲノムＤＮＡの配列とが相補的にマッチして相補鎖を形成すると、ゲノムＤＮＡはライゲーション反応が起こって環状になることができる。その結果、環状ＤＮＡのＲＣＡが進行する。これに対し、プローブの端がゲノムＤＮＡとマッチしなければ、ライゲーションされず環状にならないため、ＲＣＡの反応は進まない。従ってＳｎｉＰｅｒ法では、ゲノムＤＮＡとアニールし、しかも環状になり得る一本鎖プローブを設計する。この一本鎖プローブをパドロックプローブという。このパドロックプローブの断端を検出目的となるＳＮＰに対応する配列にしておいて、このパドロックプローブとゲノムＤＮＡとを混ぜ、ライゲーション反応を行う。パドロックプローブの断端とゲノムＤＮＡのＳＮＰ部分が相補的であれば、ライゲーション反応によってパドロックプローブは断端がつながり環状となるが、相補的でなければ環状にならない。従って、対象となるＳＮＰに相当するパドロックプローブのみが環状となり、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅する。ＳＮＰは、この増幅の有無を検出すればよい。検出は、両端に蛍光色素とクエンチャーをもち、ヘアピン構造を有する合成オリゴヌクレオチドを使用する。
【００９３】
（５）　ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法による検出
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ　（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ　ｏｆ　Ｆｌｉｇｈｔ　／　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法は、質量分析計をＳＮＰタイピングに応用した方法である。この方法は、以下のステップから構成される。
【００９４】
（ｉ）ＳＮＰを含むＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅及び精製
ＳＮＰ部位の塩基とＰＣＲプライマーは重複しないように設計した後ＤＮＡ断片を増幅し、増幅反応産物からエキソヌクレアーゼやアルカリホスファターゼ処理によりプライマー、ｄＮＴＰ等を除去して増幅断片を精製する。
【００９５】
（ｉｉ）プライマー伸長反応（サーマルサイクル）及び精製
ＰＣＲ産物である標的領域の鋳型に対して１０倍以上のプライマーを加え、サーマルサイクル反応させてプライマー伸長反応を行う。ここで使用するプライマーは、その３’末端がＳＮＰ部位の塩基に隣接するように設計する。プライマーの長さは、１５〜３０塩基、好ましくは２０〜２５塩基である。マルチプレックス反応を行う場合には、鋳型と相補的でない配列を５’末端に付加する。また、サーマルサイクルは、８５〜１０５℃（好ましくは９４℃）と３５〜４０℃（好ましくは３７℃）の２温度間で２０〜３０サイクル（好ましくは２５サイクル）行う。
得られた反応産物を、質量分析機に適した状態にするため精製キット等を用いて精製する。
【００９６】
（ｉｉｉ）質量分析計によるＤＮＡの質量分析
精製された伸長反応産物を質量分析機にアプライして、目的産物の質量を測定する。すなわち、精製産物をマトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩプレートに０．５〜１．０μＬスポットする。プレートを乾燥後、試料にレーザー光を照射し、スペクトログラムを作成する。
【００９７】
（６）塩基配列決定法による検出
本発明においては、１塩基の伸長反応を利用した多型の検出を行うことができる。つまり、異なる蛍光化合物で標識された４種類のジデオキシヌクレオチドを、検出の対象となる遺伝子が含まれる反応系に添加し、１塩基の伸長反応を行う。この場合、伸長する塩基を多型部位としておき、また、ＤＮＡ合成の停止とＤＮＡ分子の３’末端の蛍光標識という２つの反応を操作する。４種類の反応液をシークエンシング用ゲルの同一レーンやキャピラリー上で電気泳動を行ない、ＤＮＡバンドを標識した蛍光色素の違いを蛍光検出器により検出して配列決定を行う、あるいは１塩基伸長したオリゴヌクレオチドを蛍光検出装置や質量分析装置などを用いてどの塩基が伸長したかを蛍光色素の種類の違いを利用して調べる方法である。蛍光標識ジデオキシヌクレオチドの代わりにプライマーを蛍光標識し、非標識ジデオキシヌクレオチドと共に用いることもできる。
【００９８】
（７）　ＤＮＡマイクロアレイによる検出
