JP2017063728A - プライマーの設計方法、プライマー、プライマーセット、ｄｎａ増幅方法および解析方法 - Google Patents

プライマーの設計方法、プライマー、プライマーセット、ｄｎａ増幅方法および解析方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＰＣＲ反応による領域毎のＤＮＡ増幅のばらつきやアレル毎のＤＮＡ増幅のばらつきを補正し、染色体量定量や遺伝子型確定を高精度に行うことができるプライマーを設計しうる、プライマーの設計方法を提供する。【解決手段】ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法であって、プライマーの５’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程を備える、ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。【選択図】図１

Description

本発明は、プライマーの設計方法、プライマー、プライマーセット、ＤＮＡ増幅方法および解析方法に関する。
近年発達してきたＤＮＡシーケンサ等により遺伝子解析が手軽に行えるようになっている。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約がある。そこで、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。
しかしながら、一般にマルチプレックスＰＣＲによる増幅性は領域毎に異なるため、染色体数定量等の解析に悪影響が生じてしまう。また例えばヒトのような２倍体の場合には、アレルごとに増幅性が異なるため、ＳＮＰの遺伝子型特定に悪影響を及ぼしてしまう。これはシングルセル解析のような、標的とするＤＮＡ量が少ない場合に特に顕著になる。
特許文献１には、プライマー同士が干渉しない安定的なマルチプレックスＰＣＲを行うため、プライマー同士のローカルアライメントを行い、プライマー同士がアニーリングしダイマーを形成するようなプライマーセットを避け、相補性が十分低いプライマーを用いて、効率的なマルチプレックスＰＣＲを行うことが記載されている。
国際公開第２００８／００４６９１号
しかしながら、プライマー同士のローカルアライメントを行い、プライマー同士の相補性が十分低くなるように、プライマーを慎重に設計しても、領域毎、アレル毎にＰＣＲ増幅効率に差異が存在してしまい、染色体量定量や遺伝子型確定に悪影響が生じてしまう。特にシングルセル解析のような少量ＤＮＡを標的とする場合には顕著になる。
そこで、本発明は、ＰＣＲ反応による領域毎のＤＮＡ増幅のばらつきやアレル毎のＤＮＡ増幅のばらつきを補正し、染色体量定量や遺伝子型確定を高精度に行うことができるプライマーを設計しうる、プライマーの設計方法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プライマーの５’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程を備える、ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法によって設計したプライマーによれば、ＰＣＲ反応による領域毎のＤＮＡ増幅のばらつきやアレル毎のＤＮＡ増幅のばらつきを補正し、染色体量定量や遺伝子型確定を高精度に行うことができることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は次の［１］〜［９］を提供する。
［１］ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法であって、
プライマーの５’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程
を備える、ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。
［２］上記プライマー設計工程は、
プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
Ｎは１以上の奇数であり、
Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−２回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含む、
上記［１］に記載のＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。
［３］上記プライマー設計工程は、
プライマーが第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
Ｎは１以上の整数であり、
Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
Ｎ＝２であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含む、
上記［１］に記載のＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。
［４］上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載のプライマーの設計方法に従って設計されたプライマー。
［５］上記［４］に記載のプライマーを含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセット。
［６］上記［５］に記載のプライマーセットを複数含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセット。
［７］上記［５］または［６］に記載のプライマーセットをＰＣＲ反応に供する、ＤＮＡ増幅方法。
［８］上記［５］または［６］に記載のプライマーセットをＰＣＲ反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
領域毎のカバレッジを、増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。
［９］上記［５］または［６］に記載のプライマーセットをＰＣＲ反応に供して少なくとも１つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
アレル毎のカバレッジを、増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。
本発明によれば、ＰＣＲ反応による領域毎のＤＮＡ増幅のばらつきやアレル毎のＤＮＡ増幅のばらつきを補正し、染色体量定量や遺伝子型確定を高精度に行うことができるプライマーを設計しうる、プライマーの設計方法が提供される。
図１は、対になるプライマーの両方が本発明のプライマーであり、奇数番目とその直後の偶数番目のＰＣＲ反応サイクルで同じプライマーセットを用いるＤＮＡ増幅方法を模式的に説明する図である。 図２は、対になるプライマーの両方が本発明のプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いるＤＮＡ増幅方法を模式的に説明する図である。 図３は、対になるプライマーの一方のみが本発明のプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いるＤＮＡ増幅方法を模式的に説明する図である。
〈ＰＣＲ〉ＰＣＲ（polymerase chain reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid；デオキシリボ核酸）を増幅するための原理、手法または反応である。手法を指す場合はＰＣＲ法、反応を指す場合はＰＣＲ反応と呼ばれる場合がある。ＰＣＲ反応はサーマルサイクルを連続して行う必要はなく、各サーマルサイクルの開始時、途中、終了時等に反応溶液に物質を追加したり除去したりしてもよい。