ＤＮＡマイクロアレイは、支持体上にヌクレオチドプローブが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはＧｅｎｅＣｈｉｐアッセイが挙げられる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）。ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。プローブアレイは、例えば固相化学合成法と半導体産業において用いられているフォトリソグラフィー製造技術とを組み合わせた光照射化学合成法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）により製造される。チップの化学反応部位の境界を明確するためにフォトリソグラフィーマスクを利用し、特定の化学合成工程を行うことによって、アレイの所定の位置にオリゴヌクレオチドプローブが貼り付けられた高密度アレイを構築することができる。マルチプルプローブアレイは、大きなガラス基板上で同時に合成する。続いてこの基板を乾燥し、個々のプローブアレイを射出成形プラスチックカートリッジに充填する。このカートリッジは、外部環境からアレイを保護し、またハイブリダイゼーションチャンバーとしても機能する。
【００９９】
まず、分析対象のポリヌクレオチドを単離し、ＰＣＲにより増幅し、蛍光レポーター基により標識する。続いて、流体ステーションを用いて、標識化ＤＮＡをアレイと共にインキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した（すなわち標的配列に取り込まれた）蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、一般的には、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。
【０１００】
また本発明においては、電子工学的に捕捉されたプローブを有するＤＮＡマイクロチップを利用することもできる（Ｎａｎｏｇｅｎ社；例えば、米国特許第６，０１７，６９６号、同第６，０６８，８１８号、及び同第６，０５１，３８０号参照）。Ｎａｎｏｇｅｎ社の技術は、マイクロエレクトロニクスを利用することによって、半導体マイクロチップ上の所定の試験部位に及びその部位から荷電分子を移動したり、濃縮したりできる。所定のＳＮＰ又は変異に特有なＤＮＡ捕捉型プローブは、マイクロチップ上の特定の部位に電子工学的に配置されるか、又はアドレス指定される。ＤＮＡは強く負に荷電しているため、正電荷領域へ電子的に移動することが可能である。
【０１０１】
最初に、マイクロチップ上の試験部位又は試験部位の列を正電荷により電子的に活性化する。続いて、ＤＮＡプローブ含有溶液をマイクロチップ上に導入する。負に荷電したプローブは、正に荷電した部位に迅速に移動するため、マイクロチップ上のその部位にプローブが濃縮され、化学的に結合する。続いてマイクロチップを洗浄し、さらに別の異なるＤＮＡプローブ溶液を添加してＤＮＡプローブとの特異的結合を行う。
【０１０２】
次に、被検サンプル中に標的ＤＮＡ分子が存在するか否かを分析する。この分析は、被検サンプル中の相補的ＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡ捕捉型プローブの種類を判定することにより行う。ここで被検サンプルとしては、例えばＰＣＲにより増幅した検出対象の遺伝子が挙げられる。また、電荷を利用することにより、マイクロチップ上の１以上の試験部位に標的分子を移動させ、濃縮することができる。各試験部位におけるサンプルＤＮＡの電気的濃縮によって、サンプルＤＮＡとそれに対し相補的な捕捉型プローブとのハイブリダイゼーションが迅速に行われる。例えば、このような操作によりハイブリダイゼーションが数分で起こるようになる。未結合ＤＮＡ又は非特異的結合ＤＮＡを各試験部位から除去するために、その部位の極性又は電荷を陰性に逆転し、それにより未結合ＤＮＡ又は非特異的結合ＤＮＡを溶液中に戻すことができる。この方法においては、例えばレーザーを利用した蛍光スキャナーを用いて特異的結合を検出することができる。
【０１０３】
さらに、本発明においては、表面張力の違いによる平面（チップ）上での流体の分離現象を利用したアレイ技術も利用可能である（ＰｒｏｔｏＧｅｎｅ社；例えば、米国特許第６，００１，３１１号、同第５，９８５，５５１号、及び同第５，４７４，７９６号参照）。Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ社の技術は、化学的被膜により付与される表面張力の違いによって、流体が平面上で分離するという事実に基づいている。オリゴヌクレオチドプローブは、上述のような原理に基づいて分離させることができるため、プローブを含む試薬をインクジェットプリントすることによりチップ上で直接合成することができる。表面張力により規定される反応部位を有するアレイを、１セット（４つ）の圧電性ノズル下に配置されたＸ／Ｙ移動ステージ上に載せる。各圧電性ノズルには、それぞれ４種の標準的なＤＮＡ塩基が含有されている。この移動ステージはアレイの各列に沿って移動し、適切な試薬（例えばアミダイト）を各反応部位に供給する。アレイの表面全体を、アレイの反応部位に共通の試薬及び洗浄液に浸漬し、その後回転させることによりこれらの溶液を除去する。