〈ＳＮＰ〉ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism；一塩基多型）とは、ある生物種集団のゲノム塩基配列中に見られる１塩基が変異した多様性であって、その変異が集団内で１％以上の頻度で見られるものをいう。
［プライマーの設計方法］
本発明のプライマー設計方法は、上記プライマーの５’末端側の塩基配列が、上記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、上記プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程を備える。
ＰＣＲ反応では、通常、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する変性ステップ、一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合するアニーリングステップ、およびプライマーの３’末端を起点として一本鎖ＤＮＡと相補的なＤＮＡを合成する伸長ステップの３ステップを含むサーマルサイクルを複数サイクル繰り返すことによって増幅対象ＤＮＡの増幅対象領域が増幅される。したがって、プライマーの５’末端にそのプライマーを識別できる識別タグ配列を組み込んでおくと、そのプライマーを使用したＰＣＲ反応で生成された増幅産物中のＤＮＡ分子は、その塩基配列中に識別タグ配列と同一の塩基配列または相補的な塩基配列を有することとなる。すなわち、このタグ配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列である。
上記何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列については、本発明のＤＮＡ増幅方法について説明する際に、より具体的に説明する。
本発明のプライマー設計方法は、プライマー同士がアニーリングしてダイマーを形成しないようにプライマーを設計することができる。例えば、特許文献１の開示に従って、プライマー同士のローカルアラインメントを行い、プライマー同士がアニーリングしダイマーを形成するようなプライマーの組合せを避けるようにプライマーを設計することができる。
上記プライマー設計工程においては、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含んでもよい。ここで、上記非相補ＤＮＡ部分の塩基配列は、上記何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列からなる。
また、上記プライマー設計工程は、上記プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、Ｎを１以上の奇数として、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−２回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含むことが好ましい。
この方法でプライマーを設計する場合、サーマルサイクル毎にプライマーを設計する場合に比べて、設計するプライマーの数を減らすことができるというメリットがある（ここで、Ｎは１以上の奇数である）。
また、上記プライマー設計工程は、上記プライマーが第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、Ｎを１以上の整数として、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、Ｎ＝２であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含むことが好ましい。
この方法でプライマーを設計する場合、プライマーの５’末端側の塩基配列はそれぞれのサーマルサイクルに特有のものとなるので、増幅産物中のＤＮＡ分子が何サイクル目で合成されたものであるかを、より容易に特定することができる。
［プライマーおよびプライマーセット］
本発明のプライマーは、上述した本発明のプライマー設計方法に従って設計された、ＰＣＲ反応に供するプライマーである。
したがって、本発明のプライマーは、ＰＣＲ反応に供するプライマーであって、上記プライマーの５’末端側の塩基配列は、上記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含む。
また、本発明のプライマーは、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーであってもよい。ここで、上記非相補ＤＮＡ部分の塩基配列は、上記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列からなる。
Ｎを１以上の奇数として、上記プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、本発明のプライマーは、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成され、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーであることが好ましい。
Ｎを１以上の整数として、上記プライマーが第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、本発明のプライマーは、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成され、Ｎ＝２であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成され、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、第１回目から第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーであることが好ましい。
本発明のプライマーは、上述した本発明のプライマー設計方法によって設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列に従って、従来公知のオリゴヌクレオチド合成方法により製造することができる。
本発明のプライマーセットは、上述した本発明のプライマーを含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセットである。
本発明のプライマーセットは、好ましくは、上述した本発明のプライマーからなる群から選択される第１のプライマーと、第２のプライマーとを組み合わせてなり、上記第１のプライマーと上記第２のプライマーとの対を用いて増幅対象ＤＮＡの増幅対象領域をＰＣＲ反応によって増幅することができる、ＰＣＲ反応に供するプライマーセットである。より好ましくは、上記第２のプライマーは上述した本発明のプライマーからなる群から選択される。
第１のプライマーおよび第２のプライマーの両方が上述した本発明のプライマーからなる群から選択されたプライマーである場合には、ＰＣＲ反応による増幅産物中のＤＮＡ分子の５’末端側にプライマーの塩基配列を、３’末端側にプライマーの塩基配列と相補的な塩基配列を付加することができるので、ＤＮＡ分子が何回目のサイクルで合成されたものであるか、より正確に特定することができたり、奇数回目と偶数回目のサイクルで同じプライマーセットを使用して工数を削減することができたりする。
第１のプライマーのみが上述した本発明のプライマーからなる群から選択されたプライマーである場合には、ＰＣＲ反応の全サイクルで同一のプライマーを第２のプライマーとして使用することができ、プライマー設計に係る工数を削減することができる。
本発明のプライマーセットは、また、上述した本発明のプライマーセットを複数含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセットである。
このプライマーセットは、マルチプレックスＰＣＲに用いる際に好適である。
［ＤＮＡ増幅方法］
本発明のＤＮＡ増幅方法は、上述した本発明のプライマーセットをＰＣＲ反応に供する、ＤＮＡ増幅方法である。
本発明のＤＮＡ増幅方法によって生成した増幅産物をシーケンスすることによって、増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができる。
本発明のＤＮＡ増幅方法は、概していえば、（１）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、奇数番目とその直後の偶数番目のＰＣＲ反応サイクルで同じプライマーセットを用いる方法（図１参照）、（２）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法（図２参照）、（３）対になるプライマーの一方のみが非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法（図３参照）の３態様を含む。
以下に、これら３態様のそれぞれについて説明する。
〈（１）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、奇数番目とその直後の偶数番目のＰＣＲ反応サイクルで同じプライマーセットを用いる方法〉
以下、適宜、図１を参照しながら説明する。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図１のＡを参照）では、ゲノムＤＮＡを増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ０（図１中では「Ａ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ１（図１中では「Ａ１」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ１（図１中では「プライマーＦ１」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ０（図１中では「Ｂ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ１（図１中では「Ｂ１」と表記する。）とから構成されるプライマーＲ１（図１中では「プライマーＲ１」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図１のＡを参照）では、５’末端にプライマーＦ１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ１を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ１を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の２サイクル目（図１のＢを参照）では、ＰＣＲ反応の１サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡとして用いて、これに対して、１サイクル目と同じプライマーＦ１およびプライマーＲ１からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の２サイクル目（図１のＢを参照）では、５’末端にプライマーＦ１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ１、３’末端にプライマーＲ１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ１に相補的な塩基配列ｂ１（図１中では「ｂ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ１、３’末端にプライマーＦ１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ１に相補的な塩基配列ａ１（図１中では「ａ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の３サイクル目（図１のＣを参照）では、ＰＣＲ反応の２サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ２（図１中では「Ａ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ２（図１中では「プライマーＦ２」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ２（図１中では「Ｂ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＲ２（図１中では「プライマーＲ２」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の３サイクル目（図１のＣを参照）では、５’末端にプライマーＦ２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ２を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ２を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の４サイクル目（図１のＤを参照）では、ＰＣＲ反応の３サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、３サイクル目（図１のＣ）と同じプライマーＦ２およびプライマーＲ２からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の４サイクル目（図１のＤを参照）では、５’末端にプライマーＦ２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ２、３’末端にプライマーＲ２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ２に相補的な塩基配列ｂ２（図１中では「ｂ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ２、３’末端にプライマーＦ２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列ａ２（図１中では「ａ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の５サイクル目以降、ｉを１以上の整数として、２（ｉ＋１）＋１サイクル目および２（ｉ＋１）＋２サイクル目でも、同様にして、プライマーＦｉ＋２およびＲｉ＋２からなる同じプライマーセットを用いる。
プライマーＦｉ＋２は、塩基配列Ａｉ＋１からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ａｉ＋２からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＦｉ＋２の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋１は、プライマーＦｉ＋１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋１と同一であり、プライマーＦｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋２は、プライマーＦｉからプライマーＦｉ＋１までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ１からＡｉ＋１までのいずれとも相違し、プライマーＦｉ＋３の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋２と同一である。
プライマーＲｉ＋２は、塩基配列Ｂｉ＋１からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ｂｉ＋２からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＲｉ＋２の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｉ＋１は、プライマーＲｉ＋１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｉ＋１と同一であり、プライマーＲｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｉ＋２は、プライマーＲｉ＋１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｉ＋１とは相違し、プライマーＦｉ＋３の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋２と同一である。
ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋１サイクル目では、５’末端にプライマーＦｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａｉ＋２を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂｉ＋２を有するＤＮＡ分子が合成される。また、ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋２サイクル目では、５’末端にプライマーＦｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａｉ＋２、３’末端にプライマーＲｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｉ＋２に相補的な塩基配列ｂｉ＋２を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂｉ＋２、３’末端にプライマーＦｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋２に相補的な塩基配列ａｉ＋２を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋１サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋２サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とは、後者が３’末端にプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋２、Ｂｉ＋２と相補的な塩基配列ａｉ＋２、ｂｉ＋２を有することにより区別することができる。
また、ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋１サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とは、後者が５’末端にプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｉ＋２、Ｂｉ＋２に由来する塩基配列を有することにより区別することができる。
このように、ＰＣＲ反応の各サイクルで合成されるＤＮＡ分子は、５’末端または３’末端に、そのＤＮＡ分子が何サイクル目で合成されたものであるかを特定する塩基配列を有する。
したがって、ＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定することができる。
また、合成されたＤＮＡ分子のそれぞれが何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができるので、増幅対象領域の最大ＰＣＲ回数を特定することもできる。
なお、ＰＣＲ反応の最終サイクルは偶数番目のサイクルであってもよいし、奇数番目のサイクルであってもよい。
〈（２）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法〉
以下、適宜、図２を参照しながら説明する。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図２のＡを参照）では、ゲノムＤＮＡを増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ０（図２中では「Ａ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ１（図２中では「Ａ１」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ１（図２中では「プライマーＦ１」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ０（図２中では「Ｂ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ１（図２中では「Ｂ１」と表記する。）とから構成されるプライマーＲ１（図２中では「プライマーＲ１」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図２のＡを参照）では、５’末端にプライマーＦ１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ１を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ１を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の２サイクル目（図２のＢを参照）では、ＰＣＲ反応の１サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡとして用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ０からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ２（図２中では「Ａ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ２（図２中では「プライマーＦ２」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ０からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ２（図２中では「Ｂ２」と表記する。）とから構成されるプライマーＲ２（図２中では「プライマーＲ２」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の２サイクル目（図２のＢを参照）では、５’末端にプライマーＦ２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ２、３’末端にプライマーＲ１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ１に相補的な塩基配列ｂ１（図２中では「ｂ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ２、３’末端にプライマーＦ１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ１に相補的な塩基配列ａ１（図２中では「ａ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の３サイクル目（図２のＣを参照）では、ＰＣＲ反応の２サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ３（図２中では「Ａ３」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ３（図２中では「プライマーＦ３」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ３（図２中では「Ｂ３」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＲ３（図２中では「プライマーＲ３」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の３サイクル目（図２のＣを参照）では、５’末端にプライマーＦ３の