【０１０４】
検出対象のＳＮＰ又は変異に特有なＤＮＡプローブをＰｒｏｔｏｇｅｎｅ社の技術を利用してチップに貼り付ける。続いて、チップを、ＰＣＲで増幅した検出対象遺伝子と接触させる。ハイブリダイゼーション後、未結合ＤＮＡを除去し、任意の適切な方法を利用してハイブリダイゼーションを検出する。適切な方法としては、例えば、導入した蛍光基の蛍光を脱消光（ｄｅ−ｑｕｅｎｃｈ）することなどが挙げられる。
【０１０５】
さらに、「ビーズアレイ」を利用して多型を検出することができる（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社；例えば、ＰＣＴ国際公開　ＷＯ　９９／６７６４１号及び同ＷＯ　００／３９５８７号参照）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社は、光ファイバー束と、アレイに自己会合するビーズとを組み合わせたビーズアレイ技術を利用している。各光ファイバー束は、その束の直径に応じて数百万のファイバーを含有する。ビーズは、所定のＳＮＰ又は変異の検出に特異的なオリゴヌクレオチドにより被覆する。各種所定量のビーズを混ぜて、アレイに特異的なプールを形成させる。アッセイを行うために、ビーズアレイと調製済みの被験者サンプルとを接触させる。そして、ハイブリダイゼーションを任意の適切な方法により検出する。
【０１０６】
８．薬物の評価
本発明においては、前記のようにして得られる一塩基多型等の検出結果から、当該薬物代謝酵素によって代謝される薬物の有効性及び安全性を評価することができる。
薬物の評価は、タイピングシステムにより行うことができる。すなわち、上記いずれかの検出手法に従って、毒性（副作用）発現群と非発現群のアレル頻度を比較する。両者を比較した際、アレル頻度に差が生じるものを毒性発現認識のためのマーカーとして選出する。統計学的検定は、通常χ^２検定によるが、例えばＦｉｓｈｅｒ検定などの他の統計処理を行うこともできる。なお、この結果を、薬物の活性本体（薬物未変化体又は代謝物でもよい）の血中濃度、組織濃度に反映させることも可能である。当該全ての遺伝子多型に関して、毒性との因果関係を調べ、相関のあった遺伝子多型部位のみを選出する。その全ての遺伝子多型解析用プローブ又はプライマーと各手法に応じた試薬を、反応プレート、カード又はガラス基盤等に予め用意し、そこに予測したいヒトのゲノムＤＮＡを添加し、反応させることで、アレルパターンを調べることができる。毒性と相関する遺伝子多型を有する場合には、そのヒトの副作用発現予測が可能となる。薬物の有効性についても同様である。また、薬物の違いにより、副作用又は有効性と相関する遺伝子多型も異なるので、それぞれに関して、当該遺伝子多型を用いてタイピング操作を行えば、有効性や副作用の予測をすることが可能となる。
【０１０７】
このことを利用して、その遺伝子多型頻度と有効／無効又は副作用の有／無を比較し、アレル頻度に差がある時に判定することが可能となる。
例えば、薬物Ａの投与によってある毒性（副作用）を示した者のＳＮＰを解析した結果、統計的に全体の９０％がＴ／Ｔを持つ者（例えばＦＡＭの蛍光強度を検出）であることが判明し、毒性（副作用）を示さなかった者のＳＮＰを解析した結果、Ｔ／Ｔを持つ者は全体の１０％にすぎず、Ｃ／Ｃを持つものが９０％を占めたことが判明したとすると、ＳＮＰ解析の結果、Ｔ／Ｔを持つ者は薬物Ａの投与はできないと評価することができる。
【０１０８】
９．薬物のスクリーニング
本発明において前記の通り得られた遺伝子多型情報は、被験者から採取した当該薬物代謝酵素をコードする遺伝子の遺伝子多型情報と比較することにより、当該薬物代謝酵素によって代謝される薬物の有効性及び安全性を解析するための指標として利用される。従って、本発明において得られた遺伝子多型情報は、どの薬物が治療に最も有効であるか、その使用すべき薬物を選択するための情報源となる。
【０１０９】
手法としては「８．薬物の評価」に記載の評価方法を利用すればよい。つまり、前項で副作用又は有効性と相関が認められた遺伝子多型は、その酵素の活性、転写、翻訳に影響を与えるものであるといえる。また、副作用又は有効性の発現機構と間接的であっても何らかの因果関係があるといえる。ある薬物の代謝は、製薬会社などにおいて前臨床又は臨床試験にて調査・確認される。よって、それらの酵素遺伝子中に存在する遺伝子多型の中に重篤な副作用と相関する多型がある場合にはこれを削除すること、あるいは条件付きで使用することが可能となる。また、有効性についても同様である。この副作用と有効性の情報から薬物のスクリーニングが可能となる。
【０１１０】
さらに、臨床試験（第Ｉ〜ＩＩＩ相試験）において副作用発現症例のボランティアと副作用非発現症例の遺伝子多型頻度解析を行うことで、前記した以外に副作用や有効性と相関する新たな遺伝子多型を検出することが可能となる。これを、上記と同様に調べることで薬物のスクリーニングが可能となる。
【０１１１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕　ＳＮＰ情報の取得
（１）　ＤＮＡ抽出
血縁関係のない４８人からＥＤＴＡ存在下に採血を行った。ＤＮＡの抽出は、ゲノム解析ラボマニュアル（中村祐輔編シュプリンガー・フェアラーク東京）の方法に従って以下の通り行った。
【０１１２】
血液１０ｍｌを５０ｍｌのファルコンチューブに移し、室温で３０００ｒｐｍ、５分間遠心を行った。ピペットにて上清（血清）を採取した後、ＲＢＣ溶解バッファー（１０ｍＭ　ＮＨ_４ＨＣＯ_３，　１４４ｍＭ　ＮＨ_３Ｃｌ）を３０ｍｌ加えた。沈殿がほぐれるまで混和した後、室温で２０分放置した。室温で３０００ｒｐｍ、５分間遠心を行った後、ピペットにて上清（血清）を捨て、白血球のペレットを得た。ＲＢＣ溶解バッファーを３０ｍｌ加え、同様の操作をさらに２回行った。白血球のペレットにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），　１００ｍＭ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を４ｍｌ、１０％　ＳＤＳを２００μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを２００μｌ加え、転倒混和した後、３７℃で一晩静置した。フェノールを４ｍｌ加え、ローテーター（Ｒｏｔａｔｏｒ　Ｔ−５０，　Ｔａｉｔｅｃ）にて４時間ゆっくりと転倒混和した。室温で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心を行い、上層を新しいチューブに回収した。４ｍｌのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（容積比２５：２４：１）を加え、同様に２時間転倒混和した後、遠心した。上層を新しいチューブに回収し、４ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（容積比２４：１）を加え、同様に３０分転倒混和した後、遠心した。上層を新しいチューブに回収し、８Ｍ酢酸アンモニウム４００μｌ、イソプロパノール４ｍｌを加え、転倒混和した。糸状の白色析出物（ＤＮＡ）を２ｍｌ容のチューブに回収し、７０％エタノールを１ｍｌ加え、転倒混和した。新しい２ｍｌ容のチューブにＤＮＡを回収し風乾した後、ＴＥ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），　１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））を５００μｌ加え、溶解後、ゲノムＤＮＡサンプルとした。
【０１１３】
（２）　ＰＣＲ
ゲノムシークエンスは、ＧｅｎＢａｎｋ　ＤＮＡデータベースから得た。ＲｅｐＭａｓｋコンピュータプログラムを用い、リピート配列を除いた後、ＰＣＲ産物が１ｋｂ前後になるようにＰＣＲプライマーを設計した。ゲノムＤＮＡは、同濃度に調製した血縁関係のない４８人のＤＮＡを使用した。それぞれ３人分のＤＮＡを１本のチューブに同量混ぜ、このうち６０ｎｇをＰＣＲに使用した。ＰＣＲは、Ｅｘ−Ｔａｑ（２．５Ｕ；　ＴａＫａＲａ）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。９４℃で２分間反応後、９４℃で３０秒の変性、６０℃又は５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分の伸長を行い、これを１サイクルとして３５サイクル行った。
【０１１４】
（３）　シークエンス
ＰＣＲ産物は、Ａｒｒａｙｌｔ（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）を使用し精製を行った後、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ＲＲ　Ｍｉｘ（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、シークエンス反応を行った。ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃で２分間反応後、９６℃で２０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリング、６０℃で４分の伸長を行い、これを１サイクルとして２５サイクル行った。シークエンス反応後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒにてシークエンス解析を行った。