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ３、３’末端に２サイクル目で使用したプライマーＲ２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ２に相補的な塩基配列ｂ２（図２中では「ｂ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ３の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ３、３’末端に２サイクル目で使用したプライマーＦ２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列ａ２（図２中では「ａ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の４サイクル目（図２のＤを参照）では、ＰＣＲ反応の３サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ２からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ４（図２中では「Ａ４」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ４（図２中では「プライマーＦ４」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ２からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ４（図２中では「Ｂ４」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＲ４（図２中では「プライマーＲ４」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の４サイクル目（図２のＤを参照）では、５’末端にプライマーＦ４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ４、３’末端にプライマーＲ３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ３に相補的な塩基配列ｂ３（図２中では「ｂ３」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ４、３’末端にプライマーＦ３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ３に相補的な塩基配列ａ３（図２中では「ａ３」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の５サイクル目以降、ｊを１以上の整数として、ｊ＋４サイクル目でも同様にして、プライマーＦｊ＋４およびＲｊ＋４からなるプライマーセットを用いる。
プライマーＦｊ＋４は、塩基配列Ａｊ＋２からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ａｊ＋４からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＦｊ＋４の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｊ＋２は、プライマーＦｊ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｊ＋２と同一であり、プライマーＦｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｊ＋４は、プライマーＦ１からプライマーＦｊ＋３までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ１からＡｊ＋３までのいずれとも相違し、プライマーＦｊ＋６の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｊ＋４と同一である。
プライマーＲｊ＋４は、塩基配列Ｂｊ＋２からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ｂｊ＋４からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＲｊ＋４の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｊ＋２は、プライマーＲｊ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｊ＋２と同一であり、プライマーＲｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｊ＋４は、プライマーＲ１からプライマーＲｊ＋３までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ１からＢｊ＋３までのいずれとも相違し、プライマーＲｊ＋６の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｊ＋４と同一である。
ＰＣＲ反応のｊ＋４サイクル目では、５’末端にプライマーＦｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａｊ＋４、３’末端にプライマーＲｊ＋３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂｊ＋３に相補的な塩基配列ｂｊ＋３を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂｊ＋４を、３’末端にプライマーＦｊ＋３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｊ＋３に相補的な塩基配列ａｊ＋３を有するＤＮＡ分子が合成される。
このように、ＰＣＲ反応の各サイクルで合成されるＤＮＡ分子は、５’末端に、そのＤＮＡ分子が何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができる塩基配列を有する。
したがって、ＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定することができる。
また、合成されたＤＮＡ分子のそれぞれが何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができるので、増幅対象領域の最大ＰＣＲ回数を特定することもできる。
〈（３）対になるプライマーの一方のみが非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法〉
以下、適宜、図３を参照しながら説明する。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図３のＡを参照）では、ゲノムＤＮＡを増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ０（図３中では「Ａ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ１（図３中では「Ａ１」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ１（図３中では「プライマーＦ１」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ０（図３中では「Ｂ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分から構成されるプライマーＲ０（図３中では「プライマーＲ０」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図３のＡを参照）では、５’末端にプライマーＦ１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ１を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ０の相