【０１１５】
（４）　ＳＮＰの検出
ＳＮＰの検出には、ＰｏｌｙＰｈｒｅｄコンピュータープログラム（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２５，　２７４５−２７５１）を使用し、解析を行った。
【０１１６】
（５）　結果
表１に示すＳＮＰの結果が得られた。また、解析を行った薬物代謝酵素名とその略号、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号、薬物代謝酵素の遺伝子の構造とＳＮＰｓの存在位置を図９〜１６に示した。図９〜１６において、エキソンは水平線で表示した遺伝子上に白抜きのボックス又は黒の線で示した。ＳＮＰｓの存在位置は、遺伝子の上側に実線で示し、番号を付した。
【０１１７】
〔実施例２〕
異なる２グループの被験者から得たＣＹＰ遺伝子の多型についてインベーダー法によりタイピングを行った。結果を図１７に示す。図１７において、横軸（Ａｌｌｅｌｅ　１）はＧに対応するＶＩＣの蛍光の強さを、縦軸（Ａｌｌｅｌｅ　２）はＡに対応するＦＡＭの蛍光の強さを表す。各点線円にてそれぞれの領域を囲ってあるが、黒四角（■）はＳＮＰのパターンがＧ／Ｇであり、黒丸（●）はＡ／Ａ、黒三角（▲）はＧ／Ａであることを示す。白四角（□）はバックグラウンド値を意味する。パネルＡ（上）のグラフに示された被検者グループはＳＮＰのパターンがＧ／Ｇのものが多く、パネルＢ（下）のグラフに示された被検者グループはＳＮＰのパターンがＡ／Ａのものが多いことが分かる。
【０１１８】
〔実施例３〕ＳＮＰの検出
血縁関係のない５人から実施例１に記載した方法により採取したゲノムＤＮＡを試料とし、２種類のＣＹＰ遺伝子（ＣＹＰ２Ｅ、ＣＹＰ２Ｓ）中のＳＮＰの検出を、インベーダー法により行った。ＣＹＰ２ＥについてはＮｏ．６、１３（配列番号５６、６３）及びＣＹＰ２ＳについてはＮｏ．３、１０（配列番号７２、７９）の各配列に基づいて設計されたインベーダープローブ及びアレルプローブを用いた。各ＳＮＰの存在位置は、表１に示されている。
結果を表２に示す。
【０１１９】
【表２】

【０１２０】
表２の結果より、本発明の方法により各被験者の薬物代謝酵素遺伝子中のＳＮＰの検出及びそのパターンの同定が可能であることが分かった。
【０１２１】
【発明の効果】
本発明により、ＳＮＰの解析方法が提供される。本発明の方法により、目的の疾患に応じた薬物の選択をすることが可能となるため、本発明の方法は極めて有用である。
【０１２２】
【配列表】

【０１２３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号６５：ｎはｔｇｔ又は欠失を表す（存在位置２１）。
配列番号６６：ｎはｔの９〜１１回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号７１：ｎはａｇｇ又は欠失を表す（存在位置２１）。
配列番号７３：ｎはａの１０〜１１回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号７５：ｎはｔｃｔｃ又は欠失を表す（存在位置２１）。
配列番号７６：ｎはａの１１〜１２回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号７８：ｎはｔｃの７〜８回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号８０：ｎはｔの１０〜１３回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号８５：ｎはｔの１１〜１３回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１００：ｎはａ又は欠失を表す（存在位置２１）。
配列番号１０１：ｎはｔｇ又は欠失を表す（存在位置２１）。
配列番号１０５：ｎはｔの１２〜２５回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１１２：ｎはｔの１０〜１２回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１１５：ｎはａの１２〜１６回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１１６：ｎはｇａｇ又は欠失を表す（存在位置２１）。
配列番号１２２：ｎはｔの９〜１０回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１２６：ｎはｔｔｇｇｔｃｃｃｃｃａａｃｃｇｃｃｔｇｔｃｔｃｃｃｃａｃａｃｃｃｃｇｃａａ又はａｇｇｃｔｇｃａｇｔｃｃを表す（存在位置２１）。
配列番号１２９：ｎはｔの９〜１２回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１３７：ｎはａｃの１２〜１３回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１４１：ｎはａの９〜１０回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１４６：ｎはｔの１３〜１６回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１４７：ｎはｃ又は欠失を表す（存在位置２１）。
配列番号１４８：ｎはｔの９〜１０回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１４９：ｎはａの１０〜１２回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１５２：ｎはｔの８〜９回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１８２：ｎはｔの９〜１０回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１９１：ｎはｔの８〜９回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１９７：ｎはｔの９〜１２回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１９８：ｎはｔの１０〜１１回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号１９９：ｎはｔの１２〜１４回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号２０４：ｎはａの１６〜１９回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
配列番号２０５：ｎはａの６〜７回の繰り返しを表す（存在位置２１）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴａｑＭａｎプローブを示す図である。
【図２】ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法の概要を示す図である。
【図３】蛍光色素を付したプローブを示す図である。
【図４Ａ】インベーダー法の概要を示す図である。
【図４Ｂ】インベーダープローブとアレルプローブとの位置関係を示す図である。
【図４Ｃ】インベーダープローブとアレルプローブとの位置関係を示す図である。
【図５】フレットプローブを示す図である。
【図６】インベーダー法の概要を示す図である。
【図７】アレルとマッチしないプローブを示す図である。
【図８】ライゲーション反応によるアレルの識別の概要を示す図である。
【図９】ＣＹＰ２Ａ６チトクローム　Ｐ４５０（サブファミリー　ＩＩＡ　（フェノバルビタール−誘導性），ポリペプチド　６）遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．）：ＮＧ＿０００００８．２
【図１０】ＣＹＰ２Ａ１３チトクロームＰ４５０（サブファミリーＩＩＡ　（フェノバルビタール−誘導性），ポリペプチド１３）遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号：ＡＣ００８９６２．９
【図１１】ＣＹＰ２Ｂ６チトクロームＰ４５０（サブファミリーＩＩＢ　（フェノバルビタール−誘導性），ポリペプチド　６）遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号：ＮＧ＿００００１０．１
【図１２】ＣＹＰ２ＥチトクロームＰ４５０（サブファミリーＩＩＥ　（エタノール−誘導性））遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号：ＡＬ１６１６４５．１４
【図１３】ＣＹＰ２Ｓ１チトクロームＰ４５０（サブファミリーＩＩＳ，ポリペプチド　１）遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号：ＮＧ＿００００１１．１