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ０を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の２サイクル目（図３のＢを参照）では、ＰＣＲ反応の１サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡとして用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ０からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ２（図３中では「Ａ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ２（図３中では「プライマーＦ２」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ０からなる相補ＤＮＡ部分から構成されるプライマーＲ０からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の２サイクル目（図３のＢを参照）では、５’末端にプライマーＦ２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ２を有するＤＮＡ分子、および、３’末端にプライマーＦ１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ１に相補的な塩基配列ａ１（図３中では「ａ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の３サイクル目（図３のＣを参照）では、ＰＣＲ反応の２サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ３（図３中では「Ａ３」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ３（図３中では「プライマーＦ３」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ０からなる相補ＤＮＡ配列から構成されるプライマーＲ０からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の３サイクル目（図３のＣを参照）では、５’末端にプライマーＦ３の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ３を有するＤＮＡ分子、および、３’末端に２サイクル目で使用したプライマーＦ２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列ａ２（図３中では「ａ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の４サイクル目（図３のＤを参照）では、ＰＣＲ反応の３サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ２からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ４（図３中では「Ａ４」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ４（図３中では「プライマーＦ４」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ０からなる相補ＤＮＡ配列から構成されるプライマーＲ０からなるプライマーセットを用いる。
ＰＣＲ反応の４サイクル目（図３のＤを参照）では、５’末端にプライマーＦ４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ４を有するＤＮＡ分子、および、３’末端にプライマーＦ３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ３に相補的な塩基配列ａ３（図３中では「ａ３」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。
ＰＣＲ反応の５サイクル目以降、ｋを１以上の整数として、ｋ＋４サイクル目でも同様にして、プライマーＦｋ＋４およびＲ０からなるプライマーセットを用いる。
プライマーＦｋ＋４は、塩基配列Ａｋ＋２からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ａｋ＋４からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＦｋ＋４の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｋ＋２は、プライマーＦｋ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｋ＋２と同一であり、プライマーＦｋ＋４の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｋ＋４は、プライマーＦ１からプライマーＦｋ＋３までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ１からＡｋ＋３までのいずれとも相違し、プライマーＦｋ＋６の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｋ＋４と同一である。プライマーＲ０は上述したとおり、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ０から構成される。
ＰＣＲ反応のｋ＋４サイクル目では、５’末端にプライマーＦｋ＋４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａｋ＋４を有するＤＮＡ分子、および、３’末端にプライマーＦｊ＋３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａｊ＋３に相補的な塩基配列ａｊ＋３を有するＤＮＡ分子が合成される。
このように、ＰＣＲ反応の各サイクルで合成されるＤＮＡ分子は、５’末端または３’末端に、そのＤＮＡ分子が何サイクル目で合成されたものであるかを特定する塩基配列を有する。
したがって、ＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定することができる。
また、合成されたＤＮＡ分子のそれぞれが何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができるので、増幅対象領域の最大ＰＣＲ回数を特定することもできる。
［解析方法］
本発明の解析方法の一態様は、本発明のプライマーセットをＰＣＲ反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、領域毎のカバレッジを、上記増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正することを特徴とする解析方法である。
複数の領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅し、次世代シーケンサを用いてシーケンスを行った場合、領域毎にカバレッジ（シーケンスのリード数）が異なる場合がある。
この解析方法は、領域毎の増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定して、領域毎のＰＣＲの成功回数（最大ＰＣＲ回数）を求め、その回数によって領域毎のカバレッジを補正するものである。
領域毎のカバレッジを補正し、領域毎のＰＣＲ増幅効率を揃えることで、例えば、染色体量定量精度を向上することができる。
本発明の解析方法の別の一態様は、プライマーセットをＰＣＲ反応に供して少なくとも１つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、アレル毎のカバレッジを、上記増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正することを特徴とする解析方法である。
ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism；一塩基多型）、ＣＮＶ（copy number variation；コピー数多型、コピー数多様性）等の多型部位をＰＣＲによって増幅し、次世代シーケンサを用いてシーケンスを行った場合、アレル毎にカバレッジ（シーケンスのリード数）が異なる場合がある。
この解析方法は、アレル毎の増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定して、アレル毎のＰＣＲの成功回数（最大ＰＣＲ回数）を求め、その回数によってアレル毎のカバレッジを補正するものである。
アレル毎のカバレッジを補正し、アレル毎のＰＣＲ増幅効率を揃えることで、例えば、その遺伝子多型部位の遺伝子型の確定精度を向上することができる。
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］
ヒトゲノム上の領域Ａおよび領域Ｂは、それぞれ、別々の染色体上に存在する。
領域Ａおよび領域Ｂのそれぞれを増幅するためのプライマーのセットを、本発明のプライマー設計方法に従って設計し、プライマーを合成し、マルチプレックスＰＣＲによって領域Ａおよび領域Ｂの増幅産物を得る。
増幅産物を次世代シーケンサによってシーケンシングし、領域ＡのカバレッジＣａ、領域ＢのカバレッジＣｂ、領域Ａの最大ＰＣＲ回数Ｍａ、領域Ｂの最大ＰＣＲ回数Ｍｂを、それぞれ、測定する。
領域Ａおよび領域ＢでのＰＣＲ増幅効率を揃え、染色体量定量精度を向上するために、領域Ｂの補正後カバレッジＣｂ’を次式により算出する。
Ｃｂ’＝Ｃｂ×２Ｍａ−Ｍｂ
実際の値として、領域ＡのカバレッジＣａ＝５００、最大ＰＣＲ成功回数Ｍａ＝１２、領域ＢのカバレッジＣｂ＝１００、最大ＰＣＲ回数Ｍｂ＝１０が得られたとすると、領域Ｂの補正後カバレッジＣｂ’は、
Ｃｂ’＝１００×２（１２−１０）＝４００
である。このように補正することによって、ＰＣＲ前の染色体量を高精度に推定することができる。
［実施例２］
ヒトゲノム上のＳＮＰ位置Ａの遺伝子型としては、ＣＣ、ＣＴおよびＴＴの３種類が存在する。
ＳＮＰ位置Ａを増幅するためのプライマーのセットを、本発明のプライマー設計方法に従って設計し、プライマーを合成し、ＰＣＲによってＳＮＰ位置Ａの増幅産物を得る。
増幅産物を次世代シーケンサによってシーケンシングし、ＳＮＰ位置ＡについてＣを持つリードのカバレッジＣｃ、Ｔを持つリードのカバレッジＣｔ、Ｃを持つリードの最大ＰＣＲ回数Ｍｃ、Ｔを持つリードの最大ＰＣＲ回数Ｍｔを、それぞれ、測定する。
Ｃを持つアレルとＴを持つアレルとのＰＣＲ増幅効率を揃え、ＳＮＰ位置Ａの遺伝子型の確定精度を向上するために、Ｔを持つアレルの補正後カバレッジＣｔ’を次式により算出する。
Ｃｔ’＝Ｃｔ×２（Ｍａ−Ｍｂ）
実際の値として、ＳＮＰ位置ＡについてＣを持つアレルのカバレッジＣｃ＝５００、ＳＮＰ位置ＡについてＴを持つアレルのカバレッジＣｔ＝１００、ＳＮＰ位置ＡについてＣを持つアレルの最大ＰＣＲ回数Ｍｃ＝１２、ＳＮＰ位置ＡについてＴを持つアレルの最大ＰＣＲ回数Ｍｔ＝１０が得られたとすると、Ｔを持つアレルの補正後カバレッジＣｔ’は、
Ｃｔ’＝１００×２（１２−１０）＝４００
である。このように補正することによって、ＳＮＰ位置Ａの遺伝子型がＣＴであったと判定する確度が向上する。
本発明は、染色体数定量やＳＮＰ解析といった遺伝子解析を行う際に、カバレッジ情報等を補正し高精度な解析を行うことに利用可能である。

Claims (9)

  1. ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法であって、
    前記プライマーの５’末端側の塩基配列が、前記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から前記増幅産物中のＤＮＡ分子が前記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、前記プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程
    を備える、ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。
  2. 前記プライマー設計工程は、
    前記プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
    Ｎは１以上の奇数であり、
    Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、前記相補ＤＮＡ部分の５’末端に前記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
    Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−２回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、前記相補ＤＮＡ部分の５’末端に前記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含む、
    請求項１に記載のＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。
  3. 前記プライマー設計工程は、
    前記プライマーが第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
    Ｎは１以上の整数であり、
    Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、前記相補ＤＮＡ部分の５’末端に前記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
    Ｎ＝２であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、前記相補ＤＮＡ部分の５’末端に前記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
    Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、前記相補ＤＮＡ部分の５’末端に前記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含む、
    請求項１に記載のＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のプライマーの設計方法に従って設計されたプライマー。
  5. 請求項４に記載のプライマーを含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセット。
  6. 請求項５に記載のプライマーセットを複数含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセット。
  7. 請求項５または６に記載のプライマーセットをＰＣＲ反応に供する、ＤＮＡ増幅方法。
  8. 請求項５または６に記載のプライマーセットをＰＣＲ反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
    領域毎のカバレッジを、前記増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
    ことを特徴とする解析方法。
  9. 請求項５または６に記載のプライマーセットをＰＣＲ反応に供して少なくとも１つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
    アレル毎のカバレッジを、前記増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
    ことを特徴とする解析方法。
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