【図１４】ＴＢＸＡＳ１トロンボキサン　Ａシンターゼ　１（血小板，チトクローム　Ｐ４５０，サブファミリーＶ）（ＣＹＰ５Ａ１）遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号：ＡＣ００６０２１．２、ＡＣ００４９１４．１及び　ＡＣ００４９６１．２
【図１５】ＣＹＰ７Ａ１チトクロームＰ４５０（サブファミリーＶＩＩＡ　（コレステロール　７アルファ−モノオキシゲナーゼ），ポリペプチド１）遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号：ＡＣ０２０７８２．１０
【図１６】ＣＹＰ７Ｂ１チトクロームＰ４５０（サブファミリーＶＩＩＢ　（オキシステロール　７アルファ−ハイドロキシラーゼ），ポリペプチド１）遺伝子の構造とＳＮＰの存在位置を示す図である。
アクセッション番号：ＡＦ１２７０８９．１、ＡＦ１７６８００．１及び　ＡＦ２１５８４５．２
【図１７】異なる２グループの被験者についてインベーダー法によりタイピングを行った結果を示す図である。

Claims

配列番号１〜２１５に示す塩基配列のうち第２１番目の塩基を含む少なくとも１３塩基の配列又はこれに相補的な配列を有するものからなる群から選択される少なくとも１つをオリゴヌクレオチドプローブ及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子の遺伝子多型を検出する方法。
遺伝子多型が、一塩基多型、複数個の塩基の欠失、置換若しくは挿入による多型、又はＶＮＴＲ若しくはマイクロサテライトによる多型である請求項１記載の方法。
請求項１又は２記載の方法により得られた検出結果から、チトクロームＰ４５０によって代謝される薬物の有効性及び安全性を評価することを特徴とする薬物の評価方法。
請求項３記載の評価方法により得られた評価を指標として、使用すべき薬物を選択することを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子及び／又はその相補配列中に含まれる遺伝子多型情報と、被験者から採取したチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子及び／又はその相補配列中に含まれる遺伝子多型情報とを比較して、チトクロームＰ４５０によって代謝される薬物の有効性及び／又は安全性を解析し、得られる解析結果から使用すべき薬物を選択することを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
チトクロームＰ４５０が、２Ａ６、２Ａ１３、２Ｂ６、２Ｅ、２Ｓ１、５Ａ１、７Ａ１及び７Ｂ１からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
配列番号１〜２１５に示される塩基配列又はこれに相補的な塩基配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子及び／又はその相補配列中に存在する遺伝子多型情報から、当該遺伝子及び／又はその相補配列の遺伝子多型部位を含むように作製されたオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又は中央の塩基が、当該遺伝子多型部位となるように作製されたものである請求項８記載のオリゴヌクレオチド。
遺伝子多型部位を含むオリゴヌクレオチドが、チトクロームＰ４５０をコードする遺伝子又はその相補配列とハイブリダイズし得る断片とハイブリダイズしない断片とが結合したものであって、前記遺伝子多型部位が、当該ハイブリダイズし得る断片の５’末端又は３’末端に位置するものである請求項９記載のオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜２１５に示すいずれかの塩基配列のうち第２１番目の塩基を含む少なくとも１３塩基の配列又はこれに相補的な配列を有するものである請求項９又は１０記載のオリゴヌクレオチド。
配列番号１〜２１５に示すいずれかの塩基配列中の遺伝子多型部位が含まれるゲノムＤＮＡ領域において、当該遺伝子多型部位から５’及び／又は３’側に向かってそれぞれ１０００ｂｐ以内に設計され、かつ、１３〜６０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチド。
請求項７〜１２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
請求項７〜１２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項１３記載のマイクロアレイを含む遺伝子多型検出用キット。